Test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka

W protokole tym opisano niektóre metody ilościowego określania powstawania kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka. Może być stosowany jako wysokoprzepustowa platforma przesiewowa do testowania leków, które modulują tworzenie kropelek lipidów. Opisana przez nas metoda opiera się na barwniku specyficznym dla kropelek lipidów i organoidach jelitowych pochodzących z biopsji.

W ten sposób zapewnia stabilny, dokładny i fizjologicznie istotny model tworzenia kropelek lipidów. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych pod kątem specyficznych dla pacjenta nowych kandydatów na leki, które modulują tworzenie kropelek lipidów, na przykład u pacjentów z niedoborem DGAT1. Ten test tworzenia kropelek lipidowych może być również stosowany do innych typów kultur organoidowych w celu zbadania metabolizmu lipidów w innych typach komórek.

Test jest w znacznym stopniu zależny od gęstości hodowli organoidów. Staraj się zapewnić stałą gęstość organoidów w próbkach i eksperymentach. Wizualna demonstracja tego testu ma kluczowe znaczenie, ponieważ ważne jest, aby pokazać, w jaki sposób organoidy powinny być hodowane i jak należy się z nimi obchodzić, aby zapewnić właściwą analizę tworzenia się kropelek lipidów.

Po przygotowaniu organoidów ostrożnie zassać pożywkę hodowlaną, nie naruszając kropelek macierzy błony podstawnej. Dodaj 500 mikrolitrów zimnego podłoża podstawowego do pierwszego dołka organoidów. Za pomocą pipety P1000 delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić kropelki macierzy błony podstawnej z organoidami.

Powtórz te procedury z tym samym podłożem w następnej studzience, zgodnie z wymaganiami, ale nie zbieraj więcej niż dwóch studzienek na 500 mikrolitrów podłoża podstawowego. Zbierz organoidy w nisko wiążącej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj je w mini-wirówce stołowej przez 15 do 20 sekund. Dodaj 400 mikrolitrów trypsyny do odwirowanych organoidów.

Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie za pomocą pipety P200 delikatnie odpipetuj zawiesinę w górę i w dół, aby rozbić pozostałe agregaty komórek. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Gdy pozostaną tylko pojedyncze komórki, dodaj jeden mililitr podłoża podstawowego i wiruj komórki w mini-wirówce stołowej przez 15 do 20 sekund. Całkowicie odessać supernatant. Użyj pipety P200, aby ponownie zawiesić pojedyncze komórki w 200 mikrolitrach świeżego hSI-EM i dodaj dodatkowe 800 mikrolitrów hSI-EM.

Następnie policz liczbę komórek w zawiesinie i oblicz objętość komórek potrzebną do uzyskania końcowej gęstości komórek. Wyjmij odpowiednią objętość zawiesiny i dostosuj gęstość do 750 komórek na mikrolitr. Dodaj macierz błony podstawnej do zawiesiny komórkowej w stosunku dwa do jednego.

Delikatnie odpipetować zawiesinę do wymieszania, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków. Na wstępnie podgrzanej płytce hodowlanej wysiew trzy 10-mikrolitrowe kropelki na studzienkę, jeśli płytka ma 24 dołki, lub jedną pięciomikrolitrową kroplę na studzienkę, jeśli płytka ma 96 dołków. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla na 10 do 15 minut, aby zestalić kropelki.

W międzyczasie należy wstępnie podgrzać odpowiednią objętość hSI-EM+Y w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie dodaj wstępnie podgrzany hSI-EM+Y do każdej studzienki płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla.

Po dwóch do trzech dniach wymień pożywkę na hSI-EM i pamiętaj, aby odświeżać ją dwa do trzech razy w tygodniu. Najpierw zważ 0,2 grama ciekłego kwasu oleinowego w temperaturze pokojowej. Dodaj 1,5 mililitra sterylnego PBS klasy kulturowej i podgrzewaj mieszaninę do 70 stopni Celsjusza przez godzinę, upewniając się, że wiruje z przerwami.

Następnie zważ 5,89 grama BSA bez kwasów tłuszczowych i rozpuść go w 33,9 mililitrach PBS. Podgrzej mieszaninę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż BSA całkowicie się rozpuści. Ponownie zwirować mieszaninę kwasu oleinowego, aby utworzyć emulsję drobnych kropelek i natychmiast dodać ją do roztworu BSA za pomocą szklanej pipety.

Trzymaj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aż pozostanie klarowny żółtawy roztwór. Przepasuj organoidy zgodnie z wcześniejszym opisem i wysiew pojedyncze komórki pochodzące z organoidów do czarnej, przezroczystej 96-dołkowej płytki. W szóstym dniu hodowli na hSI-EM zastąp pożywkę hodowlaną hSI-EM zawierającą jeden milimol kwasu oleinowego i koniugatu BSA.

Inkubować komórki przez 16 do 17 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności lub bez 0,1 mikromolowego inhibitora DGAT1. Następnie odessać pożywkę, nie naruszając kropelek macierzy błony podstawnej. Utrwal organoidy, dodając 100 mikrolitrów czteroprocentowego neutralnego buforowanego formaldehydu do studzienek przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Delikatnie usuń formaldehyd i ostrożnie umyj komórki 150 mikrolitrami PBS na studzienkę. Wybarwić komórki na kropelki lipidów 025 miligramami na mililitr LD540 i DAPI w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dokładnie umyj studzienki PBS.

Do zdjęć przeglądowych całych organoidów należy użyć 40-krotnego subiektywnego obrazu dostosowanego do konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego. Ustaw mikroskop na obrazowanie pod kątem DAPI i barwnika LD540, korzystając z ustawień wzbudzenia i emisji pokazanych tutaj. Ustaw rozmiar otworka na jedną przewiewną jednostkę, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość osi z.

Aby zobrazować połowę sferycznego organoidu, ustaw stos z na około 85 mikrometrów. Korzystając z odpowiedniego systemu przetwarzania obrazu, przekształć stos z każdego organoidu do maksymalnej projekcji, klikając Obraz, Stosy, Projekt Z. Ustaw próg maksymalnej projekcji na poziomie, w którym nie ma sygnału LD540 widocznego w próbce kontrolnej pojazdu BSA, klikając Obraz, Dostosuj, Próg.

Użyj tych ustawień, aby określić próg każdego obrazu. Następnie zmierz całkowitą powierzchnię fluorescencji dla każdej maksymalnej projekcji za pomocą funkcji Analizuj, Analizuj cząstki. W celu prawidłowej analizy tworzenia się kropelek lipidów, organoidy nie powinny być zbyt gęsto wysiewane przed stymulacją kwasem oleinowym i późniejszym barwieniem.

Jest to szczególnie ważne dla odczytu konfokalnego i czytnika płytek, ponieważ nakładające się na siebie organoidy mogą zakłócać fluorescencję. Po stymulacji jednym milimolem kwasu oleinowego przez noc, tworzenie się kropelek lipidów można uwidocznić za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola. Nagromadzenie kropelek lipidów rozprasza przechodzące światło, dlatego organoidy wydają się ciemniejsze, podczas gdy organoidy niestymulowane mają półprzezroczysty wygląd.

Po utrwaleniu i wybarwieniu organoidów stymulowanych kwasem oleinowym, tworzenie się kropelek lipidów można uwidocznić za pomocą mikroskopu konfokalnego. Ponieważ organoidy są strukturami 3D, zwykły mikroskop epifluorescencyjny nie jest odpowiedni ze względu na nieostry sygnał tła, dlatego do scharakteryzowania LDF w organoidach stosuje się konfokalny stos z. Oznaczanie ilościowe próbek z mikroskopii konfokalnej można również przeprowadzić za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych znormalizowanego do fluorescencyjnego sygnału Hoechsta.

Test czytnika płytek wskazuje na znaczny spadek sygnału LD540 w komórkach organoidowych traktowanych inhibitorem DGAT1 w porównaniu z organoidami nieleczonymi. Kwantyfikacja powstawania LD w poszczególnych komórkach może być osiągnięta za pomocą cytometru przepływowego. Pokazana tutaj strategia bramkowania dotyczy zdysocjowanych organoidów jelitowych człowieka.

Reprezentatywne histogramy zarówno dla sygnału SSC-A, jak i LD540 końcowej populacji żywych komórek pokazują, że tworzenie się kropelek lipidów spowoduje wzrost SSC-A w wyniku tworzenia się wewnątrzkomórkowych kropelek lipidów. Ponadto LD540 barwi lipidy, które są przechowywane w kropelkach lipidów, a sygnał również wzrośnie po indukcji tworzenia się kropelek lipidów. W związku z tym tworzenie się kropelek lipidów mierzy się jako zmianę średniej intensywności fluorescencji zarówno SSC-A, jak i LD540.

Najważniejszymi etapami tego protokołu są hodowla organoidów jelitowych człowieka i prawidłowe pofałdowanie kwasu oleinowego do BSA. Aby dostosować się do większej liczby warunków, test ten można przeanalizować za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Aby skorygować liczbę organoidów na studzienkę, sygnał LD540 został znormalizowany do sygnału DAPI.

Dzięki tej technice naukowcy mogą badać powstawanie kropelek lipidów w układach organoidowych i ulepszać różne techniki analizy, takie jak mikroskopia elektronowa, w celu potwierdzenia swoich ustaleń.