Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Protokół ten pozwala na jednoczesną modulację wielu mikro RNA w komórkach eukariotycznych i opiera się na bardzo prostej i elastycznej metodzie, która minimalizuje etapy klonowania molekularnego. Technika ta ma implikacje dla badania interakcji funkcjonalnych mikro RNA in vitro, ale co ważniejsze, stanowi platformę do bardziej efektywnego wykorzystania mikro RNA w terapii. Opracowaliśmy go i stosowaliśmy głównie w kontekście raka mózgu, ale ma on zastosowanie do wszystkich chorób, w których zaangażowanych jest wiele zmian w ekspresji genów.

Przetestowaliśmy nasze sztuczne geny trans w innych modelach, takich jak linie raka piersi i tarczycy, pokazując odtwarzalność tej techniki. Podstawowa wiedza z zakresu bioinformatyki i biologii mikro RNA jest pomocna w tym protokole, ale nie jest niezbędna. Podejście bioinformatyczne jest ważne dla zdefiniowania odpowiednich kombinacji mikro RNA i TRK-11, podczas gdy znajomość przetwarzania mikro RNA jest ważna, aby zrozumieć, w jaki sposób te różne mikro RNA mogą być łączone w sztuczne klastry DNA, które mogą być z powodzeniem przetwarzane po ustabilizowaniu się w określonych komórkach.

Aby pokryć danie, najpierw rozpuść poli-D-lizynę w wodzie o stężeniu 100 mikrogramów na mililitr. Wlej roztwór do naczynia w ilości jednego mililitra roztworu na 25 centymetrów kwadratowych powierzchni. Zakręć naczyniem, aby upewnić się, że całe danie jest pokryte.

Po sześciu godzinach odessać roztwór poli-D-lizyny i dwukrotnie spłukać PBS. Płytki ludzkich nerwowych komórek macierzystych w ilości 100 000 komórek na pięć mililitrów pożywki, albo w pożywce z komórek macierzystych, pożywce do różnicowania astrocytów lub pożywki do różnicowania neuronów. Po posianiu komórek umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla na tydzień i przystąp do przeprowadzenia analizy ekspresji mikro RNA zgodnie z manuskryptem.

Aby wyhodować komórki macierzyste glejaka GBM-34, zacznij od jednej razy dziesięć do piątej komórki i pięciu mililitrów pożywki neuropodstawowej w kolbie o niskim natężeniu 25 centymetrów kwadratowych. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla. 48 godzin po posianiu dodawać podwajające stężenie środka alkilującego DNA, temozolomidu, co siedem dni.

Zacznij od dodania pięciu mikromolowych TMZ uzupełnionych w pięciomililitrowym podłożu przez pięć dni. Po pięciu dniach usuń pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką bez temozolomidu, aby komórki, które przeżyły, mogły się zregenerować. Po 48 godzinach dodać 10 mikromolowych temozolomidów i inkubować przez kolejne pięć dni.

Powtarzać podwajanie temozolomidu do momentu osiągnięcia stężenia co najmniej 100 mikromolów i uzyskania przez komórki oporności na lek. Po indukcji oporności połóż komórki za pomocą 1 mililitra odczynnika do lizy. Wyekstrahuj całkowite RNA i przeanalizuj ekspresję określonych mikro RNA zgodnie z manuskryptem.

Aby uzyskać przewidywany cel każdego wcześniej zdefiniowanego mikro RNA, należy użyć narzędzi predykcyjnych do celowania w mikro RNA. Na pierwszej stronie TargetScan wybierz interesujący Cię mikro RNA z wstępnie wypełnionego menu rozwijanego. Kliknij przycisk Prześlij.

Pobierz wynikową listę celów jako arkusz kalkulacyjny, korzystając z linku do tabeli pobierania. Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia wyników fałszywie dodatnich, uwzględnij tylko cele w kolumnie Witryny chronione i analizie podrzędnej. Dodatkowe programy predykcyjne mikro RNA są bardziej rygorystyczne i obejmują tylko cele, które są wspólne dla wszystkich algorytmów.

Następnie otwórz pakiet ToppGene 20. Aby ocenić wzbogacenie szlaków, które są wspólne dla każdego mikro RNA, wklej listę celów uzyskanych w oknie zestawów genów treningowych. Kliknij Symbol HGNC jako typ wpisu.

Kliknij przycisk Prześlij i uruchom. Program udostępnia tabelę wyjściową przedstawiającą najważniejsze kategorie GO dla wprowadzonej listy genów. Aby ostatecznie ustalić wkład każdego mikro RNA w regulację wspólnego szlaku lub procesu komórkowego, otwórz funkcję diagramu Venna dostępną na stronie internetowej Bioinformatyki i Genomiki Ewolucyjnej.

Porównaj każdy uzyskany cel z pełną listą genów zaangażowanych w określony proces komórkowy. Jeśli docelowe informacyjne RNA dla każdego interesującego mikro RNA znajdują się w odpowiednich oknach, prześlij lub skopiuj i wklej listę. Nazwij każdą listę unikatowym identyfikatorem.

Kliknij przycisk Prześlij. Program zapewnia wizualny wynik diagramu Venna z liczbą genów w każdym sektorze, a także pełną listą informacyjnych RNA dla każdego podzbioru i kombinacji przecięć. Aby zgrupować wybrane mikro RNA w funkcjonalny gen trans, należy uzyskać rusztowanie transgeniczne oparte na locus klastra miR-17-92.

Uzyskaj sekwencję nukleotydów z przeglądarki genomu zespołowego. Wybierz sekwencję rdzenia około 800 par zasad obejmującą wszystkie sześć kodowanych spinek do włosów mikro RNA locus i co najmniej 200 sekwencji flankujących nukleotydy zarówno przed, jak i za sekwencją rdzenia. Wklej sekwencję do dowolnego programu do edycji słów.

Zdefiniuj sekwencję każdego z sześciu natywnych szpilek do włosów, pobierając je w bazie miR. Zaznacz każdą z tych sekwencji w zakresie poprzednio zidentyfikowanej sekwencji rdzeniowej. Wszystkie sekwencje między poszczególnymi spinkami do włosów reprezentują sekwencje dystansowe.

Następnie uzyskaj sekwencje spinki do włosów mikro RNA, które mają ulegać nadekspresji w genie trans z zasady miR. Uważnie zwróć uwagę na specyficzne nukleotydy, które znajdują się w miejscach rozszczepienia mikroprocesora. Usuń natywne sekwencje spinki do włosów z sekwencji rdzeniowej, z wyjątkiem trzech do pięciu nukleotydów zarówno na pięciu końcach, jak i na końcach każdej spinki do włosów, które będą służyć jako akceptor dla nowych spinek do włosów.

Wklej sekwencje spinki do włosów żądanych mikro RNA, aby zastąpić wcześniej usunięte spinki do włosów. Dodaj pożądane sekwencje restrykcyjne w obu flankujących regionach genu trans, aby ułatwić subklonowanie do wybranych wektorów dostarczania. Sprawdź, czy wybrane sekwencje ograniczeń nie są obecne w samej sekwencji.

Aby zweryfikować dwuwymiarową strukturę genu trans, skopiuj pełną sekwencję transgeniczną do programu do przewidywania struktury RNA Webfold. Wybierz standardowe ustawienia programu i kliknij kontynuuj. Przeanalizuj wynik graficzny, szczególnie pod kątem obecności dobrze zdefiniowanych spinek do włosów w obecności dwuniciowych struktur łodygowych, które mają co najmniej 11 nukleotydów proksymalnie do miejsca cięcia mikroprocesora.

Zwróć również uwagę na brak punktów rozgałęzień w sekwencjach spinek do włosów. W tym momencie gen trans jest gotowy do wytworzenia w procesie syntezy genów i sklonowania do pożądanych wektorów dostarczania. Metoda ta pozwoliła na scharakteryzowanie modułu trzech mikro RNA, które są konsekwentnie regulowane w dół w guzach mózgu, które ulegają koekspresji specyficznie podczas różnicowania neuronów.

Potwierdzono wzorce koekspresji modułów mikro RNA podczas stresu genotoksycznego, co sugeruje silną synergiczną aktywność między tymi trzema mikro RNA. Zaprojektowany gen trans może jednocześnie rekapitulować ekspresję trzech mikro RNA w komórkach glejaka, zarówno in vitro, jak i in vivo, ze znaczącą ingerencją w biologię guza i obiecującą możliwością zastosowania translacyjnego. Dodatkowo, klaster transgeniczny był również funkcjonalny w modelu raka piersi.

Kluczowym wymogiem tego protokołu jest utrzymanie pierwotnego rozmiaru rozszczepienia procesora w genie trans. I upewnij się, że struktura pętli łodygi chimerycznych spinek do włosów z mikro RNA jest zachowana. Dzięki tej metodzie możemy skoncentrować wiele biologicznie aktywnych genów mikro RNA w bardzo krótkie sekwencje DNA, które można dosłownie wpleść w dowolne wektory dostarczania do zastosowania w terapii genowej.

Metoda ta jest idealna do badania funkcjonalnej interakcji między różnymi mikro RNA i do ingerowania w złożone wieloczynnikowe szlaki komórkowe, które w przeciwnym razie wymagałyby wielu kombinacji leków.