Name: Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę inżynierii sztucznych klastrów miRNA do terapii genowej w glejaku. Protokół umożliwia równoczesną modulację wielu mikroRNA w komórkach eukariotycznych z minimalizacją kroków klonowania molekularnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować członkom Laboratorium Neuroonkologii Harveya Cushinga za wsparcie i konstruktywną krytykę. Prace te były wspierane przez granty NINDS K12NS80223 i K08NS101091 dla P. P.

1. Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku
<ol>
	<li>Analiza szerokiej różnicowej ekspresji miRNA w glejaku a mózgu
	<ol>
		<li>Po pierwsze, określ najbardziej znacząco rozregulowane miRNA w guzie. Można to osiągnąć za pomocą co najmniej trzech różnych metod:
		<ol>
			<li>Przeszukaj atlas genomu raka, który znajduje się pod adresem https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, aby uzyskać dane sekwencjonowania11.</li>
			<li>Wykonaj analizę mikromacierzy ze świeżej próbki operacyjnej12.</li>
			<li>Użyj wcześniej opublikowanych zestawów danych13. 
			nuta: Niezależnie od wybranej metody, wynik dostarcza masowy zestaw miRNA, których ekspresja jest statystycznie skorelowana (bezpośrednio lub odwrotnie) z biologią guza. Ta początkowa grupa stanowi pulę miRNA, które są dalej analizowane w celu identyfikacji podzbioru miRNA wykazujących najbardziej rygorystyczne powiązanie funkcjonalne poprzez przeprowadzenie bardziej dynamicznej analizy zmian ekspresji, jak omówiono poniżej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza ekspresji miRNA specyficzna dla danego stanu
	<ol>
		<li>Indukcja różnicowania komórek:
		<ol>
			<li>Używaj wstępnie powlekanych plastikowych naczyń z poli-D-lizyny (PDL), aby sprzyjać tworzeniu kultury jednowarstwowej. W przypadku powlekania naczyń należy rozpuścić PDL w wodzie o stężeniu 100 μg/ml. Użyj 1 ml roztworu na 25cm2 powierzchni. Przepłukać 2x PBS 6 h po zastosowaniu roztworu PDL.</li>
			<li>Umieść ludzkie nerwowe komórki macierzyste w równych ilościach (100 000 komórek/5 ml) w pożywce z komórek macierzystych (podłoże neuropodstawowe + suplement B27 + 20 ng / mL EGF / FGF), pożywce do różnicowania astrocytów (DMEM + 10% FBS) lub pożywce różnicującej neurony (podłoże neuropodstawowe + suplement B27, + 2 μM kwas retinowy)14. Protokół różnicowania oligodendrocytów wymaga dodania IGF-1 (200 ng/mL) po usunięciu EGF/FGF14,15.</li>
			<li>Po posiewie komórek umieścić w inkubatorze na 1 tydzień w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ekstrakcja RNA:
		<ol>
			<li>Po 7 dniach wyjmij komórki z inkubatora i usuń pożywkę.</li>
			<li>Umyj komórki PBS (5 ml). Następnie dodaj 1 ml odczynnika do lizy (patrz tabela materiałów) w celu lizy komórek i zeskrob komórki do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml za pomocą skrobaka do komórek. Probówki zawierające zlizowane komórki należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.</li>
			<li>Przejdź do całkowitej izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza ekspresji miRNA:
		<ol>
			<li>Określ ilościowo różnicową ekspresję specyficznych miRNA zidentyfikowanych w kroku 1.1 między trzema wzorcami różnicowania za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, przy użyciu sond TaqMan i zgodnie z protokołami producenta dotyczącymi odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Walidacja klastrów miRNA przez wyzwania specyficzne dla stresu
	<ol>
		<li>Hodowla komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego G34 w podłożu neurobazalnym + suplement B27 + 20 ng / mL EGF / FGF. Zacznij od 1 x 106 komórek w 5 ml w kolbie o niskiej nasadce 25 cm2.</li>
		<li>Zaczynając 48 godzin po posiewie, co 5 dni dodawać podwajające stężenie czynnika alkilującego DNA temozolomidu (TMZ) w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Zacznij od 5 μM przez 5 dni. Po 5 dniach usuń pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką bez temozolomidu, aby komórki, które przeżyły, mogły się zregenerować. Po 48 godzinach dodać 10 μM TMZ i inkubować przez kolejne 5 dni.</li>
			<li>Powtórz krok 1.3.2.1, podwajając stężenie TMZ za każdym razem, aż do osiągnięcia stężenia co najmniej 100 μM i komórki staną się odporne na lek10.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W równoległym eksperymencie napromieniuj komórki G34 w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Rozpoczynając 48 godzin po posianiu 1 x 106 komórek w 5 ml w kolbie o niskim mocowaniu o średnicy 25cm2, naświetlić komórki energią 2 Gy (dopuszczalny jest każdy promiennik zapewniający emisję fotonów). Włóż komórki z powrotem do inkubatora i nie przeszkadzaj. Po 48 godzinach należy ponownie napromienić ogniwa dodatkowymi 2 Gy energii.</li>
			<li>Powtórz krok 1.3.3.1 4x, aż do uzyskania łącznie 10 Gy energii.</li>
			<li>Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze i pozostawić je do odzyskania w świeżej pożywce przez co najmniej 5 dni przed dalszą analizą.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po indukcji oporności należy poddać komórki lizie za pomocą odczynnika do lizy i wyekstrahować całkowite RNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Przeanalizuj ekspresję specyficznych miRNA zidentyfikowanych w sekcjach 1.1-1.2, jak opisano w kroku 1.2.1 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka funkcjonalnej konwergencji zgrupowanych miRNA
	<ol>
		<li>Uzyskaj przewidywany cel każdego miRNA zdefiniowanego w sekcjach 1.2-1.3 uzyskany za pomocą narzędzi do przewidywania celowania w miRNA. 
		nuta: Zazwyczaj korzystamy z TargetScan, ponieważ jego algorytm jest okresowo aktualizowany16. Dodatkowymi narzędziami do przewidywania są: miRanda17, miRDB18 oraz DIANA-miRPath19. Wszystkie te programy są darmowymi aplikacjami internetowymi.
		<ol>
			<li>Na pierwszej stronie Targetscan wybierz interesujące Cię miRNA z wstępnie wypełnionego menu rozwijanego. Kliknij przycisk Prześlij.</li>
			<li>Pobierz wynikową listę celów jako arkusz kalkulacyjny, korzystając z łącza Pobierz tabelę (Rysunek uzupełniający 1).</li>
			<li>Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia wyników fałszywie dodatnich, w dalszych analizach uwzględniaj tylko cele w kolumnie Chronione witryny. Dalsze rygorystyczności można również uzyskać, stosując dodatkowe programy do przewidywania miRNA (patrz wyżej) i uwzględniając tylko cele, które są wspólne dla wszystkich algorytmów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sklasyfikuj wynikowe cele zgodnie z kategoriami ontologii genów za pomocą ToppGene Suite20, aby ocenić wzbogacenie szlaków, które są wspólne dla każdego miRNA.
		<ol>
			<li>Wklej listę celów uzyskanych z kroku 1.4.1 w oknie "Trening zestawu genów", używając symbolu HGNC jako typu wpisu. Kliknij przycisk Prześlij> Rozpocznij. Program dostarczy tabelę wyjściową pokazującą najważniejsze kategorie "Go" dla wprowadzonej listy genów (rysunek uzupełniający 2).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby ostatecznie ustalić wkład każdego miRNA w regulację wspólnego szlaku lub procesu komórkowego (w tym przypadku regulacji chromatyny), sprawdź każdy cel uzyskany w kroku 1.4.1 z pełną listą genów zaangażowanych w określony proces komórkowy (tj. regulację chromatyny), korzystając z funkcji diagramu Venna dostępnej na stronie internetowej Bioinformatyki i Genomiki Ewolucyjnej http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn. 
		nuta: Ten program pozwala na przecięcie wielu grup w tym samym czasie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Specyficzne unikalne cele dostarczane przez każdą miRNA są następnie opisywane i wybierane do dalszych eksperymentów funkcjonalnych.
		<ol>
			<li>Na stronie głównej programu prześlij lub skopiuj/wklej listę, jeśli docelowe mRNA dla każdego miRNA lub zainteresowania w odpowiednich oknach. Nazwij każdą listę unikatowym identyfikatorem.</li>
			<li>Kliknij przycisk Prześlij. Program dostarczy wizualny wynik diagramu Venna z liczbą genów w każdym sektorze, a także pełną listę mRNA dla każdego podzbioru i kombinacji przecięć.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Składanie modułów miRNA w polistroniczny klaster transgeniczny
<ol>
	<li>Przygotowanie rusztowania transgenicznego na bazie locus klastra miR-17-92
	<ol>
		<li>Uzyskaj sekwencję nukleotydową klastra miR-17-92 z przeglądarki genomu Ensembl 21. Wybierz sekwencję "rdzenia" ~ 800 par zasad obejmującą wszystkie sześć kodowanych spinek do włosów miRNA locus i co najmniej 200-nukleotydowe sekwencje flankujące zarówno przed (5'), jak i za (3') sekwencji rdzenia.</li>
		<li>Wklej powyższą sekwencję do dowolnego programu do edycji słów.</li>
		<li>Zdefiniuj sekwencję każdego z sześciu natywnych spinów do włosów, pobierając je w miRBase22. Zaznacz każdą z tych sekwencji w zakresie poprzednio zidentyfikowanej sekwencji "podstawowej". Wszelkie sekwencje między każdą spinką do włosów reprezentują sekwencje dystansowe, które są ważne dla prawidłowego przetwarzania transgenu.</li>
		<li>Usuń natywne sekwencje spinek do włosów z sekwencji "rdzenia", z wyjątkiem 3-5 nukleotydów na końcach 5' i 3' każdej spinki do włosów, które będą służyć jako akceptor dla nowych spinek do włosów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa nowego transgenu kodującego wiele wybranych miRNA
	<ol>
		<li>Uzyskaj sekwencje spinki do włosów miRNA, które mają być nadmiernie eksprymowane w transgenie z miRBazy. Uważnie zwróć uwagę na specyficzne nukleotydy, które są miejscami rozszczepienia mikroprocesora.</li>
		<li>Zastąp usunięte spinki do włosów (krok 2.1.4) sekwencjami spinek do włosów pożądanych miRNA uzyskanych w kroku 2.2.1.</li>
		<li>Dodaj pożądane sekwencje restrykcyjne w obu flankujących regionach transgenu, aby ułatwić subklonowanie do wybranych wektorów dostarczania. Sprawdź, czy wybrane sekwencje ograniczeń nie są obecne w samej sekwencji.</li>
		<li>W przypadku kontroli ujemnych należy użyć zaszyfrowanych sekwencji 20-nukleotydowych, aby zastąpić naturalną sekwencję 20-nukleotydową każdego dojrzałego miRNA. Wygeneruj te zaszyfrowane sekwencje za pomocą narzędzia online, takiego jak https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weryfikacja dwuwymiarowej struktury transgenu
	<ol>
		<li>Skopiuj pełną sekwencję transgeniczną do programu do przewidywania struktury RNA RNAweb Fold23.</li>
		<li>Korzystając ze standardowych ustawień programu, kliknij przycisk Kontynuuj.</li>
		<li>Przeanalizuj wynik graficzny, szczególnie pod kątem obecności dobrze zdefiniowanych spinek do włosów i obecności dwuniciowych struktur łodygowych co najmniej 11 nukleotydów proksymalnych do miejsca cięcia mikroprocesora. Zwróć również uwagę na brak punktów rozgałęzień w sekwencjach spinek do włosów (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Otrzymywanie transgenów przez syntezę DNA
<ol>
	<li>Po zaprojektowaniu i walidacji in silico chimerycznego klastra miRNA, uzyskaj sekwencję roboczą za pomocą syntezy DNA od komercyjnych dostawców24 i przystąp do dalszego klonowania do wektorów i dostarczania transgenu. Użyliśmy wektorów lentiwirusowych do dostarczania in vitro10 oraz wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do dostarczania wewnątrzczaszkowego in vivo25.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer%27s+Disease%3A+A+Meta-Analysis+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767(2018).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciencesof+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li>
<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs%3A+tiny+regulators+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li>
<li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124%2C+%E2%88%92128%2C+and+%E2%88%92137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li>
<li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442(2019).</li>
<li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li>
<li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li>
<li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li>
<li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).</li>
<li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miRNA.org+resource%3A+targets+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li>
<li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRD%28B%29+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li>
<li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIANA-miRPath+v3.0%3A+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li>
<li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembl+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li>
<li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+from+miRNA+sequences+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vienna+RNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).</li>
<li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly%3A+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).</li>
<li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li>
<li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li>
<li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li>
<li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li>
<li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).</li>
<li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Protokół ten opiera się na założeniu, że miRNA nie funkcjonują w izolacji, ale są biologicznie istotne poprzez pracę w grupach, a grupy te są determinowane transkrypcyjnie przez określone konteksty komórkowe26. Aby uzasadnić to podejście z perspektywy translacyjnej, wprowadzono protokół uzupełniający, który umożliwia odtworzenie tego wzorca multi-miRNA w komórkach/tkankach. Jest to możliwe dzięki wykorzystaniu stosunkowo prostej biogenezy miRNA, przy czym rozpoznanie charakterystycznej spinki do w...

miRNA oferują niezrównaną możliwość rozwoju szerokiego podejścia terapii genowej do wielu chorób1,2,3, w tym raka4,5. Opiera się to na kilku unikalnych cechach tych biologicznych molekuł, w tym ich niewielkich rozmiarach6, prostej biogenezie7 i naturalnej tendencji do funkcjonowania w asocjacji8. Wiele chorób charakteryzuje się specyficznymi wzorcami ekspresji miRNA, które często zbiegają się w regulacji złożonych funkcji biologicznych9. Celem tej metody jest najpierw zdefiniowanie strategii identyfikacji grup miRNA, które są synergistycznie istotne dla określonych funkcji komórkowych. W związku z tym zapewnia strategię ponownego ustanowienia takich kombinacji miRNA w dalszych badaniach i zastosowaniach.
Ta metoda pozwala na funkcjonalną analizę wielu miRNA jednocześnie, wykorzystując ich jednoczesne celowanie w dużą liczbę mRNA, rekapitulując w ten sposób złożone krajobrazy chorób. Podejście to zostało niedawno zastosowane do zdefiniowania grupy trzech miRNA, które 1) są jednocześnie regulowane w dół w raku mózgu i 2) wykazują silny wzorzec koekspresji podczas różnicowania neuronalnego, a także w odpowiedzi na stres genotoksyczny przez promieniowanie lub środek alkilujący DNA. Kombinatoryczna reekspresja tego modułu trzech miRNA za pomocą opisanej poniżej metody grupowania powoduje głęboką ingerencję w biologię komórek nowotworowych i może być łatwo wykorzystana jako strategia terapii genowej w badaniach przedklinicznych10. Protokół ten może być szczególnie interesujący dla osób zajmujących się badaniami nad miRNA i jego zastosowaniami translacyjnymi.

<table><tbody><tr><td>0,4% niska temperatura topnienia agarozy&nbsp;</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70058</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mikro; M sterylna jednostka filtrująca</td><td>Merck Millipore</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Myszy atymiczne (FoxN1 nu/nu)</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement&nbsp;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych</td><td>Skrobak do komórek Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>, 16cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Cez 137&nbsp;</td><td>JL Sheperd and Associates</td><td>Core Facility (Harvard Medical School)</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, pirogronian&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y rozwiązanie&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie pierwotne komórki macierzyste glejaka pierwotnego (GBM62)</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez dr E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Ludzkie pierwotne komórki macierzyste glejaka (MGG4)</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Wektor lentiwirusowy pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>System Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 11668019</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka chłodzona</td><td>Eppendorf</td><td>model nr 5424 R, nr kat. 5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Szybkoobrotowe probówki wirówkowe z poliwęglanu okrągłodennego&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>Neuronalne komórki progenitorowe (NPC)</td><td></td><td></td><td>Dostarczone przez dr Jakuba Godlewskiego (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Neurobasel Medium&nbsp;</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon eclipse Ti zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon, Japonia</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>probówki PCR&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego 94/16&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF-podstawowy&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Gibco</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania RNA</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Termocykler&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Mikropromiennik sterowany obrazem dla małych zwierząt&nbsp;</td><td>Xstrahal Life Sciences, Wielka Brytania</td><td>Główny zakład (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Sorvall WX+&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>75000100</tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym StepOne</td><td>Biosystemy stosowane&nbsp;</td><td></td><td></td>4376357</tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego SterilGARD&nbsp;</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td><td>Kultura typu amerykańskiego Collecti</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomid</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek optymalna temperatura cięcia&nbsp;</td><td>Odczynnik Fisher Scientific</td><td>NC9636948</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Odczynnik do lizy</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&nbsp;</td><td>Kultura typu amerykańskiego Collecti</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>System ekspresji wektorowej ViraPower&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>Woda, klasa HPLC</td><td>Fisher</td><td>W54</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka funkcjonalnie powiązanych mirna w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

Biologiczne znaczenie mikroRNA (miRNA) w zdrowiu i chorobie w znacznym stopniu zależy od specyficznych kombinacji wielu jednocześnie zderegulowanych miRNA, a nie od działania pojedynczego miRNA. Charakterystyka tych specyficznych modułów miRNA jest podstawowym krokiem w maksymalizacji ich wykorzystania w terapii. Jest to niezwykle istotne, ponieważ ich kombinatoryczne atrybuty mogą być praktycznie wykorzystane. Opisano tutaj metodę definiowania specyficznej sygnatury miRNA istotnej dla kontroli onkogennych represorów chromatyny w glejaku. Podejście to najpierw definiuje ogólną grupę miRNA, które są rozregulowane w guzach w porównaniu z normalną tkanką. Analiza jest dodatkowo udoskonalana przez zróżnicowane warunki hodowli, podkreślając podgrupę miRNA, które ulegają jednoczesnej ekspresji podczas określonych stanów komórkowych. Wreszcie, miRNA, które spełniają te filtry, są łączone w sztuczne policistroniczne transgeny, które są oparte na rusztowaniu naturalnie istniejących genów klastrów miRNA, a następnie wykorzystywane do nadekspresji tych modułów miRNA do komórek odbiorczych.

Niniejsza metoda pozwoliła na charakterystykę modułu trzech miRNA, które są konsekwentnie obniżone w guzach mózgu, współwyrażane specyficznie podczas różnicowania neuronalnego (Rysunek 1) i zaangażowane w odpowiedź przeżycia guza po terapii (Rysunek 2). Odbywa się to poprzez regulację złożonej onkogennej ścieżki represji chromatyny. Ten wzorzec współwyrażania sugerował silne synergistyczne działanie tych trzech miRNA (<strong cla...

Opisany tutaj jest protokół charakteryzujący moduły biologicznie synergicznych miRNA i ich łączenie w krótkie transgeny, co pozwala na jednoczesną nadekspresję dla zastosowań terapii genowej.

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Protokół ten pozwala na jednoczesną modulację wielu mikro RNA w komórkach eukariotycznych i opiera się na bardzo prostej i elastycznej metodzie, która minimalizuje etapy klonowania molekularnego. Technika ta ma implikacje dla badania interakcji funkcjonalnych mikro RNA in vitro, ale co ważniejsze, stanowi platformę do bardziej efektywnego wykorzystania mikro RNA w terapii. Opracowaliśmy go i stosowaliśmy głównie w kontekście raka mózgu, ale ma on zastosowanie do wszystkich chorób, w których zaangażowanych jest wiele zmian w ekspresji genów.Przetestowaliśmy nasze sztuczne geny trans w innych modelach, takich jak linie raka piersi i tarczycy, pokazując odtwarzalność tej techniki. Podstawowa wiedza z zakresu bioinformatyki i biologii mikro RNA jest pomocna w tym protokole, ale nie jest niezbędna. Podejście bioinformatyczne jest ważne dla zdefiniowania odpowiednich kombinacji mikro RNA i TRK-11, podczas gdy znajomość przetwarzania mikro RNA jest ważna, aby zrozumieć, w jaki sposób te różne mikro RNA mogą być łączone w sztuczne klastry DNA, które mogą być z powodzeniem przetwarzane po ustabilizowaniu się w określonych komórkach.Aby pokryć danie, najpierw rozpuść poli-D-lizynę w wodzie o stężeniu 100 mikrogramów na mililitr. Wlej roztwór do naczynia w ilości jednego mililitra roztworu na 25 centymetrów kwadratowych powierzchni. Zakręć naczyniem, aby upewnić się, że całe danie jest pokryte.Po sześciu godzinach odessać roztwór poli-D-lizyny i dwukrotnie spłukać PBS. Płytki ludzkich nerwowych komórek macierzystych w ilości 100 000 komórek na pięć mililitrów pożywki, albo w pożywce z komórek macierzystych, pożywce do różnicowania astrocytów lub pożywki do różnicowania neuronów. Po posianiu komórek umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla na tydzień i przystąp do przeprowadzenia analizy ekspresji mikro RNA zgodnie z manuskryptem.Aby wyhodować komórki macierzyste glejaka GBM-34, zacznij od jednej razy dziesięć do piątej komórki i pięciu mililitrów pożywki neuropodstawowej w kolbie o niskim natężeniu 25 centymetrów kwadratowych. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla. 48 godzin po posianiu dodawać podwajające stężenie środka alkilującego DNA, temozolomidu, co siedem dni.Zacznij od dodania pięciu mikromolowych TMZ uzupełnionych w pięciomililitrowym podłożu przez pięć dni. Po pięciu dniach usuń pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką bez temozolomidu, aby komórki, które przeżyły, mogły się zregenerować. Po 48 godzinach dodać 10 mikromolowych temozolomidów i inkubować przez kolejne pięć dni.Powtarzać podwajanie temozolomidu do momentu osiągnięcia stężenia co najmniej 100 mikromolów i uzyskania przez komórki oporności na lek. Po indukcji oporności połóż komórki za pomocą 1 mililitra odczynnika do lizy. Wyekstrahuj całkowite RNA i przeanalizuj ekspresję określonych mikro RNA zgodnie z manuskryptem.Aby uzyskać przewidywany cel każdego wcześniej zdefiniowanego mikro RNA, należy użyć narzędzi predykcyjnych do celowania w mikro RNA. Na pierwszej stronie TargetScan wybierz interesujący Cię mikro RNA z wstępnie wypełnionego menu rozwijanego. Kliknij przycisk Prześlij.Pobierz wynikową listę celów jako arkusz kalkulacyjny, korzystając z linku do tabeli pobierania. Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia wyników fałszywie dodatnich, uwzględnij tylko cele w kolumnie Witryny chronione i analizie podrzędnej. Dodatkowe programy predykcyjne mikro RNA są bardziej rygorystyczne i obejmują tylko cele, które są wspólne dla wszystkich algorytmów.Następnie otwórz pakiet ToppGene 20. Aby ocenić wzbogacenie szlaków, które są wspólne dla każdego mikro RNA, wklej listę celów uzyskanych w oknie zestawów genów treningowych. Kliknij Symbol HGNC jako typ wpisu.Kliknij przycisk Prześlij i uruchom. Program udostępnia tabelę wyjściową przedstawiającą najważniejsze kategorie GO dla wprowadzonej listy genów. Aby ostatecznie ustalić wkład każdego mikro RNA w regulację wspólnego szlaku lub procesu komórkowego, otwórz funkcję diagramu Venna dostępną na stronie internetowej Bioinformatyki i Genomiki Ewolucyjnej.Porównaj każdy uzyskany cel z pełną listą genów zaangażowanych w określony proces komórkowy. Jeśli docelowe informacyjne RNA dla każdego interesującego mikro RNA znajdują się w odpowiednich oknach, prześlij lub skopiuj i wklej listę. Nazwij każdą listę unikatowym identyfikatorem.Kliknij przycisk Prześlij. Program zapewnia wizualny wynik diagramu Venna z liczbą genów w każdym sektorze, a także pełną listą informacyjnych RNA dla każdego podzbioru i kombinacji przecięć. Aby zgrupować wybrane mikro RNA w funkcjonalny gen trans, należy uzyskać rusztowanie transgeniczne oparte na locus klastra miR-17-92.Uzyskaj sekwencję nukleotydów z przeglądarki genomu zespołowego. Wybierz sekwencję rdzenia około 800 par zasad obejmującą wszystkie sześć kodowanych spinek do włosów mikro RNA locus i co najmniej 200 sekwencji flankujących nukleotydy zarówno przed, jak i za sekwencją rdzenia. Wklej sekwencję do dowolnego programu do edycji słów.Zdefiniuj sekwencję każdego z sześciu natywnych szpilek do włosów, pobierając je w bazie miR. Zaznacz każdą z tych sekwencji w zakresie poprzednio zidentyfikowanej sekwencji rdzeniowej. Wszystkie sekwencje między poszczególnymi spinkami do włosów reprezentują sekwencje dystansowe.Następnie uzyskaj sekwencje spinki do włosów mikro RNA, które mają ulegać nadekspresji w genie trans z zasady miR. Uważnie zwróć uwagę na specyficzne nukleotydy, które znajdują się w miejscach rozszczepienia mikroprocesora. Usuń natywne sekwencje spinki do włosów z sekwencji rdzeniowej, z wyjątkiem trzech do pięciu nukleotydów zarówno na pięciu końcach, jak i na końcach każdej spinki do włosów, które będą służyć jako akceptor dla nowych spinek do włosów.Wklej sekwencje spinki do włosów żądanych mikro RNA, aby zastąpić wcześniej usunięte spinki do włosów. Dodaj pożądane sekwencje restrykcyjne w obu flankujących regionach genu trans, aby ułatwić subklonowanie do wybranych wektorów dostarczania. Sprawdź, czy wybrane sekwencje ograniczeń nie są obecne w samej sekwencji.Aby zweryfikować dwuwymiarową strukturę genu trans, skopiuj pełną sekwencję transgeniczną do programu do przewidywania struktury RNA Webfold. Wybierz standardowe ustawienia programu i kliknij kontynuuj. Przeanalizuj wynik graficzny, szczególnie pod kątem obecności dobrze zdefiniowanych spinek do włosów w obecności dwuniciowych struktur łodygowych, które mają co najmniej 11 nukleotydów proksymalnie do miejsca cięcia mikroprocesora.Zwróć również uwagę na brak punktów rozgałęzień w sekwencjach spinek do włosów. W tym momencie gen trans jest gotowy do wytworzenia w procesie syntezy genów i sklonowania do pożądanych wektorów dostarczania. Metoda ta pozwoliła na scharakteryzowanie modułu trzech mikro RNA, które są konsekwentnie regulowane w dół w guzach mózgu, które ulegają koekspresji specyficznie podczas różnicowania neuronów.Potwierdzono wzorce koekspresji modułów mikro RNA podczas stresu genotoksycznego, co sugeruje silną synergiczną aktywność między tymi trzema mikro RNA. Zaprojektowany gen trans może jednocześnie rekapitulować ekspresję trzech mikro RNA w komórkach glejaka, zarówno in vitro, jak i in vivo, ze znaczącą ingerencją w biologię guza i obiecującą możliwością zastosowania translacyjnego. Dodatkowo, klaster transgeniczny był również funkcjonalny w modelu raka piersi.Kluczowym wymogiem tego protokołu jest utrzymanie pierwotnego rozmiaru rozszczepienia procesora w genie trans. I upewnij się, że struktura pętli łodygi chimerycznych spinek do włosów z mikro RNA jest zachowana. Dzięki tej metodzie możemy skoncentrować wiele biologicznie aktywnych genów mikro RNA w bardzo krótkie sekwencje DNA, które można dosłownie wpleść w dowolne wektory dostarczania do zastosowania w terapii genowej.Metoda ta jest idealna do badania funkcjonalnej interakcji między różnymi mikro RNA i do ingerowania w złożone wieloczynnikowe szlaki komórkowe, które w przeciwnym razie wymagałyby wielu kombinacji leków.

characterization-functionally-associated-mirnas-glioblastoma-their

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Tutaj opisujemy skuteczny i wszechstronny protokół do indukcji, monitorowania i analizy nowych glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o histopatologicznej charakterystyce ludzkiego GBM.

Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

MikroRNA odgrywają kluczową rolę w mózgu i są potencjalnymi celami do modelowania neurodegeneracji. Jednak zaburzanie poziomów miRNA jest trudne ze względu na krótką długość miRNA i niedostępność tkanki mózgowej. Ten film przedstawia metodę projektowania antagomiru i dostarczania specyficznego dla mózgu przy użyciu neuropeptydu u myszy.

Prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu miRNA

Neurosfery wyhodowane jako kultury 3D stanowią potężne narzędzie do badania biologii glejaka. W tym miejscu przedstawiamy protokół przeprowadzania immunohistochemii przy zachowaniu struktury 3D neurosfer glejaka poprzez zatapianie parafiny. Metoda ta umożliwia scharakteryzowanie właściwości neurosfery glejaka, takich jak łodyga i różnicowanie neuronalne.

Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na kulturach neurosfery 3D glejaka zatopionych w parafinie

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Dysregulacja proteomiczna odgrywa ważną rolę w rozprzestrzenianiu się glejaków naciekających dynacyjnie, ale kilka istotnych białek pozostaje niezidentyfikowanych. Cyfrowe przetwarzanie przestrzenne (DSP) oferuje wydajne, wysokoprzepustowe podejście do charakteryzowania zróżnicowanej ekspresji białek kandydujących, które mogą przyczyniać się do inwazji i migracji glejaków naciekających.

Cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.

Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metodę inżynierii sztucznych klastrów miRNA do terapii genowej w glejaku. Protokół umożliwia równoczesną modulację wielu mikroRNA w komórkach eukariotycznych z minimalizacją kroków klonowania molekularnego.

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Przeglądaj więcej filmów