Protokół mikrodysekcji z wychwytem laserowym, który zapewnia wysokiej jakości RNA ze świeżo zamrożonych kości myszy
16 września 2019
Protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów w komórkach dowolnej tkanki twardej.
Czy kiedykolwiek myślałeś o wykorzystaniu mocy mikrodysekcji wychwytywania laserowego do analizy ekspresji genów w określonych komórkach kostnych w ich naturalnym środowisku? W tym miejscu opisujemy protokół, który umożliwi uzyskanie wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA z kriosekcji kości myszy. Technologia ta jest doskonałym narzędziem do badania zmian w ekspresji genów w określonych komórkach kostnych w genetycznie modyfikowanych modelach mysich lub w modelach chorób.
Opisany tutaj protokół koncentruje się na kościach myszy, ale może być wykorzystany do badania in situ ekspresji genu w komórkach dowolnej tkanki twardej u dowolnego gatunku. W zademonstrowaniu tej procedury pomoże Christiane Schueler, technik z mojego laboratorium. Po eutanazji myszy przez wykrwawienie w znieczuleniu ogólnym należy szybko usunąć całe kości udowe.
Użyj skalpela i ręczników papierowych, aby oczyścić kości udowe z otaczających tkanek miękkich. Następnie wlej związek o optymalnej temperaturze cięcia do formy do zatapiania i umieść kości udowe na dnie form do zatapiania. Zatrzaskowo zamrozić próbki w ciekłym azocie.
Po całkowitym zamrożeniu próbek zawiń je w folię i przenieś na suchym lodzie do zamrażarki. Przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do dalszej obróbki. Najpierw ustaw temperaturę w kriostacie na minus 19 stopni Celsjusza, a temperaturę uchwytu bloku na minus 17 stopni Celsjusza.
Następnie przetrzyj wnętrze kriostatu 70% etanolem. Umieść jednorazowe ostrze do twardych tkanek, szkiełka podstawowe i narzędzie do dopasowania w kriostacie do ostygnięcia i trzymaj je w kriostacie na czas cięcia. Przenieść zamrożony blok tkanki na suchym lodzie do kriostatu i pozostawić do zrównoważenia przez co najmniej 10 minut.
Następnie naciśnij dolną część formy do zatapiania, aby wypchnąć blok OCT z formy. Nałóż wystarczającą ilość podłoża OCT na uchwyt bloku, aby przykleić do niego blok i poczekaj, aż podłoże OCT całkowicie zamarznie. Następnie umieść uchwyt bloku w uchwycie na przedmiot i dokręć go na miejscu.
Wyreguluj położenie ostrza i przycinaj blok w odstępach co 15 mikrometrów, aby usunąć OCT pokrywający próbkę. Dostosuj kriostat do generowania ośmiomikrometrowych odcinków i wytnij od dwóch do trzech kriosekcji, które zostaną odrzucone. Umieść folię samoprzylepną na bloku i użyj narzędzia do montażu, aby przykleić folię do bloku.
Teraz wykonaj cięcie powoli i ze stałą prędkością, trzymając sekcję za folię. Umieść folię z próbką skierowaną do góry na wstępnie schłodzonym szkiełku podstawowym na kriobarze w kriostacie, aby uniknąć rozmrożenia próbki. Użyj taśmy, aby przymocować folię do szkiełka, aby ułatwić barwienie.
W dygestorium przygotuj niezbędne roztwory etanolu, wody wolnej od RNaz i ksylenu na lodzie, jak opisano w protokole tekstowym. Inkubować sekcje w 95% etanolu przez 30 sekund. Następnie ostrożnie zanurz sekcje w wodzie wolnej od RNaz na 30 sekund, aby całkowicie usunąć OCT.
Następnie nałóż 50 mikrolitrów komercyjnego barwnika z zamrożonego przekroju LCM na sekcję i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 sekund. Opróżnij sekcję, umieszczając krawędź szkiełka na chłonnej bibułce. Opłucz sekcję w 100% etanolu przez 30 sekund, aby usunąć nadmiar plam
.Zanurz skrawki kości w drugiej probówce zawierającej 100% etanolu na 30 sekund, a następnie przenieś je do 100% ksylenu na 30 sekund. Połóż folię samoprzylepną na suchym szkiełku jako podparcie, uważając, aby folia była jak najbardziej płaska. Następnie umieść szkiełko ramy z membrany PET na folii i krótko naciśnij palec w rękawiczce na membranie, aby przymocować ją do folii.
Próbka ta zostanie umieszczona między membraną a folią samoprzylepną. Folia samoprzylepna nie powinna być złożona ani pomarszczona, a między folią a membraną nie powinno być pęcherzyków powietrza. Zacznij od użycia środka do odkażania powierzchni, aby wyczyścić uchwyt zaślepki sceny.
Załaduj suwak do uchwytu suwaka, a zaślepki do uchwytu nasadki. Następnie wyreguluj ostrość i uzyskaj przegląd slajdów za pomocą obiektywu 1,25x. Zmień obiektyw na 40x i wyreguluj ostrość.
Korzystając z przeglądu slajdów, wybierz obszar zainteresowania. Następnie dostosuj parametry lasera, jak pokazano tutaj, upewniając się, że zoptymalizujesz te parametry dla każdego obiektywu. Jeśli laser nie zdoła przeciąć próbki, zwiększ moc lasera.
Wybierz osteoblasty, osteocyty i komórki wyściółki kostnej w dystalnej kości udowej, gąbczastej lub korowej na podstawie kryteriów morfologicznych. Narysuj linię ścieżki lasera znajdującą się dalej od komórek docelowych, aby zminimalizować uszkodzenia spowodowane przez laser UV. Jeśli laser nie zdoła przeciąć próbki, zastosuj laser więcej niż raz lub sprawdź cel pod kątem miejsc niekompletnych cięć i użyj opcji przesuwania i cięcia, aby przeciąć tkankę w tych miejscach.
Zbierz każdy typ ogniwa w osobnej nasadce probówki o pojemności 0,5 mililitra. Najpierw dozować 50 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego beta merkaptoetanol do nakrętki probówki zbiorczej. Poddać próbkę lizie, pipetując ją w górę i w dół w nasadce przez jedną minutę.
Następnie odwirować lizat i dodać 00 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego beta-merkaptoetanol do probówki. Dla każdego szkiełka należy przygotować oznakowaną probówkę do mikrowirówki z 350 mikrolitrami buforu do lizy zawierającego beta merkaptoetanol. Użyj skrawków pozostałych po LCM, aby wyekstrahować RNA.
Ostrożnie oddzielić folię od membrany i poddać próbkę lizie, kilkakrotnie powoli nacierając bufor do lizy na sekcję. Następnie umieść próbki lizatu na suchym lodzie i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, rozmroź lizaty w temperaturze pokojowej.
Następnie przenieś lizaty z komórek zebranych LCM w probówkach zbiorczych do nowych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek i wyekstrahuj RNA zgodnie z instrukcjami producenta. W tym badaniu opracowano protokół LCM w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych kości udowych myszy. LCM wykonuje się przy użyciu systemu LCM, który wykorzystuje grawitację do pobierania próbek.
Wydajność i integralność wyizolowanego RNA mierzono za pomocą elektroforezy mikrokapilarnej. Różnicę w jakości i ilości RNA uzyskanego przy użyciu różnych protokołów lizy można zobaczyć w reprezentatywnym żelu i elektroferogramach. Gdy próbka jest poddawana lizie przez pipetowanie w górę i w dół w nasadce przez jedną minutę, możliwe jest wyizolowanie około 8,5 nanograma RNA z jednego milimetra kwadratowego mikrowypreparowanej tkanki kostnej.
Wartość RIN wynosi 8,60. Alternatywnie, LCM jest wykonywany za pomocą systemu LCM, który wykorzystuje rozogniskowany impuls laserowy, który katapultuje materiał do wystającej nasadki samoprzylepnej. W przypadku świeżo mrożonych kości możliwe jest wyizolowanie około 1,6 nanograma RNA z jednego milimetra kwadratowego mikrowypreparowanej tkanki kostnej.
Wartość RIN wynosi jeden. Podsumowując, najważniejszymi rzeczami, o których należy pamiętać w tej procedurze, są prawidłowe stosowanie protokołu stałego, zapobieganie całkowitemu wysuszeniu skrawków w kompleksie warstwowym, stosowanie odpowiedniego systemu LCM oraz nieprzekraczanie limitów czasowych na pobranie komórek. Po wyizolowaniu RNA z przechwyconych komórek można użyć RNA do profilowania ekspresji, na przykład przez poszukiwanie RNA.
Na koniec chcielibyśmy przypomnieć, że ksylen i beta-merkaptoetanol to substancje niebezpieczne, z którymi należy obchodzić się pod maską. Ponadto należy podjąć odpowiednie środki ostrożności podczas obchodzenia się z ciekłym azotem, a także z łopatkami kriotomicznymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół wykorzystujący mikrodyseksję laserową (LCM) do ekstrakcji wysokiej jakości RNA z komórek kostnych w kościach udowych myszy, ułatwiając analizę ekspresji genów. Chociaż skupia się na tkankach kostnych myszy, metoda ta może być dostosowana do badania ekspresji genów w tkankach twardych różnych gatunków.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Analiza ekspresji genów
- Biologia komórek kostnych
- Badania nad tkankami twardymi
Tło
- Znaczenie ekspresji genów w rozumieniu biologii kości
- Wyzwania w izolowaniu wysokiej jakości RNA z określonych komórek kostnych
- Potencjał technologii LCM w badaniach biologicznych
Zastosowane metody
- Mikrodyskcja laserowa (LCM)
- Tkanka udowej myszy jako system biologiczny
- Protokoły ekstrakcji i analizy RNA
Główne wyniki
- Sukces w izolowaniu RNA z różnych typów komórek kostnych
- Wysoki wydajność i integralność wyekstrahowanego RNA
- Demonstracja uniwersalności protokołu w różnych tkankach twardych
Wnioski
- Opracowany protokół LCM poprawia zdolność do badania ekspresji genów w komórkach kostnych
- Istotne implikacje dla badań w dziedzinie biologii kości i pokrewnych dziedzin
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection enables precise isolation of specific bone cell populations from complex hard tissues, addressing a critical bottleneck in target validation for bone-related therapeutic discovery. By preserving RNA integrity and yield from microdissected samples, this method supports mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses in preclinical models. It enhances predictive confidence in early discovery by linking genotype to phenotype in physiologically relevant contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in specific bone cell types within their native microenvironment.
- Operational Value: Provides high-quality RNA for gene expression profiling, reducing noise from heterogeneous tissue populations.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by clarifying cell-type-specific pathway activity in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducible RNA yields (e.g., 8.5 ng/mm² with optimized lysis) for assay standardization.
- Operational Value: Compatible with column-based extraction and gravity-fed LCM systems, enabling scalable workflow integration.
- Scientific Value: Produces RNA with high integrity (RIN 8.60), ensuring reliable downstream transcriptional analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by enabling consistent cell-type-specific analysis across model systems.
- Operational Value: Uses rapid staining and adhesive film sandwiching to prevent RNA degradation during processing.
- Scientific Value: Adaptable to any hard tissue, supporting cross-species and disease-model applications in bone biology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through preclinical validation, particularly for bone-targeted therapeutics where cellular resolution is critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating osteoblasts, osteocytes, and bone lining cells for molecular profiling.
- Screening: Enables assay-ready RNA extraction with defined yield and integrity metrics for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantitative RNA output and RIN measurements that inform go/no-go decisions in target prioritization.
- Translational Research: Connects in situ gene expression findings to preclinical outcomes through consistent hard tissue analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for hard tissue LCM applicable across multiple projects and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in bone cell signaling.
- Operational Value: Standardizes RNA isolation from low-input hard tissue samples, improving reproducibility across sites.
- Strategic Value: Informs better go/no-go decisions by providing cell-type-specific data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of bone-targeted candidates based on mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, laser parameter optimization, and sterile tissue handling.
- Dependent on LCM system compatibility with gravity-based sample collection and adhesive film sandwiching.
- Necessitates RNase-free environments and proper handling of hazardous reagents like xylene and beta-mercaptoethanol.
- Must adapt section thickness (8 µm) and staining duration to tissue type to preserve RNA integrity.
- Limited by RNA yield from small microdissected areas, necessitating careful input quantification for downstream applications.
