Name: Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę pomiaru mitochondrialnej respiracji i glikolizy w krwiotwórczych komórkach macierzystych HSPCs. Protokół poprawia izolację z mysiej szpiku kostnego i zwiększa żywotność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częściowo wspierana przez fundusze z National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick's Foundation i Pelotonia Foundation.

Ten protokół został zatwierdzony przez Nationwide Children's Hospital Animal Care and Use Committee (IACUC).
UWAGA: Protokół jest opisany w porządku chronologicznym, który obejmuje okres dwóch dni. Używaj świeżych odczynników zgodnie z opisem w poniższym protokole.
1. Przygotowanie odczynników w dniu poprzedzającym test
<ol>
	<li>Uwodnić wkład czujnika.
	<ol>
		<li>Inkubować przez noc 5 ml kalibru (tabela materiałów) w inkubatorze o temperaturze 37 °C niezawierającej CO2 °C.</li>
		<li>Otwórz zestaw do oznaczania topnika (tabela materiałów) i oddziel wkład czujnika (zielony; u góry) od tabliczki znamionowej (przezroczysty; na dole). Następnie umieść wkład czujnika do góry nogami i przylegaj do tabliczki użytkowej.</li>
		<li>Sterylną wodą napełnij studzienki na tabliczce użytkowej (200 μL) oraz komory wokół studni (400 μL).</li>
		<li>Zanurz wkład czujnika w tabliczce narzędziowej, upewniając się, że czujniki są całkowicie pokryte wodą. Stuknij 3x, aby uniknąć tworzenia się bąbelków.</li>
		<li>Umieść na noc wkład zanurzony w tabliczce narzędziowej w inkubatorze bez emisjiCO2 37 °C. Aby zapobiec parowaniu wody, upewnij się, że inkubator jest odpowiednio nawilżony. Umieść otwartą zlewkę zawierającąH2Ojako dodatkowy środek ostrożności obok płytki nabojowej, szczególnie jeśli używasz zwykłego piekarnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować płytkę do oznaczania.
	<ol>
		<li>Wysterylizuj powierzchnię komory bezpieczeństwa biologicznego klasy 2 przy użyciu 70% etanolu. Otwórz płytkę testową pod maską.</li>
		<li>Dodaj 40 μl dostępnego w handlu 0,01% (w/v) roztworu poli-L-lizyny (PLL) do każdego dołka płytki testowej pod maską.</li>
		<li>Przykryj płytkę testową pokrywką znajdującą się w zestawie. Inkubować zamkniętą płytkę testową w temperaturze pokojowej (RT) pod maską przez 1 h. 
		nuta: Celem inkubacji jest umożliwienie PLL pokrycia powierzchni płytki testowej w celu ułatwienia przylegania komórek zawiesiny do powierzchni płytki testowej.</li>
		<li>Po 1 godzinie inkubacji płytki testowej usunąć nadmiar roztworu za pomocą sterylnego aspiratora próżniowego i wysuszyć studzienkę pod pokrywą. 
		nuta: Wysuszenie na powietrzu dołków płytki testowej zajmuje ~30-60 minut po nadmiernym usunięciu PLL za pomocą aspiratora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dzień próby
<ol>
	<li>Przygotuj wkład.
	<ol>
		<li>Podnieś wkład czujnika. Umieść go do góry nogami w kapturze do hodowli tkankowych i wylej wodę z płytki użytkowej.</li>
		<li>Napełnij studzienki na płytki użytkowe 200 μl wstępnie podgrzanego kalibru.</li>
		<li>Napełnij komory wokół studni 400 μl kalibru.</li>
		<li>Zanurz wkład czujnika w płycie narzędziowej, upewniając się, że czujniki są całkowicie zakryte przez kaliber. Stuknij 3x, aby uniknąć tworzenia się bąbelków.</li>
		<li>Wyrównaj wkład czujnika zanurzony w tabliczce użytkowej w inkubatorze bez CO2 37 °C na 45−60 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz mysie HSPC LSK pochodzące ze szpiku kostnego.
	<ol>
		<li>Aby pomieścić wystarczającą liczbę kontrprób biologicznych, należy zaplanować użycie HSPC pochodzących od jednej myszy na studzienkę płytki testowej. 
		nuta: Ta metoda pozyskiwania szpiku kostnego zapewnia ~ 50 000-80 000 LSK HSPC od każdej myszy. Ten protokół pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego jest zoptymalizowany dla ~ 70 000 LSK HSPC na dołek 96-dołkowej płytki.</li>
		<li>Eutanazja myszy z użyciem przedawkowania CO2 i zwichnięcia szyjki macicy, zgodnie z lokalnymi metodami zatwierdzonymi przez IACUC.</li>
		<li>Wysterylizuj powierzchnię narzędzi sekcyjnych i ławkę za pomocą 70% etanolu.</li>
		<li>Dla każdej myszy należy wstępnie napełnić jedną szalkę Petriego 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 2% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze RT. 
		nuta: Nie używaj wstępnie schłodzonego PBS, ponieważ w kolejnych krokach utworzy on grudki.</li>
		<li>Spryskaj 70% etanolem (v/v) całą mysz poddaną eutanazji. Odizoluj wszystkie kości, w tym kończyny górne i dolne, kości biodrowe, mostek, klatkę piersiową i kręgosłup, od mouse17,18. Wyciągnij istotę białą z rdzenia kręgowego myszy, ponieważ może ona zanieczyścić komórki LSK. Umieść wszystkie kości w 1x PBS (+ 2% FBS), podczas ich zbierania, na szalce Petriego do dalszego użycia.</li>
		<li>Odwróć stożkową probówkę o pojemności 50 ml (za każdym razem nową) i użyj jej do rozdrobnienia kości zanurzonych w 1x PBS (+ 2% FBS) na szalce Petriego.</li>
		<li>Używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml, pipetuj w górę i w dół (~10x), aby równomiernie wypłukać komórki z kości, po zmiażdżeniu kości.</li>
		<li>Umieść sitko o pojemności 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wstępnie zwilż powierzchnię sitka, przepuszczając 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS).</li>
		<li>Zawiesinę komórkową pochodzącą ze szpiku kostnego pobrać z etapu 2.2.7 i przepuścić przez wstępnie zwilżoną powierzchnię sitka komórkowego w celu usunięcia resztek kostnych.</li>
		<li>Powtarzać kroki od 2.2.6 do 2.2.9, aż wszystkie materiały kostne zmienią kolor na biały jako marker, że większość komórek szpiku kostnego została zebrana w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. 
		nuta: Często potrzeba dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml na mysz, aby zebrać wszystkie komórki pochodzące ze szpiku kostnego.</li>
		<li>Odwirować 50 ml stożkowych probówek zawierających komórki pochodzące ze szpiku kostnego przez 5 minut przy 500 x g i RT.</li>
		<li>Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki pochodzące ze szpiku kostnego (połączyć zawartość obu probówek o pojemności 50 ml) w 5 ml 1x PBS (+ 2% FBS) jako ostateczną objętość i utrzymać komórki w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz monojądrzaste mysie komórki szpiku kostnego.
	<ol>
		<li>Dodać 5 ml pożywki o gradiencie gęstości (tj. Ficollu) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie powoli dodawać 5 ml zawiesiny komórek szpiku kostnego. Upewnij się, że komórki pozostają jako warstwa powyżej ośrodka gradientu gęstości.</li>
		<li>Wirować przez 30 minut przy 500 x g i RT. Nie używaj hamulca w wirówce. Upewnij się, że wirówka ma najniższe możliwe przyspieszenie (np. 1 przyspieszenie i 0 opóźnienia).</li>
		<li>Zebrać środkową granicę faz komórek jednojądrowych (kolor biały) po odwirowaniu do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Umyj komórki, zebrane z pożywki o gradiencie gęstości, 5 ml 1x PBS (+ 2% FBS). Wirować przez 5 minut przy 500 x g i temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Powtórz krok 2.3.4.</li>
		<li>Zawiesić zawartość komórek w probówce w 300 μl 1x PBS (+ 2% FBS). Podwielokrotność 10 μl zawiesiny komórek do niebarwionej lub jednobarwnej kontroli w probówce FACS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz LSK HSPC z monojądrzastych komórek mysiego szpiku kostnego.
	<ol>
		<li>Przygotuj koktajl przeciwciał biotyny, mieszając 3 μl na próbkę następujących przeciwciał: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Dodać 15 μl koktajlu biotyny i przeciwciał do 300 μl jednojądrowych komórek szpiku kostnego. 
		nuta: Każde przeciwciało stosuje się w rozcieńczeniu 1:100.</li>
		<li>Inkubować komórki z koktajlem biotyny i przeciwciał przez 30 minut w temperaturze 4 °C z mieszaniem, aby uniknąć zlepiania się komórek na dnie probówki.</li>
		<li>Dodaj 10 ml wstępnie schłodzonego 1x PBS (+ 2% FBS) do komórek zmieszanych z koktajlem biotyny i przeciwciał.</li>
		<li>Odwirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 μl 1x PBS (+ 2% FBS). Podwielokrotność 10 μl do kontroli pojedynczego koloru streptawidyny.</li>
		<li>Przed użyciem krótko wymieszaj mikrogranulki antybiotyny (tabela materiałów). Dodać 80 μl mikrogranulek do każdej próbki komórek (z 400 μl). Dobrze wymieszać i inkubować przez dodatkowe 20 minut w temperaturze 4 °C, mieszając.</li>
		<li>Dodaj 10 ml wstępnie schłodzonego 1x PBS (+ 2% FBS) do komórek. Wirować probówkę przez 5 minut przy 500 x g i temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C podczas ustawiania jednostki separacji magnetycznej.</li>
		<li>Umieścić kolumnę (Tabela materiałów) w polu magnetycznym separatora do sortowania komórek wspomaganych magnetycznie (MACS) w temperaturze 4 °C. Przygotować kolumnę do separacji magnetycznej, przepłukując ją 3 ml 1x PBS (+ 2% FBS) pod przepływem grawitacyjnym w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać zawiesinę komórek z kroku 2.4.7 do wstępnie zwilżonej kolumny w temperaturze 4 °C. Pozwolić, aby komórki przeszły przez kolumnę w temperaturze 4 °C i zebrać ścieki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. 
		nuta: Frakcja z nieznakowanymi komórkami w takich ściekach reprezentuje wzbogacone komórki ujemne linii.</li>
		<li>Przemyć kolumnę 3 ml 1x PBS (+ 2% FBS) w temperaturze 4 °C. Powtórzyć 3 razy. Zebrać przepływ i utrzymać go w temperaturze 4 °C. Policz eluowane żywe komórki przez wykluczenie błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą przepływowy płyn przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml 1x PBS (+ 2% FBS) i przenieść zawartość do probówki FACS.</li>
		<li>Dodaj 24 μl koktajlu przeciwciał LSK do każdych10-7 komórek. Koktajl przeciwciał zawiera równe stężenie przeciwciała 450-streptawidyny, przeciwciała PE-CY7-Sca1 i przeciwciała APC-c-Kit.</li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z mieszaniem w ciemności (przykryte folią aluminiową).</li>
		<li>Dodaj 3 ml 1x PBS (+ 2% FBS) do probówki FACS. Wirować przez 5 minut przy 500 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki znakowane przeciwciałami w 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS). Dodać 1 μl 1 mg/ml jodku propidyny do zawiesiny komórek tuż przed sortowaniem.</li>
		<li>Przefiltrować zawartość probówki FACS za pomocą sitka 40 μm tuż przed sortowaniem komórek LSK.</li>
		<li>Zebrać komórki LSK, poprzez sortowanie FACS, do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 0,5 ml kompletnej pożywki uzupełnionej 2 mM glutaminy, 3 mg / ml glukozy, 1 mM pirogronianu, 1x trombopoetyny (TPO), 1x czynnika komórek macierzystych (SCF), 0,5x penicyliny/streptomycyny (P / S), pH 7,4 (Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oddychanie mitochondrialne i testy glikolizy LSK HSPC
<ol>
	<li>Wysiew LSK na płytce probierczej
	<ol>
		<li>Odwirować komórki LSK z kroku 2.4.17 przez 5 minut przy 500 x g i RT. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić komórki w kompletnych pożywkach do końcowego stężenia co najmniej 70 000 komórek/40 μl.</li>
		<li>Zawartość nasion w 40 μl pożywki (zawierającej 70 000 komórek) na 8-dołkowej płytce pokrytej PLL z kroku 1.2.4. Pozostaw wszystkie studzienki narożne puste.</li>
		<li>Wirować przez 1 minutę przy 450 x g i RT. Nie włączaj hamulca. Upewnij się, że komórki są przymocowane do dna studzienki za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
		<li>Dodać 135 μl kompletnej pożywki do komórek w każdym dołku, aby uzyskać końcową objętość 175 μl. Dodać 175 μl kompletnej pożywki do 2 rogów płytki jako ślepe próby.</li>
		<li>Inkubować komórki w inkubatorze niezawierającym emisjiCO2 przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Skonfiguruj program dodawania leków do każdego dołka płytki studzienki w analizatorze, używając metryki opisanej w Tabeli 2 (test stresu mitochondrialnego) i Tabeli 3 (test stresu glikolizy). 
		UWAGA: Podczas inkubacji komórek włącz instrument i upewnij się, że ma temperaturę 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test wysiłkowy mitochondriów
	<ol>
		<li>Przygotować 45 μM roztwory podstawowe oligomycyny, 50 μM 4-(triflurometoksy)fenylohydrazonu cyjanku karbonylu (FCCP) i 25 μM roztworów podstawowych rotenonu/antymycyny A. Aby przygotować 45 μM roztwór podstawowy oligomycyny, należy rozpuścić zawartość dostępnej w handlu torebki w 280 μl kompletnej pożywki. Aby przygotować 50 μM roztwór podstawowy FCCP, należy rozpuścić zawartość dostępnej w handlu torebki w 288 μl kompletnej pożywki. Aby przygotować 25 μM roztwór podstawowy rotenonu/antymycyny A, należy rozpuścić zawartość dostępnej w handlu torebki w 216 μl kompletnej pożywki.</li>
		<li>Wyjmij wkład czujnika z tabliczki użytkowej z inkubatora i załaduj jego porty (A, B i C) tak, aby każda studzienka miała końcowe stężenie 2 μM oligomycyny, 1,5 μM FCCP i 0,5 μM rotenonu/antymycyny A w razie potrzeby, zgodnie ze wskaźnikami rozcieńczenia opisanymi w tabeli 4 (dla wskaźnika zużycia tlenu).</li>
		<li>Zdejmij pokrywę z wkładu czujnika zamontowanego w tabliczce narzędziowej i umieść ją na tacy na instrumenty. Rozpocznij kalibrację, która potrwa 20 minut.</li>
		<li>Po kalibracji usuń tabliczkę użytkową i zastąp ją płytką testową zawierającą komórki LSK, które są teraz przyklejone do dna studzienki.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić program opisany w Tabeli 2. Po zakończeniu programu pobierz dane i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania Wave Desktop. 
		nuta: Dane wygenerowane z testów strumienia zewnątrzkomórkowego można wykreślić za pomocą wykresu punktowego z oprogramowania Wave Desktop lub wyeksportować do internetowego programu statystycznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test warunków skrajnych glikolizy
	<ol>
		<li>Glukozę rozpuścić w 300 μl (100 mM), oligomycynę w 288 μl (50 μM), glukozę 2-D (2-DG) w 300 μl (500 mM) kompletnych pożywek z dostępnego w handlu woreczka.</li>
		<li>Delikatnie pipetuj w górę i w dół (~10x), aby rozpuścić związki. Wirować 2-DG przez około 1 minutę, aby zapewnić prawidłowe rozpuszczenie w pożywce.</li>
		<li>Wyjmij wkład czujnika z inkubatora. Załaduj porty od A do C zgodnie z metrykami rozcieńczenia opisanymi w tabeli 5, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM glukozy, 2 μM oligomycyny i 50 mM 2-DG.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.3 i 3.2.4.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić program opisany w Tabeli 3. Po zakończeniu programu pobierz dane i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania Wave Desktop.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origin%2C+development%2C+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+diet%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li>
<li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+change%3A+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li>
<li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125(2016).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li>
<li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+Mitochondria%2C+Metabolism%2C+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li>
<li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901(2015).</li>
<li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li>
<li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li>
<li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li>
<li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li>
<li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis%3A+therapeutic+targets+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility%3A+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li>
<li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li>
<li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism%3A+Culprits+or+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li>
<li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li>
<li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li>
<li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj pokazujemy izolację maksymalnej ilości czystej i żywotnej populacji mysich HSPC LSK, a także pomiar ich glikolizy i oddychania mitochondrialnego za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. W szczególności protokół przezwycięża następujące problemy techniczne związane ze stosowaniem LSK HSPC: i) niska częstość występowania LSK HSPC w mysim szpiku kostnym14, ii) niska podstawowa aktywność metaboliczna LSK HSPC26, iii) kruchość LSK HSPC27</sup...

Ponieważ długość życia większości dojrzałych komórek krwi jest krótka, homeostaza krwi opiera się na samoodnawianiu i różnicowaniu długowiecznej, ale rzadkiej populacji hematopoetycznych komórek macierzystych (HSPC)1. HSPC są w stanie spoczynku, ale szybko się namnażają i ulegają różnicowaniu po stymulacji, aby sprostać wymaganiom układu krwionośnego. Ponieważ każdy stan komórkowy HSPC wymaga unikalnego zapotrzebowania bioenergetycznego, zmiany metaboliczne są kluczowymi czynnikami wpływającymi na decyzje dotyczące losu HSPC. Dlatego utrata plastyczności metabolicznej, poprzez zmianę równowagi między spoczynkiem, samoodnawianiem i różnicowaniem HSPC, często prowadzi do zaburzeń mielo- lub limfoproliferacyjnych. Zrozumienie regulacji metabolicznej rozwoju HSPC ma kluczowe znaczenie dla odkrycia mechanizmów leżących u podstaw nowotworów hematologicznych2,3,4,5.
Oddychanie mitochondrialne i glikoliza generują ATP do napędzania reakcji wewnątrzkomórkowych i wytwarzania elementów budulcowych niezbędnych do syntezy makromolekuł. Ponieważ HSPC mają niską masę mitochondrialną w porównaniu z komórkami zróżnicowanymi6 i utrzymują stan spoczynku w niedotlenionych niszach szpiku kostnego, HSPC polegają głównie na glikolizie. Aktywacja HSPC zwiększa ich metabolizm mitochondrialny, co prowadzi do utraty spoczynku, a następnie ich wejścia do cyklu komórkowego. Taka plastyczność metaboliczna HSPC pozwala na utrzymanie puli HSPC przez całe dorosłe życie6,7,8,9,10,11,12. Dlatego tak ważne jest zbadanie ich aktywności metabolicznej, takiej jak wskaźnik zużycia tlenu (OCR; wskaźnik fosforylacji oksydacyjnej) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR; wskaźnik glikolizy) w celu analizy aktywacji HSPC i stanu zdrowia. Zarówno OCR, jak i ECAR mogą być mierzone jednocześnie, w czasie rzeczywistym, za pomocą zewnątrzkomórkowego analizatora strumienia. Jednak obecna metoda wymaga dużej liczby komórek i jest zoptymalizowana pod kątem komórek przylegających13. Ponieważ HSPC nie mogą być izolowane w dużych ilościach od myszy14, wymagają sortowania w celu uzyskania czystej populacji, są komórkami nieprzylegającymi15 i nie mogą być hodowane przez noc bez uniknięcia różnicowania16, trudno było zmierzyć OCR i ECAR HSPC. W tym miejscu udostępniamy zestaw jasnych instrukcji krok po kroku, które towarzyszą samouczkom wideo na temat pomiaru oddychania metabolicznego i glikolizy kilku tysięcy mysich szpiku kostnego - LineagenegSca1 + c-Kit + (LSK) HSPC.

<table><tbody><tr><td>0,01% (w/v) roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>Używany do mocowania LSK</td></tr><tr><td>40 i mikro; m sitko komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Używany do filtracji komórek po zmiażdżeniu kości</td></tr><tr><td>Mikrokulki antybiotyny</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td>Używany do separacji lin-</td></tr><tr><td>Biotyna Szczur Anti-Mouse CD45R/B220 Klon RA3-6B2</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td>Używany do separacji Lin-</td></tr><tr><td>Biotyna Szczur Anti-Mouse CD5 Klon 53-7.3</td><td>BD Biosciences</td><td>553019</td><td>Używany do Lin- separacja</td></tr><tr><td>Biotyna Szczur Anty-Mysz CD8a Klon 53-6.7</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td>Używany do separacji Lin- separacja</td></tr><tr><td>Biotyna Szczur Anty-Mysz Klon Ly-6G i Ly-6C RB6-8C5</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>Używany do separacji Lin-</td></tr><tr><td>Szczur Biotyna Anty-mysi TER-119 / Komórki erytroidalne Klon TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>Używany do separacji Lin- separacji</td></tr><tr><td>CD117 (c-Kit) Przeciwciało monoklonalne (2B8), APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Używany do sortowania LSK</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Używany do izolacji komórek</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Używany do izolacji komórek</td></tr><tr><td>Falcon Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-11A</td><td>Używany do Sortowanie LSK</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Neuromika</td><td>FBS001-HI</td><td>Używany w buforze FACS</td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td>Używany do separacji gradientu fikolu</td></tr><tr><td>L-glutamina 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>Używany do podłoża testowego</td></tr><tr><td>LS Kolumna</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Używany do separacji</td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) Monoklonalny Przeciwciało (D7), PE-cyjanina7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>Używany do sortowania LSK</td></tr><tr><td>Mysi czynnik komórek macierzystych (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>250-03-100UG</td><td>Używany do pożywki testowej</td></tr><tr><td>Mysia trombopoetyna (TPO)</td><td>PeproTech</td><td>315-14-100UG</td><td>Używany do podłoża testowego</td></tr><tr><td>PBS 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>Używany do buforu FACS</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna ( 10 000 U/ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Używany do pożywki testowej</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1304MP</td><td>Używany do sortowania LSK</td></tr><tr><td>Konik morski XFp Kultura komórkowa Minipłytka</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td>Używany do siewu LSK</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td>Używany do podłoża testowego</td></tr><tr><td>Streptawidyna eFluor 450 Koniugat</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>Używany do sortowania LSK</td></tr><tr><td>XF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td><td>Używany do równoważenia wkładów</td></tr><tr><td>Pożywki XF</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>Używany do podłoża testowego</td></tr><tr><td>XFp Zestaw do testów wysiłkowych glikolizy</td><td>Agilent Technologies</td><td>103017100</td><td>Leki do testu wysiłkowego glikolizy</td></tr><tr><td>XFp Mitochondria Zestaw do testów warunków skrajnych</td><td>Agilent Technologies</td><td>103010100</td><td>Leki do mitochondrialnego testu wysiłkowego</td></tr><tr><td>Wkład czujnika XFp</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td>Służy do glikolizy i mitochondrialnego testu wysiłkowego</td></tr></tbody></table>

analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Krwiotwórcze komórki progenitorowe (HSPC) mają wyraźną plastyczność metaboliczną, która pozwala im przejść ze stanu spoczynku do stanu różnicowania, aby sprostać wymaganiom tworzenia krwi. Jednak analiza stanu metabolicznego (oddychanie mitochondrialne i glikoliza) HSPC była trudna ze względu na ich ograniczoną liczbę i brak zoptymalizowanych protokołów dla nieprzylegających, delikatnych HSPC. W tym miejscu przedstawiamy zestaw jasnych instrukcji krok po kroku, jak mierzyć oddychanie metaboliczne (wskaźnik zużycia tlenu; OCR) i glikoliza (szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego; ECAR) mysiego szpiku kostnego - LineagenegSca1 + c-Kit+ (LSK) HSPC. Protokół ten zapewnia większą ilość LSK HSPC z mysiego szpiku kostnego, poprawia żywotność HSPC podczas inkubacji, ułatwia analizy strumienia zewnątrzkomórkowego nieprzylegających HSPC i zapewnia zoptymalizowane protokoły iniekcji (stężenie i czas) dla leków ukierunkowanych na fosforylację oksydacyjną i szlaki glikolityczne. Metoda ta umożliwia przewidywanie stanu metabolicznego i zdrowia HSPC podczas rozwoju krwi i chorób.

Nasza metoda ekstrakcji pozwoliła nam na pozyskanie do ~80 000 LSK HSPCs na mysz. Żywotność i liczba komórek LSK uległy poprawie dzięki zastosowaniu naszej metody, ponieważ: (1) połączyliśmy szpik kostny z kończyn górnych i dolnych, kości biodrowych, mostka, klatki piersiowej i kręgosłupa, (2) zrezygnowaliśmy z użycia buforu do lizy erytrocytów, który zwiększyłby obumieranie komórek i ich agregację, (3) zastosowaliśmy separację komórek jednojądrowych za pomocą medium do gradientu gęstości oraz (4) uniknęliśmy użycia schł...

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Zmiany metaboliczne w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych pozwalają im przejść ze stanu spoczynku do stanu różnicowania, aby sprostać wymaganiom tworzenia krwi. Zmiana plastyczności metabolicznej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych prowadzi do zaburzeń hematologicznych. Nasz protokół pomoże zmierzyć regulację metaboliczną i zdrowie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych podczas rozwoju krwi i chorób.Analiza oddychania mitochondrialnego i glikolizy hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych jest trudna, ponieważ są to delikatne i rzadkie populacje. Nasz zoptymalizowany protokół pozwala na wyizolowanie większej ilości hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych z mysiego szpiku kostnego, poprawia ich żywotność podczas inkubacji, ułatwia analizę strumienia zewnątrzkomórkowego nieprzylegających HSPC i zapewnia zoptymalizowane parametry iniekcji dla fosforylacji oksydacyjnej ukierunkowanej na lek, a także szlaków glikolitycznych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy napełnić studnie płyty użytkowej i komory wokół studni sterylną wodą.Zanurz wkład czujnika w tabliczce narzędziowej, upewniając się, że czujniki są całkowicie pokryte wodą. Następnie umieść wkład zanurzony w płytce użytkowej w inkubatorze bez CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby inkubować przez noc. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II dodaj 40 mikrolitrów dostępnego w handlu 0,1% roztworu PLL do każdej studzienki płytki testowej.Przykryj płytkę testową pokrywką dołączoną do zestawu i inkubuj zamkniętą płytkę w temperaturze pokojowej pod kapturem przez jedną godzinę. Następnie użyj sterylnego aspiratora próżniowego, aby usunąć nadmiar roztworu i wysuszyć płytkę pod pokrywą przeciwsłoneczną. Aby zebrać monojądrowe mysie komórki szpiku kostnego, dodaj pięć mililitrów pożywki o gradiencie gęstości do 15-mililitrowej stożkowej probówki.Powoli dodaj pięć mililitrów zawiesiny komórek szpiku kostnego, upewniając się, że komórki pozostają jako warstwa powyżej ośrodka gradientu gęstości. Wirować przy 500 razy g i w temperaturze pokojowej przez 30 minut, upewniając się, że wirówka ma najniższe możliwe przyspieszenie. Zbierz środkową granicę komórek jednojądrowych do świeżej 15-mililitrowej probówki.Następnie umyj komórki pięcioma mililitrami 1X PBS zawierającego 2% FBS. Wirować w temperaturze 500 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 mikrolitrach 1X PBS zawierającego 2% FBS.Następnie podwielokrotność 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do niebarwionej lub jednokolorowej kontroli w probówce FACS. Aby zebrać LSK HSPC z monojądrowych komórek mysiego szpiku kostnego, dodaj 15 mikrolitrów koktajlu przeciwciał biotyny do 300 mikrolitrów jednojądrowych komórek szpiku kostnego. Aby zebrać LSK HSPC z monojądrowych komórek mysiego szpiku kostnego, dodaj 15 mikrolitrów koktajlu przeciwciał biotyny do 300 mikrolitrów jednojądrowych komórek szpiku kostnego.Umieść probówki w wiaderku z lodem umieszczonym na shakerze w lodówce do inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem przez 30 minut. Następnie dodaj do komórek 10 mililitrów wstępnie schłodzonego 1X PBS zawierającego 2% FBS. Wirować w temperaturze 500 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 mikrolitrach 1X PBS zawierającego 2% FBS. Przed użyciem krótko wymieszaj mikrogranulki antybiotyny. Dodaj 80 mikrolitrów mikrogranulek do każdej próbki i dobrze wymieszaj.Inkubować przez dodatkowe 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem. Następnie dodaj do komórek 10 mililitrów wstępnie schłodzonego PBS zawierającego 2% FBS. Odwirować probówkę w temperaturze 500 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze PBS zawierającym 2% FBS. Przechowuj zawiesinę ogniw w temperaturze czterech stopni Celsjusza podczas ustawiania jednostki separacji magnetycznej. Umieść kolumnę w polu magnetycznym separatora do sortowania komórek ze wspomaganiem magnetycznym w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przygotuj kolumnę do separacji magnetycznej, przepłukując ją trzema mililitrami 1X PBS zawierającego 2% FBS pod przepływem grawitacyjnym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj zawiesinę komórek do wstępnie zwilżonej kolumny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pozwól, aby wszystkie komórki przeszły przez kolumnę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zbierz ścieki w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów.Następnie umyj kolumnę trzema mililitrami 1X PBS i 2% FBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powtórz to pranie trzy razy. Zbierz przepływ i utrzymuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odwirować stożkową rurkę zawierającą przepływ, o ciśnieniu 500 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 0,5 mililitra 1X PBS z 2% FBS i przenieś zawiesinę do probówki FACS. Następnie dodaj 24 mikrolitry koktajlu przeciwciał LSK do każdych 10 milionów komórek.Przykryj probówkę folią i inkubuj w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem przez godzinę. Następnie dodaj trzy mililitry 1X PBS z 2% FBS do probówki FACS. Wirować w temperaturze 500 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki znakowane przeciwciałami w jednym mililitrze 1X PBS zawierającym 2% FBS. Tuż przed sortowaniem dodaj jeden mikrolitr jednego miligrama na mililitr jodku propidyny do zawiesiny komórek i użyj sitka o średnicy 40 mikrometrów do przefiltrowania zawartości probówki FACS. Najpierw odwiruj zebrane komórki LSK w temperaturze 500 razy g i w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w kompletnych pożywkach do końcowego stężenia co najmniej 70 000 komórek na 40 mikrolitrów. Wysiewaj 40 mikrolitrów tej zawiesiny komórkowej do dołków ośmiodołkowej płytki pokrytej PLL, upewniając się, że wszystkie dołki narożne są puste. Odwirować płytkę w temperaturze 450 g i w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.Użyj odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że komórki są przymocowane do dna studzienek. Następnie dodaj 135 mikrolitrów kompletnej pożywki do komórek w każdym dołku, zwiększając końcową objętość każdej studzienki do 175 mikrolitrów. Dodaj 175 mikrolitrów kompletnej pożywki do dwóch rogów płytki jako półfabrykaty.Inkubować komórki w inkubatorze bez CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie skonfiguruj program dla analizatora, aby dodawać leki do każdej studzienki płytki, jak opisano w tabeli drugiej i tabeli trzeciej protokołu tekstowego. W celu przeprowadzenia testu wysiłkowego mitochondriów należy pobrać z inkubatora wkład czujnika z płytki użytkowej w taki sposób, aby każda studzienka miała końcowe stężenie dwóch oligomycyny mikromolowej, 1,5 mikromolowej FCCP i 0,5 mikromolowej rotenonu i antymycyny A w razie potrzeby.Zdejmij pokrywę z wkładu czujnika i umieść go na tacy na instrumenty. Rozpocznij proces kalibracji, który potrwa 20 minut. Po zakończeniu kalibracji wyjmij tabliczkę użytkową i zastąp ją płytką testową zawierającą komórki LSK.Naciśnij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić poprzednio ustawiony program. Po zakończeniu programu pobierz dane i przeanalizuj je. W tym badaniu izoluje się maksymalną ilość żywotnych mysich LSK HSPC, a ich glikolizę i metabolizm mitochondrialny mierzy się za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.Chociaż analiza strumienia zewnątrzkomórkowego jest tradycyjnie stosowana w przypadku komórek przylegających, metoda ta sprawia, że HSPC LSK przylegają do studzienek pokrytych PLL, co pozwala na pomiar strumienia zewnątrzkomórkowego, a tym samym zdrowia metabolicznego HSPC LSK. W celu zmierzenia oddychania mitochondrialnego poprzez wskaźnik zużycia tlenu i glikolizy poprzez wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w warunkach podstawowych i stresowych, leki zakłócające glikolizę i oddychanie mitochondrialne są wstrzykiwane sekwencyjnie. Zgodnie z oczekiwaniami, podstawowy poziom wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego jest wyższy dla LSK HSPC hodowanych w pożywkach dodatnich z glukozą i pirogronianem w porównaniu z tymi hodowanymi w pożywkach ujemnych.Wstrzyknięcie glukozy nie zmieniło szybkości zewnątrzkomórkowego zakwaszenia komórek hodowanych w pożywce dodatniej, ale zwiększyło glikolizę komórek w pożywce ujemnej. Jednak podstawowy poziom tych komórek nadal pozostawał niższy w grupie dodatniej. Wstrzyknięcie oligomycyny aktywowało glikolizę na maksymalnym poziomie w grupie dodatniej, ale nie wpłynęło na grupę ujemną.Wstrzyknięcie analogu glukozy w 2-DG przywróciło szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego do poziomów nieglikolitycznych. W teście stresu mitochondrialnego wstrzyknięcie oligomycyny spowodowało hiperpolaryzację błony mitochondrialnej, zapobiegając pompowaniu większej ilości protonów przez kompleksy ETC, a tym samym zmniejszając szybkość oddychania mitochondrialnego. Wstrzyknięcie FCCP zwiększa zużycie tlenu do maksimum, ponieważ komórki próbują odzyskać potencjał błony mitochondrialnej.Wstrzyknięcie dwóch innych inhibitorów łańcucha transportu elektronów powoduje całkowite zatrzymanie oddychania mitochondrialnego, a tym samym tempo zużycia tlenu powraca do minimalnego poziomu. Należy unikać stosowania buforu do lizy krwinek czerwonych do izolacji komórek jednojądrzastych. Zalecamy separację w gradiorze Ficoll, aby zapobiec tworzeniu się grudek i zmniejszyć utratę LSK.Korzystając z naszej zoptymalizowanej metody, możemy zmierzyć oddychanie mitochondrialne i glikolizę rzadkich i delikatnych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oraz badać sygnały metaboliczne regulujące prawidłową i złośliwą hematopoezę.

analysis-of-hematopoietic-stem-progenitor-cell-metabolism

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Test tworzenia kolonii (CFC) to badanie in vitro, w którym komórki progenitorowe krwiotwórcze tworzą kolonie w podłożu półstałym. Do oceny zdolności progenitorów do proliferacji i różnicowania się wzdłuż różnych linii krwiotwórczych wykorzystuje się kombinację analizy morfologii kolonii, morfologii komórek oraz cytometrii przepływowej.

Test tworzenia kolonii (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania konkurencyjnych eksperymentów z przeszczepem szpiku kostnego myszy w celu zbadania funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych bez wcześniejszego oczyszczania komórek macierzystych przez sortowanie komórek.

Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Ksenobiotyczne pompy wypływowe są bardzo aktywne w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) i powodują ekstruzję TMRM, barwnika fluorescencyjnego o potencjale błony mitochondrialnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół do dokładnego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w HSPC za pomocą TMRM w obecności Werapamilu, inhibitora pompy wypływowej.

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

Tutaj opisujemy wiarygodną metodę pomiaru masy mitochondriów i potencjału błonowego w hodowanych ex vivo hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T.

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego i niezawodnego pomiaru metabolitów w rzadkich typach komórek. Udoskonalenia techniczne, w tym zmodyfikowany płyn osłonkowy do sortowania komórek i generowanie odpowiednich próbek ślepych, umożliwiają kompleksową ocenę ilościową metabolitów przy wkładzie zaledwie 5000 komórek na próbkę.

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Poznaj zoptymalizowaną metodę pomiaru mitochondrialnej respiracji i glikolizy w krwiotwórczych komórkach macierzystych HSPCs. Protokół poprawia izolację z mysiej szpiku kostnego i zwiększa żywotność komórek.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów