Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

Protokół ten pozwala na produkcję zmutagenizowanych haploidalnych kończyn, które można wykorzystać do genetycznych badań przesiewowych u aksolotla. W haploidach nawet mutageneza niskiego poziomu może powodować utratę fenotypów funkcji w komórkach. Ta technika szczepienia może być również stosowana do ratowania embrionalnych letalnych fenotypów.

Metoda ta może być stosowana do badania regeneracji u dowolnego gatunku, który jest podatny na zapłodnienie in vitro i szczepienie. Przed wykorzystaniem haploidalnych zarodków jako dawców zalecamy przećwiczenie i potwierdzenie powodzenia przeszczepów między zarodkami diploidalnymi dodatnimi i ujemnymi według GFP. W celu przygotowania żeńskiego dawcy gamet należy znieczulić dojrzałą płciowo białą lub białą samicę aksolotla RFP, aby służyła jako dawca gamet.

Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na symulację bólu, użyj strzykawki insulinowej o rozmiarze 30, aby wstrzyknąć 0,15 mililitra ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej do mięśni grzbietowych do kończyny tylnej. Wprowadzić strzykawkę pod kątem 45 stopni do linii środkowej, aby uniknąć kontaktu z rdzeniem kręgowym. Umieść wstrzyknięte zwierzę w świeżym 40% roztworze Holtfretera i przenieś aksolotla do lodówki o temperaturze od 8 do 12 stopni Celsjusza na 48 godzin.

Następnie przywróć samicę do temperatury pokojowej. Podczas gdy samica składa jaja, umieść w pełni znieczulonego samca w pozycji leżącej na wilgotnych ręcznikach papierowych pod mikroskopem preparacyjnym i umieść końcówkę pipety P1000 u podstawy kloaki dominującą ręką. Umieść drugi palec wskazujący i kciuk dwa do trzech centymetrów rostralnie do miednicy i delikatnie ściśnij zwierzę, przesuwając palce w kierunku tylnych nóg, aby wypłukać próbki moczu plemników, zbierając każdą próbkę do nowej probówki do mikrowirówki.

Następnie przenieś pięć mikrolitrów z każdej próbki na szalkę Petriego, aby sprawdzić jakość plemników za pomocą odwróconego mikroskopu. Po zliczeniu rozcieńczyć plemniki do stężenia osiem razy 10 do czwartej komórki na mililitr w 0,1X sterylnym MMR i przenieść 0,5 mikrolitra plemników na komórkę jajową na nową szalkę Petriego. Następnie za pomocą końcówki pipety rozprowadź zawiesinę na warstwę o grubości jednego milimetra i użyj plastikowego podnośnika, aby umieścić próbkę w odległości czterech centymetrów od bańek środka sieciującego o długości 254 nanometrów w celu napromieniowania z prędkością osiem razy 10 do piątych mikrodżuli na milimetr kwadratowy.

Po pobraniu zdrowej próbki nasienia umieść samicę w pozycji leżącej na stosie wilgotnych ręczników papierowych i użyj podobnego ruchu spłukiwania, aby wydobyć niezapłodnione jaja z samicy aksolotla. Następnie za pomocą mokrych kleszczy przenieś jaja na 10-centymetrową szalkę Petriego. W ciągu 15 minut od pobrania użyj pipety P10, aby dozować napromieniowane plemniki na niezapłodnione jaja, pokrywając każdą komórkę jajową 0,25 do 0,5 mikrolitra inaktywowanych plemników.

Po pozostawieniu jaj w temperaturze pokojowej na 30 minut, zalej je 0,1X MMR. Trzydzieści minut po uwodnieniu użyj ostrych kleszczy, aby usunąć jaja i umieść jaja w temperaturze 18 stopni Celsjusza w celu mikrowstrzyknięcia w ciągu siedmiu godzin. Aby wytworzyć haploidalno-diploidalną chimerę, umieść jednego zdrowego haploidalnego dawcę z jednym lub dwoma etapami dopasowanymi diploidalnymi zarodkami gospodarza GFP dodatnimi w korycie wstępnie schłodzonego naczynia operacyjnego zawierającego pożywkę chirurgiczną w temperaturze 10 stopni Celsjusza lub niższej temperaturze schładzania.

Użyj dwóch ultra cienkich, autoklawowanych kleszczyków z prostą końcówką, aby usunąć cały pączek kończyny i otaczające warstwy tkanki ektodermy i mezodermy, a następnie odłóż na bok tkankę gospodarza. Usunąć osłonkę tkankową o równoważnej wielkości od haploidalnego dawcy i umieścić haploidalną osłonkę tkankową dawcy w odpowiednim obszarze zarodka gospodarza. Zabezpiecz tkankę autoklawizowanym prostokątnym odłamkiem szkła ze zmiażdżonego szkła mikroskopowego i delikatnie wciśnij tkankę w ciało zarodka gospodarza.

Pozostaw kotwicę na miejscu na 60 do 75 minut, sprawdzając co 20 minut, aby upewnić się, że szkło się nie zsunęło przed użyciem kleszczy do odklejenia fragmentu szkła nakrywkowego. Przenieś przeszczepione zarodki do świeżego podłoża chirurgicznego, pozwalając im zagoić się w temperaturze od 8 do 12 stopni Celsjusza przez noc, a następnie umieść wszczepione zarodki pojedynczo na 12- lub 24-dołkowych płytkach. 38,7% oocytów przekształciło się w normalnie rozwinięte haploidalne zarodki.

Na etapie przeszczepu haploidalne zarodki wykazują zmniejszoną krzywiznę wzdłuż osi przednio-tylnej i niepełne zamknięcie czopu żółtkowego. Ponadto mikroskop fluorescencyjny może być użyty do potwierdzenia, że haploidalne zarodki są wolne od ekspresji GFP pochodzącej od ojca. Nieudane i zanieczyszczone przeszczepy wytwarzają różne fenotypy.

Gdy przeszczepy są czyste i normalnie rozwinięte, ekspresja GFP powinna być ograniczona przede wszystkim do splotu ramiennego, sieci neuronowej pochodzącej z rdzenia kręgowego gospodarza. Punktowa ekspresja GFP jest również obecna w pojedynczych komórkach, które wydają się być neuronami czuciowymi w komórkach gospodarza pochodzących z krwi, które migrują do rozwijającej się kończyny. Gdy stosuje się dawców RFP dodatnich, haploidalne kończyny przeszczepione wykazują uniwersalne wyrażenie RFP.

W trakcie rozwoju niemutagenne haploidalne kończyny są znacznie krótsze niż przeciwstawne diploidalne kończyny przednie u zwierząt chimerycznych. Niemutagenne haploidalne kończyny w pełni się regenerują, choć wykazują niewielkie opóźnienie w osiąganiu stadium wzrostu cyfrowego w porównaniu z diploidami. Pamiętaj, aby użyć sterylnej techniki i całkowicie usunąć i wymienić pełne warstwy tkanki mezodermy i ektodermy z embrionalnego gospodarza, aby uzyskać czysto przeszczepioną kończynę.

Zmutowane kończyny mogą być amputowane i oceniane pod kątem fenotypów regeneracji. Zmutowane allele można określić ilościowo za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W połączeniu z mutagenezą CRISPR-Cas9, nasza technika szczepienia pozwoliła nam przeprowadzić negatywną selekcję docelowych genów w regenerujących się haploidalnych kończynach.