Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące genetycznej regulacji tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg podczas wielu etapów rozwoju drosophila. Metodę tę można również dostosować do badania przepuszczalności innych barier, takich jak nabłonek jelitowy w różnych organizmach. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ocenę funkcji bariery krew-mózg w żywych tkankach.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ manipulacje próbkami mogą być trudne, a wiele kroków wymaga szczególnej dbałości o szczegóły. Do pobierania zarodków należy umieścić co najmniej 50 dziewiczych samic z 20 do 25 samcami w butelce z pokarmem agarowym z mączki kukurydzianej i inkubować te muchy przez jeden do dwóch dni przed rozpoczęciem zbierania. Dzień przed zbiorem rozgrzej talerze z sokiem jabłkowym w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego ranka przenieś znieczulone dwutlenkiem węgla muchy do klatki zbiorczej i umieść wstępnie podgrzany talerz agarowy z sokiem jabłkowym z niewielką ilością pasty drożdżowej na otwartym końcu klatki. Następnie przymocuj płytkę do klatki za pomocą czerwonej tulei. Aby usunąć starsze zarodki, pozwól muszkom złożyć jaja na talerzu z sokiem jabłkowym na godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji odwróć siatkę klatką do dołu i postukaj muchami o dno klatki. Zastąp agar z sokiem jabłkowym nowym, wstępnie podgrzanym talerzem agarowym z sokiem jabłkowym z niewielką ilością pasty drożdżowej. Pozwól muchom złożyć jaja na nowym talerzu przez kolejną godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Aby pobrać zarodki w późnym stadium 17 do wstrzyknięcia, zastąp płytkę agarową z sokiem jabłkowym nową, wstępnie podgrzaną płytką z odrobiną pasty drożdżowej. I pozwól muchom złożyć jaja na talerzu w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po upływie godziny należy wymienić płytkę i starzyć płytkę z pobranymi zarodkami przez 19 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza, tak aby zarodki miały od 20 do 21 godzin w momencie obrazowania.

Pod koniec 19-godzinnej inkubacji wyjąć płytkę do pobierania zarodków z inkubatora i pokryć powierzchnię płytki PbTx. Za pomocą pędzla poluzować zarodki z powierzchni płytki do sitka z nylonowej siatki o grubości 70 mikrometrów. I umieść sitko z zarodkami w 50% roztworze wybielacza na 100-milimetrowej szalce Petriego na pięć minut, od czasu do czasu mieszając w temperaturze pokojowej, aby je zdekorionować.

Pod koniec inkubacji opłucz zarodki trzy razy, obracając sitko w świeżym PbTx, używając nowej szalki Petriego do każdego przemycia. Umyj zarodki po jednej stronie sitka za pomocą PbTx i za pomocą szklanej pipety przenieś zarodki na 2% płytkę z żelu agarozowego. Usuń nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej.

Ustaw sześć do ośmiu zarodków na płycie z tylnymi częściami po prawej stronie, a grzbietem skierowanymi do góry i mocno dociśnij kawałek dwustronnej taśmy przymocowanej do szkiełka na górze zarodków. Następnie wysusz zarodki w temperaturze pokojowej przez około 25 minut, a następnie przykryj próbki olejem halowęglowym. W celu pobrania larw należy skonfigurować krzyżówkę z 5 do 10 dziewiczymi samicami much o pożądanym genotypie i o połowę mniejszą liczbą samców o pożądanym genotypie w fiolce z pokarmem z agaru z mąki kukurydzianej.

Po pięciu do siedmiu dniach w temperaturze 25 stopni Celsjusza, w zależności od genotypu, użyj kleszczy, aby delikatnie zebrać wędrujące larwy trzeciego stadium z fiolki i przepłukać larwy PBS, aby usunąć zablokowany pokarm. Przenieś larwy na płytkę agarową z sokiem jabłkowym w celu genotypowania, jeśli to konieczne, przed użyciem pędzla do wysuszenia larw na tkance. Następnie za pomocą kleszczy przenieś sześć do ośmiu larw na szkiełko przygotowane za pomocą taśmy dwustronnej.

Przed wstrzyknięciem należy użyć ściągacza do mikropipet, aby wciągnąć rurki kapilarne w standardowy kształt igły do wstrzyknięć D. Melanogaster i zakotwiczyć igły w glinie na szalce Petriego. Do wstrzykiwania zarodków należy użyć końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów z żelem, aby załadować przygotowaną igłę z 5 mikrolitrami 10 kilodaltonowego dekstranu sprzężonego z chlorkiem kwasu sulforodaminy 101 i umieścić igłę w uchwycie igły. Umieść igłę w mikromanipulatorze przymocowanym do stalowej podstawy i ustaw aparat do wstrzykiwania na 50 funtów na cal kwadratowy i 5 do 10 milisekund w zakresie 10.

Umieść szkiełko na stoliku mikromanipulatora i ocieraj krawędź igły o krawędź taśmy dwustronnej pod kątem 45 stopni, aby utworzyć lekko pochyloną końcówkę złamaną na tyle, aby umożliwić przepływ 10 kilodaltonowego dekstranu przez otwór. Pompuj pedał nożny, aż barwnik znajdzie się na końcu igły. Wyrównaj igłę tak, aby była równoległa do zarodka i nakłuj tylny koniec próbki.

Napompuj pedał nożny, aby wstrzyknąć dwa nanolitry barwnika do próbki. Zanotuj czas wstrzyknięcia do celów inkubacji i kontynuuj w dół szkiełka, aby wstrzyknąć dodatkowe próbki. W przypadku wstrzyknięcia larw należy wykonać nieco większy otwór pod kątem niż ten, który jest używany do wstrzykiwania zarodków i ustawić igłę lekko w dół w kierunku próbki przed wstrzyknięciem larw za pomocą 220 nanolitrów, podobnie jak w przypadku próbek embrionalnych.

Pod koniec 10-minutowej inkubacji do wstrzykiwań należy użyć aplikatora z bawełnianą końcówką, aby nałożyć wazelinę po prawej i lewej stronie próbek na szkiełku jako przekładkę. Umieść szkiełko nakrywkowe na górze i umieść szkiełko na stoliku mikroskopu konfokalnego. Wybierz obiektyw 20X i zobrazuj próbki na całej głębokości każdego zarodka.

Następnie oblicz procent próbek z naruszoną barierą krew-mózg zgodnie ze wzorem. Przed rozpoczęciem procedury preparacji użyj lakieru do paznokci, aby zamontować dwa szkiełka nakrywkowe oddalone od siebie o około 0,5 centymetra na szkiełku i umieść wstrzykniętą larwę w PBS na szkiełku pod koniec 30-minutowej inkubacji. Używając jednej pary kleszczy, chwyć larwę do połowy ciała larwy i użyj drugiej pary kleszczy, aby oddzielić przednią i tylną połowę larwy.

Następnie użyj jednej pary kleszczy, aby chwycić przedni obszar za haczyki do ust i użyj drugiej pary kleszczy, aby odwrócić ścianę ciała nad czubkiem pierwszej pary kleszczy. Odsłonięty zostanie mózg i brzuszny rdzeń nerwowy. Oddziel mózg i brzuszny rdzeń nerwowy od ściany ciała, przecinając nerwy, jeśli to konieczne, i usuń ścianę ciała ze zjeżdżalni.

Przykryj próbkę 10 mikrolitrami 80% glicerolu. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na próbce w celu obrazowania i zobrazuj próbki, aby określić procent próbek z naruszoną barierą krew-mózg, jak pokazano. Gdy zarodkom typu dzikiego w późnym stadium 17 wstrzykuje się 10 kilodaltonów dekstranu sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym chlorku kwasu sulforodaminy 101, duża cząsteczka dekstranu jest wykluczana z brzusznego rdzenia nerwowego, zgodnie z oczekiwaniami.

Heterozygotyczne zmutowane zarodki surowca 1 wykazują nienaruszoną barierę krew-mózg, podobną do obserwowanej u zarodków kontrolnych typu dzikiego. W przeciwieństwie do tego, homozygotyczne zmutowane zarodki surowca 1 wykazują defekty w integralności bariery krew-mózg, z 10 kilodaltonami dekstranu zalewającymi brzuszny rdzeń nerwowy, co wskazuje na niezdolność do tworzenia się bariery krew-mózg. W próbkach larw kontrolnych typu dzikiego dekstran 10 kilodaltonów nie przenika przez barierę krew-mózg i jest wykluczany z mózgu i brzusznego rdzenia nerwowego.

Podczas próby tej procedury kluczowe znaczenie ma prawidłowe starzenie się zarodków, aby zapewnić, że próbki są badane w wieku, w którym oczekuje się, że tworzenie bariery krew-mózg zostanie zakończone. Po tej procedurze mutanty wykazujące naruszoną barierę krew-mózg mogą być dalej badane za pomocą genetyki, immunohistochemii i mikroskopii, aby lepiej zrozumieć funkcję genów na poziomie komórkowym. Technika ta pozwoli naukowcom zidentyfikować dodatkowe geny, które mają kluczowe znaczenie dla ustanowienia i utrzymania bariery krew-mózg.