Elektroporacja siRNA w celu modulacji autofagii w komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów zakażonych wirusem opryszczki pospolitej typu 1

Nasz protokół opisuje metody skutecznego zakłócania indukowanego przez HSV-1 obrotu autofagicznego w komórkach dendrytycznych. W szczególności porównujemy strategię opartą na inhibitorach i opartą na siRNA, aby zablokować autofagię przed infekcją. Podczas gdy interferencja z autofagią oparta na inhibitorach obejmuje potencjalne i specyficzne efekty poza celem, opracowana przez nas strategia oparta na siRNA jest bardziej specyficzna dla celu.

Co ważne, obie przedstawione techniki nie wpływają na etapy dojrzewania choroby. Procedurę zademonstrują Petra Muhl-Zurbes, technik, i Alexandra Duthorn, doktorantka z mojego laboratorium. Rozpocznij od zebrania niedojrzałych komórek dendrytycznych lub iDC, delikatnie spłukując luźno przylegające komórki z dna kolby do hodowli komórkowej w czwartym dniu po adherencji.

Dodaj koktajl dojrzewania do komórek, aby wygenerować dojrzałe komórki dendrytyczne lub mDC. Dwa dni po indukcji dojrzewania wypłukać mDC z dna kolby do hodowli komórkowych. Powtórz płukanie dwukrotnie, a następnie przenieś iDC i mDC do 50-mililitrowych probówek w odpowiednim pożywce hodowlanej.

Zebrać komórki przez odwirowanie w ilości 300 razy g przez pięć minut. Delikatnie ponownie zawiesić komórki w pięciu do 10 mililitrach RPMI 1640 na kolbę do hodowli komórkowych i połączyć odpowiednie zawiesiny DC w jednej probówce. Następnie określ ilościowo ogniwa za pomocą komory liczącej, upewniając się, że unikasz zmian temperatury podczas obsługi DC.

Przenieś dwa miliony iDC lub mDC do dwumililitrowej probówki, odwiruj je przy 3 390 razy g przez 1-1/2 minuty i odrzuć supernatant. Delikatnie zawiesić komórki w pożywce infekcyjnej. Zahamować autofagosomalny szlak degradacji lizosomalnej poprzez dodanie 10 mikromolowych spautyny-1 lub jednej mikromolowej bafilomycyny A1 do pożywki infekcyjnej na godzinę przed zakażeniem.

Dodać DMSO do kontroli niepoddanej działaniu substancji i inkubować komórki na bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 300 obr./min. W przypadku badań nad infekcjami należy zaszczepić komórki wirionami HSV-1 przy wielokrotności infekcji wynoszącej dwa. Dodać odpowiednią objętość buforu MNT jako próbną kontrolę i inkubować komórki na bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z wytrząsaniem.

Godzinę po zakażeniu zebrać komórki przez odwirowanie w ilości 3 390 razy g przez 1-1/2 minuty, a następnie delikatnie odessać inokulum i ponownie zawiesić komórki w pożywce DC. Makieta nasion i komórki zakażone HSV-1 w końcowym stężeniu miliona komórek na mililitr w sześciodołkowej płytce. Po 16 do 24 godzinach od infekcji zbierz iDC za pomocą skrobaka do komórek lub mDC przez płukanie, przenieś komórki do 1,5-mililitrowej probówki z bezpiecznym zamkiem i zbierz je przez wirowanie w temperaturze 3 390 razy g przez 1-1/2 minuty.

Powtórz zbiór i odwirowanie z pozostałymi komórkami w studzienkach, a następnie przemyj granulki raz jednym mililitrem PBS i energicznie ponownie zawieś komórki w mieszance do lizy. Próbki inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie podgrzewać do 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wykonaj analizę strony SDS i western blot, aby zweryfikować poziomy białek LC3B1 i LC3B2, P62, ICP0 i ICP5 oraz GAPDH.

W 3,5 dniu po adherencji przenieś 12 milionów iDC do 50-mililitrowej probówki, odwiruj je z prędkością 300 razy g przez pięć minut, a następnie odrzuć supernatant. Równolegle wykonaj analizę cytometrii przepływowej w celu monitorowania stanu dojrzewania. Delikatnie umyj iDC w pięciu mililitrach Opti-MEM bez czerwieni fenolowej i odwiruj je w ilości 300 razy g przez pięć minut.

Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach Opti-MEM, dostosowując stężenie komórek do sześciu milionów komórek na 100 mikrolitrów. Dodać 75 pikomoli specyficznego dla FIP200 lub zaszyfrowanego siRNA do czterech milimetrowych elektrokuwet i przenieść 100 mikrolitrów zawiesiny ogniw do odpowiedniej kuwety. Bezpośrednio pulsuj iDC za pomocą aparatu do elektroporacji.

Po elektroporacji przenieś iDC na sześciodołkowe płytki ze świeżym, wstępnie podgrzanym podłożem DC, wysiewając komórki w końcowym stężeniu miliona komórek na mililitr i umieść je w inkubatorze. Po 48 godzinach zbadaj mikroskopowo morfologię elektroporowanych iDC, a następnie zbierz ogniwa za pomocą skrobaka do ogniw i przenieś je do 15-mililitrowych probówek. Przepłukać studzienki jednym mililitrem PBS uzupełnionym 0,1% EDTA i przenieść roztwór do odpowiednich probówek.

Następnie podziel komórki dla każdego warunku siRNA, jak opisano w manuskrypcie. Użyj 500 000 komórek do oceny stanu dojrzewania i żywotności komórek, użyj miliona komórek do analizy western blot, aby zweryfikować specyficzną skuteczność knockdownu FIP200, a pozostałe komórki wykorzystaj do eksperymentów z infekcją HSV-1. Wygenerowane iDC i mDC poddano analizie fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykluczenia zanieczyszczenia innymi typami komórek i zweryfikowania ich stanu dojrzewania.

Komórki wybarwiono przeciwciałami CD3 i CD14, aby wykluczyć odpowiednio zanieczyszczenie limfocytami T i monocytami. Komórki wybarwiono pod kątem CD11c, który służy jako wysoce eksprymowany ogólny marker dla DC. Do oceny stanu dojrzewania użyto przeciwciał CD80, CCR7, CD83 i MHCII, ponieważ cząsteczki te ulegają silnej ekspresji na dojrzałych DC.

Mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa zostały wykorzystane do określenia zakażenia EGFP eksprymującym HSV-1. Silne sygnały GFP wskazują na prawie całkowite zakażenie iDC i mDC. Analizę Western blot wykorzystano w celu określenia, czy spautyna-1 lub bafilomycyna A1 hamują przepływ autofagiczny w komórkach zakażonych HSV-1.

W iDC strumień autofagiczny jest wykazywany przez spadek ekspresji P62 i LC3B przy braku odpowiednio spautyny-1 i bafilomycyny A1. W przeciwieństwie do tego, zakażenie HSV-1 mDC przy braku spautyny-1 nie wpływa na ekspresję P62, podczas gdy leczenie spautin-1 i BA1 wywołało akumulację LC3B-II, co odzwierciedla indukcję autofagii, ale niepowodzenie obrotu autofagicznego w mDC. Obniżenie poziomu białka FIP200 za pomocą elektroporacji siRNA powoduje również silny spadek strumienia autofagicznego w iDC zakażonych HSV-1.

Ten oparty na siRNA protokół elektroporacji w celu hamowania autofagii nie wpływa na żywotność komórek, fenotyp obrazu ani na ustalanie ekspresji białka HSV-1 w iDC. Nasze protokoły elektroporacji dają możliwość dostarczania różnych gatunków DNA lub RNA do chorób i innych pierwotnych typów komórek. Następnie można przeprowadzić różne analizy molekularne, funkcjonalne i infekcje.

Oparta na siRNA strategia wyciszania ekspresji w chorobie toruje drogę do zbadania funkcji dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania, również w połączeniu z późniejszymi testami funkcjonalnymi.