Name: Badania przesiewowe i identyfikacja małych peptydów ukierunkowanych na receptor czynnika wzrostu fibroblastów2 przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metodę przesiewowania małych peptydów wiążących FGFR2 przy użyciu biblioteki fagowej. Technika ta umożliwia identyfikację modulatorów receptora z wysokim powinowactwem i ocenę ich wpływu na proliferację komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Nauki i Technologii w Kantonie (nr 2016201604030039).

1. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>LB (bulion lizogeniczny): Rozpuść 1 g tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego i 0,5 g NaCl w 100 ml H2O. Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Bulion tetracyklinowy: Przygotować 20 mg/ml w 1:1 etanolu:H2O. Przechowywać w temperaturze -20 °C i przed użyciem przemieszać.</li>
	<li>Roztwór IPTG/X-gal: Zmieszać 0,5 g IPTG (izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd) i 0,4 g X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktozyd) w 10 ml DMF (dimetyloformamidu). Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C przez rok w ciemności.</li>
	<li>LB + Płytki tetracyklinowe (Tet): Rozpuść 1 g bakto-tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl i 1,5 g agaru w 100 mlH2O. Autoklaw i schłodzić do < 70 °C. Dodać 100 μl bulionu tetracyklinowego i wlać płytki. Przechowywać talerze w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Płytki LB + IPTG/X-gal: Rozpuść 1 g baktoonu-tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl i 1,5 g agaru w 100 ml H2O. Autoklaw i ostudź do < 70°C. Dodać 100 μl roztworu IPTG/X-gal i wlać płytki. Przechowywać talerze w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Bufor glicyna-HCI (0,2 M): Rozpuścić 1,5014 g glicyny i 100 mg BSA (albuminy surowicy bydlęcej) w 100 mlH2Oi dostosować pH do 2,2 za pomocą HCl. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Bufor Tris-HCl (1 M): Rozpuścić 12,11 g Tris (tris(hydroksymetylo)aminometanu) w 100 mlH2Oi dostosować pH do 9,1 za pomocą HCl. Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Bufor powlekający (0,1 M): Rozpuścić 1,68 gNaHCO3 w 200 mlH2Oi dostosować pH do 8,6 za pomocą NaOH. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Bufor blokujący: Przygotować 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) z 5 mg/ml BSA. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>TBS: Przygotuj 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) ze 150 mM NaCl. Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>0,05%, 0,1% lub 0,5% TBST: Przygotuj TBS z 0,05%, 0,1% lub 0,5% (v/v) Tween-20. Przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>PEG/NaCl: Przygotować 20% (w/v) glikolu polietylenowego–8000 z 2,5 M NaCl. Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Roztwór TE: Wymieszaj 1 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0) i 2 ml 50 mM EDTA (pH 8,0) i dostosuj objętość do 100 ml za pomocą H2O. Autoklaw i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Bufor jodkowy: Rozpuścić 30 g NaI w 50 ml TE, pH 8,0. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Agar górny: Rozpuść 1 g tryptonu, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g NaCl i 0,7 g agaryny w 100 ml H2O. Autoklaw i dozuj do 15 ml podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze pokojowej do użycia.</li>
</ol>
2. Pierwsza runda biopanowania: badanie przesiewowe klonów fagów, które wiążą się z zewnątrzkomórkową domeną FGFR2
UWAGA: Używaj odpornych na aerozole końcówek do pipet i noś rękawiczki do wszystkich protokołów, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteriofagami środowiskowymi.
<ol>
	<li>Przygotować 10 μg/ml roztworu FGFR2 (czystość > 97%; patrz tabela materiałów) w buforze powlekającym. Dodaj 1 ml przygotowanego roztworu do naczynia o powierzchni 35cm2 i kilkakrotnie mieszaj, aż powierzchnia będzie całkowicie mokra. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem. 
	UWAGA: Aby uniknąć wyboru wabików docelowych wiążących, docelowe białko musi być wysoce oczyszczone.</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml pożywki LB + Tet Escherichia coli (E. coli) ER2738 przez 5–10 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Amplifikowane komórki ER2738 zostaną użyte do miareczkowania w kroku 3.3.</li>
	<li>Odlej roztwór powlekający z naczynia (nadmiar roztworu należy usunąć) i dodaj roztwór blokujący. Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór blokujący i szybko przemyj 6 razy TBST (TBS + 0,05% (v/v] Tween-20). Unikaj wysuszenia naczynia.</li>
	<li>Rozpuść oryginalną bibliotekę fagów w 1 ml TBST [końcowe stężenie 1011 jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU)], dodaj do powlekanego naczynia i delikatnie kołysz przez 2 godziny na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzuć supernatant i umyj naczynie 10 razy TBST (TBS + 0,05% (v/v) Tween-20), jak wykonano w kroku 2.4. 
	UWAGA: Niezwiązane fagi muszą być dokładnie usunięte przez energiczne mycie.</li>
	<li>Eluować związany, dodając 1 ml 0,2 M buforu glicynowo-HCl (pH 2,2) do naczynia i delikatnie kołysząc przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść eluat do wysterylizowanej probówki do mikrofuge i zneutralizować ją 100 μl 1 M Tris-HCl, pH 9.1. 
	UWAGA: W kroku 2.6 usuń niezwiązany tak bardzo, jak to możliwe, energicznie myjąc naczynie 10 razy. To kluczowy krok. Wymyty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez tydzień. Najlepiej jednak jak najszybciej przejść do następnego kroku.</li>
</ol>
3. Wyznaczanie miana eluowanych fagów
<ol>
	<li>Przed użyciem podgrzej płytki LB + IPTG/X-gal przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować 100 μl 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń (tj. 101, 102, 103 i 104) eluatu z kroku 2.8 w LB. Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy użyć końcówek z wkładami filtrującymi.</li>
	<li>Niech kultura z kroku 2.2 osiągnie środkową fazę logarytmiczną (OD600 ≈ 0,5). Dozować 200 μl kultury do wysterylizowanych probówek do mikrofuge, po jednej na każde rozcieńczenie eluatu.</li>
	<li>Aby zainicjować infekcję, dodać 10 μl każdego rozcieńczenia z kroku 3.2 do pojedynczych probówek zawierających kulturę E. coli ER2738 z kroku 3.3. Szybko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Pokryć 90 μl mieszaniny z kroku 3.4 na płytki LB + IPTG/X-gal patyczkami do powlekania.</li>
	<li>Opcjonalnie rozpuść górny agar w kuchence mikrofalowej, rozlej 3 ml do sterylnych probówek hodowlanych, po jednej na każde rozcieńczenie eluatu, i utrzymuj probówki w temperaturze 45 °C. Przenieść mieszaninę z kroku 3.4 do probówek hodowlanych zawierających górny agar o temperaturze 45 °C. Szybko wymieszaj i natychmiast wlej kulturę na wstępnie podgrzaną płytkę LB/IPTG/X-gal. Delikatnie przechyl i obróć płytkę, aby równomiernie rozprowadzić górny agar.</li>
	<li>Po 5 minutach odwrócić płytki i inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Policz tabliczki na tabliczkach z około 100 tabliczkami. Pomnóż każdą liczbę przez współczynnik rozcieńczenia dla tej płytki, aby uzyskać miano faga w PFU na 10 μl.</li>
	<li>Zaszczepić kolejne 5 ml pożywki LB + Tet E. coli ER2738 w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem w celu amplifikacji faga. 
	UWAGA: Użyj kultury ER2738 w środkowej fazie logarytmicznej (OD600 ≈ 0,5) dla miana fagów. Jeśli większość blaszek na płytkach X-gal/IPTG jest biała, oznacza to, że pula fagów została skażona dzikimi bakteriofagami. Jeśli dojdzie do zanieczyszczenia, konieczne jest ponowne rozpoczęcie etapów płukania z niezanieczyszczonego roztworu podstawowego faga.</li>
</ol>
4. Amplifikacja fagów
<ol>
	<li>Rozcieńczyć (1:100) nocną hodowlę z kroku 3,8 w 20 ml LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Dodać nieamplifikowany eluat i inkubować energicznie wytrząsając przez 4,5 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść kulturę do probówki wirówkowej i wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do świeżej probówki, ponownie odwirować i wyrzucić osad.</li>
	<li>Przenieść górne 80% supernatantu do świeżej probówki i dodać do niej 1/6 objętości 20% PEG/2,5 M NaCl. Pozostawić faga do wytrącenia się w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Dobrze wymieszać supernatant kultury z PEG/2,5 M NaCl.</li>
	<li>Odwirować wytrącony przy stężeniu 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, ponownie odwirować i usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml TBS i przenieść supernatant do probówki do mikrodmuchowania. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrofuge i ponownie wytrącić, dodając 1/6 objętości 20% PEG/2,5 M NaCl. Inkubować na lodzie przez 15–60 minut. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, ponownie odwirować i usunąć pozostały supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 200 μl TBS i odwirować przez dodatkową minutę w celu usunięcia zanieczyszczeń. Przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrofuge, aby otrzymać amplifikowany eluat.</li>
	<li>Mianować amplifikowany zgodnie z opisem w sekcji 3. 
	UWAGA: Rozcieńczenie amplifikowanego eluatu jest wyższe w porównaniu z eluatem nieamplifikowanym; Zazwyczaj sugeruje się seryjne rozcieńczenia 108–1011.</li>
</ol>
5. Druga runda biopanowania
<ol>
	<li>Powtórz sekcje od 2 do 4.</li>
	<li>Mianować drugą rundę amplifikowanego eluatu na płytkach LB + IPTG/X-gal, jak opisano w sekcji 3. 
	UWAGA: Zmniejsz stężenie otoczki białka FGFR2 do 5 μg/ml. Jako dane wejściowe należy użyć amplifikowanego faga z kroku 4.7 i utrzymywać miano takie samo jak w pierwszej rundzie (1011 PFU). Skróć czas inkubacji faga i naczynia pokrytego FGFR2 do 1 godziny i zwiększ stężenie Tween do 0,1% (v/v) na etapach mycia.</li>
</ol>
6. Trzecia runda biopanowania
<ol>
	<li>Powtórz kroki 2.1-2.6.</li>
	<li>Eluować związany, dodając 1 ml 20 μM roztworu bFGF (ligand dla FGFR2) do naczynia i delikatnie kołysząc przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1-3.7. 
	UWAGA: Zmniejszyć stężenie otoczki białka FGFR2 do 2,5 μg/ml. Jako dane wejściowe należy użyć drugiej rundy amplifikowanego faga z sekcji 5 i utrzymywać miano takie samo jak w pierwszej rundzie (1011 PFU). Skróć czas inkubacji faga i naczynia pokrytego FGFR2 do 30 minut i zwiększ stężenie Tween do 0,5% (v/v) na etapach mycia.</li>
</ol>
7. Pozyskiwanie DNA płytki nazębnej do sekwencjonowania
<ol>
	<li>Wzmocnienie płytki nazębnej
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć (1:100) nocną hodowlę ER2738 w LB. Dozować 1 ml rozcieńczonej kultury do probówki o pojemności 2 ml, po jednej dla każdego klonu, który ma być scharakteryzowany.</li>
		<li>Za pomocą końcówki pipety pobrać jedną dobrze oddzieloną niebieską blaszkę z płytki mianowej z sekcji 6 i przenieść do probówki zawierającej rozcieńczoną kulturę. Wybierz łącznie 15 tabliczek. 
		UWAGA: Płytki powinny mieć < 1–3 dni, przechowywać w temperaturze 4 °C i mieć < 100 blaszek.</li>
		<li>Inkubować probówki, energicznie wstrząsając przez 4,5 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przenieść kultury do probówek wirówkowych i wirować przy 12 000 x g przez 30 s. Przenieść supernatant do świeżej probówki i ponownie odwirować.</li>
		<li>Za pomocą pipety przenieść górne 80% supernatantu do świeżej probówki. Oznacz to jako amplifikowany zapas fagów. 
		UWAGA: Rozcieńczyć amplifikowany równą objętością 100% sterylnego glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA płytki nazębnej
	<ol>
		<li>Przenieś 500 μl amplifikowanego faga do świeżej probówki do mikrofuge i dodaj 1/6 objętości 20% PEG/2,5 M NaCl. Odwróć do wymieszania i odstaw na 10–20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odlać supernatant. 
		UWAGA: Osad faga może nie być widoczny.</li>
		<li>Ponownie odwirować. Ostrożnie usunąć pozostały sklarowany szwaczek.</li>
		<li>Dokładnie zawiesić osad w 100 μl buforu jodkowego, energicznie stukając w probówkę.</li>
		<li>Dodać 250 μl 100% etanolu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Umyj granulat 0,5 ml 70% etanolu, szybko ponownie odwiruj, usuń supernatant i krótko wysusz pellet.</li>
		<li>Zawiesić osad w 30 μl buforu TE i użyć go do sekwencjonowania. 
		UWAGA: Wstępnie schłodzić 70% etanol w temperaturze -20°C przed krokiem 7.2.6. Osad fagowy musi być dokładnie zawieszony w buforze jodkowym przed dodaniem etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Identyfikacja sekwencji peptydowej
<ol>
	<li>Do sekwencjonowania należy użyć startera sekwencjonowania -96 gIII (5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3').</li>
	<li>Przeanalizuj sekwencje peptydowe wyświetlane na fagu na podstawie wyników sekwencjonowania DNA.</li>
	<li>Zsyntetyzuj małe peptydy i przeanalizuj je za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i spektrometrii mas, aby potwierdzić ich czystość (≥98%).</li>
</ol>
9. Wykrywanie powinowactwa otrzymanego małego peptydu i białka zewnątrzkomórkowego FGFR2 przez ITC
<ol>
	<li>Odgazuj sterylną wodę za pomocą przyrządu ultradźwiękowego. Rozpuść mały peptyd i białko zewnątrzkomórkowe FGFR2 w sterylnej wodzie. Odwirować te próbki, aby usunąć resztki osadu.</li>
	<li>Przeprowadzić doświadczenie miareczkowania ITC w temperaturze 25 °C. Miareczkować 40 μM małego peptydu w komórce za pomocą 1,5 μM białka FGFR2 ze strzykawki, z prędkością mieszania 750 obr./min. Dodać białko FGFR2 w 2 μl podwielokrotności (w sumie 19 wstrzyknięć) w odstępach 5-minutowych.</li>
	<li>Analizowanie danych ITC przy użyciu modelu powiązań z jedną lokacją. 
	UWAGA: Sterylna woda musi zostać odgazowana, a wszystkie próbki muszą zostać odwirowane w celu usunięcia pęcherzyków powietrza i resztkowych zanieczyszczeń. Doświadczenie musi być przeprowadzone w stałej temperaturze 25 °C.</li>
</ol>
10. Weryfikacja aktywności biologicznej otrzymanego małego peptydu za pomocą testu proliferacji komórek
<ol>
	<li>Wysiewaj BALB/c 3T3 komórki (3,0 × 103 komórki/dołek, 100 μl) na 96-dołkowej płytce ze zmodyfikowanym podłożem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Zastąp supernatant świeżym DMEM z 0,5% FBS i głodz komórki przez 12 godzin.</li>
	<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia małego peptydu (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 i 100 μM) świeżym DMEM uzupełnionym 0,5% FBS (6 zduplikowanych studzienek / stężenie). Usunąć supernatant z płytki 96-dołkowej i dodać 100 μl roztworu małego peptydu do dołka. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Zastąp supernatant świeżym DMEM zawierającym 10% roztwór zestawu do liczenia komórek (CCK)-8 i inkubuj przez 2 godziny.</li>
	<li>Zmierz absorbancję każdej studzienki przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek i przeanalizuj żywotność komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+by+fibroblast+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).</li>
<li>Turner, N., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signaling%3A+from+development+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumors.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+gene+amplification+and+clinicopathological+features+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer.</a> British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).</li>
<li>Weiss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+and+focal+FGFR1+amplification+associates+with+therapeutically+tractable+FGFR1+dependency+in+squamous+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93(2010).</li>
<li>Babina, I. S., Turner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+targeting+FGFR+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).</li>
<li>Katoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+receptors+as+treatment+targets+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).</li>
<li>Soria, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FIIa+study+evaluating+the+safety%2C+efficacy%2C+pharmacokinetics%2C+and+pharmacodynamics+of+lucitanib+in+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors.</a> Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).</li>
<li>French, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+FGFR4+inhibits+hepatocellular+carcinoma+in+preclinical+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models.</a> PLoS ONE. 7 (5), e36713(2012).</li>
<li>Martinez-Torrecuadrada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+extracellular+domain+of+fibroblast+growth+factor+receptor+3+with+human+single-chain+Fv+antibodies+inhibits+bladder+carcinoma+cell+line+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation.</a> Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).</li>
<li>Palamakumbura, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase+propeptide+inhibits+prostate+cancer+cell+growth+by+mechanisms+that+target+FGF-2-cell+binding+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling.</a> Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).</li>
<li>Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display-derived+peptides+as+therapeutic+alternatives+to+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies.</a> Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).</li>
<li>Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancement+and+applications+of+peptide+phage+display+technology+in+biomedical+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science.</a> Journal of Biomedical Science. 23, 8(2016).</li>
<li>Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+phage-displayed+combinatorial+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries.</a> Methods. 24 (3), 240-246 (2001).</li>
<li>Rodi, D. J., Makowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-display+technology+-+Finding+a+needle+in+a+vast+molecular+haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).</li>
<li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+M13+for+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineering M13 for phage display.</a> Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).</li>
<li>Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+peptide+ligands+for+epidermal+growth+factor+receptor+using+phage+display+and+computationally+modeling+their+mode+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology+%26+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding.</a> Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).</li>
<li>Askoxylakis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-based+targeting+of+the+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta.</a> Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdermal+protein+delivery+by+a+coadministered+peptide+identified+via+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).</li>
<li>Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+technology%3A+clinical+applications+and+recent+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phage display technology: clinical applications and recent innovations.</a> Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).</li>
<li>Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+targeting+In+vivo+using+phage+display+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries.</a> Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).</li>
<li>Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeting+peptides+from+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).</li>
<li>Binetruy-Tournaire, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peptide+blocking+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29-mediated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis.</a> The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).</li>
<li>Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Lipopolysaccharide-Targeted+Peptide+Mimic+Vaccine+against+Q+Fever%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever.</a> Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).</li>
<li>Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+Peptides+Targeting+Helix+31+of+Bacterial+16S+Ribosomal+RNA+by+Screening+M13+Phage-Display+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries.</a> Molecules. 16, 1211-1239 (2011).</li>
<li>Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Identification+of+Peptides+Specifically+Targeted+to+Gastric+Cancer+Cells+from+a+Phage+Display+Peptide+Library.+Asian+Pacific%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Prevention%22%5BJournal%5D)">Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific.</a> Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).</li>
<li>Kelly, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nanoparticles+for+imaging+incipient+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> PLOS Medicine. 5 (4), e85(2008).</li>
<li>Sugihara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pro-apoptotic+peptides+as+potential+therapy+for+peritoneal+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis.</a> Nature Communications. 5, 4478(2014).</li>
<li>Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vasculature+address+book%3A+Identification+of+stage-specific+tumor+vessel+zip+codes+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display.</a> Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).</li>
<li>Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Treatment+by+Targeted+Drug+Delivery+to+Tumor+Vasculature+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model.</a> Science. 279, 377-390 (1997).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów finansowych.

Kombinatoryczna biblioteka fagów jest potężnym i skutecznym narzędziem do wysokoprzepustowych badań przesiewowych nowych peptydów, które mogą wiązać cząsteczki docelowe i regulować ich funkcję13. Obecnie biblioteki peptydów wyświetlających fagi mają szeroki zakres zastosowań. Na przykład można je wykorzystać do selekcji bioaktywnych peptydów związanych z białkami receptorowymi23, celami niebiałkowymi 24,25, naśladow...

Receptory czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR) odgrywają kluczową rolę w proliferacji komórek, gojeniu ran i angiogenezie in vivo1. Nieprawidłowa aktywacja sygnalizacji FGFR obserwowana w różnych nowotworach2,3,4,5 obejmuje amplifikację genu, mutacje genów, aberracje chromosomowe i nadmierne wydzielanie ligandów6. Wiele inhibitorów ukierunkowanych na FGFR wykazało obiecujące efekty terapeutyczne w badaniach klinicznych i dzieli się je głównie na trzy typy: (1) inhibitory kinaz drobnocząsteczkowych, które wiążą się z wewnątrzkomórkową domeną FGFR, (2) antagoniści ukierunkowani na segment zewnątrzkomórkowy oraz (3) pułapki ligandów FGF6. Chociaż kilka małocząsteczkowych inhibitorów kinaz ma dobre efekty terapeutyczne zarówno in vitro, jak i in vivo7, większość z nich ma słabą swoistość docelową i wykazuje działania niepożądane, takie jak nadciśnienie8. Większość antagonistów to przeciwciała monoklonalne9,10 i polypeptides11. Peptydy mają przewagę nad małymi cząsteczkami ze względu na ich specyficzność i mniejsze skutki uboczne. Zachowują również przepuszczalność komórek i nie kumulują się w określonych narządach w porównaniu z lekami białkowymi12. W związku z tym celowane małe peptydy są zarówno skutecznymi, jak i perspektywicznymi środkami terapeutycznymi.
Technologia wyświetlania fagów to łatwe, ale potężne narzędzie do identyfikacji małych peptydów, które mogą wiązać się z daną cząsteczką13,14,15. Użyliśmy biblioteki peptydów wyświetlających fagi, która jest oparta na prostym fagu M13 z ponad 109 różnych sekwencji peptydowych wyświetlanych na końcu do wiązania z cząsteczką docelową (patrz Tabela materiałów)16. Ze względu na wysokie powinowactwo fagów do danej cząsteczki, niezwiązane fagi mogą zostać wypłukane, a tylko ściśle związane fagi z pożądanymi krótkimi peptydami są zatrzymywane. Danymi celami molekularnymi mogą być unieruchomione białka17,18, węglowodany, hodowane komórki, a nawet materiały nieorganiczne19,20. Opisano ekscytujący przypadek, w którym peptydy specyficzne dla narządów zostały wybrane in vivo przy użyciu technologii wyświetlania fagów21. Zalety technologii wyświetlania fagów to wysoka przepustowość, łatwość obsługi, niski koszt i szeroki zakres zastosowań22.
W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół badania przesiewowego małych peptydów wiążących się z unieruchomionym białkiem (FGFR2) za pomocą biblioteki wyświetlania fagów. Skuteczność technologii jest również badana poprzez pomiar powinowactwa otrzymanego peptydu do FGFR2 za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC), a aktywność biologiczna za pomocą testu proliferacji komórek. Metoda może zostać rozszerzona o badania przesiewowe małych peptydów, które wiążą się z węglowodanami, hodowanymi komórkami, a nawet materiałami nieorganicznymi.

<table><tbody><tr><td>0,22 &m; m Filtr</td><td>Merck Millipore</td><td>MPGP002A1</td><td></td></tr><tr><td>35 cm2 Małe naczynie</td><td>Thermo</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>fabryka odczynników chemicznych Guangzhou</td><td>64-17-5-96</td><td></td></tr> <tr><td>Starter</td><td></td><td></td> sekwencjonowania gIII <td>Synteza z Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Nest</td><td>701001-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Beyotime</td><td>ST004D</td><td></td></tr><tr><td>Oksoid</td><td>bakto-tryptonowy</td><td>L0037</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c Komórki 3T3</td><td>ATCC</td><td>CRL-&shy; 6587</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Biodragon</td><td>BD-M10110</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 zestaw</td><td>DOJINDO</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclon</td><td>sh30243.01</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Newprobe</td><td>PB10247</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 Protein</td><td>Sino Biological Inc.</td><td>10014-HNAE</td><td>Czystość >95%</td></tr> <tr><td>glicyny</td><td>Sigma</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Beyotime</td><td>ST097</td><td></td></tr><tr><td>ITC200 system</td><td>MicroCal Omega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Guangzhou fabryka odczynników chemicznych</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>NaI</td><td>Bidepharm</td><td></td><td></td>BD40879</tr><tr><td>Fabryka</td><td>odczynników chemicznych NaOH Guangzhou</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>PEG&ndash; 8000</td><td>Sigma</td><td>P2139-250</td><td></td></tr><tr><td>Ph.D.-7 zestaw biblioteki peptydów do wyświetlania fagów</td><td>New England BioLabs</td><td>E8100S</td><td>Zawierający bibliotekę fagów Ph.D.-7, E. coli Szczep gospodarza ER2738 i kontrolny M13KE</td></tr><tr><td>Rekombinowane białka domeny zewnątrzkomórkowej FGFR2</td><td>Sino Biological Inc.</td><td>10824-H08H</td><td>Czystość > 97%</td></tr> <tr><td>Synteza małych peptydów</td><td></td><td></td><td>z GL Biochem Ltd. (Szanghaj, Chiny)</td></tr> <tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma</td><td>S-SHS-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td>Sigma SLF-T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Beyotime</td><td>ST825</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Beyotime</td><td>ST912</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Oxoid</td><td>Zobacz materiał LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe i identyfikacja małych peptydów ukierunkowanych na receptor czynnika wzrostu fibroblastów2 przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

Rodzina receptorów ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów (FGFR) składa się z czterech członków, a mianowicie FGFR1, FGFR2, FGFR3 i FGFR4, które są zaangażowane w różne działania biologiczne, w tym proliferację komórek, przetrwanie, migrację i różnicowanie. W różnych typach nowotworów zidentyfikowano kilka aberracji w szlaku sygnałowym FGFR, spowodowanych mutacjami lub zdarzeniami amplifikacji genów. W związku z tym ostatnie badania skupiły się na opracowaniu strategii obejmujących terapeutyczne ukierunkowanie na FGFR. Obecne inhibitory FGFR na różnych etapach rozwoju przedklinicznego i klinicznego obejmują albo małocząsteczkowe inhibitory kinaz tyrozynowych, albo przeciwciała monoklonalne, a w przygotowaniu jest tylko kilka inhibitorów opartych na peptydach. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystujący technologię wyświetlania fagów do badania przesiewowego małych peptydów jako antagonistów FGFR2. Krótko mówiąc, bibliotekę peptydów wyświetlanych przez fagi inkubowano na płytce pokrytej FGFR2. Następnie niezwiązany został zmyty przez TBST (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), a związany eluowano 0,2 M buforem glicyny-HCl (pH 2,2). Wymyty poddano dalszej amplifikacji i wykorzystano jako dane wejściowe do następnej rundy biopanowania. Po trzech rundach biopanacji sekwencje peptydowe poszczególnych klonów fagów zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania DNA. Na koniec przebadane peptydy zsyntetyzowano i przeanalizowano pod kątem powinowactwa i aktywności biologicznej.

Uzyskanie małego peptydu o wysokim powinowactwie celującego w FGFR2.
W celu przesiewania fagów celujących w FGFR2, w niniejszym badaniu wykorzystano bibliotekę Ph.D.-7. Schematyczny przebieg procedury przedstawiono na Ryc. 1. W tym procesie liczba wprowadzonych fagów (PFU) pozostała niezmieniona, podczas gdy stężenie białka FGFR2 użytego do powlekania powierzchni było stopniowo zmniejszane. Wyniki miana fagów wykazały, że liczba odzyskanych fagów ...

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania przesiewowego małych peptydów, które wiążą się z FGFR2, przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi. Dalej analizujemy powinowactwo wybranych peptydów do FGFR2 in vitro i jego zdolność do hamowania proliferacji komórek.

Badania przesiewowe i identyfikacja małych peptydów ukierunkowanych na receptor czynnika wzrostu fibroblastów2 przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

W porównaniu z innymi metodami, protokół ten jest łatwiejszy do ilościowego i jakościowego znalezienia nowych antagonistów, agonistrów i modulatorów allosterycznych bez znajomości struktury hydrorozcieńczenia i tworzenia białka docelowego. Ten protokół jest wysoce wydajny, łatwy w obsłudze, ekonomiczny i dostępny na rynku. Łącząc tę wysokoprzepustową metodę przesiewową z analizą ITC, funkcjonalne małe peptydy można uzyskać ilościowo i jakościowo.Procedurę zademonstrują Ying Zhao i Qiang Wang, absolwenci naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować roztwór FGFR2 w buforze powlekającym o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Dodaj jeden mililitr roztworu do naczynia o powierzchni 35 centymetrów kwadratowych i kilkakrotnie mieszaj, aż powierzchnia będzie całkowicie mokra.Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wstrząsając. Następnego dnia odlej roztwór powlekający i dodaj przygotowany roztwór blokujący. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, następnie wyrzucić roztwór blokujący i szybko umyć płytkę sześć razy TBST, upewniając się, że naczynie nie wyschnie.Rozpuść oryginalną bibliotekę fagów w jednym mililitrze TBST i dodaj ją do powlekanego naczynia. Delikatnie kołysz talerzem na shakerze w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie wyrzuć supernatant i umyj naczynie 10 razy za pomocą TBST.Eluować związany, dodając jeden mililitr 0,2 molowej glicyny HCL do naczynia i delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przenieść eluent do wysterylizowanej probówki mikrowirówkowej i zneutralizować ją 100 mikrolitrami jednego molowca Tris-HCL o pH 9,1. Najpierw podgrzej przygotowane płytki LB i IPTG X-Gal w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę przed użyciem.Za pomocą końcówek pipet z wkładami filtrującymi przygotować 100 mikrolitrów dziesięciokrotnych rozcieńczeń eluentu w LB. Po tym, jak przygotowana kultura E. coli osiągnie fazę mid-log, należy dozować 200 mikrolitrów kultury do wysterylizowanych probówek mikrowirówek, po jednej na każde rozcieńczenie eluentu. Aby zainicjować zakażenie, dodać 50 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do probówek zawierających kulturę E. coli. Szybko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie za pomocą patyczków powlekających pokryć płytki LB i IPTG X-GAL 90 mikrolitrami tej mieszanki. Po pięciu minutach odwróć płytki i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Policz tabliczki, gdy się pojawią.Na początek rozcieńczyć nocną kulturę w 20 mililitrach LB w 250-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. Dodać nieamplifikowany eluent i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, energicznie wstrząsając przez 4-1/2 godziny. Następnie odwiruj kulturę w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Przenieść supernatant do świeżej probówki. Odwirować ponownie w tych samych warunkach i wyrzucić osad. Przenieść górne 80% supernatantu do świeżej probówki i dodać go do 1/6 objętości 20% glikolu polietylenowego i 2,5 molowego chlorku sodu.Pozwól fagowi wytrącić się przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odwiruj wytrącony w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Odrzucić supernatant i ponownie odwirować w tych samych warunkach.Za pomocą pipety usunąć pozostały supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze TBS i przenieść supernatant do probówki mikrowirówkowej. Wirować w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki i ponownie wytrącić, dodając 1/6 objętości 20% glikolu polietylenowego i 2,5 molowego chlorku sodu. Inkubować na lodzie przez 15 do 60 minut. Następnie odwiruj w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Odrzucić supernatant i ponownie odwirować w tych samych warunkach. Za pomocą pipety usunąć pozostały supernatant. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach TBS i odwirować na dodatkową minutę w celu usunięcia zanieczyszczeń.Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki mikrowirówkowej w celu uzyskania amplifikowanego eluentu. W tym badaniu liczba wejściowych fagów pozostaje niezmieniona, podczas gdy stężenie otoczki białka FGFR2 jest stopniowo zmniejszane. Wyniki miana faga sugerują, że liczba odzyskanych fagów stopniowo wzrasta i że po trzech rundach następuje 65-krotny wzrost w porównaniu z pierwszą rundą.Następnie przeprowadza się eksperyment ITC w celu zmierzenia powinowactwa małego peptydu do FGFR2. Wyniki wskazują, że peptyd SP1 ma wysokie powinowactwo do FGFR2. Dane te świadczą o skuteczności protokołu badań przesiewowych.Aby zbadać aktywność biologiczną peptydu SP1, przeprowadza się test proliferacji fibroblastów przy użyciu zestawu CCK-8. BALB/C3T3 inkubuje się z peptydem SP1 w różnych stężeniach. Wyniki sugerują, że peptyd SP1 hamuje wzrost komórek.Należy przy tym unikać zanieczyszczenia fagami typu dzikiego. Upewnij się, że używasz końcówek do pipet odpornych na działanie aerozoli. Podczas wzrostu poprzez uzyskanie amplifikacji fagów.Procedura ta może być również stosowana w badaniach przesiewowych małych peptydów, które wiążą się z węglowodanami, komórkami hodowlanymi i tkankami. Peptydy te mogą być dalej amplifikowane w stosunku do diagnostycznych i celowanych

screening-identification-small-peptides-targeting-fibroblast-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W celu zidentyfikowania sekwencji peptydowych celujących w kość wykorzystano bibliotekę displayu fagowego. Celem badania było sprawdzenie wpływu tych peptydów na różnicowanie komórek mezenchymalnych oraz określenie ich oddziaływania na regenerację kości.

Peptydy z biblioteki phage display modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i potęgują osteogenezę w jedokortykalnych defektach kostnych

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Oferujemy metodę jednoczesnego badania biblioteki fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności cytoplazmatycznej za pomocą szlaku translokacji podwójnej argininy Escherichia coli, który ma nieodłączny mechanizm kontroli jakości dla wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, w celu wyświetlenia fragmentów przeciwciała na wewnętrznej błonie.

Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Tutaj prezentujemy metodę selekcji nowych wariantów ligazy białkowej biotyny E. coli BirA, która biotynyluje określony peptyd docelowy. Protokół opisuje budowę plazmidu do bakteryjnego wyświetlania docelowego peptydu, generowanie biblioteki BirA, selekcję i charakterystykę wariantów BirA.

Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Opisano techniki generowania biblioteki krótkich peptydów, które mogą aktywować komórki tuczne za pośrednictwem receptora MRGPRX2. Powiązane techniki są łatwe, niedrogie i można je rozszerzyć na inne receptory komórkowe.

Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Poznaj metodę przesiewowania małych peptydów wiążących FGFR2 przy użyciu biblioteki fagowej. Technika ta umożliwia identyfikację modulatorów receptora z wysokim powinowactwem i ocenę ich wpływu na proliferację komórek.

Badania przesiewowe i identyfikacja małych peptydów ukierunkowanych na receptor czynnika wzrostu fibroblastów2 przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi (Wideo) | JoVE Journal

Badania przesiewowe i identyfikacja małych peptydów ukierunkowanych na receptor czynnika wzrostu fibroblastów2 przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi

Przeglądaj więcej filmów