Name: Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę oceny integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster w żywych tkankach. Protokół obejmuje iniekcję barwników i mikroskopię konfokalną do badania dynamiki bariery.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. F. Bryanowi Pickettowi i Dr. Rodneyowi Dale'owi za użycie sprzętu do iniekcji. Praca ta została sfinansowana z funduszy badawczych z Uniwersytetu Loyola w Chicago dla M.D., D.T. i J.J.

1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Pobieranie zarodków
	<ol>
		<li>W każdej klatce do pobierania zarodków należy użyć co najmniej 50 dziewiczych samic i 20-25 samców do pobrania. Wysiaduj te muchy w butelce z pokarmem z mąki kukurydzianej (Tabela materiałów) przez 1−2 dni przed rozpoczęciem zbiorów23. 
		nuta: Można użyć więcej much, ale stosunek samic do samców powinien być utrzymany na poziomie 2:1.</li>
		<li>Wstępnie podgrzej talerze agarowe z sokiem jabłkowym (tabela 1) w temperaturze 25 °C przez noc. 
		nuta: Jest to wymagane do prawidłowej oceny zarodków. Jeśli płytki szybko wysychają, dodaj miskę z wodą do inkubatora, aby zwiększyć wilgotność w komorze.</li>
		<li>Znieczulić muchy z kroku 1.1.1 za pomocą CO2 i przenieść muchy do klatki zbiorczej. Umieść wstępnie podgrzany talerz agarowy z sokiem jabłkowym z niewielką ilością pasty drożdżowej na otwartym końcu i przymocuj do klatki za pomocą czerwonej tulei (Tabela materiałów). W celu usunięcia starszych zarodków należy pozwolić muchom na złożenie zarodków/jaj na płycie z sokiem jabłkowym na płycie z sokiem jabłkowym przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Wyjąć klatkę zbiorczą z inkubatora. Odwróć siatkę klatki stroną do dołu i dotknij muchy w dół na dno klatki. Zastąp agar z sokiem jabłkowym nowym, wstępnie podgrzanym talerzem agarowym z sokiem jabłkowym z niewielką ilością pasty drożdżowej. Wyrzuć pierwszą płytkę.</li>
		<li>Pozwolić muszkom na złożenie zarodków/jaj na nowej płytce z sokiem jabłkowym na 1 godzinę w temperaturze 25 °C. Po upływie 1 godziny pobierania należy odrzucić tę płytkę i przejść do następnego etapu pobierania zarodków do wstrzykiwań.</li>
		<li>W celu zebrania zarodków w późnym stadium 17 (20−21 h AEL), należy pozwolić muszkom o pożądanym genotypie z kroków 1.1.1−1.1.5 położyć się na nowych, wstępnie podgrzanych płytkach agarowych z sokiem jabłkowym z niewielką ilością pasty drożdżowej w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Tabliczka wieku przez 19 godzin w inkubatorze w temperaturze 25 °C, Tak więc zarodki będą miały 20−21 godzin w momencie obrazowania. 
		nuta: Ten krok można powtórzyć w razie potrzeby w przypadku wielu rund pobierania próbek, wstrzykiwania i obrazowania.</li>
		<li>Zebrać zarodki z płytek do sitka komórkowego z siatką nylonową o grubości 70 μm, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym (PBTx; Tabela 1) pokryć powierzchnię płytki i spulchnić zarodki z powierzchni za pomocą pędzla.</li>
		<li>Zarodki dechorionatu zebrane w sitku komórkowym w 50% roztworze wybielacza (Tabela 1) na 100-milimetrowej szalce Petriego przez 5 minut, od czasu do czasu mieszając w temperaturze pokojowej. Opłucz zarodki 3x, obracając sitko komórkowe w PBTx na szalce Petriego, za każdym razem używając świeżego naczynia z PBTx.</li>
		<li>Jeśli wszystkie zarodki mają prawidłowy genotyp, należy przejść bezpośrednio do kroku 1.1.10. Jeśli uzyskanie zarodków o prawidłowym genotypie wymaga krzyżówki z muszkami heterozygotycznymi, należy wybrać zarodki o prawidłowym genotypie, wykorzystując obecność lub brak fluorescencyjnie oznaczonych chromosomów równoważących. Do wyboru genotypu należy użyć mikroskopu stereoskopowego z funkcjami fluorescencyjnymi. 
		nuta: Chromosomy równoważące oznaczone zdeformowanym żółtym białkiem fluorescencyjnym; Kruppel-Gal4, UAS-zielone białko fluorescencyjne (GFP); i twist-Gal4, UAS-GFP dobrze sprawdzają się w selekcji genotypu w późnej embriogenezie (Tabela 2)24,25,26.</li>
		<li>Za pomocą szklanej pipety przenieś zarodki z PBTx do 2% płytki z żelu agarozowego (Tabela 1). Usuń nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej. Wyrównaj ~6−8 zarodków na 2% płycie żelu agarozowego z tylną stroną po prawej i grzbietowej skierowaną do góry (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). 
		nuta: Mikropyle, mały otwór, przez który plemniki dostają się do komórki jajowej, znajduje się na przednim końcu zarodka. Tylny koniec jest bardziej zaokrąglony. Tchawica wydaje się biała i znajduje się grzbietowo w zarodku, co pozwala na rozróżnienie grzbietowej i brzusznej strony zarodka (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).</li>
		<li>Przygotuj szkiełko z jednym kawałkiem taśmy dwustronnej. Mocno dociśnij szkiełko na górze zarodków, aby przenieść je na taśmę dwustronną.</li>
		<li>Wysuszyć zarodki przez inkubację w temperaturze pokojowej przez ~25 min (nie stosuje się środka osuszającego). Po wysuszeniu przykryj zarodki olejem halowęglowym. 
		nuta: Okresy osuszania mogą się różnić w zależności od temperatury, wilgotności i wentylacji w pomieszczeniu. Okres inkubacji powinien być wykorzystany do ustawienia aparatury do wstrzykiwań i mikroskopu konfokalnego do obrazowania, jak opisano w sekcjach 2 i 3 niniejszego protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcja larw
	<ol>
		<li>Stwórz krzyżówkę z 5−10 dziewiczymi samicami much o pożądanym genotypie i o połowę mniejszą liczbą samców o pożądanym genotypie w fiolce z pokarmem z mąki kukurydzianej i inkubuj w temperaturze 25 °C23.</li>
		<li>Po 5-7 dniach, w zależności od genotypu, delikatnie zebrać wędrujące larwy trzeciego stadium z fiolki za pomocą kleszczy. Opłucz larwy w 1x PBS, aby usunąć pokarm przyklejony do larw. W razie potrzeby przenieść larwy na płytkę z sokiem jabłkowym w celu genotypowania zgodnie z opisem w kroku 1.1.9.</li>
		<li>Rozwałkuj larwy na chusteczce za pomocą pędzla, aby je wysuszyć. Przenieś 6−8 larw na szkiełko przygotowane taśmą dwustronną za pomocą kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie igieł i iniekcji próbki
<ol>
	<li>Pociągnąć igły za ściągacz do mikropipet przed rozpoczęciem stosowania tego protokołu. Zabezpiecz rurki kapilarne w ściągaczu igieł i pociągnij zgodnie ze standardowym kształtem igły i parametrami dla wstrzyknięć D. melanogaster (Tabela 3)27. Igły należy przechowywać na szalce Petriego, zakotwiczając je w glinie do czasu użycia do wstrzykiwań.</li>
	<li>Naładować igłę 5 μl dekstranu o stężeniu 10 kDa sprzężonego z chlorkiem kwasu sulforodaminy 101 (tabela materiałów) za pomocą końcówki pipety o pojemności 20 μl w żelu podczas 25-minutowego okresu suszenia zarodków (etap 1.1.12) lub bezpośrednio po przeniesieniu larw na szkiełko (etap 1.2.3).</li>
	<li>Załadować igłę do uchwytu na igłę i umieścić w mikromanipulatorze przymocowanym do stalowej podstawy (Tabela materiałów). 
	nuta: Igła powinna być prawie równoległa do stopnia mikroskopu w przypadku iniekcji zarodka i lekko pochylona w dół w przypadku wstrzyknięć larw.</li>
	<li>Ustaw aparat iniekcyjny (tabela materiałów) na 50 psi, 5−10 ms z zakresem 10. 
	nuta: Może być konieczna zmiana tych ustawień dla konkretnego używanego aparatu do wstrzykiwań.</li>
	<li>Umieść szkiełko na scenie i dociśnij krawędź igły do krawędzi taśmy dwustronnej pod kątem 45°, aby utworzyć skośną, złamaną końcówkę. 
	nuta: W przypadku zarodków konieczne jest jedynie złamanie końcówki na tyle, aby umożliwić przepływ dekstranu o masie 10 kDa. Idealna igła ma lekko pochyloną końcówkę i przy każdym wstrzyknięciu wydostaje się tylko niewielka kropla barwnika. W przypadku larw konieczne jest większe złamanie końcówki, ale z ukośną końcówką, aby przebić ścianę ciała larwy. Wyjdzie większa kropla barwnika.</li>
	<li>Pompuj pedał nożny, aż barwnik znajdzie się na końcu igły.</li>
	<li>Ustaw igłę tak, aby była równoległa do zarodka lub lekko pochylona w dół w kierunku larwy.</li>
	<li>Przesunąć igłę, aby nakłuć tylny koniec próbki i wstrzyknąć próbkę, pompując pedał nożny. Wstrzyknąć ~2 nL barwnika do zarodków i ~220 nL barwnika do larw. 
	nuta: Zarodek lub larwa powinna zostać zalana barwnikiem, jeśli wstrzyknięcie się powiedzie.</li>
	<li>Zanotuj czas wstrzyknięcia do celów inkubacji. Inkubować zarodki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wysiadywać larwy przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Kontynuuj przesuwanie w dół szkiełka, aby wstrzyknąć dodatkowe próbki, zwracając uwagę na czas wstrzyknięcia dla każdej próbki. 
	nuta: W zależności od szybkości, z jaką można wykonać kolejne etapy sekcji i obrazowania, jednorazowo można wstrzyknąć 4-8 próbek.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek do obrazowania
<ol>
	<li>Obrazowanie zarodków
	<ol>
		<li>Po wstrzyknięciu należy przygotować zarodki do obrazowania. Nałóż wazelinę za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką po prawej i lewej stronie próbek na szkiełku jako przekładkę, aby zapobiec uszkodzeniu zarodków po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Obrazuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego na całej głębokości zarodka za pomocą obiektywu 20x. Obliczyć odsetek wszystkich próbek z barwnikiem zaobserwowanych w brzusznym rdzeniu nerwowym (VNC), stosując następujące równanie: % próbek z upośledzoną barierą krew-mózg = liczba próbek z akumulacją barwnika w VNC/całkowita liczba badanych próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcja i obrazowanie larw
	<ol>
		<li>Przygotuj szkiełka z próbkami larw z wyprzedzeniem. Zamontuj dwa szkiełka nakrywkowe w odległości około 0,5 cm od szkiełka z lakierem do paznokci. 
		nuta: Szkiełka nakrywkowe pełnią funkcję przekładek dla mózgu, dzięki czemu nie ulega uszkodzeniu podczas procesu montażu.</li>
		<li>Po 30-minutowej inkubacji należy wypreparować larwy w 1x PBS bezpośrednio na szkiełku, które zostanie wykorzystane w obrazowaniu. Najpierw użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić larwę w połowie ciała larwy, a drugiej pary kleszczy użyj drugiej pary kleszczy, aby oddzielić przednią i tylną połowę larwy.</li>
		<li>Następnie użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić przedni obszar przy haczykach ustnych, a drugiej pary kleszczy odwróć ścianę ciała nad czubkiem kleszczy chwytających haczyki do ust. Mózg i VNC zostaną odsłonięte.</li>
		<li>Oddziel mózg i VNC od ściany ciała, przecinając nerwy, a następnie usuń ścianę ciała ze zjeżdżalni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C,D). W razie potrzeby usuń wyimaginowane dyski.</li>
		<li>Przykryj próbkę 10 μl 80% glicerolu i umieść szkiełko nakrywkowe na próbce w celu obrazowania.</li>
		<li>Obraz w głąb tkanki układu nerwowego za pomocą obiektywu 20x. Obliczyć procent wszystkich próbek z barwnikiem zaobserwowany w VNC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Brightman, M. W., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctions+between+intimately+apposed+cell+membranes+in+the+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain.</a> Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).</li>
<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers%3A+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).</li>
<li>Hindle, S. J., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+mechanisms+in+the+Drosophila+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 414(2014).</li>
<li>Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+signaling+is+required+for+blood-brain+barrier+formation+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila.</a> Cell. 123 (1), 133-144 (2005).</li>
<li>Stork, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).</li>
<li>Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+of+glia+in+neural+development+links+tissue+growth+to+blood-brain+barrier+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity.</a> Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).</li>
<li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li>
<li>Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+cell+cycles+regulated+by+Notch+signaling+control+cell+size+and+ensure+a+functional+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier.</a> Development. 145 (3), dev157115(2018).</li>
<li>von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity%2C+origin%2C+and+migration+of+peripheral+glial+cells+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo.</a> Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).</li>
<li>Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtypes+of+glial+cells+in+the+Drosophila+embryonic+ventral+nerve+cord+as+related+to+lineage+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression.</a> Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).</li>
<li>Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurexin+IV%2C+caspr+and+paranodin--novel+members+of+the+neurexin+family%3A+encounters+of+axons+and+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia.</a> Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).</li>
<li>Baumgartner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+neurexin+is+required+for+septate+junction+and+blood-nerve+barrier+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function.</a> Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).</li>
<li>Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+ensheathment+and+septate+junction+formation+in+the+peripheral+nervous+system+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).</li>
<li>Bhat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon-glia+interactions+and+the+domain+organization+of+myelinated+axons+requires+neurexin+IV%2FCaspr%2FParanodin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin.</a> Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).</li>
<li>Faivre-Sarrailh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+contactin%2C+a+homolog+of+vertebrate+contactin%2C+is+required+for+septate+junction+organization+and+paracellular+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function.</a> Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).</li>
<li>Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+domains+of+myelinated+axons+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system.</a> Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).</li>
<li>von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predetermined+embryonic+glial+cells+form+the+distinct+glial+sheaths+of+the+Drosophila+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system.</a> Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).</li>
<li>Matzat, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+wrapping+in+the+Drosophila+PNS+is+controlled+by+glia-derived+neuregulin+homolog+Vein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein.</a> Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).</li>
<li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+blood-brain+barrier%3A+development+and+function+of+a+glial+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365(2014).</li>
<li>Ho, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressional+Profiling+of+Carpet+Glia+in+the+Developing+Drosophila+Eye+Reveals+Its+Molecular+Signature+of+Morphology+Regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 244(2019).</li>
<li>DeSalvo, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+surface+glia+transcriptome%3A+evolutionary+conserved+blood-brain+barrier+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 346(2014).</li>
<li>BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html">https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html</a> (2017).</li>
<li>Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+Drosophila+balancer+chromosomes+with+a+w-+dfd-GMR+yellow+fluorescent+protein+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker.</a> Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).</li>
<li>Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).</li>
<li>Halfon, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).</li>
<li>Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+microinjection+glass+capillary+needles+for+P-element+transformations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster.</a> BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).</li>
<li>Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+raw+as+a+regulator+of+glial+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of raw as a regulator of glial development.</a> PLoS One. 13 (5), e0198161(2018).</li>
<li>Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+models+for+studying+the+blood-brain+and+blood-eye+barriers+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).</li>
<li>Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLove%2C+CR+%22Blood-Brain+Barrier%22">Blood-Brain Barrier</a>. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).</li>
<li>Lin, D. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+and+increased+expression+of+Fasciclin+II+alters+motoneuron+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance.</a> Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).</li>
<li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS%2FPNS+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. 132, e57038(2018).</li>
<li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zawiera wyczerpujący opis kroków potrzebnych do oznaczenia integralności BBB w późnym stadium embrionalnym i larwalnym trzeciego stadium rozwojowego D. melanogaster. Podobne podejścia zostały opisane w innym miejscu w celu zbadania integralności bariery krew-mózg podczas rozwoju, a także w stadiach dorosłych 5,7,29,30. Jednak opisy procedur w sekcjach dotyczących materiałó...

Podczas rozwoju, komunikacja i interakcje między komórkami są kluczowe dla ustanowienia struktury i funkcji tkanek i organów. W niektórych przypadkach te interakcje komórka-komórka uszczelniają narządy od otaczającego środowiska, aby zapewnić prawidłowe funkcjonowanie narządów. Dotyczy to układu nerwowego, który jest izolowany przez barierę krew-mózg (BBB). Dysfunkcja bariery krew-mózg u ludzi została powiązana z zaburzeniami neurologicznymi, w tym padaczką, a uszkodzenie bariery zaobserwowano w chorobach neurodegeneracyjnych, w tym stwardnieniu rozsianym i stwardnieniu zanikowym bocznym1. U ssaków bariera krew-mózg jest tworzona przez ścisłe połączenia między komórkami śródbłonka2,3. Inne zwierzęta, w tym muszka owocowa, Drosophila melanogaster, mają barierę krew-mózg złożoną z komórek glejowych. Te komórki glejowe tworzą selektywnie przepuszczalną barierę kontrolującą przepływ składników odżywczych, produktów przemiany materii, toksyn i dużych cząsteczek do i z układu nerwowego4. Pozwala to na utrzymanie gradientu elektrochemicznego niezbędnego do wyzwolenia potencjałów czynnościowych, co pozwala na mobilność i koordynację4. U D. melanogaster glej chroni układ nerwowy przed bogatą w potas, podobną do krwi hemolimfą5.
W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i obwodowym układzie nerwowym (PNS) D. melanogaster, dwie zewnętrzne warstwy glejowe, glej podperynkowy i glej okołonerwowy, a także zewnętrzna sieć macierzy zewnątrzkomórkowej, blaszka nerwowa, tworzą barierę hemolimfa-mózg i hemolimfę-nerw6, określaną w tym artykule jako bariera BBB. Podczas rozwoju glej podokołonerwowy staje się poliploidalny i powiększa się, otaczając układ nerwowy5,6,7,8,9,10,11. Glej podokołonerwowy tworzy połączenia przegrodowe, które stanowią główną barierę dyfuzyjną między hemolimfą a układem nerwowym5,6,12. Połączenia te są molekularnie podobne do połączeń przypominających przegrody znajdujących się w parawędach mielinizującego gleju u kręgowców i pełnią tę samą funkcję, co połączenia ścisłe w BBB ssaków13,14,15,16,17. Glej okołonerwowy dzieli, rośnie i owija się wokół gleju podokołonerwowego, aby regulować dyfuzję metabolitów i dużych cząsteczek6,10,18,19. Formowanie BBB jest zakończone po 18,5 h po złożeniu jaj (AEL) w temperaturze 25 °C5,8. Wcześniejsze badania zidentyfikowały geny, które są krytycznymi regulatorami powstawania BBB20,21,22. Aby lepiej zrozumieć dokładną rolę tych genów, ważne jest zbadanie wpływu mutacji tych potencjalnych regulatorów na integralność bariery krew-mózg. Podczas gdy poprzednie badania nakreśliły podejścia do oznaczania integralności BBB w zarodkach i larwach, kompleksowy protokół tego testu nie został jeszcze opisany5,7. Ten protokół krok po kroku opisuje metody oznaczania integralności BBB podczas stadiów embrionalnych i larwalnych w trzecim stadium rozwojowym D. melanogaster.

<table><tbody><tr><td>10 kDa sulforodaminy 101 chlorek kwasowy (Texas Red) Dekstran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1863</td><td>Dekstran należy rozcieńczyć w autoklawizowanym ddH2O do stężenia 25 mg/ml.</td></tr><tr><td>20 &mu; L Końcówki do pipet żelowych</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol (200 dowodów)</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>11000200</td><td></td></tr><tr><td>Aktywne suche drożdże</td><td>Red</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Star Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Sprężarka powietrza</td><td>DeWalt</td><td>D55140</td><td></td></tr><tr><td>Sok jabłkowy</td><td>Mott's Naturalny sok</td><td></td><td></td>jabłkowy</tr><tr><td>Wybielacz</td><td>domowy</td><td></td><td>1-5% Podchloryn</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Świat Precyzyjne instrumenty</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Zatyczki do butelek</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-277</td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>Próbki zobrazowane za pomocą obiektywu 20x (UPlanSApo 20x/ 0,75)</td></tr><tr><td>Aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan</td><td>19-062614</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna 1/2"</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pęseta; Wzór #5; .05 x .01 mm Końcówka</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Butelki na muchy</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki na muchy</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Pedał nożny</td><td>Treadlite II</td><td>T-91-S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Caster</td><td>Bio-Rad</td><td>1704422</td><td></td></tr><tr><td>Tacka na żel</td><td>Bio-Rad</td><td>1704436</td><td></td></tr><tr><td>Szkło Pipeta</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Cukier</td><td></td><td></td> granulowany <td>Zakupiony w sklepie spożywczym.</td></tr><tr><td>Laboratorium oleju halowęglowego</td><td>Scientific, Inc.</td><td>FLY-7000</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Stojak manipulatora Schott</td><td>Ace I</td><td></td></tr><tr><td>Światowe</td><td>instrumenty precyzyjne</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Świat instrumentów precyzyjnych</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH310</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy filtrów Nightsea</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Nauka SFA-LFS-CY</td><td>Do wizualizacji systemu pełnego adaptera YFP</td></tr><tr><td>Nightsea z głowicą Royal Blue Light Head</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>SFA-RB</td><td>Do wizualizacji</td></tr><tr><td>pędzla</td> GFP <td>Po prostu Simmons Chisel</td><td>Blender #6</td><td></td></tr><tr><td>Pipeter</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>Pompa pneumatyczna</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Jest to również określane jako mikrowtryskiwacz lub regulator ciśnienia. Ponieważ model zastosowany w naszym badaniu nie jest już dostępny, jest to jedna z alternatyw.</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Małe klatki do pobierania zarodków</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Stalowa płyta podstawy</td><td>World Precision Instruments</td><td>5052</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Służy do preparowania tkanek.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy ze źródłem światła przechodzącego</td><td>Baytronix</td><td></td><td>Służy do iniekcji.</td></tr><tr><td>Tegosept (kwas p-hydroksybenzoesowy, ester metylowy)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Zatyczki do fiolek</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-273</td><td></td></tr></tbody></table>

test integralności bariery krew-mózg u drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Prawidłowy rozwój układu nerwowego obejmuje tworzenie bariery krew-mózg, bariery dyfuzyjnej, która ściśle reguluje dostęp do układu nerwowego i chroni tkankę nerwową przed toksynami i patogenami. Defekty w tworzeniu tej bariery zostały skorelowane z neuropatiami, a załamanie tej bariery zaobserwowano w wielu chorobach neurodegeneracyjnych. Dlatego tak ważne jest zidentyfikowanie genów, które regulują tworzenie i utrzymywanie bariery krew-mózg, aby zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne. Aby zrozumieć dokładne role, jakie te geny odgrywają w rozwoju neuronalnym, konieczne jest zbadanie wpływu zmienionej ekspresji genów na integralność bariery krew-mózg. Stwierdzono, że wiele cząsteczek, które działają w tworzeniu bariery krew-mózg, jest zachowanych u gatunków eukariotycznych, w tym muszki owocowej, Drosophila melanogaster. Muszki owocowe okazały się doskonałym systemem modelowym do badania mechanizmów molekularnych regulujących rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego. Protokół ten opisuje krok po kroku procedurę oznaczania integralności bariery krew-mózg podczas embrionalnych i larwalnych stadiów rozwoju D. melanogaster.

Opisane tutaj metody umożliwiają wizualizację integralności BBB w całym OUN w embrionach i larwach D. melanogaster (Rycina 1). Po zakończeniu formowania się BBB w późnej embriogenezie, bariera ta pełni funkcję wykluczania dużych cząsteczek z mózgu i VNC5. Niniejszy protokół wykorzystuje tę funkcję do oceny formowania się BBB. Gdy embriony typu dzikiego (Oregon R) w późnym stadium 17 (wiek 20–21 h) zostały wstrzyknięte dekstranem 10 kDa sprzężonym z fluorescen...

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące genetycznej regulacji tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg podczas wielu etapów rozwoju drosophila. Metodę tę można również dostosować do badania przepuszczalności innych barier, takich jak nabłonek jelitowy w różnych organizmach. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ocenę funkcji bariery krew-mózg w żywych tkankach.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ manipulacje próbkami mogą być trudne, a wiele kroków wymaga szczególnej dbałości o szczegóły. Do pobierania zarodków należy umieścić co najmniej 50 dziewiczych samic z 20 do 25 samcami w butelce z pokarmem agarowym z mączki kukurydzianej i inkubować te muchy przez jeden do dwóch dni przed rozpoczęciem zbierania. Dzień przed zbiorem rozgrzej talerze z sokiem jabłkowym w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc.Następnego ranka przenieś znieczulone dwutlenkiem węgla muchy do klatki zbiorczej i umieść wstępnie podgrzany talerz agarowy z sokiem jabłkowym z niewielką ilością pasty drożdżowej na otwartym końcu klatki. Następnie przymocuj płytkę do klatki za pomocą czerwonej tulei. Aby usunąć starsze zarodki, pozwól muszkom złożyć

assay-for-blood-brain-barrier-integrity-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Testy behawioralne służące do pomiaru funkcji lokomocyjnych, zdolności uczenia się i pamięci u Drosophila.

Ocena deficytów motorycznych, uczenia się i pamięci w modelach neurodegeneracji u Drosophila

Drosophila melanogaster to genetycznie i behawioralnie podatny system modelowy, który od ponad wieku jest wykorzystywany do zrozumienia molekularnych i komórkowych podstaw wielu ważnych procesów biologicznych 1. Drosophila została szeroko wykorzystana w celu uzyskania wglądu w genetyczne podstawy zachowania much.

Metody oceny zachowania Drosophila

Ten film demonstruje procedurę oceny przerwania bariery krew-mózg w mysim modelu EAE. Barwniki fluorescencyjne o różnych rozmiarach są wstrzykiwane po ortopie i krążą w naczyniach krwionośnych mózgu. Mniejszy barwnik przecieka przez szczeliny do tkanki mózgowej, podczas gdy większy barwnik dostaje się tylko wtedy, gdy zakłócenie jest poważne, co koreluje z zakresem uszkodzenia bariery.

Określanie przerwania bariery krew-mózg za pomocą barwników fluorescencyjnych w mysim modelu EAE

Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.

Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Protokół opisuje prosty test do identyfikacji larw Drosophila melanogaster, które doświadczają niedotlenienia przy normalnym poziomie tlenu w atmosferze. Protokół ten pozwala odróżnić niedotlenione larwy od innych mutantów, które wykazują nakładające się fenotypy, takie jak powolność lub powolny wzrost.

Test kopania/tunelowania w celu wykrycia niedotlenienia u larw Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Protokół ten przedstawia wiarygodną metodę oceny integralności bariery krew-mózg (BBB) w modelu dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) przy użyciu oceny Evana opartej na niebieskim barwniku, umożliwiając zarówno jakościową, jak i ilościową analizę zaburzeń nerwowo-naczyniowych.

Wizualizacja strażnika: oparta na niebieskim barwniku ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez Evana u dorosłych danio pręgowanych

Poznaj metodę oceny integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster w żywych tkankach. Protokół obejmuje iniekcję barwników i mikroskopię konfokalną do badania dynamiki bariery.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów