Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Nasz protokół może być wykorzystany do zbadania ruchliwości i lokalizacji organelli lub białek astrocytarnych w kontrolowanym środowisku zewnątrzkomórkowym i łagodnych stanach chorobowych. W przeciwieństwie do preparatów utrwalonych MHA, które zapewniają pojedyncze migawki lokalizacji białek i organelli, nasza technika obrazowania na żywo może być wykorzystana do analizy dynamiki cząstek w poszczególnych żywych astrocytach. Dzień przed transfekcją wysiewa astrocyty w odpowiedniej gęstości do obrazowania po 24 do 48 godzinach od transfekcji.

Rozcieńczyć odczynnik do lipofekcji w zredukowanym podłożu surowicy do odpowiedniego stężenia doświadczalnego. Rozcieńczyć pięć mikrogramów DNA o wysokiej czystości w 250 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy i dodać do probówki pięć mikrolitrów odczynnika wzmacniającego lipofekcję. Wymieszać odczynnik do lipofekcji z równą objętością mieszanki wzmacniacza lipofekcji DNA i inkubować roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji usunąć supernatant z hodowli astrocytów i dodać kroplami 100 mikrolitrów mieszanki transfekcyjnej do komórek. Po sześciu godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla zastąp kompleks transfekcji odpowiednią objętością pożywki do hodowli astrocytów i włóż komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na dodatkowe 24 do 72 godzin. Na 30 minut przed obrazowaniem rozcieńczyć odpowiednią lizosomalną sondę znakującą w 200 mikrolitrach pożywki do hodowli astrocytów do stężenia roboczego jednego mikromola i znakować astrocyty sondą przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie przemyj komórki jednym raz ciepłym podłożem do hodowli astrocytów i zastąp płukanie pożywką do obrazowania. Natychmiast po znakowaniu sondy umieść pojemnik na hodowlę astrocytów w odpowiednim adapterze na stoliku mikroskopu i za pomocą światła fluorescencyjnego EBI zlokalizuj komórki wyrażające białka fluorescencyjne lub sondę. Użyj aparatu cyfrowego, aby dostosować oświetlenie próbki fluorescencyjnej, aby zobrazować wybrane komórki oraz dostosować ostrość i powiększyć do pojedynczej komórki.

Następnie użyj funkcji Zoom i Definite Focus, aby uzyskać pojedynczą serię poklatkową Z-stack z częstotliwością jednej klatki co dwie sekundy w odstępach czasu od 300 do 500 sekund. Zapisz i wyeksportuj obrazy poklatkowe jako pliki stosu AVI lub TIFF. Aby przeanalizować obrazy poklatkowe, otwórz sekwencję obrazów poklatkowych w ImageJ lub Fiji i użyj narzędzia Podziel kanał, aby podzielić kanały.

Na ośmiobitowym obrazie kanału zielonego użyj narzędzia Linia segmentowana, aby prześledzić linię wzdłuż trajektorii cząstek, używając tej samej pożądanej konwencji kierunkowej dla wszystkich filmów, tak aby polaryzacja była spójna we wszystkich badanych komórkach i między nimi. Kliknij dwukrotnie narzędzie Linia, aby dostosować szerokość linii do grubości ścieżki i uruchom makro Rysuj Kymo wtyczki Kymo ToolBox, używając szerokości linii 10. Pojawi się monit z prośbą o kalibrację obrazu w czasie i przestrzeni.

Po kalibracji zostaną wygenerowane kimografy, które można zapisać jako pliki TIFF. Aby przypisać trajektorie cząstek, użyj narzędzia Linia segmentowa, aby ręcznie śledzić każdą cząstkę w kimografie przez cały czas akwizycji i użyj menedżera ROI, aby zarejestrować trajektorię każdej cząstki jako obszar zainteresowania. Zapisz wszystkie obszary zainteresowania dla każdego filmu poklatkowego do dalszej analizy i uruchom makro Analizuj Kymo wtyczki Kymo ToolBox.

Otworzy się okno z prośbą o zdefiniowanie zewnętrznego kierunku ruchu cząstek od jądra interesującej komórki z menu rozwijanego. Prędkość graniczna powinna być zdefiniowana zgodnie z czułością oprogramowania dla każdego ładunku będącego przedmiotem zainteresowania, a szerokość linii powinna być dostosowana do grubości trajektorii każdej cząstki. Rejestr wszystkich danych i ekstrapolowane współrzędne logarytmiczne powinny służyć do obliczania różnych parametrów transportu ładunku.

Kliknij przycisk OK. Dane obliczone dla poszczególnych ścieżek zostaną następnie zebrane dla każdego kimografu i zapisane w plikach tekstowych specyficznych dla każdego obrazu. Połączenie leczenia arabinozydem cytozyny ze strategią oczyszczania opartą na wstrząsaniu wzbogaca czystość kultur astrocytów w porównaniu z tradycyjnymi protokołami, które obejmują tylko etap oczyszczania.

Transfekcja oparta na lipofekcji umożliwia przejściową ekspresję białek na poziomach optymalnych do obrazowania żywych komórek, nie powodując toksyczności ani nie wpływając na żywotność astrocytów. Podobnie, zastosowanie sondy fluorescencyjnej pozwala na szybkie i skuteczne znakowanie kwaśnych organelli endolizosomalnych w celu śledzenia dynamiki organelli i astrocytów. Dane poklatkowe z obrazowania mogą być wykorzystane do generowania kymografów, które śledzą ruch ładunku w czasie i przestrzeni.

W tych kymografach ruch następczy wskazanego ładunku jest reprezentowany przez trajektorie o ujemnym nachyleniu, podczas gdy ruch wsteczny jest reprezentowany przez trajektorie o dodatnim nachyleniu. Stacjonarne pęcherzyki pojawiają się jako trajektorie pionowe. W tej analizie kwantyfikacja strumienia określonego ładunku przez obszar astrocytu ujawniła różnice w procentowym odsetku cząstek modalnych wśród ładunków, które są prawdopodobnie reprezentatywne dla ich normalnej ruchliwości linii podstawowej w regionie astrocytu, w którym uzyskano filmy.

Precyzyjne odwzorowanie zmiany położenia X, Y w pełnej skali czasowej dla każdej cząstki uzyskane z kimografu może być również wykorzystane do oceny innych parametrów ruchu, takich jak prędkość ładunku i długość biegu. Ponieważ protokół ten wymaga wysokiej jakości hodowli astrocytów i wydajnego znakowania ładunków, czas inkubacji odczynnika do transfekcji i czas akwizycji należy dostosować do każdego plazmidu lub ładunku będącego przedmiotem zainteresowania. Protokół ten można zmodyfikować w celu scharakteryzowania zdarzeń transportowych w astrocytach w odpowiedzi na uszkodzenie komórek, toksyczność, mutacje patogenne, aktywność synaptyczną lub zmiany w środowisku wewnątrzkomórkowym lub zewnątrzkomórkowym.