Poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów

Możemy wyizolować i zebrać probiotyki, które mogą zarówno promować zdrowie koralowców, jak i jednocześnie łagodzić wpływ zanieczyszczeń i które mogą przyczynić się do przetrwania rafy w zmieniającym się świecie. Opisane podejście oparte na izolacji i badaniach przesiewowych można wykorzystać do selekcji mikroorganizmów wykazujących kluczowe działania metaboliczne, takie jak rozkład zanieczyszczeń lub inne korzystne cechy dla organizmów morskich, takich jak koralowce. Metoda ta może być stosowana do izolowania mikroorganizmów zdolnych do rozkładu wszelkich zanieczyszczeń.

Ponadto inne źródła materiału mogą być wykorzystane w innych próbkach środowiskowych, takich jak rośliny, gleba, woda, cokolwiek. Zapoznaj się z literaturą i spróbuj skupić się na szczepach, które mogą być dobrymi kandydatami do Twojego celu. Jeśli to możliwe, kieruj metodami izolacji tych szczepów i unikaj znanych patogenów.

A jeśli zamierzasz użyć konsorcjum bakterii, bardzo ważne jest również, aby najpierw zbadać, czy członkowie konsorcjum mają antagonistyczną aktywność wobec siebie. Ponieważ koralowce są coraz bardziej zagrożone wyginięciem, metodologia ta zaczyna być wdrażana na całym świecie i istnieje potrzeba rozpowszechnienia i ujednolicenia metody. Ponieważ niektórzy badacze koralowców nie mają doświadczenia w konwencjonalnej mikrobiologii, dlatego często proszą o radę, jak postępować z takim podejściem.

Na początek z każdego docelowego miejsca pobierania próbek użyj sterylnych butelek z zakrętkami, aby zebrać 500 mililitrów wody w trzech egzemplarzach. Jeśli przetwarzanie próbki odbywa się później, trzymaj butelki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj sterylnej pary szczypiec i kleszczy, aby wyciąć fragmenty koralowców z tego samego miejsca pobierania próbek, co próbki wody.

Opłucz próbkę koralowca za pomocą 20 mililitrów sterylnego 3% roztworu soli fizjologicznej lub sztucznej wody morskiej, aby pozbyć się luźno przyczepionych wolno żyjących bakterii z wody morskiej. Za pomocą kleszczy umieść każdy fragment koralowca w sterylnym pojemniku z zakrętką zawierającą sterylny roztwór soli fizjologicznej. Za pomocą sterylnych kleszczyków i szczypiec zważ na wadze pięć gramów fragmentów koralowców na sterylnych szalkach Petriego.

Przenieś pięć gramów próbki koralowca do sterylnego moździerza i zmaceruj ją za pomocą sterylnego tłuczka. Za pomocą sterylnej szpatułki przenieść zmacerowaną próbkę do sterylnej kolby hodowlanej zawierającej 25 mililitrów 3% sterylnego roztworu chlorku sodu i 10 do 15 szklanych kulek o średnicy 2,5 milimetra. Użyj 20 mililitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby przemyć zaprawę do probówki, aby odzyskać maksymalną ilość maceratu.

W celu odłączenia mikroorganizmów od różnych komór koralowców, należy utrzymywać kolby w ciągłym mieszaniu pod ciśnieniem 150 g przez 16 godzin w temperaturze wody w miejscu pobierania próbek. Aby wybrać bakterie, najpierw wykonaj seryjne rozcieńczenia do 10 do ujemnej dziewiątki w sterylnym roztworze soli fizjologicznej dla próbek koralowców i do 10 do ujemnych sześciu dla próbek wody. Rozcieńczenia pipety należy pięć razy w górę i w dół przed wyrzuceniem końcówki.

Następnie wywiruj każdy z nich. Za każdym razem należy wirować próbki przez pięć sekund przed wykonaniem następnego rozcieńczania seryjnego. Odpipetować 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na szalkach Petriego zawierających 3% chlorku sodu, lizogenii, bulionu agarowego i poczynić je na płytce.

Inkubuj płytki przez jeden do trzech dni w temperaturze docelowej, na przykład 26 stopni Celsjusza. Sprawdzaj tabliczki raz dziennie. Selekcjonować i izolować kolonie o odmiennej morfologii wzrostu na nowych płytkach przy użyciu techniki płytki smugowej.

Powtórz ten krok tyle razy, ile potrzeba, aby na płytkach wyrosły czyste kolonie. Izolaty należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub w glicerolu zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby wykonać test zdolności degradacji EE2, wybierz pojedynczą kolonię ze świeżych płytek i zaszczepij w dwóch mililitrach sterylnej pożywki LB w probówce.

W przypadku, gdy jest to bulion glicerolowy, weź 10 mikrolitrów bulionu bakteryjnego glicerolu i rozprowadź smugi na płytkach agarowych LB. Inkubuj w temperaturze od 24 do 28 stopni Celsjusza przez noc, aby wyrosły pojedyncze kolonie. Umieścić probówkę zawierającą pożywkę LB nachyloną pod stałym mieszaniem 150 razy g w temperaturze od 24 do 28 stopni Celsjusza przez noc.

Po wzroście bakterii osadzaj komórki, odwirowując je z prędkością 8 000 razy g przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Aby umyć pozostały bulion LB, dodaj dwa mililitry soli fizjologicznej, aby ponownie zawiesić komórki.

Powtórz pranie dwukrotnie, aby upewnić się, że nie ma śladów źródła węgla. Inokulować umyte i ponownie zawieszone komórki w minimalnej pożywce hodowlanej Bushnell Haas zawierającej EE2 jako jedyne źródło węgla. Oceń wzrost bakterii na podstawie gęstości optycznej przy 600 nanometrach i naszych jednostkach tworzących kolonie na podłożu agarowym LB po 16 do 72 godzinach inkubacji.

Aby przygotować minimalną ilość pożywki zawierającej frakcję rozpuszczalną w oleju i wodzie oraz frakcję nierozpuszczalną w wodzie i oleju jako jedyne źródło węgla, dodaj 1-2% ropy naftowej do 500 mililitrów sterylnej wody destylowanej w kolbie filtracyjnej zawierającej zawór na dnie. Utrzymywać kolbę w ciągłym mieszaniu w temperaturze od 24 do 28 stopni Celsjusza w temperaturze 150 razy g przez 48 godzin. Następnie umieścić kolbę na stabilnej powierzchni i odczekać 10 do 20 minut, aby umożliwić oddzielenie się frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej.

Następnie otwórz dolną kolbę filtracyjną, aby przenieść frakcję rozpuszczalną w oleju i wodzie do nowej sterylnej kolby, oszczędzając frakcję nierozpuszczalną w oleju i wodzie. Następnie przygotuj dwie butelki minimalnej pożywki agarowej Bushnell Haas. Zrób to w autoklawie.

Połącz z frakcją rozpuszczalną w oleju i wodzie jako jedynym źródłem węgla, aby uzyskać 500 mililitrów podłoża agarowego. Zrób to samo z frakcją nierozpuszczalną w oleju i wodzie i przenieś około 25 mililitrów każdej pożywki na poszczególne szalki Petriego. Aby wyizolować bakterie rozkładające olej, należy ponownie użyć wcześniej rozcieńczonych próbek i pobrać pipetą 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na szalki Petriego zawierające podłoże agarowe i ułożyć je na płytkach.

Pamiętaj o zachowaniu negatywnych kontroli na swoich talerzach. Inkubuj naczynia przez jeden do trzech dni w temperaturze docelowej i powtórz procedury izolacji jak poprzednio. W tym protokole mikroorganizmy zostały wyizolowane z różnych źródeł wody i guzków koralowców o przypuszczalnych cechach BMC i zdolnych do degradacji różnych klas zanieczyszczeń.

Korzystając z próbek wody pobranych w oczyszczalni ścieków uzyskanych z Eksperymentalnego Centrum Warunków Sanitarnych Uniwersytetu Federalnego w Rio de Janeiro, wyizolowano 33 szczepy bakterii zdolne do degradacji EE2. Dodatkowo, korzystając z techniki selekcji bakterii rozkładających olej, wyizolowano 20 szczepów zdolnych do degradacji zarówno frakcji rozpuszczalnej w oleju, jak i frakcji nierozpuszczalnej w oleju-wodzie. Przypuszczalne cechy BMC zostały przebadane w mikroorganizmach, wśród których znalazł się szczep wykazujący silne działanie antagonistyczne wobec patogenu koralowców Vibrio cholerae lyticus, szczepy zdolne do degradacji mocznika, który jest dobrym producentem katalazy, oraz mikroorganizmy wykazujące potencjalnie korzystne geny.

Wykorzystując zarówno bioremediację, jak i inokulację BMC, możliwe było przewidzenie wpływu narażenia na działanie ropy naftowej na koralowce. Konsorcjum PBMC bioremediatora oleju wyizolowanego z koralowca zaszczepiono na guzkach koralowców wystawionych na działanie 1% oleju. Wykazał on lepiej zachowaną zdolność fotochemiczną w porównaniu ze zdrowiem koralowców bez inokulacji.

Nie pozostawiaj próbek w temperaturze pokojowej zbyt długo. W przeciwnym razie społeczność drobnoustrojów może się zmienić, a drobnoustroje związane z chorobami mogą przerastać inne. Ropa naftowa jest toksyczna.

Upewnij się, że używasz odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej podczas pracy z tym lub innym zanieczyszczeniem, którego zdecydujesz się użyć. Technika ta utorowała innowacyjną drogę w dziedzinie odbudowy koralowców i bioremediacji oceanów, które mogą być potencjalnie wykorzystane do zminimalizowania skutków gospodarczych, ekologicznych i społecznych spowodowanych globalnymi zmianami.