Name: Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj technikę szczepienia embrionalnego do tworzenia chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami zmutowanymi przez Cas9. Ta metoda umożliwia badania genetyczne i mechanizmów regeneracji u płazów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Katherine Roberts za jej opiekę nad kolonią aksolotlów. Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 i 15-RMB-YALE-01) oraz Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka Eunice Kennedy Shriver (Indywidualne Stypendium Podoktorskie F32HD086942).

Procedury eksperymentalne użyte w tym protokole zostały zatwierdzone przez Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, 2017–10557) i były zgodne ze wszystkimi federalnymi politykami i wytycznymi regulującymi wykorzystanie kręgowców. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono na Ambystoma mexicanum (aksolotle) w obiektach Uniwersytetu Yale.
1. Generacja diploidalnych zarodków
<ol>
	<li>Uzyskaj diploidalne zarodki GFP+, które będą służyć jako gospodarze przeszczepu poprzez naturalne krycie przy użyciu jednego lub dwóch rodziców gfp24.</li>
	<li>Zbierz świeżo złożone jaja diploidalne i umieść je na metalowym sicie.</li>
	<li>Dokładnie opłucz jaja 40% roztworem Holtfretera (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mMMgSO4, pH do 7,4).</li>
	<li>Umieść jajka w świeżym 40% roztworze Holtfretera i przechowuj w temperaturze 12 °C. 
	UWAGA: Zarodki diploidalne należy zawsze uzyskiwać przed przejściem do pokolenia zarodków haploidalnych.</li>
</ol>
2. Pokolenie zarodków haploidalnych
<ol>
	<li>Przygotowanie dawcy gamet żeńskich
	<ol>
		<li>Na 48 godzin przed przeprowadzeniem aktywacji in vitro znieczulić dojrzałą płciowo samicę aksolotla białego lub białego/RFP przez zanurzenie w 1 g/l buforowanym przez HEPES MS-222 w 40% roztworze Holtfretera25.</li>
		<li>Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone po około 30 minutach zanurzenia, mocno ściskając jego ogon między kciukiem a palcem wskazującym. W pełni znieczulone zwierzęta nie będą fizycznie reagować na żadne szczypanie.</li>
		<li>Przygotować roztwór ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) zawierający 10 000 U/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki insulinowej 30 G wstrzyknij 0,15 CC HCG (1500 jednostek) w mięśnie grzbietowe do tylnej kończyny znieczulonej kobiety pod kątem 45° do linii środkowej, aby uniknąć kontaktu z rdzeniem kręgowym.</li>
		<li>Umieść samicę w świeżym 40% roztworze Holtfretera i umieść w lodówce o temperaturze 8−12 °C.</li>
		<li>Po 48 godzinach przywróć samicę do temperatury pokojowej. Umieść kilka kamieni lub plastikowych roślin w jej pojemniku jako powierzchnie do składania jaj. 
		UWAGA: Samice, którym wstrzyknięto HCG, często zdeponują puste pudełka po galaretkach na kilka godzin przed złożeniem jaj.</li>
		<li>Usuń kamienie lub plastikowe rośliny po tym, jak samica zacznie konsekwentnie składać jaja.</li>
		<li>Pozwól samicy siedzieć w pustym zbiorniku przez 30 minut do 1 godz. 
		UWAGA: Wstrzymanie materiałów, na których zwierzę może składać jaja, pozwoli na ściślejszą kontrolę pobierania oocytów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcja męskich gamet
	<ol>
		<li>Podczas gdy składanie jaj przez samicę jest wstrzymane, należy znieczulić dojrzałego płciowo samca aksolotla GFP+, aby służył jako dawca nasienia, jak w kroku 2.1.1.</li>
		<li>Połóż w pełni znieczulonego samca na plecach na wilgotnych ręcznikach papierowych pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
		<li>Jeśli eksperymentator jest praworęczny, prawą ręką umieść końcówkę pipety P1000 u podstawy kloaki.</li>
		<li>Umieść lewy palec wskazujący i kciuk lewej ręki w odległości 2−3 cm rostral od miednicy. Delikatnie ściśnij zwierzę, przesuwając palce w kierunku tylnych nóg, aby wypłukać próbki moczu nasienia.</li>
		<li>Zebrać każdą z nich, która została wypłukana z kloaki, do osobnej probówki do mikrowirówki. Powtórz ten proces, aby zebrać od 6 do 10 próbek.</li>
		<li>Odpipetować 5,0 μl z każdej próbki na szalkę Petriego, aby sprawdzić jakość nasienia za pomocą mikroskopu odwróconego. 
		UWAGA: Skoncentrowane próbki nasienia mają mlecznobiały kolor, zwykle wahają się od 5 do 20 μl i są zwykle pobierane po ekstrakcji kilku, większych objętości próbek moczu plemników. Plemniki gromadzą się na dnie probówek w próbkach o większej objętości, jeśli nie zostaną zakłócone. Skoncentrowane próbki zdrowych plemników są bardzo ruchliwe i tracą aktywność wraz ze spadkiem ich stężenia. Zdrowi mężczyźni mogą wyprodukować do 50 μl skoncentrowanych plemników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcja gamet żeńskich
	<ol>
		<li>Po uzyskaniu i potwierdzeniu zdrowej próbki nasienia znieczulij samicę aksolotla wstrzykniętą HCG, jak w kroku 2.1.1.</li>
		<li>Połóż w pełni znieczuloną samicę na wilgotnych ręcznikach papierowych na jej plecach.</li>
		<li>Usuń niezapłodnione jaja od samicy, wykonując ruch ręki podobny do tego w kroku 2.2.4.</li>
		<li>Zbierz jaja za pomocą mokrych kleszczy i przenieś je na 10-centymetrową szalkę Petriego. Potraktuj jaja napromieniowanym plemnikiem w ciągu 15 minut od pobrania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie gamet męskich i aktywacja in vitro
	<ol>
		<li>Użyj pipety P10 lub P20, aby pipetować plemniki w górę i w dół, rozbijając grudki w celu utworzenia jednorodnej zawiesiny.</li>
		<li>Przybliż procent ruchliwych plemników, umieszczając kroplę 0,5 μl nierozcieńczonej zawiesiny nasienia na pokrywie szalki Petriego lub szkiełku podstawowym i badając pod mikroskopem odwróconym.</li>
		<li>Dodać 9,5 μl 0,1x zmodyfikowanego roztworu Ringera Marca (MMR; Tabela materiałów) do tej próbki, aby uzyskać 20-krotne rozcieńczenie plemników. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.</li>
		<li>Za pomocą mikroskopu odwróconego policz plemniki w trzech kroplach 1,0 μl 20x rozcieńczonej podwielokrotności na pokrywie płytki Petriego lub hemocytometrze, aby oszacować stężenie plemników w nierozcieńczonej zawiesinie.</li>
		<li>Przygotuj plemniki do napromieniania, rozcieńczając podwielokrotność oryginalnej próbki nasienia do około 80 000 ruchliwych komórek/ml w sterylnym 0,1x MMR.</li>
		<li>Policz liczbę komórek jajowych uzyskanych w ciągu ostatnich 15 minut. Dodać 0,5 μl świeżo rozcieńczonego nasienia z kroku 2.4.5 na jajo na szalkę Petriego. Za pomocą końcówki pipety rozprowadzić zawiesinę na warstwę o grubości 1 mm.</li>
		<li>Za pomocą plastikowego podnośnika umieścić próbkę w odległości 4 cm od bańek urządzenia sieciującego o długości fali 254 nm. Genetycznie dezaktywuj plemniki poprzez napromieniowanie próbki 800 000 uJ/mm2.</li>
		<li>Za pomocą pipety P10 odpipetuj zawiesinę na niezapłodnione komórki jajowe, pokrywając każdą komórkę jajową 0,25-0,5 μl napromienionego plemnika. Pozostaw jajka w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
		<li>Po 30 minutach zalej jaja 0,1x MMR. Jaja należy natychmiast umieścić w inkubatorze o temperaturze 8−10 °C do wstrzykiwań następnego dnia lub w temperaturze 18 °C w przypadku wstrzyknięć w ciągu 7 godzin po aktywacji (hpa).</li>
		<li>Odjęte haploidy za pomocą ostrych kleszczy 30 minut po nawodnieniu. Jaja należy natychmiast umieścić w inkubatorze o temperaturze 8−10 °C do wstrzykiwań następnego dnia lub w temperaturze 18 °C do wstrzyknięć tego samego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mutageneza haploidalna i jej utrzymanie
<ol>
	<li>Mikroiniekcje CRISPR/Cas9
	<ol>
		<li>Projektuj sgRNA za pomocą skanowania CRISPRscan i syntetyzuj26,27.</li>
		<li>W przypadku mutagenezy multipleksowej należy przygotować zapas 5 sgRNA (10 ng/μL dla każdego sgRNA) i białka Cas9 (1 μg/μL). Przygotować 100-krotne rozcieńczenie tego zapasu (0,1 ng/μL na sgRNA, 10 ng/μL Cas9) do wstrzykiwań. W przypadku mutagenezy pojedynczego genu o wysokiej częstotliwości mutacji postępuj zgodnie z protokołem opisanym wcześniej28.</li>
		<li>Zarodki haploidalne należy wstrzykiwać w stadium jednokomórkowym 7 hpa, jeśli są przechowywane w temperaturze 18 °C, lub wstrzykiwać zarodki następnego dnia w stadium 2−8 komórek, jeśli są przechowywane w temperaturze 8−10 °C.</li>
		<li>Przenieś zarodki do 1,0x MMR z 20% polisarozą 400.</li>
		<li>Jeśli jest to pojedyncza komórka, wstrzyknąć każdemu zarodkowi kroplę o pojemności 5 nl roztworu do wstrzykiwań (około 1/4 promienia komórki jajowej) zawierającego całkowitą masę 0,5 pg/sgRNA i 50 pg białka Cas9. Jeśli jest wielokomórkowy, rozprowadź tę masę, wstrzykując mniejsze objętości do wielu komórek.</li>
		<li>Pozostawić zarodki do zagojenia się w polisacharozie 400 przez minimum 4 godziny, a maksymalnie 18 godzin w temperaturze 18 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomieszczenia dla zarodków haploidalnych
	<ol>
		<li>Przenieś zarodki do 0,1x MMR z antybiotykiem-antybiotykiem.</li>
		<li>Umieść każdy zarodek w osobnym dołku na 24-dołkowej płytce, ponieważ niektóre z nich umrą lub rozwiną się nieprawidłowo. Utrzymuj w temperaturze 16−18 °C. W razie potrzeby można zastosować niższe temperatury w celu przedłużenia rozwoju.</li>
		<li>Zastąp pożywkę świeżą 0,1x MMR antybiotyko-antybiotykiem co drugi dzień.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie zarodków diploidalnego gospodarza
<ol>
	<li>Utrzymywać zarodki w otoczce galaretki w temperaturze od 12 do 16 °C aż do osiągnięcia stadium 22–26.</li>
	<li>Zebrać zarodki gotowe do szczepienia, umieścić je na sicie (rozmiar oczek 4 mm) i delikatnie spłukać 40% roztworem Holtfretera.</li>
	<li>Przenieś zarodki do wysterylizowanego filtrem 0,1x MMR zawierającego 1,5% wybielacza na okres do 2 minut. Całkowicie zanurz zarodki w roztworze wybielacza i delikatnie je obracaj, aby upewnić się, że powłoka galaretki ma pełny kontakt z roztworem wybielacza, aby zabić drobnoustroje obecne na zarodkach.</li>
	<li>Po 2 minutach rozcieńczyć roztwór wybielacza zawierający zarodki równą objętością wysterylizowanego przez filtr 0,1x MMR.</li>
	<li>Delikatnie przelej zarodki na odkażone wybielaczem sito (rozmiar oczek 4 mm) i przepłucz zarodki pięciokrotnie wysterylizowanym filtrem 0,1x MMR.</li>
	<li>Umieść zarodki na sterylnych 10 cm szalkach Petriego z 0,1x MMR z antybiotykami do dejelizji (penicylina 100 jednostek/ml, streptomycyna 100 μg/μL, 0,25 μg/ml, gentamycyna 25 μg/ml).</li>
	<li>Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym usunąć galaretki i błony witelinowe z zarodków GFP+ za pomocą ostrych kleszczyków (wymiary końcówki 0,05 x 0,01 mm2).</li>
	<li>Przenieś zarodki GFP+ na nową szalkę Petriego. Zminimalizuj ilość płynu przenoszonego z szalki Petriego, na której zostały one poddane deżelacji.</li>
	<li>Przepłukać zarodki gospodarza GFP+ sterylnym 0,1x MMR antybiotykami cztery do sześciu razy w celu usunięcia zanieczyszczeń.</li>
	<li>Umieść czyste zarodki w temperaturze 4 °C na noc przed szczepieniem. 
	UWAGA: Chłodzenie zarodków sprawia, że są one bardziej sztywne i czyste, możliwe jest oddzielenie mezodermy od endodermy.</li>
</ol>
5. Pokolenie chimery haploidalno-diploidalnej
<ol>
	<li>Przygotowanie naczynia chirurgicznego i podłoża
	<ol>
		<li>Przygotuj sterylne chirurgiczne naczynia operacyjne, wlewając autoklawowaną 2% agarozę w 0,1x MMR do sterylnych, łatwych do uchwycenia 35 mm szalek Petriego. Napełnij szalki Petriego do połowy agarozą.</li>
		<li>Po ostygnięciu agarozy użyj sterylnego skalpela, aby wyciąć w agarozie pochyłe koryto o długości 25 mm, aby utrzymać zarodki na miejscu.</li>
		<li>Napełnij naczynie sterylnym środkiem chirurgicznym (0,1x MMR z antymykoplazmą 2,5 μg/ml, amfoterycyną B 0,25 μg/ml i cyprofloksacyną 10,0 μg/ml) i wstaw do lodówki w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabieg szczepienia zarodków
	<ol>
		<li>Umieść jednego zdrowego haploidalnego dawcę z jednym lub dwoma dopasowanymi do etapu diploidalnymi zarodkami gospodarza GFP+ w korycie wstępnie schłodzonego naczynia operacyjnego zawierającego pożywkę chirurgiczną (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3). 
		UWAGA: Jeśli to możliwe, wykonaj procedurę na etapie chłodzenia (10 °C lub mniej).</li>
		<li>Użyj dwóch ultracienkich, autoklawizowanych kleszczyków (prosta końcówka, wymiary końcówki 0,05 x 0,02 mm2), aby usunąć warstwy ektodermy i mezodermy z gospodarza z pączkiem kończyny w pobliżu środka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4). 
		UWAGA: Prostokątny obszar przeszczepu tkanki obejmuje pączek kończyny i rozciąga się od dziewiątego somitu do tylnej połowy wybrzuszenia skrzelowego, około 2 mm, wzdłuż przedniej tylnej osi. Wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej szczepiony obszar rozciąga się na około 1,5 mm, w tym somity tuż poza brzuszną krawędź wybrzuszenia skrzelowego. Przeszczepiony obszar obejmuje całą mezodermę płytki bocznej i boczne połówki somitów, bez naruszania leżącej pod spodem endodermy. Zobacz Rysunek 4 i towarzyszący mu film, aby uzyskać szczegółowe informacje.</li>
		<li>Odłóż na bok tkankę gospodarza i usuń arkusz tkanki o równoważnej wielkości od haploidalnego dawcy przy użyciu tych samych metod.</li>
		<li>Umieścić arkusz tkanki haploidalnego dawcy na odpowiednim obszarze zarodka dawcy.</li>
		<li>Zabezpiecz tkankę, przykrywając ją autoklawowanym, prostokątnym odłamkiem szkła ze zmiażdżonego szkła mikroskopowego i delikatnie wciskając go w ciało zarodka gospodarza.</li>
		<li>Odwróć haploidalny zarodek dawcy na drugą stronę, aby pobrać zarodek kończyny dla drugiego zarodka gospodarza. Powtórz kroki od 5.2.2 do 5.2.5.</li>
		<li>Ostrożnie usuń pozostały nadmiar tkanek gospodarza i zarodek dawcy z naczynia.</li>
		<li>Pozostaw przeszczepy z kotwami do odłamków szkła na miejscu przez 60-75 minut, sprawdzając co 20 minut, aby upewnić się, że szkło się nie zsunęło.</li>
		<li>Po całkowitym przyleganiu przeszczepów tkanek użyj kleszczy, aby powoli odkleić kotwy odłamków szkła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konserwacja Chimery
	<ol>
		<li>Przenieś wszczepione zarodki na świeże podłoże chirurgiczne i utrzymuj je w temperaturze 8−12 °C przez noc do zagojenia. Indywidualnie umieszczaj wszczepione zarodki na płytkach 12- lub 24-dołkowych.</li>
		<li>Po 36−48 h przenieść wszczepione zarodki do sterylnego 0,1x antybiotyk-antybiotyk-antybiotyk MMR. Silne antybiotyki zawarte w pożywce chirurgicznej powodują toksyczność w przeszczepionych zarodkach po 3 dniach.</li>
		<li>Zastąp pożywkę świeżym 0,1x MMR i antybiotykami co 2-3 dni.</li>
		<li>Utrzymuj wszczepione zarodki w temperaturze 18 °C, aż będą w stanie się odżywiać28.</li>
		<li>Po 1 do 2 miesiącach rozwoju i pielęgnacji, haploidalne kończyny można ocenić pod kątem czystości przeszczepu za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego. 
		UWAGA: Obecność w kończynach tkanki GFP pochodzącej od gospodarza lub niepochodzącej od krwi jest wskaźnikiem nieczystego przeszczepu i często wiąże się z nieprawidłowym rozwojem kończyn. Zwierzęta te powinny zostać wyłączone z dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li>
<li>Maden, M., Goodwin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+developing+limb+buds+of+the+axolotl+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).</li>
<li>McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+and+bone+cells+do+not+participate+in+skeletal+regeneration+in+Ambystoma+mexicanum+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs.</a> Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).</li>
<li>Brun, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+analysis+of+the+eyeless+mutant+in+the+mexican+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).</li>
<li>Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+hematopoiesis+in+a+fully+regenerative+vertebrate%3A+the+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl.</a> Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).</li>
<li>de Both, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Axolotl+Heads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Axolotl Heads.</a> Science. 162 (3852), 460-461 (1968).</li>
<li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+Unexpected+Results+of+the+Heteroplastic+Transplantation+of+Limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).</li>
<li>Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Pattern+regulation+in+epimorphic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">V Pattern regulation in epimorphic fields.</a> Science. 193 (4257), 969-981 (2013).</li>
<li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li>
<li>Knapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptional+profiling+of+the+axolotl+limb+identifies+a+tripartite+regeneration-specific+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program.</a> PloS One. 8 (5), e61352(2013).</li>
<li>Campbell, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+the+regeneration+epithelium+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration.</a> Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).</li>
<li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li>
<li>Gardiner, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+during+the+first+28+days+of+axolotl+limb+regeneration+I%3A+Experimental+design+and+global+analysis+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression.</a> Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).</li>
<li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).</li>
<li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Chromosome-Scale+Assembly+of+the+Enormous+%2832+Gb%29+Axolotl+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome.</a> bioRxiv. , 373548(2018).</li>
<li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).</li>
<li>Fankhauser, B. Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Changes+in+Chromosome+Number+on+Amphibian+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Quarterly+Review+of+Biology%22%5BJournal%5D)">The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development.</a> The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).</li>
<li>Malacinski, G. M., Brothers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Genes+in+the+Mexican+Axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutant Genes in the Mexican Axolotl.</a> Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).</li>
<li>Armstrong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gynogenesis+in+the+mexican+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gynogenesis in the mexican axolotl.</a> Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).</li>
<li>Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+genome-edited+alleles+reveals+high+fidelity+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration.</a> eLife. 6, 1-15 (2017).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+-+scale+CRISPR+-+Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Screens+in+Human+Cells+Using+the+CRISPR-Cas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Yin, Z., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Meets+Single%3A+The+Application+of%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR%2FCas9+in+Haploid+Embryonic+Stem+Cells.+Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Simple Meets Single: The Application of.</a> CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).</li>
<li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+husbandry%2C+breeding%2C+metamorphosis%2C+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li>
<li>Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+anesthetic+effects+of+MS222+in+the+adult+Mexican+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Medicine%3A+Research+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).</li>
<li>Montague, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Mutagenesis+by+Cas9+Protein-Mediated+Oligonucleotide+Insertion+and+Large-Scale+Assessment+of+Single-Guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
<li>Kumar, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+A+%22Salamanders+in+Regeneration+Research%3A+Methods+and+Protocols%22">Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Survival+of+Haploids+of+the+Mexican+Axolotl%2C+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).</li>
<li>Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+stages+of+development+of+the+axolotl%2C+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum.</a> Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).</li>
<li>Hertwig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitrage+Zum+Determinations-+Und+Regenerationsproblem+Mittels+Der+Transplantation+Haploidkerniger+Zellen%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f.+Entwicklungsmechanik%22%5BJournal%5D)">Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen.</a> Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).</li>
<li>Fei, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W naszym protokole jest kilka krytycznych kroków do generowania chimer haploidalno-diploidalnych, które technik operacyjny powinien wziąć pod uwagę, aby uzyskać spójne wyniki szczepienia.
Najbardziej prawdopodobną przyczyną niepowodzenia wytwarzania haploidalnych są złe warunki aktywacji in vitro. Do aktywacji komórek jajowych należy użyć odpowiednich ilości ruchliwych plemników. Aby przedłużyć ruchliwość, próbki nasienia należy zawsze utrzymywać w temperaturze 4 °C. Przed nałożeniem jakiejkol...

Historycznie rzecz biorąc, szczepienie tkanek embrionalnych u było ważną techniką do badania podstawowych mechanizmów biologii rozwoju i regeneracji. Aksolotl, gatunek salamandry, posiada imponującą zdolność do regeneracji tkanek i złożonych struktur, takich jak kończyny i narządy, po urazie lub amputacji. Równie imponujące jest to, że mogą one otrzymywać, bez odrzucenia, przeszczepy tkanek od innych osobników w stadium embrionalnym, młodocianym i dorosłym1,2,3. Regiony zarodków, które wytwarzają całe struktury, takie jak kończyny, ogony, oczy i głowy, oraz bardziej specyficzne tkanki, takie jak neuroektoderma i somit, mogą być szczepione między zarodkami w celu wytworzenia chimerycznych zwierząt1,2,4,5,6. Przez prawie sto lat badania takich chimerycznych zwierząt dostarczały kluczowych informacji na temat regeneracji, różnicowania tkanek, kontroli wielkości i tworzenia wzorów1,7,8.
W ciągu ostatniej dekady, liczne badania transkrypcyjne regenerujących się tkanek dostarczyły wglądu w programy genetyczne leżące u podstaw regeneracji salamandry9,10,11,12,13. Badania te uzupełniły rozszerzającą się listę genów kandydujących, które do tej pory w dużej mierze nie zostały scharakteryzowane w kontekście regeneracji. Ukierunkowane techniki mutagenezy, takie jak CRISPR/Cas, pozwalają obecnie na badanie takich genów, a takie podejścia genetyczne są znacznie ułatwione dzięki niedawnemu sekwencjonowaniu i składaniu dużego genomu aksolotla 14,15,16.
Staraliśmy się opracować techniki, które łączyłyby klasyczną biologię rozwojową z nową technologią genetyczną w celu zbadania mechanizmów regeneracji. Metody generowania haploidalnych zarodków aksolotli i innych salamander są znane od dziesięcioleci17. Chociaż techniki te od dawna są uważane za zalety salamander jako organizmów modelowych genetycznie18, niewiele późniejszych badań genetycznych obejmowało haploidalne zwierzęta. Używamy aktywacji in vitro w aksolotlu do produkcji haploidalnych zarodków, które służą jako dawcy tkanek do szczepienia19. Wykorzystując embriony zawierające fluorescencyjne markery genetyczne, opracowaliśmy niezawodne metody generowania kończyn pochodzących prawie w całości z tkanek dawcy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Łącząc te dwie techniki, ominęliśmy późną śmiertelność embrionalną związaną z haploidią, co pozwoliło na produkcję w pełni rozwiniętych, przeszczepionych haploidalnych kończyn (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, <silna klasa = "xfig" > Figura 1B' i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2).
Przeprowadzając mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas w haploidalnych zarodkach przed szczepieniem w celu stworzenia chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami, możemy badać funkcję genów szczególnie w kontekście rozwoju i regeneracji kończyn. Pozwala to na uratowanie kończyn przed potencjalnie śmiertelnymi dla zarodka zmutowanymi fenotypami. Podczas gdy mikroiniekcja CRISPR/Cas może generować zwierzęta, które są wysoce zmutowane, takie zwierzęta są zazwyczaj wysoce mozaikowe, z pewnym stopniem zatrzymywania alleli typu dzikiego i różnymi odrębnymi mutacjami w docelowych miejscach14,20. Mutageneza oparta na CRISPR w komórkach haploidalnych zwiększa penetrację mutacji powodujących utratę funkcji pojedynczego allelu, ponieważ nie można ich zamaskować przez zatrzymane allele typu dzikiego. Z tego powodu badania przesiewowe oparte na CRISPR w haploidalnych liniach komórkowych są coraz częściej wykorzystywane do badania genetycznych podstaw wielu procesów komórkowych21,22,23. Łącząc śledzenie linii oparte na CRISPR z naszymi protokołami szczepienia haploidalnych pąków kończyn, opisane tutaj podejście może służyć jako platforma dla haploidalnych badań genetycznych u żywych zwierząt20.

<table><tbody><tr><td>#55 Dumont Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11295-1</td><td>Używaj wyłącznie materiału Dumostar (można sterylizować w autoklawie)</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td>20 ml</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloksacyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400 (polisaroza 400)</td><td>bioworld</td><td>40600032-3</td><td>Ficoll 400</td></tr><tr><td>Gentamyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1914-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator grzewczo-chłodzący</td><td>RevSci</td><td>RS-IF-233</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmówkowa</td><td>Merk</td><td></td><td>Chorulon</td></tr><tr><td>Megascript T7 Zestaw do transkrypcji</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1334</td><td>40 reakcji</td></tr><tr><td>Etap chłodzenia Miroscope</td><td>Brook Industries</td><td>Niestandardowe</td><td></td></tr><tr><td>niestandardowe białko NLS Cas9</td><td>PNAbio</td><td>CP01-200</td><td>4 fiolki po 50 i mikro; g białko każdy</td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpt-1</td><td>Poziom zabiegu</td></tr><tr><td>Receptury</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0x Zmodyfikowany roztwór Ringera Marca (MMR)</td><td></td><td></td><td>0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7,8), ph 7,4</td></tr><tr><td>40% roztwór</td><td></td><td></td> Holtfretera <td>20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH do 7,4</td></tr></tbody></table>

pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

Rosnący zestaw technik genetycznych i zasobów umożliwia badaczom badanie molekularnego pochodzenia zdolności niektórych gatunków salamander, takich jak aksolotle, do regeneracji całych kończyn w wieku dorosłym. W tym miejscu przedstawiamy techniki stosowane do generowania chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami przednimi zmutagowanymi Cas9, które można wykorzystać do badania funkcji genów i wierności regeneracji kończyn. Łączymy kilka technik embriologicznych i genetycznych, w tym wytwarzanie haploidalne poprzez aktywację in vitro, mutagenezę CRISPR/Cas9 i przeszczepianie tkanek w jednym protokole, aby stworzyć unikalny system haploidalnych badań genetycznych w modelowym organizmie regeneracyjnym. Strategia ta zmniejsza liczbę zwierząt, przestrzeń i czas potrzebny do funkcjonalnej analizy genów w regeneracji kończyn. Pozwala to również na badanie specyficznych dla regeneracji funkcji genów, które mogą być wymagane do innych istotnych procesów, takich jak organogeneza, morfogeneza tkanek i inne niezbędne procesy embrionalne. Opisana tu metoda jest unikalną platformą do przeprowadzania haploidalnych badań genetycznych w systemie modelowym kręgowców.

Rozwijające się zarodki haploidalne można odróżnić od zarodków diploidalnych po fenotypie „zespołu haploidalnego”29. W stadium szczepienia (graft-stage) zarodki haploidalne wykazują zmniejszone zakrzywienie wzdłuż osi przednio-tylnej oraz niepełne otoczenie czopa żółtkowego (Rysunek 3A). Do upewnienia się, że zarodki haploidalne nie wykazują pochodzącej od ojca ekspresji GFP, można wykorzystać mikroskop fluorescencyjny...

Tym celem tego protokołu jest produkcja chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami przednimi pochodzącymi z tkanki dawcy zmutowanej, Cas9, przy użyciu technik przeszczepu tkanek embrionalnych.

Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Protokół ten pozwala na produkcję zmutagenizowanych haploidalnych kończyn, które można wykorzystać do genetycznych badań przesiewowych u aksolotla. W haploidach nawet mutageneza niskiego poziomu może powodować utratę fenotypów funkcji w komórkach. Ta technika szczepienia może być również stosowana do ratowania embrionalnych letalnych fenotypów.Metoda ta może być stosowana do badania regeneracji u dowolnego gatunku, który jest podatny na zapłodnienie in vitro i szczepienie. Przed wykorzystaniem haploidalnych zarodków jako dawców zalecamy przećwiczenie i potwierdzenie powodzenia przeszczepów między zarodkami diploidalnymi dodatnimi i ujemnymi według GFP. W celu przygotowania żeńskiego dawcy gamet należy znieczulić dojrzałą płciowo białą lub białą samicę aksolotla RFP, aby służyła jako dawca gamet.Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na symulację bólu, użyj strzykawki insulinowej o rozmiarze 30, aby wstrzyknąć 0,15 mililitra ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej do mięśni grzbietowych do kończyny tylnej. Wprowadzić strzykawkę pod kątem 45 stopni do linii środkowej, aby uniknąć kontaktu z rdzeniem kręgowym. Umieść wstrzyknięte zwierzę w świeżym 40% roztworze Holtfretera i przenieś aksolotla do lodówki o temperaturze od 8 do 12 stopni Celsjusza na 48 godzin.Następnie przywróć samicę do temperatury pokojowej. Podczas gdy samica składa jaja, umieść w pełni znieczulonego samca w pozycji leżącej na wilgotnych ręcznikach papierowych pod mikroskopem preparacyjnym i umieść końcówkę pipety P1000 u podstawy kloaki dominującą ręką. Umieść drugi palec wskazujący i kciuk dwa do trzech centymetrów rostralnie do miednicy i delikatnie ściśnij zwierzę, przesuwając palce w kierunku tylnych nóg, aby wypłukać próbki moczu plemników, zbierając każdą próbkę do nowej probówki do mikrowirówki.Następnie przenieś pięć mikrolitrów z każdej próbki na szalkę Petriego, aby sprawdzić jakość plemników za pomocą odwróconego mikroskopu. Po zliczeniu rozcieńczyć plemniki do stężenia osiem razy 10 do czwartej komórki na mililitr w 0,1X sterylnym MMR i przenieść 0,5 mikrolitra plemników na komórkę jajową na nową szalkę Petriego. Następnie za pomocą końcówki pipety rozprowadź zawiesinę na warstwę o grubości jednego milimetra i użyj plastikowego podnośnika, aby umieścić próbkę w odległości czterech centymetrów od bańek środka sieciującego o długości 254 nanometrów w celu napromieniowania z prędkością osiem razy 10 do piątych mikrodżuli na milimetr kwadratowy.Po pobraniu zdrowej próbki nasienia umieść samicę w pozycji leżącej na stosie wilgotnych ręczników papierowych i użyj podobnego ruchu spłukiwania, aby wydobyć niezapłodnione jaja z samicy aksolotla. Następnie za pomocą mokrych kleszczy przenieś jaja na 10-centymetrową szalkę Petriego. W ciągu 15 minut od pobrania użyj pipety P10, aby dozować napromieniowane plemniki na niezapłodnione jaja, pokrywając każdą komórkę jajową 0,25 do 0,5 mikrolitra inaktywowanych plemników.Po pozostawieniu jaj w temperaturze pokojowej na 30 minut, zalej je 0,1X MMR. Trzydzieści minut po uwodnieniu użyj ostrych kleszczy, aby usunąć jaja i umieść jaja w temperaturze 18 stopni Celsjusza w celu mikrowstrzyknięcia w ciągu siedmiu godzin. Aby wytworzyć haploidalno-diploidalną chimerę, umieść jednego zdrowego haploidalnego dawcę z jednym lub dwoma etapami dopasowanymi diploidalnymi zarodkami gospodarza GFP dodatnimi w korycie wstępnie schłodzonego naczynia operacyjnego zawierającego pożywkę chirurgiczną w temperaturze 10 stopni Celsjusza lub niższej temperaturze schładzania.Użyj dwóch ultra cienkich, autoklawowanych kleszczyków z prostą końcówką, aby usunąć cały pączek kończyny i otaczające warstwy tkanki ektodermy i mezodermy, a następnie odłóż na bok tkankę gospodarza. Usunąć osłonkę tkankową o równoważnej wielkości od haploidalnego dawcy i umieścić haploidalną osłonkę tkankową dawcy w odpowiednim obszarze zarodka gospodarza. Zabezpiecz tkankę autoklawizowanym prostokątnym odłamkiem szkła ze zmiażdżonego szkła mikroskopowego i delikatnie wciśnij tkankę w ciało zarodka gospodarza.Pozostaw kotwicę na miejscu na 60 do 75 minut, sprawdzając co 20 minut, aby upewnić się, że szkło się nie zsunęło przed użyciem kleszczy do odklejenia fragmentu szkła nakrywkowego. Przenieś przeszczepione zarodki do świeżego podłoża chirurgicznego, pozwalając im zagoić się w temperaturze od 8 do 12 stopni Celsjusza przez noc, a następnie umieść wszczepione zarodki pojedynczo na 12- lub 24-dołkowych płytkach. 38,7% oocytów przekształciło się w normalnie rozwinięte haploidalne zarodki.Na etapie przeszczepu haploidalne zarodki wykazują zmniejszoną krzywiznę wzdłuż osi przednio-tylnej i niepełne zamknięcie czopu żółtkowego. Ponadto mikroskop fluorescencyjny może być użyty do potwierdzenia, że haploidalne zarodki są wolne od ekspresji GFP pochodzącej od ojca. Nieudane i zanieczyszczone przeszczepy wytwarzają różne fenotypy.Gdy przeszczepy są czyste i normalnie rozwinięte, ekspresja GFP powinna być ograniczona przede wszystkim do splotu ramiennego, sieci neuronowej pochodzącej z rdzenia kręgowego gospodarza. Punktowa ekspresja GFP jest również obecna w pojedynczych komórkach, które wydają się być neuronami czuciowymi w komórkach gospodarza pochodzących z krwi, które migrują do rozwijającej się kończyny. Gdy stosuje się dawców RFP dodatnich, haploidalne kończyny przeszczepione wykazują uniwersalne wyrażenie RFP.W trakcie rozwoju niemutagenne haploidalne kończyny są znacznie krótsze niż przeciwstawne diploidalne kończyny przednie u zwierząt chimerycznych. Niemutagenne haploidalne kończyny w pełni się regenerują, choć wykazują niewielkie opóźnienie w osiąganiu stadium wzrostu cyfrowego w porównaniu z diploidami. Pamiętaj, aby użyć sterylnej techniki i całkowicie usunąć i wymienić pełne warstwy tkanki mezodermy i ektodermy z embrionalnego gospodarza, aby uzyskać czysto przeszczepioną kończynę.Zmutowane kończyny mogą być amputowane i oceniane pod kątem fenotypów regeneracji. Zmutowane allele można określić ilościowo za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W połączeniu z mutagenezą CRISPR-Cas9, nasza technika szczepienia pozwoliła nam przeprowadzić negatywną selekcję docelowych genów w regenerujących się haploidalnych kończynach.

generation-chimeric-axolotls-with-mutant-haploid-limbs-through

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Transplantacja komórek u rybek zebrafish umożliwia połączenie genetyki i embriologii w celu generowania chimer specyficznych dla danej tkanki. Niniejsze wideo demonstruje transplantacje komórek na etapie gastruli, które pozwoliły naszemu laboratorium zbadać role populacji astroglialnych oraz specyficznych sygnałów prowadzących podczas formowania się spoiw w przedmózgowiu.

Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Ze względu na twardy chorion i delikatne embriony, manipulacja zarodkami medaki jest bardziej skomplikowana niż w przypadku danio prążkowanego. W tym filmie zaprezentowano krok po kroku procedury manipulacji embrionami medaki, w tym usuwanie chorionu (dechorionację), unieruchamianie w agarozie do obrazowania oraz transplantację komórek w celu wytworzenia chimer. Procedury te są niezbędne do wykorzystania medaki i danio prążkowanego w laboratorium, aby w pełni skorzystać z ich komplementarnych...

Dechorionizacja zarodków ryby medaka i transplantacja komórek w celu generowania chimer

Poprzez szczepienie koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub specyficznymi inhibitorami szlaków sygnałowych do rozwijających się zarodków, możliwe jest bezpośrednie testowanie ich efektów in vivo. W tym protokole kulki są szczepione w zawiązku kończyny w celu określenia wpływu tych cząsteczek na ekspresję genów i transdukcję sygnału.

Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Geny niezbędne do przetrwania stanowią techniczne przeszkody w tworzeniu linii mutantów. Skakanie pozwala uniknąć śmiertelności, łącząc edycję genomu z przeszczepem pierwotnych komórek rozrodczych w celu stworzenia zwierząt typu dzikiego z mutacjami linii zarodkowej. Leapfrogging pozwala również na efektywne generowanie homozygotycznych mutantów zerowych w pokoleniu F1. Tutaj pokazany jest etap przeszczepu.

Przeszczep pierwotnych komórek rozrodczych w celu przeskoku opartego na CRISPR/Cas9 w Xenopus

Tutaj prezentujemy protokoły echokardiografii do dwuwymiarowego i trójwymiarowego obrazowania bijącego serca salamandry aksolotlowej (Ambystoma mexicanum), modelowego gatunku w regeneracji serca. Metody te pozwalają na podłużną ocenę funkcji serca w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Echokardiografia 2D i 3D u aksolotla (Ambystoma Mexicanum)

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia ograniczonego czasowo i przestrzennie nokautowania genów w rdzeniu kręgowym aksolotla poprzez wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego rdzenia kręgowego, a następnie elektroporację.

Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9

Ten artykuł opisuje, jak przeprowadzić metodę chirurgiczną hamującą powstawanie naskórka ran podczas regeneracji kończyn aksolotla poprzez natychmiastowe zszycie skóry o pełnej grubości na płaszczyźnie amputacji. Metoda ta pozwala badać funkcjonalne role naskórka rany we wczesnych etapach regeneracji kończyn.

Hamowanie tworzenia się naskórka rany poprzez pełną operację płata skóry podczas regeneracji kończyn aksolotla

Rekombinowane kończyny to potężny model eksperymentalny, który pozwala badać proces różnicowania komórek i generowania wzorców pod wpływem sygnałów embrionalnych. Protokół ten przedstawia szczegółową metodę generowania rekombinowanych kończyn z komórkami mezodermalnymi kończyn kurczaka, które można dostosować do innych typów komórek uzyskanych z różnych organizmów.

Test rekombinowanych kończyn kurczaka w celu zrozumienia morfogenezy, wzorca i wczesnych etapów różnicowania komórek

Przedstawiono protokół operacji osteotomii kości udowej z użyciem wewnętrznego mocowania płytki u dojrzałych aksolotlów. Zabieg może być wykorzystany do wykonywania badań porównawczych nad regeneracją kończyn i gojeniem złamań u wodnych.

Stabilizacja osteotomii kości udowej z mocowaniem płytki w Ambystoma mexicanum

W tym protokole pokazujemy, jak przygotować tkankę aksolotla do mikroskopii sił atomowych (AFM) i wykonać pomiary wgłębień w nienaruszonej i regenerującej się chrząstce kończyny.

Pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki w nienaruszonych i regenerujących się kończynach aksolotla

Poznaj technikę szczepienia embrionalnego do tworzenia chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami zmutowanymi przez Cas9. Ta metoda umożliwia badania genetyczne i mechanizmów regeneracji u płazów.

Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

Przeglądaj więcej filmów