Pożywka Preparat do hodowli mikroorganizmów w warunkach ściśle beztlenowych/beztlenowych
15 sierpnia 2019
Ponieważ organizmy beztlenowe nie są w stanie rosnąć po ekspozycji na tlen, niezbędne jest stosowanie technik hodowli beztlenowej. W tym miejscu demonstrujemy prostą i skuteczną metodę uprawy mieszanej kultury pochodzącej z biogazowni, od przygotowania pożywki do ilościowego oznaczania gazu i lotnych kwasów tłuszczowych.
W przeciwieństwie do organizmów tlenowych, mikroorganizmy ściśle beztlenowe wymagają braku tlenu. Ponieważ tlen jest wszechobecny w powietrzu, utrzymanie warunków beztlenowych podczas uprawy jest warunkiem wstępnym hodowli beztlenowej. Zastosowana technika stanowi prostą i niedrogą metodę zapewnienia warunków beztlenowych do hodowli mieszanej populacji drobnoustrojów w płynnej kulturze.
Technika ta może być również stosowana do uprawy czystych kultur. Jednak w przypadku mikroorganizmów wysoce wrażliwych na tlen ta procedura może nie mieć zastosowania. Zacznij od zważenia składników podłoża w odpowiedniej kolbie i rozpuszczenia ich w połowie objętości wody destylowanej.
Następnie dodaj mililitr wskaźnika REDOX, a następnie witaminy w roztworze pierwiastków śladowych. Dostosuj pH do wymagań organizmu i doprowadź końcową objętość do 1 litra wodą destylowaną. Kolor wskaźnika REDOX jest zależny od pH i może wymagać trochę czasu, aby się dostosować.
Napełnij 120-mililitrowe kolby surowicy 50 mililitrami pożywki, a następnie inkubuj je w łaźni wodnej o temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut, aby zmniejszyć rozpuszczalność tlenu w fazie ciekłej. Przepłukać przestrzeń nad głową azotem. Podczas pracy z azotem zadbaj o odpowiednią wentylację pomieszczenia.
Zamknij kolby septą z kauczuku butylowego i zamocuj aluminiowe nasadki. Następnie dodaj 0,1 mililitra środka redukującego do każdej kolby, aby jeszcze bardziej zmniejszyć potencjał REDOX. I sterylizować kolby w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.
Podczas stosowania tego protokołu należy używać autoklawu certyfikowanego do sterylizacji naczyń zamkniętych. W przeciwnym razie nadciśnienie wynikające ze wzrostu temperatury może spowodować eksplozję kolb surowicy. Aby przygotować inokulum z beztlenowej komory fermentacyjnej, dodaj 400 mililitrów wody destylowanej do kolby i doprowadź do wrzenia.
Schłodzić go do około 30 stopni Celsjusza, jednocześnie trwale spłukując przestrzeń nad głową azotem. Dodać około 100 gramów osadu pochodzącego z beztlenowej komory fermentacyjnej, upewniając się, że zapisano dokładną masę osadu w celu określenia rozcieńczenia. Zamień przestrzeń nad kolbą na azot i zamknij ją przegrodą z kauczuku butylowego.
Potrząsać kolbą przez 30 minut z prędkością 120 obr./min. Pozwól, aby większe cząstki osadu osiadły, a następnie użyj strzykawki i kaniuli, aby usunąć 5 mililitrów inokulum i wstrzyknąć je do wcześniej przygotowanej kolby surowicy. Inkubować zaszczepioną kolbę surowicy w temperaturze odpowiedniej do eksperymentu, upewniając się, że nadmierne ciśnienie spowodowane wzrostem temperatury nastąpiło około 15 do 30 minut po rozpoczęciu inkubacji.
Aby ocenić produkcję i skład biogazu w czasie inkubacji, należy zarejestrować aktualne ciśnienie atmosferyczne i przygotować manometr do oceny ciśnienia w kolbie. Wstrząśnij kolbami i usuń 1 mililitr gazu z przestrzeni powietrznej za pomocą strzykawki i kaniuli. Zmierz stężenie wodoru, tlenu, metanu i dwutlenku węgla za pomocą chromatografii gazowej.
Użyj 1 mililitra płynu z kolby, aby monitorować stężenie wszystkich wysokich kwasów tłuszczowych, zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, i opróżnij kolby pod ciśnieniem po przywróceniu ich do odpowiedniej temperatury. Protokół ten został wykorzystany do stworzenia miniaturowych bioreaktorów przeprowadzających fermentację beztlenową. Tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina, ekstrakt mięsny i kazeina zostały dodane w 3 różnych stężeniach, a produkcja metanu była monitorowana przez 28-dniowy okres inkubacji.
Metanogeny zostały uwidocznione poprzez wypromieniowanie koenzymu F420, który jest nośnikiem elektronów w metanogenezie i wykazuje niebiesko-zieloną fluorescencję z maksimum absorpcji na 420 nanometrach. Równolegle z analizą gazową, próbki analizowano pod kątem stężeń lotnych kwasów tłuszczowych i fenylowych w okresie inkubacji. Metody biologii molekularnej ukierunkowane na liczebność określonych mikroorganizmów i/lub skład społeczności drobnoustrojów, w pewnym momencie eksperymentu, mogą być stosowane przy użyciu opisanej procedury.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia prostą metodę hodowli mikroorganizmów beztlenowych pochodzących z biogazowni. Szczegółowo opisano przygotowanie pożywek oraz określanie ilości gazu i lotnych kwasów tłuszczowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biotechnologia
- Nauki o środowisku
Wstęp
- Organizmy anaerobowe nie mogą przeżyć w obecności tlenu.
- Utrzymanie warunków anoksycznych jest kluczowe dla ich hodowli.
- Metoda ta jest prosta i efektywna kosztowo w przypadku mieszanych populacji drobnoustrojów.
- Można ją również dostosować do kultur czystych.
Cel badania
- Zaprezentowanie skutecznego protokołu hodowli beztlenowej.
- Ilościowe oznaczenie produkcji biogazu oraz lotnych kwasów tłuszczowych.
- Wizualizacja metanogenów podczas procesu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywek beztlenowych z wskaźnikami REDOX.
- Inokulacja osadem z komór fermentacyjnych.
- Monitorowanie składu gazu za pomocą chromatografii gazowej.
- Analiza lotnych kwasów tłuszczowych podczas inkubacji.
Główne wyniki
- Osiągnięto pomywną hodowlę mikroorganizmów beztlenowych.
- Produkcję biogazu monitorowano przez okres 28 dni.
- Ilościowo określono stężenia metanu oraz lotnych kwasów tłuszczowych.
- Metanogeny zobrazowano z wykorzystaniem technik fluorescencyjnych.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w hodowli kultur beztlenowych.
- Pozwala ona na ocenę produkcji biogazu oraz składu społeczności mikrobowej.
- Niniejszy protokół może zostać dostosowany do różnych zastosowań w badaniach nad procesami beztlenowymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna hodowla mikroorganizmów ściśle beztlenowych jest niezbędna w badaniach i rozwoju (B+R) w sektorze biofarmaceutycznym&celujące w metabolizm drobnoustrojów, biologię syntetyczną oraz innowacje w bioprocesach. Niniejszy protokół umożliwia powtarzalne przygotowanie mediów beztlenowych i ilościowy monitoring produktów metabolicznych drobnoustrojów, co wspiera wczesne etapy odkrywania oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach opartych na organizmach beztlenowych. Skalowalność i standaryzacja tej metody ułatwiają jej integrację z przedsiębiorczymi systemami przesiewowymi oraz rurociągami badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków metabolicznych beztlenowych oraz funkcji drobnoustrojów w oparciu o postawione hipotezy.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez utrzymywanie ścisłych warunków anoksycznych dla wrażliwych celów.
- Ułatwia walidację funkcjonalną konsorcjów mikrobiologicznych istotnych dla rozwoju bioprocesów i terapii.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane i powtarzalne przygotowanie pożywek beztlenowych do dalszych analiz.
- Gwarantuje ilościowy pomiar wydzielanych gazów i metabolitów w celu wiarygodnej oceny związków.
- Wspiera skalowalność testów oraz możliwość ponownego wykorzystania platformy w różnych systemach beztlenowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie produktów mikrobiologicznych z biomarkerami translacyjnymi, takimi jak metan i lotne kwasy tłuszczowe.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w zastosowaniach opartych na organizmach beztlenowych.
- Zmniejsza ryzyko przy wdrażaniu kandydatów mikrobiologicznych poprzez dostarczenie wiarygodnych danych ilościowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół pozycjonuje hodowlę beztlenową jako fundamentalną kompetencję, począwszy od wczesnych etapów odkrywania, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po badania przedkliniczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie ścisłej kontroli poziomu redox i tlenu.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki analizy gazów i metabolitów, wspierając przygotowanie testów.
- Analityka: Integruje chromatografię gazową i HPLC w celu precyzyjnego pomiaru aktywności mikrobowej i produktów metabolicznych.
- Badania translacyjne: Zgadza produkty mikrobowe z przedklinicznymi punktami końcowymi istotnymi dla rozwoju bioprocesów i terapii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku, zestandaryzowany przepływ pracy dla hodowli beztlenowych w programach B&R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach systemów anaerobowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną, skalowalną i powtarzalną hodowlę oraz analizę anaerobową.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową dzięki dostarczaniu solidnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów opartych na organizmach anaerobowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrobiologii beztlenowej i techniki aseptycznej.
- Wymagany jest dostęp do kolb gazoszczelnych, autoklawów do naczyń zamkniętych oraz platform analitycznych (GC, HPLC).
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu utrzymania warunków anoksycznych i powtarzalności.
- Możliżna jest konieczność adaptacji w przypadku szczepów wysoce wrażliwych na tlen lub alternatywnych systemów modelowych.
- Niezbędne jest przestrzeganie protokołów bezpieczeństwa dotyczących obchodzenia się z azotem i gazami pod ciśnieniem.
