Badania przesiewowe i identyfikacja małych peptydów ukierunkowanych na receptor czynnika wzrostu fibroblastów2 przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi

W porównaniu z innymi metodami, protokół ten jest łatwiejszy do ilościowego i jakościowego znalezienia nowych antagonistów, agonistrów i modulatorów allosterycznych bez znajomości struktury hydrorozcieńczenia i tworzenia białka docelowego. Ten protokół jest wysoce wydajny, łatwy w obsłudze, ekonomiczny i dostępny na rynku. Łącząc tę wysokoprzepustową metodę przesiewową z analizą ITC, funkcjonalne małe peptydy można uzyskać ilościowo i jakościowo.

Procedurę zademonstrują Ying Zhao i Qiang Wang, absolwenci naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować roztwór FGFR2 w buforze powlekającym o stężeniu 10 mikrogramów na mililitr. Dodaj jeden mililitr roztworu do naczynia o powierzchni 35 centymetrów kwadratowych i kilkakrotnie mieszaj, aż powierzchnia będzie całkowicie mokra.

Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wstrząsając. Następnego dnia odlej roztwór powlekający i dodaj przygotowany roztwór blokujący. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, następnie wyrzucić roztwór blokujący i szybko umyć płytkę sześć razy TBST, upewniając się, że naczynie nie wyschnie.

Rozpuść oryginalną bibliotekę fagów w jednym mililitrze TBST i dodaj ją do powlekanego naczynia. Delikatnie kołysz talerzem na shakerze w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie wyrzuć supernatant i umyj naczynie 10 razy za pomocą TBST.

Eluować związany, dodając jeden mililitr 0,2 molowej glicyny HCL do naczynia i delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przenieść eluent do wysterylizowanej probówki mikrowirówkowej i zneutralizować ją 100 mikrolitrami jednego molowca Tris-HCL o pH 9,1. Najpierw podgrzej przygotowane płytki LB i IPTG X-Gal w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę przed użyciem.

Za pomocą końcówek pipet z wkładami filtrującymi przygotować 100 mikrolitrów dziesięciokrotnych rozcieńczeń eluentu w LB. Po tym, jak przygotowana kultura E. coli osiągnie fazę mid-log, należy dozować 200 mikrolitrów kultury do wysterylizowanych probówek mikrowirówek, po jednej na każde rozcieńczenie eluentu. Aby zainicjować zakażenie, dodać 50 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do probówek zawierających kulturę E. coli. Szybko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie za pomocą patyczków powlekających pokryć płytki LB i IPTG X-GAL 90 mikrolitrami tej mieszanki. Po pięciu minutach odwróć płytki i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Policz tabliczki, gdy się pojawią.

Na początek rozcieńczyć nocną kulturę w 20 mililitrach LB w 250-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. Dodać nieamplifikowany eluent i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, energicznie wstrząsając przez 4-1/2 godziny. Następnie odwiruj kulturę w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Przenieść supernatant do świeżej probówki. Odwirować ponownie w tych samych warunkach i wyrzucić osad. Przenieść górne 80% supernatantu do świeżej probówki i dodać go do 1/6 objętości 20% glikolu polietylenowego i 2,5 molowego chlorku sodu.

Pozwól fagowi wytrącić się przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odwiruj wytrącony w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Odrzucić supernatant i ponownie odwirować w tych samych warunkach.

Za pomocą pipety usunąć pozostały supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze TBS i przenieść supernatant do probówki mikrowirówkowej. Wirować w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki i ponownie wytrącić, dodając 1/6 objętości 20% glikolu polietylenowego i 2,5 molowego chlorku sodu. Inkubować na lodzie przez 15 do 60 minut. Następnie odwiruj w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Odrzucić supernatant i ponownie odwirować w tych samych warunkach. Za pomocą pipety usunąć pozostały supernatant. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach TBS i odwirować na dodatkową minutę w celu usunięcia zanieczyszczeń.

Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki mikrowirówkowej w celu uzyskania amplifikowanego eluentu. W tym badaniu liczba wejściowych fagów pozostaje niezmieniona, podczas gdy stężenie otoczki białka FGFR2 jest stopniowo zmniejszane. Wyniki miana faga sugerują, że liczba odzyskanych fagów stopniowo wzrasta i że po trzech rundach następuje 65-krotny wzrost w porównaniu z pierwszą rundą.

Następnie przeprowadza się eksperyment ITC w celu zmierzenia powinowactwa małego peptydu do FGFR2. Wyniki wskazują, że peptyd SP1 ma wysokie powinowactwo do FGFR2. Dane te świadczą o skuteczności protokołu badań przesiewowych.

Aby zbadać aktywność biologiczną peptydu SP1, przeprowadza się test proliferacji fibroblastów przy użyciu zestawu CCK-8. BALB/C3T3 inkubuje się z peptydem SP1 w różnych stężeniach. Wyniki sugerują, że peptyd SP1 hamuje wzrost komórek.

Należy przy tym unikać zanieczyszczenia fagami typu dzikiego. Upewnij się, że używasz końcówek do pipet odpornych na działanie aerozoli. Podczas wzrostu poprzez uzyskanie amplifikacji fagów.

Procedura ta może być również stosowana w badaniach przesiewowych małych peptydów, które wiążą się z węglowodanami, komórkami hodowlanymi i tkankami. Peptydy te mogą być dalej amplifikowane w stosunku do diagnostycznych i celowanych