Name: Technologia komórek kapsułkowanych do dostarczania leków biologicznych do oka myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj technologię mikrokapsułkowania komórek w alginacie do długoterminowego dostarczania leków biologicznych do oka myszy. Ta metoda umożliwia ukierunkowaną terapię przy minimalizacji reakcji immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było częściowo wspierane przez granty przyznane B. R. przez National Institutes of Health (R01EY019320), Departament Spraw Weteranów (RX000444 i BX003050) oraz South Carolina SmartState Endowment.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny pod numerem protokołu ID 00399.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Wygeneruj linię komórkową ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (ARPE-19) stabilnie wyrażającą wybrany gen zgodnie z opublikowanymi protokołami14,15.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wymieniaj podłoże co 2-3 dni.</li>
	<li>Pasaż komórek po osiągnięciu 70%–80% konfluencji przy użyciu standardowych procedur hodowli tkankowej.</li>
</ol>
2. Hermetyzacja komórek
<ol>
	<li>Wymieszaj alginian sodu z wodą dejonizowaną (DI), aby uzyskać końcowe stężenie 2% w/v i oczyść przez filtrację za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 μm.</li>
	<li>Przygotować komórki do zmieszania z roztworem alginianu poprzez trypsynizację, odwirowanie i przemycie ich 10 mM buforowanym roztworem soli HEPES (pH = 7,4). Za pomocą hemocytometru policz komórki i dostosuj końcowe stężenie komórek do 1 x 106 w roztworze alginianu. 
	nuta: Proces hermetyzacji powinien odbywać się wewnątrz wysterylizowanego kaptura.</li>
	<li>Załaduj ~300 μl porcji mieszaniny alginianów i komórek do strzykawki o pojemności 3 ml i podłącz ją do pompy strzykawkowej. Roztwór zostanie przepompowany przez igłę o sile 30 g z końcówką do sterylnej kąpieli żelującej umieszczonej w sterylnej zlewce o pojemności 50 ml poniżej końcówki strzykawki na głębokości 7 mm, aby uzyskać odległość natryskiwania igły do kąpieli.</li>
	<li>Kąpiel żelująca zawiera objętość 40 ml 10 mM buforowanego roztworu soli fizjologicznej HEPES zawierającego 100 mM chlorku wapnia (CaCl2) i 0,5% w/v poli-L-ornityny (PLO). PLO jest wtórną powłoką polimerową, którą można pominąć lub zmienić w zależności od potrzeb badacza.</li>
	<li>Dostosuj napięcie i natężenie przepływu i utrzymuj je na stałym poziomie podczas procesu enkapsulacji przy natężeniu przepływu 60 mm/h i napięciu początkowym 6,0 kV, aby uzyskać mikrokapsułki o wielkości ~150 μm.</li>
	<li>Podłącz zacisk drutu anodowego (czerwony) końcówki igły generatora wysokiego napięcia do igły i podłącz zacisk uziemiający () do drutu miedzianego, który jest do połowy zanurzony w kąpieli żelującej. Jedna partia mieszaniny alginian + komórki (1 ml) zajmuje około 30 minut do przygotowania zamkniętych komórek (około 25 000 mikrokapsułek).</li>
	<li>Uformowane mikrokapsułki zawierające komórki przemyć roztworem płuczącym (10 mM buforowanej soli fizjologicznej HEPES zawierającej 1,5 mM CaCl2, pH = 7,4) dwukrotnie. Nie używaj PBS do prania.</li>
	<li>Inkubować zamknięte komórki z 10% pożywką DMEM uzupełnioną FBS w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	nuta: Instrumenty do procesu enkapsulacji są przedstawione na Rysunek 1.</li>
</ol>
3. Potwierdzenie, że enkapsulacja nie wpływa na żywotność komórek
<ol>
	<li>Po inkubacji zamkniętych komórek przez 24 godziny w pożywce, należy przygotować małą próbkę 500 μL (~30 mikrokapsułek) do barwienia.</li>
	<li>Przemyć mikrokapsułki 2x roztworem płuczącym (10 mM buforowanej soli fizjologicznej HEPES zawierającej 1,5 mM CaCl2) i zabarwić je w celu zapewnienia żywotności żywej śmierci za pomocą zestawu do oznaczania żywych/martwych.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę barwiącą kalceiny AM (acetoksymetylu) i homodimeru etydyny-1 w końcowych stężeniach odpowiednio 2 μM i 4 μM.</li>
	<li>Dodać 2 ml mieszaniny barwiącej do zamkniętych komórek i inkubować przez 30–45 minut w ciemności w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przy ostrożnym zasysaniu odessać roztwór barwiący i przemyć mikrokapsułki 2x roztworem myjącym. Użyj systemu mikroskopu fluorescencyjnego, aby obserwować i obrazować zamknięte komórki. 
	nuta: Dokumentacja enkapsulacji jest przedstawiona w Rysunek 2.</li>
</ol>
4. Potwierdzenie, że kapsułki mają odpowiedni rozmiar do dostarczania i dostarczania leku biologicznego.
<ol>
	<li>Iniekcje doszklistkowe do oka myszy są zwykle wykonywane za pomocą igły o końcówce o wadze 27 g (średnica wewnętrzna 210 μm) przymocowanej do strzykawki Hamiltona o pojemności 2,5 μl.</li>
	<li>Wytwarzaj kapsułki o wielkości od 100 do 200 μm, rozcieńczaj je w podłożu bez surowicy i ostrożnie wciągaj do strzykawki Hamiltona. PBS nie jest odpowiednim nośnikiem, ponieważ kapsułki alginianowe rozpuszczają się w PBS.</li>
	<li>Powoli wysunąć krople zawierające kapsułki o wielkości 1 μl na szkiełko mikroskopowe i określić ich integralność za pomocą pionowego mikroskopu jasnego pola.</li>
	<li>Dostosuj rozmiar kapsułki (patrz krok 2.3), dostosowując odpowiednio voltage i natężenie przepływu. Mniejsze mikrokapsułki są produkowane w sposób nieliniowy poprzez zwiększanie napięcia i nieznaczne zmniejszanie natężenia przepływu8. W naszych rękach najbardziej odpowiednie okazały się kapsułki o średnicy 150 μm. Regulacja wielkości kapsułki jest również uzależniona od utrzymania stałego stężenia alginianów przy jednoczesnej zmianie pozostałych parametrów.</li>
	<li>Utrzymuj oddzielny zestaw komórek w kapsułkach o odpowiedniej wielkości w podłożu bez surowicy, aby określić ilość wydzieliny pożądanego leku biologicznego. Użyć czułych testów ELISA lub western blot, aby określić stężenie leków biologicznych w supernatancie.</li>
	<li>Określić wymaganą ilość kapsułek, które należy wstrzyknąć, w oparciu o znaną farmakokinetykę/farmakodynamikę (PK/PD) środka terapeutycznego. W naszych rękach 10 kapsułek na oko myszy okazało się najbardziej skuteczne.</li>
</ol>
5. Podawanie kapsułek do ciała szklistego myszy
<ol>
	<li>Wykonaj iniekcje doszklistkowe za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Zobacz Rysunek 3 przedstawia przygotowanie chirurgiczne i materiały użyte podczas zabiegu. Szczegółowy protokół dotyczący iniekcji doszklistkowych można znaleźć gdzie indziej16.</li>
	<li>Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ksylazyny i ketaminy (20 mg/kg i 80 mg/kg) lub innych preferowanych środków znieczulających zatwierdzonych przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania danej instytucji. Upewnij się, że znieczulenie jest na odpowiedniej głębokości za pomocą szczypania palców u stóp17.</li>
	<li>Rozszerz źrenice myszy za pomocą fenylefryny HCL (2,5%) i siarczanu atropiny (1%), aby zapewnić dobrą widoczność komory ciała szklistego i nałóż nawilżający żel pod oczy na oczy, aby utrzymać ich nawilżenie podczas zabiegu.</li>
	<li>Nakłuć twardówkę na rąbku igłą 26 G jako otworem prowadzącym, upewniając się, że 1) igła jest ustawiona pod kątem 45° z okiem i stołem oraz 2) ścięta końcówka jest skierowana do góry, aby uniknąć przebicia soczewki.</li>
	<li>Ostrożnie wstrzyknąć kapsułki za pomocą igły o sile 27 G z końcówką przymocowanej do strzykawki Hamiltona pod kątem 45° pod kontrolą wzrokową, upewniając się, że nie dotyka się igły soczewki. Uszkodzenie soczewki doprowadzi do powstania zaćmy. Kapsułki powinny być widoczne w ciele szklistym za pomocą mikroskopu preparacyjnego (<silna klasa="xfig">Ryc. 4A).</li>
	<li>Po wycofaniu igły należy leczyć miejsce wstrzyknięcia maściami z antybiotykiem, neomycyną i siarczanami polimyksyny B oraz maścią z antybiotykiem okulistycznym deksametazonu.</li>
	<li>Nałóż goniotaire hypromeloza demulujący roztwór okulistyczny (2,5%) na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w okresie rekonwalescencji.</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej utrzymywanej w temperaturze 37°C i monitoruj, aż do całkowitego wybudzenia.</li>
	<li>Udane wstrzyknięcie zamkniętych w kapsułkach komórek ARPE-19 powinno ujawnić obecność nienaruszonych kapsułek w komorze ciała szklistego myszy z niewielkimi ilościami zanieczyszczeń podczas obrazowania oka za pomocą optycznej tomografii koherentnej lub innych metod (<silna klasa = "xfig">Figura 4B).</li>
	<li>Oko myszy, w które wstrzyknięto implant, po kilku dniach rekonwalescencji po operacji, jest teraz gotowe do wdrożenia paradygmatu eksperymentalnego. 
	nuta: Konfiguracja chirurgiczna i dokumentacja kapsułek w oku są przedstawione odpowiednio na Rysunek 3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 4.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+systems%3A+entering+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drug delivery systems: entering the mainstream.</a> Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).</li>
<li>Tonnesen, H. H., Karlsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+in+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Development+and+Industrial+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Alginate in drug delivery systems.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).</li>
<li>Vilos, C., Velasquez, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+strategies+based+on+polymeric+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic strategies based on polymeric microparticles.</a> Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).</li>
<li>Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+polymers+for+the+microencapsulation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Natural polymers for the microencapsulation of cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 11 (100), 20140817(2014).</li>
<li>Gasper, D. P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasper%2C+DPR+%22Novel+strategy+to+produce+a+drug+delivery+system+for+skin+regeneration.+Uma+nova+estrat%C3%A9gia+para+produzir+um+dispositivo+para+entrega+de+f%C3%A1rmacos+que+ser%C3%A1+usado+na+regenera%C3%A7%C3%A3o+da+pele%22">Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele</a>. , (2012).</li>
<li>Huang, S., Fu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+materials-based+cell+and+drug+delivery+systems+in+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration.</a> Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).</li>
<li>Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+characterization+of+pDNA-loaded+alginate+microspheres+for+oral+administration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).</li>
<li>Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polymeric+microcapsules+containing+a+low+molecular+weight+peptide+for+controlled+release%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).</li>
<li>Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+encapsulation+of+water-soluble+protein+with+polylactide.+I.+Effects+of+formulations+and+process+on+morphology+and+particle+size%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microencapsulation%22%5BJournal%5D)">Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size.</a> Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).</li>
<li>Gryshkov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+high+voltage+alginate+encapsulation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells.</a> Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).</li>
<li>Thanos, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+secretion+of+ciliary+neurotrophic+factor+to+the+vitreous%2C+using+the+encapsulated+cell+therapy-based+NT-501+intraocular+device%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device.</a> Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).</li>
<li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-year+intraocular+delivery+of+ciliary+neurotrophic+factor+by+encapsulated+cell+technology+implants+in+patients+with+chronic+retinal+degenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).</li>
<li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term%2C+sustained+intraocular+delivery+of+a+VEGF+antagonist+using+encapsulated+cell+technology+implant+for+the+treatment+of+choroidal+neovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455(2012).</li>
<li>Annamalai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+Cell+Technology-Based+Delivery+of+a+Complement+Inhibitor+Reduces+Choroidal+Neovascularization+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Visual+Science+Technology%22%5BJournal%5D)">Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model.</a> Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3(2018).</li>
<li>Alge, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Pigment+Epithelium+Is+Protected+Against+Apoptosis+by+%CE%B1B-Crystallin%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).</li>
<li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), 313(2007).</li>
<li>Jove Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Holz, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+Safety+of+Lampalizumab+for+Geographic+Atrophy+Due+to+Age-Related+Macular+Degeneration%3A+Chroma+and+Spectri+Phase+3+Randomized+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).</li>
<li>Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+inhibition+as+a+therapeutic+strategy+in+retinal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).</li>
<li>Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Non+Membrane-Targeted+Human+Soluble+CD59+Attenuates+Choroidal+Neovascularization+in+a+Model+of+Age+Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration.</a> PLoS ONE. 6 (4), e19078(2011).</li>
<li>Vincent, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+combination+PDGF+%2F+VEGF-antagonist+ECT+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290(2013).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+treatment+of+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).</li>
<li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+for+macular+telangiectasia+type+2%3A+results+from+a+phase+1+safety+trial%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial.</a> American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).</li>
<li>Birch, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+trial+of+ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Ta technika enkapsulacji komórek jest stosunkowo szybka i łatwa do wykonania; Należy jednak pamiętać o pewnych kwestiach, aby uzyskać dokładne wyniki końcowe. Komórki powinny być utrzymywane w hodowli na szalce Petriego przed enkapsulacją i utrzymywane w odpowiednim zbiegu. Enkapsulacja powinna być wykonywana w odpowiednim okapie wentylacyjnym z regulowanym przepływem powietrza, jeśli to możliwe. Zbyt silny prąd powietrza może wpływać na tworzenie się kapsułek, zwłaszcza w długotrwałych eksperymentach. Sterylne naczynia ...

Terapie oparte na komórkach reprezentują rewolucyjne techniki biologiczne, które są szeroko stosowane w medycynie. Od niedawna z powodzeniem stosuje się je w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, chorób oczu i nowotworów. Terapie komórkowe obejmują szeroki zakres dziedzin, od wymiany komórek po dostarczanie leków, a ten protokół koncentruje się na tych ostatnich. Biodegradowalne mikrokapsułki alginianowe (MC) wykazały skuteczność jako system dostarczania i stają się szeroko stosowane w dziedzinie biomedycyny. Alginian został zastosowany w mikrokapsułkowaniu ze względu na prosty proces żelowania, biodegradowalność, doskonałą biokompatybilność i stabilność w warunkach in vivo1,2,3,4.
Metoda elektronatryskowa, jako technika mikrokapsułkowania, została z powodzeniem wykorzystana do enkapsulacji peptydów i białek za pomocą alginianu (polimeru bazowego) i poli-l-ornityny (polimeru powlekającego wtórnie). Oba polimery są naturalnie występujące i używane ze względu na ich biokompatybilność5,6,7. Jednak głównym wyzwaniem w terapiach komórkowych jest supresja układu odpornościowego gospodarza w celu uniknięcia skutków ubocznych spowodowanych lekami immunosupresyjnymi. Przepuszczalność mikrokapsułek alginianowych jest uważana za odpowiednią właściwość do enkapsulacji komórek, która umożliwia dyfuzję składników odżywczych, odpadów i czynników terapeutycznych do i z komórek, jednocześnie maskując je przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza8,9,10.
W oku, zamknięte komórki były używane w badaniach klinicznych do ciągłego dostarczania leków biologicznych (tj. czynników wzrostu11,12 i antagonistów czynnika wzrostu13) do leczenia barwnikowego zwyrodnienia siatkówki lub zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. Inne cele, takie jak inhibitory dopełniacza14, są obecnie badane w warunkach przedklinicznych.

<table><tbody><tr><td>3 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1" igła</td><td>SAI Technologia infuzji</td><td>B30-100</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu alginowego, z brązowych alg</td><td>Sigma</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan atropiny Roztwór oftalmoliczny (1%)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-215-15</td><td>do rozszerzania źrenicy</td></tr><tr><td>BD 1 mL Strzykawka 26 G x 3/8 (0,45 mm x 10 mm)</td><td>Becton, Dickinson i Firma</td><td>DG518105 500029609 REF 309625</td><td>do generowania otworu prowadzącego</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia, bezwodny, granulowany</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal Tears</td><td>Alcon</td><td>NDC 0078-0429-47</td><td>do smarowania oczu podczas znieczulenia</td></tr><tr><td>Goniotaire: Hypromeloza (2,5%) Oftalmoliczny roztwór łagodzący (sterylny)</td><td>Altaire Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 59390-182-13</td><td>do smarowania oczu podczas znieczulenia</td></tr><tr><td>Hamilton Końcówka igły/strzykawki: 27 G, mała piasta RN NDL, długość tulei (12 mm), końcówka 3, 6/PK</td><td>Hamilton</td><td>7803-01</td><td>do podawania kapsułek do ciała szklistego</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton: 2,5 i mikro; L, Model 62 RN SYR, NDL sprzedawany oddzielnie</td><td>Hamilton</td><td>7632-01</td><td>do doszklistkowego dostarczania kapsułek</td></tr><tr><td>Bufor HEPES, 1 M</td><td>Bioodczynniki Fisher</td><td>BP299100</td><td></td></tr><tr><td>Generator wysokiego napięcia</td><td>ESD Technologia EMC</td><td>ES813-D20</td><td></td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Zestaw żywotności/cytotoksyczności</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-ornityny, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12111</td><td></td></tr><tr><td>Siarczany neomycyny i polimyksyny B oraz deksametazon Maść oftalmolowa</td><td>SANDOZ</td><td>NDC 61314-631-36</td><td>Antybiotyk zapobiegający infekcji po wstrzyknięciu do ciała szklistego</td></tr><tr><td>Chlorowodorek fenolefryny Roztwór oftalmolowy (2,5%)</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-201-15</td><td>do rozszerzania źrenic</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka filtry, 0,2 &mu; m</td><td>VWR</td><td>28143-312</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>GRASEBY</td><td>MS16A</td><td></td></tr></tbody></table>

technologia komórek kapsułkowanych do dostarczania leków biologicznych do oka myszy

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Wiele obecnie opracowywanych metod leczenia chorób tylnego bieguna oka to leki biologiczne. Leki te muszą być często podawane, zazwyczaj w postaci zastrzyków do ciała szklistego. Kapsułkowane komórki wykazujące ekspresję wybranego leku biologicznego stają się narzędziem do lokalnej produkcji i uwalniania białek (np. poprzez długoterminowe dostarczanie leków). Ponadto systemy enkapsulacji wykorzystują przepuszczalne materiały, które umożliwiają dyfuzję składników odżywczych, odpadów i czynników terapeutycznych do i z komórek. Dzieje się tak podczas maskowania komórek przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza, unikając konieczności tłumienia układu odpornościowego gospodarza. Protokół ten opisuje zastosowanie alginianu jako polimeru w mikrokapsułkowaniu w połączeniu z metodą elektronatryskiwania jako techniką mikrokapsułkowania. Komórki ARPE-19, spontanicznie powstająca ludzka linia komórkowa RPE, była wykorzystywana w długoterminowych eksperymentach terapii komórkowej ze względu na swoją funkcjonalność w ciągu całego życia i jest tutaj używana do kapsułkowania i dostarczania kapsułek do oczu myszy. Manuskrypt podsumowuje etapy mikrokapsułkowania komórek, kontroli jakości i dostarczania do oka.

Komórki ARPE-19 to spontanicznie unieśmiertelniona ludzka linia komórkowa nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), w przypadku której wykazano podatność na enkapsulację oraz długoterminowe przeżycie po implantacji kapsułek do oka. Narzędzia do enkapsulacji w alginianie przedstawiono na Rysunku 1. W niniejszym badaniu wykazano, że po enkapsulacji w alginianie obecność komórek w kapsułkach alginianowych została potwierdzona za pomocą obrazowania w polu jasnym (Rysunek 2A</st...

Prezentowany tutaj jest protokół użycia alginianu jako polimeru w mikrokapsułkowaniu unieśmiertelnionych komórek w celu długoterminowego dostarczania leków biologicznych do oczu gryzoni.

Technologia komórek kapsułkowanych do dostarczania leków biologicznych do oka myszy

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Ta technika jest niezawodnym sposobem dostarczania dowolnych treści, takich jak leki, białka lub komórki, do określonych miejsc w tkankach lub zwierzętach. Możesz śledzić dostawę i dostroić wydanie zawartości, aby dopasować ją do pożądanego eksperymentu. Może być stosowany w leczeniu wielu chorób, od gojenia się ran po choroby oczu i serca.Główną zaletą tej metody jest możliwość dostarczania komórek terapeutycznych za pomocą mikrokapsułek alginianowych do miejsc docelowych bez wywoływania jakichkolwiek reakcji immunologicznych oraz utrzymanie trwałego dostarczania świeżo wydzielanych środków terapeutycznych przez dłuższy okres czasu. Zacznij od hodowli komórek nabłonka siatkówki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Przejście komórek po osiągnięciu od 70 do 80% konfluencji przy użyciu standardowych procedur hodowli tkankowej.Aby otoczyć komórki, zmieszaj alginian sodu z wodą dejonizowaną, aby uzyskać końcowe stężenie 2% wagowo do objętości i oczyść mieszaninę przez filtrację za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego o średnicy 0,2 mikrometra. Trypsynizować, odwirować i przemyć komórki 10-milimolowym roztworem soli fizjologicznej buforowanym HEPES. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i dostosować końcowe stężenie komórek do miliona na jeden mililitr roztworu alginianu.Załadować 300 mikrolitrów podwielokrotności mieszaniny alginianów i komórek do trzymililitrowej strzykawki i podłączyć ją do pompy strzykawkowej. Przygotować kąpiel żelującą zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i umieścić ją w sterylnej zlewce o pojemności 50 mililitrów poniżej końcówki strzykawki w odległości od siedmiomilimetrowej igły do kąpieli. Dostosuj napięcie do ośmiu kilowoltów, a natężenie przepływu do 30 milimetrów na godzinę, aby wyprodukować mikrokapsułki o wielkości około 150 mikrometrów.Podłącz zacisk uziemiający do drutu miedzianego, który jest do połowy zanurzony w kąpieli żelującej i podłącz zacisk czerwonego przewodu anodowego do igły. Przygotowanie zamkniętych w kapsułkach komórek z każdej mililitrowej partii mieszaniny alginianów i komórek zajmuje około 30 minut. Po uformowaniu przemyj mikrokapsułki dwukrotnie roztworem myjącym i inkubuj je z 10% pożywką DMEM uzupełnioną FBS w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.Po 24-godzinnej inkubacji przygotuj 500-litrową próbkę mikrokapsułek do barwienia, myjąc je dwukrotnie w roztworze myjącym. Użyj zestawu do oznaczania ŻYWYCH/MARTWYCH, aby zabarwić je pod kątem żywotności. Aby upewnić się, że mikrokapsułki są odpowiedniej wielkości, należy je rozcieńczyć w pożywce niezawierającej surowicy.Ostrożnie odessać je strzykawką Hamiltona o pojemności 2,5 mikrolitra. Powoli wyrzuć jedną mikrolitrową kroplę na szkiełko mikroskopowe i określ integralność mikrokapsułek za pomocą pionowego mikroskopu Brightfield. W odpowiednio znieczulonej myszy nałóż lubrykant do oczu, aby utrzymać wilgotność oka i użyj igły strzykawkowej o rozmiarze 26 x 3/8 cala, aby ustalić początkowe nakłucie oka tuż poniżej rąbka.Upewnij się, że zbliżasz się do oka od strony nosa pod kątem 45 stopni, trzymając ściętą końcówkę do góry, aby uniknąć perforacji soczewki. Następnie upewnij się, że cała końcówka igły jest włożona do oka w celu wygenerowania otworu prowadzącego, ale należy uważać, aby nie przemieścić się zbyt daleko i nie przebić siatkówki skroniowej. Po zakończeniu powoli wycofaj igłę.W mikromanipulatorze umieść strzykawkę Hamiltona o rozmiarze 27 i grubości 2,5 mikrolitra z końcówką, która została wypełniona roztworem kapsułki i wyrównaj igłę z początkowym otworem prowadzącym. Trzymaj głowę zwierzęcia w stabilnej pozycji i celowo manewruj igłą w kierunku oka. Aby zapewnić prawidłowe położenie igły w ciele szklistym, należy wprowadzić strzykawkę do momentu, aż końcówka igły będzie mogła być uwidoczniona za soczewką.Następnie należy powoli wstrzykiwać roztwór kapsułki w ciągu 25 do 30 sekund. A po zakończeniu stopniowo chować strzykawkę z końcówką, aby zminimalizować obrażenia oka. W razie potrzeby dostosuj rozmiar kapsułki, dostosowując napięcie i natężenie przepływu zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Enkapsulacja komórek w alginianie została potwierdzona za pomocą obrazowania Brightfield, a test LIVE/DEAD wykazał, że 90% komórek było zdolnych do życia po enkapsulacji. Długoterminową żywotność komórek zapewniono poprzez rozpuszczenie kapsułek w roztworze cytrynianu sodu i ponowne posiewanie. Iniekcja doszklistkowa została wykonana pod kontrolą wzrokową, co pozwoliło na wizualizację kapsułek w ciele szklistym.Próbując wykonać tę procedurę, nie należy używać PBS do żadnych etapów mycia, ponieważ PBS rozpuszcza utworzone mikrokapsułki alginianowe. Po jego opracowaniu nasze laboratorium jest wykorzystywane jako system dostarczania do leczenia form niewydolności serca i nadciśnienia. Technika ta jest uważana za obiecujące narzędzie do przyszłego leczenia różnych chorób sercowo-naczyniowych i neurologicznych.

encapsulated-cell-technology-for-delivery-biologics-to-mouse

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę propagacji ludzkich guzów siatkówczaka u myszy. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do oczu myszy z niedoborem odporności. Guzy wtórne zostały pomyślnie wywołane z wykorzystaniem zarówno komórek pobranych bezpośrednio z ludzkich guzów, jak i hodowanych tumorsfer.

Ustanowienie i propagacja guzów retinoblastomy ludzkiej u myszy z niedoborem odporności

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Ten film opisuje metodę generowania modelu myszy, który naśladuje bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej - infekcję wewnątrzgałkową wynikającą z inwazji bakterii do jamy ciała szklistego oka - poprzez doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do oka. Ten mysi model pomaga badać mechanizm choroby i oceniać terapie dla niej.

Mysi model bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej: metoda generowania bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej poprzez doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do oka myszy

Ten film demonstruje technikę dostarczania przeciwciał do mózgu myszy za pomocą wspomagania konwekcji (CED). Czaszka znieczulonej myszy jest odsłaniana, a w obszarze docelowym tworzony jest otwór na zadziory w celu dostarczenia przeciwciał. W miejscu docelowym wprowadza się cewnik krokowy zawierający przeciwciała, a za pomocą pompy infuzyjnej wytwarzany jest gradient ciśnienia w celu dostarczania przeciwciał w kontrolowanej szybkości.

Konwekcyjne dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy.  Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Opisujemy tutaj metodę iniekcji doszklistkowej i późniejszej oceny ilościowej bakterii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Protokół ten można rozszerzyć o pomiar odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz ekspresji genów bakteryjnych i gospodarza.

Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Poznaj technologię mikrokapsułkowania komórek w alginacie do długoterminowego dostarczania leków biologicznych do oka myszy. Ta metoda umożliwia ukierunkowaną terapię przy minimalizacji reakcji immunologicznych.

Technologia komórek kapsułkowanych do dostarczania leków biologicznych do oka myszy

Przeglądaj więcej filmów