Name: Test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania kropelek lipidów w ludzkich organoidach jelitowych przy użyciu fluorescencyjnego barwnika specyficznego dla lipidów. Ta technika umożliwia przesiewowe badania leków modulujących metabolizm lipidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy B. Spee za hojne dostarczenie LD540. Prace te były wspierane przez grant Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) do S.M.

<ol><li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li>
<li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li>
<li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat%3A+Presence%2C+synthesis%2C+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li>
<li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li>
<li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li>
<li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li>
<li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li>
<li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li>
<li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements%2C+Protein-losing+Enteropathy%2C+and+Rickets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li>
<li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+protein+losing+enteropathy%3A+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li>
<li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li>
<li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye%2C+LD540%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li>
<li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokół określający tworzenie LD w organoidach jelitowych człowieka podczas inkubacji z kwasem oleinowym. Metoda ta opiera się na barwniku fluorescencyjnym LD LD54018, który pozwala na scharakteryzowanie i ilościowe określenie całkowitej objętości kropelek lipidów w kulturze organoidów. Procedury tworzenia i utrzymywania kultur organoidów jelitowych człowieka zostały opublikowane przed13 rokiem, a wizualny przewodnik po tym protokole jest równie...

Lipidy są kluczowym składnikiem diety człowieka i odgrywają ważną rolę w magazynowaniu energii i metabolizmie. Po spożyciu lipidy w diecie są rozkładane na wolne kwasy tłuszczowe (FFA) i monoglicerydy (MG) przez lipazy trzustkowe. Substraty te są następnie pobierane przez enterocyty nabłonka jelitowego, gdzie są najpierw reestryfikowane do diglicerydów (DG) przez enzymy acylotransferazy monoglicerydów (MGAT), a następnie do trójglicerydów (TG) przez acylotransferazę diacyloglicerolu 1 (DGAT1)1. Wreszcie, te TG są integrowane z chylomikronami w celu eksportu do układu limfatycznego lub cytozolowymi kropelkami lipidów (LD) do przechowywania wewnątrzkomórkowego2,3. Chociaż chylomikrony są potrzebne do dystrybucji lipidów dietetycznych do innych narządów, znaczenie wewnątrzkomórkowego magazynowania tłuszczu w LD nie jest do końca jasne. Wykazano jednak, że LD pełnią funkcję regulacyjną w jelicie, ponieważ powoli uwalniają lipidy do krążenia do 16 godzin po posiłku4. Ponadto wykazano, że LD chronią przed toksycznymi stężeniami kwasów tłuszczowych, na przykład w adipocytach myszy podczas warunków lipolitycznych5.
Białko DGAT1 znajduje się na błonie retikulum endoplazmatycznego (ER) i odgrywa kluczową rolę w tworzeniu LD w nabłonku jelitowym. Homozygotyczne mutacje w DGAT1 prowadzą do ciężkiej biegunki i/lub wymiotów o wczesnym początku, hipoalbuminemii i/lub (śmiertelnej) enteropatii tracącej białko z niewydolnością jelit po spożyciu tłuszczu, co ilustruje znaczenie DGAT1 w homeostazie lipidowej nabłonka jelitowego człowieka6,7,8,9,10. Ponieważ występowanie niedoboru DGAT1 u ludzi jest rzadkie, dostęp do pierwotnych komórek pochodzących od pacjentów jest ograniczony. Co więcej, długotrwała hodowla komórek nabłonka jelitowego od dawna jest ograniczona do linii komórkowych pochodzących z nowotworów, które reprezentują normalną fizjologię tylko w ograniczonym zakresie. W związku z tym tworzenie LD za pośrednictwem DGAT1 badano głównie w fibroblastach lub liniach komórkowych pochodzenia zwierzęcego7,10,11,12. W związku z tym niedawno wykazano, że fibroblasty pochodzące od pacjentów z niedoborem DGAT1 gromadzą mniej LD w porównaniu ze zdrowymi komórkami kontrolnymi po stymulacji kwasem oleinowym (OA)8.
Poprzednio ustanowiono protokoły hodowli komórek macierzystych nabłonka z dowolnego narządu przewodu pokarmowego w postaci trójwymiarowych (3D) organoidów13. Te organoidy jelitowe mogą być przechowywane w kulturze przez długi okres czasu13 i umożliwiają funkcjonalne badanie cech nabłonka specyficznych dla pacjenta i lokalizacji jelita14. Są one stabilne genetycznie i fenotypowo i mogą być przechowywane, co pozwala na długoterminową ekspansję i biobanking13.
Niedawno pokazaliśmy, że formowanie LD można łatwo zmierzyć w ludzkich organoidach jelitowych w teście LDF (LDF)6. Po wystawieniu na działanie choroby zwyrodnieniowej stawów przez 16 godzin organoidy wytwarzają LD, aby chronić komórki przed toksycznością wywołaną przez lipidy. Gdy stężenie choroby zwyrodnieniowej stawów jest zbyt wysokie, komórki umierają w wyniku apoptozy za pośrednictwem kaspazy6. Wcześniej wykazano, że test LDF jest w dużej mierze zależny od DGAT1, na co wskazują organoidy pochodzące od pacjentów z mutacją DGAT1 oraz zastosowanie inhibitorów specyficznych dla DGAT16.
Dla szczegółowo opisanego tutaj testu LDF, organoidy 3D są hodowane z biopsji jelitowych i są co tydzień przenoszone przez rozpad na pojedyncze komórki, które łatwo tworzą nowe organoidy. Aby przeprowadzić test LDF, ~ 7,500 pojedynczych komórek pochodzących z organoidów jest posianych w każdym dołku 24-dołkowej płytki. Organoidy są formowane przez kilka dni, inkubowane przez noc z 1 mM OA i barwione LD540, fluorescencyjnym barwnikiem specyficznym dla LD, przepuszczalnym dla komórek, który ułatwia obrazowanie. Powstawanie LD jest następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii konfokalnej, czytnika płytek fluorescencyjnych lub cytometrii przepływowej.
Poprzez skalowanie tego testu tworzenia LD do formatu 96-dołkowego, test może być również używany do wysokoprzepustowej analizy powstawania LD w celu przesiewania nowych leków, które wpływają na powstawanie LD w hodowlach organoidów jelitowych ludzkich, lub do badania zaburzeń (genetycznych człowieka), które wpływają na metabolizm LD.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Macierz błony podstawnej (matrigel)</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor DGAT1 (AZD 3988)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4837/10</td><td></td></tr><tr><td>Bez kwasów tłuszczowych BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Klinipath</td><td>4078-9001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina (GlutaMAX, 100x)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>SP8X</td><td></td></tr><tr><td>LD540</td><td></td><td></td><td>dzięki uprzejmości dostarczonej przez Dr. B. Spee, Uniwersytet w Utrechcie</td></tr><tr><td>mEGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09_500ug</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500G</td><td></td></tr><tr><td>Komórki produkujące nogginę (komórki HEK293-mNoggin-Fc)</td><td></td><td></td><td>MTA z J. den Hertog, Instytut Hubrechta</td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008-5G</td><td></td></tr><tr><td>p38 Inhibitor MAPK (p38i) (SB202190)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Komórki wytwarzające R-spondynę (komórki Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T)</td><td>R& Systemy D</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki z TC</td><td>Greiner-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>czarne płytki 96-dołkowe z przezroczystym dnem poddane TC</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor receptora TGFb typu I (A83-01)&nbsp;</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (TrypLE Express)</td><td>Life Technologies</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Komórki wytwarzające WNT-3A (komórki L-Wnt-3A)</td><td></td><td></td><td>MTA z J. den Hertog, Hubrecht Institute</td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek (inhibitor kinazy Rho)</td><td>Abcam</td><td>ab120129-10</td><td></td></tr></tbody></table>

test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Lipidy dietetyczne są pobierane przez nabłonek jelitowy jako wolne kwasy tłuszczowe (FA). Te FA są przekształcane wewnątrzkomórkowo w cząsteczki trójglicerydów (TG), zanim zostaną upakowane w chylomikrony w celu transportu do limfy lub w cytozolowe kropelki lipidów (LD) do przechowywania wewnątrzkomórkowego. Kluczowym etapem tworzenia LD jest aktywność katalityczna acylotransferaz diacyloglicerolu (DGAT) w końcowym etapie syntezy TG. LD są ważne dla buforowania toksycznych form lipidów i regulowania metabolizmu komórkowego w różnych typach komórek. Ponieważ nabłonek jelitowy człowieka jest regularnie konfrontowany z wysokimi stężeniami lipidów, tworzenie LD ma ogromne znaczenie dla regulacji homeostazy. Tutaj opisujemy prosty test do charakterystyki i kwantyfikacji powstawania LD (LDF) po stymulacji najpowszechniejszym nienasyconym kwasem tłuszczowym, kwasem oleinowym, w ludzkich organoidach jelitowych. Test LDF opiera się na barwniku fluorescencyjnym LD540 specyficznym dla LD, który pozwala na ilościowe określenie LD za pomocą mikroskopii konfokalnej, czytnika płytek fluorescencyjnych lub cytometrii przepływowej. Test LDF może być wykorzystany do scharakteryzowania powstawania LD w ludzkich komórkach nabłonka jelitowego lub do badania ludzkich zaburzeń (genetycznych), które wpływają na metabolizm LD, takich jak niedobór DGAT1. Co więcej, test ten może być również stosowany w wysokoprzepustowym rurociągu do testowania nowych związków terapeutycznych, które przywracają defekty w tworzeniu LD w jelitach lub innych typach organoidów.

Aby zapewnić prawidłową analizę tworzenia się LD, organoidy nie powinny być wysiewane zbyt gęsto przed stymulacją OA i późniejszym barwieniem. Ma to szczególne znaczenie w przypadku odczytu konfokalnego oraz z czytnika płytek, ponieważ nakładające się organoidy mogą zakłócać fluorescencję. Przykład prawidłowej gęstości wysiewu organoidów (Rysunek 1A) oraz hodowli z nakładającymi się organoidami przedstawiono na (Rysunek 1...

Ten protokół opisuje test do charakterystyki tworzenia się kropelek lipidowych (LD) w organoidach jelitowych człowieka po stymulacji kwasami tłuszczowymi. Omówiliśmy, w jaki sposób ten test jest używany do ilościowego oznaczania powstawania LD i jak można go wykorzystać do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które wpływają na tworzenie LD.

Test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

W protokole tym opisano niektóre metody ilościowego określania powstawania kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka. Może być stosowany jako wysokoprzepustowa platforma przesiewowa do testowania leków, które modulują tworzenie kropelek lipidów. Opisana przez nas metoda opiera się na barwniku specyficznym dla kropelek lipidów i organoidach jelitowych pochodzących z biopsji.W ten sposób zapewnia stabilny, dokładny i fizjologicznie istotny model tworzenia kropelek lipidów. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych pod kątem specyficznych dla pacjenta nowych kandydatów na leki, które modulują tworzenie kropelek lipidów, na przykład u pacjentów z niedoborem DGAT1. Ten test tworzenia kropelek lipidowych może być również stosowany do innych typów kultur organoidowych w celu zbadania metabolizmu lipidów w innych typach komórek.Test jest w znacznym stopniu zależny od gęstości hodowli organoidów. Staraj się zapewnić stałą gęstość organoidów w próbkach i eksperymentach. Wizualna demonstracja tego testu ma kluczowe znaczenie, ponieważ ważne jest, aby pokazać, w jaki sposób organoidy powinny być hodowane i jak należy się z nimi obchodzić, aby zapewnić właściwą analizę tworzenia się kropelek lipidów.Po przygotowaniu organoidów ostrożnie zassać pożywkę hodowlaną, nie naruszając kropelek macierzy błony podstawnej. Dodaj 500 mikrolitrów zimnego podłoża podstawowego do pierwszego dołka organoidów. Za pomocą pipety P1000 delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić kropelki macierzy błony podstawnej z organoidami.Powtórz te procedury z tym samym podłożem w następnej studzience, zgodnie z wymaganiami, ale nie zbieraj więcej niż dwóch studzienek na 500 mikrolitrów podłoża podstawowego. Zbierz organoidy w nisko wiążącej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj je w mini-wirówce stołowej przez 15 do 20 sekund. Dodaj 400 mikrolitrów trypsyny do odwirowanych organoidów.Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie za pomocą pipety P200 delikatnie odpipetuj zawiesinę w górę i w dół, aby rozbić pozostałe agregaty komórek. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Gdy pozostaną tylko pojedyncze komórki, dodaj jeden mililitr podłoża podstawowego i wiruj komórki w mini-wirówce stołowej przez 15 do 20 sekund. Całkowicie odessać supernatant. Użyj pipety P200, aby ponownie zawiesić pojedyncze komórki w 200 mikrolitrach świeżego hSI-EM i dodaj dodatkowe 800 mikrolitrów hSI-EM.Następnie policz liczbę komórek w zawiesinie i oblicz objętość komórek potrzebną do uzyskania końcowej gęstości komórek. Wyjmij odpowiednią objętość zawiesiny i dostosuj gęstość do 750 komórek na mikrolitr. Dodaj macierz błony podstawnej do zawiesiny komórkowej w stosunku dwa do jednego.Delikatnie odpipetować zawiesinę do wymieszania, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków. Na wstępnie podgrzanej płytce hodowlanej wysiew trzy 10-mikrolitrowe kropelki na studzienkę, jeśli płytka ma 24 dołki, lub jedną pięciomikrolitrową kroplę na studzienkę, jeśli płytka ma 96 dołków. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla na 10 do 15 minut, aby zestalić kropelki.W międzyczasie należy wstępnie podgrzać odpowiednią objętość hSI-EM+Y w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie dodaj wstępnie podgrzany hSI-EM+Y do każdej studzienki płytki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla.Po dwóch do trzech dniach wymień pożywkę na hSI-EM i pamiętaj, aby odświeżać ją dwa do trzech razy w tygodniu. Najpierw zważ 0,2 grama ciekłego kwasu oleinowego w temperaturze pokojowej. Dodaj 1,5 mililitra sterylnego PBS klasy kulturowej i podgrzewaj mieszaninę do 70 stopni Celsjusza przez godzinę, upewniając się, że wiruje z przerwami.Następnie zważ 5,89 grama BSA bez kwasów tłuszczowych i rozpuść go w 33,9 mililitrach PBS. Podgrzej mieszaninę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż BSA całkowicie się rozpuści. Ponownie zwirować mieszaninę kwasu oleinowego, aby utworzyć emulsję drobnych kropelek i natychmiast dodać ją do roztworu BSA za pomocą szklanej pipety.Trzymaj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aż pozostanie klarowny żółtawy roztwór. Przepasuj organoidy zgodnie z wcześniejszym opisem i wysiew pojedyncze komórki pochodzące z organoidów do czarnej, przezroczystej 96-dołkowej płytki. W szóstym dniu hodowli na hSI-EM zastąp pożywkę hodowlaną hSI-EM zawierającą jeden milimol kwasu oleinowego i koniugatu BSA.Inkubować komórki przez 16 do 17 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności lub bez 0,1 mikromolowego inhibitora DGAT1. Następnie odessać pożywkę, nie naruszając kropelek macierzy błony podstawnej. Utrwal organoidy, dodając 100 mikrolitrów czteroprocentowego neutralnego buforowanego formaldehydu do studzienek przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Delikatnie usuń formaldehyd i ostrożnie umyj komórki 150 mikrolitrami PBS na studzienkę. Wybarwić komórki na kropelki lipidów 025 miligramami na mililitr LD540 i DAPI w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dokładnie umyj studzienki PBS.Do zdjęć przeglądowych całych organoidów należy użyć 40-krotnego subiektywnego obrazu dostosowanego do konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego. Ustaw mikroskop na obrazowanie pod kątem DAPI i barwnika LD540, korzystając z ustawień wzbudzenia i emisji pokazanych tutaj. Ustaw rozmiar otworka na jedną przewiewną jednostkę, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość osi z.Aby zobrazować połowę sferycznego organoidu, ustaw stos z na około 85 mikrometrów. Korzystając z odpowiedniego systemu przetwarzania obrazu, przekształć stos z każdego organoidu do maksymalnej projekcji, klikając Obraz, Stosy, Projekt Z. Ustaw próg maksymalnej projekcji na poziomie, w którym nie ma sygnału LD540 widocznego w próbce kontrolnej pojazdu BSA, klikając Obraz, Dostosuj, Próg.Użyj tych ustawień, aby określić próg każdego obrazu. Następnie zmierz całkowitą powierzchnię fluorescencji dla każdej maksymalnej projekcji za pomocą funkcji Analizuj, Analizuj cząstki. W celu prawidłowej analizy tworzenia się kropelek lipidów, organoidy nie powinny być zbyt gęsto wysiewane przed stymulacją kwasem oleinowym i późniejszym barwieniem.Jest to szczególnie ważne dla odczytu konfokalnego i czytnika płytek, ponieważ nakładające się na siebie organoidy mogą zakłócać fluorescencję. Po stymulacji jednym milimolem kwasu oleinowego przez noc, tworzenie się kropelek lipidów można uwidocznić za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola. Nagromadzenie kropelek lipidów rozprasza przechodzące światło, dlatego organoidy wydają się ciemniejsze, podczas gdy organoidy niestymulowane mają półprzezroczysty wygląd.Po utrwaleniu i wybarwieniu organoidów stymulowanych kwasem oleinowym, tworzenie się kropelek lipidów można uwidocznić za pomocą mikroskopu konfokalnego. Ponieważ organoidy są strukturami 3D, zwykły mikroskop epifluorescencyjny nie jest odpowiedni ze względu na nieostry sygnał tła, dlatego do scharakteryzowania LDF w organoidach stosuje się konfokalny stos z. Oznaczanie ilościowe próbek z mikroskopii konfokalnej można również przeprowadzić za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych znormalizowanego do fluorescencyjnego sygnału Hoechsta.Test czytnika płytek wskazuje na znaczny spadek sygnału LD540 w komórkach organoidowych traktowanych inhibitorem DGAT1 w porównaniu z organoidami nieleczonymi. Kwantyfikacja powstawania LD w poszczególnych komórkach może być osiągnięta za pomocą cytometru przepływowego. Pokazana tutaj strategia bramkowania dotyczy zdysocjowanych organoidów jelitowych człowieka.Reprezentatywne histogramy zarówno dla sygnału SSC-A, jak i LD540 końcowej populacji żywych komórek pokazują, że tworzenie się kropelek lipidów spowoduje wzrost SSC-A w wyniku tworzenia się wewnątrzkomórkowych kropelek lipidów. Ponadto LD540 barwi lipidy, które są przechowywane w kropelkach lipidów, a sygnał również wzrośnie po indukcji tworzenia się kropelek lipidów. W związku z tym tworzenie się kropelek lipidów mierzy się jako zmianę średniej intensywności fluorescencji zarówno SSC-A, jak i LD540.Najważniejszymi etapami tego protokołu są hodowla organoidów jelitowych człowieka i prawidłowe pofałdowanie kwasu oleinowego do BSA. Aby dostosować się do większej liczby warunków, test ten można przeanalizować za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Aby skorygować liczbę organoidów na studzienkę, sygnał LD540 został znormalizowany do sygnału DAPI.Dzięki tej technice naukowcy mogą badać powstawanie kropelek lipidów w układach organoidowych i ulepszać różne techniki analizy, takie jak mikroskopia elektronowa, w celu potwierdzenia swoich ustaleń.

a-fluorescence-based-assay-for-characterization-quantification-lipid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje test cytometrii przepływowej do ilościowego określenia poziomów ROS w organoidach jelitowych 3D uzyskanych od transgenicznych myszy wykazujących ekspresję GFP. Metoda ta zapewnia eksperymentalny model in vitro do zbadania skuteczności badanych związków w produkcji ROS.

Test cytometrii przepływowej do ilościowego określania stresu oksydacyjnego: Test do ilościowego określania reaktywnych form tlenu w organoidach jelitowych za pomocą sond fluorogennych

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

Niniejsze badanie opisuje oparte na decelularyzacji metodologie wizualizacji i ilościowego określania wewnątrzmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) poprzez nienaruszoną objętość mięśni, a także ilościowe określanie metryk poszczególnych adipocytów składających się na IMAT.

Kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji

Lipofagia to selektywna forma autofagii, która polega na degradacji kropelek lipidów. Dysfunkcje w tym procesie są związane z rozwojem nowotworów. Jednak dokładne mechanizmy nie są jeszcze w pełni poznane. Protokół ten opisuje ilościowe podejścia do obrazowania, aby lepiej zrozumieć wzajemne zależności między autofagią, metabolizmem lipidów i progresją raka.

Badanie regulacji katabolizmu kropelek lipidów poprzez lipofagię

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Ten protokół umożliwia reprodukowalną wizualizację kropli lipidowych i dynamiki organelli podczas mitozy z wykorzystaniem zsynchronizowanych komórek hepatomu.

Metoda oparta na fluorescencji do wizualizowania dynamiki kropelek lipidowych i organelli podczas mitozy w komórkach hepatoma

Opisujemy małoinwazyjną i bezbolesną metodę pomiaru siły mięśni kończyn tylnych u psów oraz reakcji mięśni na powtarzające się skurcze ekscentryczne.

Test funkcji mięśni psów in vivo

Poznaj metodę ilościowego oznaczania kropelek lipidów w ludzkich organoidach jelitowych przy użyciu fluorescencyjnego barwnika specyficznego dla lipidów. Ta technika umożliwia przesiewowe badania leków modulujących metabolizm lipidów.

Test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka

Przeglądaj więcej filmów