Name: Poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Odkryj metody izolacji mikroorganizmów do bioremediacji i rozwoju probiotyków dla koralowców. Techniki te wspierają ochronę metaorganizmów morskich i zwiększają odporność raf koralowych na zanieczyszczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało przeprowadzone w połączeniu z trwającym projektem badawczo-rozwojowym zarejestrowanym jako ANP 21005-4, "PROBIO-DEEP - Survey of potential impacts caused by oil and gas exploration on deep-sea marine holobionts and selection of potential bioindicators and bioremediation processes for these ecosystems" (UFRJ / Shell Brasil / ANP) - "PROBIO-DEEP - Levantamento de potenciais impactos causados pela exploração de óleo e gá s em holobiontes marinhos em mar profundo e seleção de potenciais bioindicadores e processos biorremediadores para esses ecossistemas", sponsorowany przez Shell Brasil w ramach opłaty badawczo-rozwojowej ANP jako "Compromisso de Investimentos com Pesquisa e Desenvolvimento. Autorzy dziękują również Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) oraz Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) za wsparcie finansowe oraz Camili Messias, Phillipe Rosado i Henrique Fragoso dos Santos za udostępnione zdjęcia.

1. Zbieranie i przechowywanie wody i koralowców w celu izolacji mikrobiologicznej
UWAGA: Ważne jest, aby zmierzyć współrzędne i temperaturę miejsc pobierania próbek. Jeśli to możliwe, metadane, takie jak zasolenie, pH, głębokość i natężenie światła, mogą również pomóc w znalezieniu precyzyjnych podejść do uprawy i przyszłej interpretacji danych. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, próbki należy przechowywać jak najkrócej przez możliwie najkrótszy czas. Mikrobiomy wodne/koralowe mogą ulec znacznym zmianom, jeśli próbki nie są przechowywane w odpowiedniej temperaturze i/lub są przechowywane przez długi czas. Jeżeli etap izolacji nie zostanie przeprowadzony natychmiast po pobraniu, kluczowe znaczenie ma utrzymanie próbek w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia. Im dłużej próbki są przechowywane, nawet w temperaturze 4 °C, tym bardziej zmienia się społeczność mikrobiologiczna.
<ol>
	<li>Pobieraj próbki i przechowuj wodę morską.
	<ol>
		<li>Zebrać 500 ml próbek wody w co najmniej trzech egzemplarzach z każdego docelowego miejsca pobierania próbek. Najlepiej używać sterylnych butelek z zakrętkami.</li>
		<li>Jeśli przetwarzasz wodę natychmiast po pobraniu, trzymaj butelki w temperaturze RT przez krótki czas. Jeśli przetwarzanie próbki odbywa się później, należy przechowywać butelki w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieraj próbki i przechowuj koralowce.
	<ol>
		<li>Użyj sterylnej pary szczypiec, aby wyciąć fragmenty koralowców z tego samego miejsca pobierania próbek, co próbki wody. Aby uniknąć zanieczyszczenia, dotykaj koralowców tylko sterylnymi rękawiczkami.</li>
		<li>Opłucz próbkowany fragment koralowca za pomocą 20 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (3% NaCl w wodzie destylowanej) lub sztucznej wody morskiej, aby pozbyć się luźno przyczepionych wolno żyjących bakterii z wody morskiej.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy umieść każdy fragment koralowca w sterylnym pojemniku o pojemności 250-500 ml z zakrętką zawierającą sterylny roztwór soli fizjologicznej.</li>
		<li>W laboratorium, za pomocą sterylnych kleszczy i szczypiec, zważ 5 g fragmentów koralowca za pomocą sterylnych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm na wadze.</li>
		<li>Przenieść 5 g próbki koralowca do sterylnego moździerza i zmacerować za pomocą sterylnego tłuczka.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej szpatułki przenieść zmacerowaną próbkę do sterylnej kolby hodowlanej zawierającej 45 ml 3% sterylnego roztworu NaCl i 10−15 szklanych kulek o średnicy 5 mm. Użyj części 45 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby umyć zaprawę i odzyskać maksymalną ilość maceratu.</li>
		<li>Kolby należy stale mieszać (150 x g) przez 16 godzin w temperaturze wody w miejscu pobierania próbek. 
		UWAGA: Dla koralowców płytkowodnych optymalna temperatura będzie wynosić od 24−28 °C. Ten krok odłączy mikroorganizmy od różnych przedziałów koralowców, takich jak te przyczepione do komórek gospodarza lub te żyjące w tkance i szkielecie. Po tym etapie maceraty koralowe nie powinny być przechowywane, a etap izolacji musi być natychmiast wykonany.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja bakterii rozkładających EE2 z wody morskiej i/lub koralowców
<ol>
	<li>Wybierz bacteria. 
	UWAGA: Po krokach 1.1.2 i 1.2.7 stężenie mikroorganizmów w wodzie morskiej, które oderwały się od różnych maceratów koralowców, będzie nieznane i zmienne. Aby zagwarantować izolację pojedynczych kolonii drobnoustrojów na szalkach Petriego zawierających podłoże agarowe, konieczne są seryjne rozcieńczenia.
	<ol>
		<li>Wykonaj seryjne rozcieńczenia do 10-9 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej dla próbek koralowców i do 10-6 dla próbek wody. Rozcieńczenia pipety w górę i w dół 5 razy przed wyrzuceniem końcówki. Wirować próbki przez 5 s za każdym razem przed wykonaniem kolejnego seryjnego rozcieńczania.</li>
		<li>Odpipetować 100 μl każdego rozcieńczenia na szalkach Petriego zawierających 3% bulionu lizogennego NaCl (LB) pożywki agarowej i umieścić je na płytce. 
		UWAGA: Użyj agaru morskiego (MA) jako alternatywnego podłoża. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, wymagane są trzykrotne powtórzenia każdego rozcieńczenia.</li>
		<li>Inkubować płytki przez 1-3 dni w temperaturze docelowej (np. 26 °C). Sprawdzaj tabliczki raz dziennie.</li>
		<li>Selekcjonować i izolować kolonie o odmiennej morfologii wzrostu na nowych płytkach przy użyciu techniki płytki smugowej. Powtórz ten krok tyle razy, ile potrzeba, aby na płytkach wyrosły czyste kolonie.</li>
		<li>Jeżeli procedura nie jest natychmiast kontynuowana do kroku 2.3.1, należy przechowywać izolaty w temperaturze 4 °C lub w glicerolu, jak opisano w sekcji 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zapasy glicerolu. 
	UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i może być stosowany do długoterminowego przechowywania zapasów bakterii.
	<ol>
		<li>Pobrać pojedyncze kolonie ze świeżej płytki lub z płytek przechowywanych w temperaturze 4 °C i niezależnie je zaszczepić w 2 ml sterylnej pożywki LB.</li>
		<li>Umieścić probówki pod stałym mieszaniem (150 x g) w temperaturze 24−28 °C przez noc (WŁ.).</li>
		<li>Dodać 1 ml kultur bakteryjnych z kroku 2.2.2 i sterylnego glicerolu do końcowego stężenia 20% do 2 ml kriowialiów.</li>
		<li>Pozostawić kriowiale włączone w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umieścić bulion bakteryjny glicerolu w temperaturze -80 °C, aż będzie potrzebny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj test zdolności do degradacji EE2.
	<ol>
		<li>Aktywuj izolaty w bulionie LB lub alternatywnym podłożu. W tym celu należy wybrać pojedynczą kolonię ze świeżych płytek lub płytki przechowywanej w temperaturze 4 °C i zaszczepić 2 ml sterylnej pożywki LB. W przypadku, gdy jest to bulion glicerolowy, najpierw rozłóż go na płytkach agarowych LB i inkubuj w temperaturze 24−28 °C ON, aby wyrosły pojedyncze kolonie. Umieścić probówkę zawierającą pożywkę LB nachyloną pod stałym mieszaniem (150 x g) w temperaturze 24−28 °C ON.</li>
		<li>Po wzroście bakterii osadzaj komórki, odwirowując je przy 8 000 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej (RT). Wyrzucić supernatant i delikatnie pipetując w górę i w dół, ponownie zawiesić komórki w równej objętości (2 ml) soli fizjologicznej, aby zmyć pozostały bulion LB.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.3.2 dwukrotnie, aby upewnić się, że nie ma śladowych ilości źródła węgla, ponownie zawieszając ogniwa w równej objętości roztworu soli fizjologicznej. Na przykład, jeśli rozpoczęto od hodowli o pojemności 2 ml, ponownie zawieś komórki w końcowej objętości 2 ml roztworu soli fizjologicznej.</li>
		<li>Zaszczepić umyte i ponownie zawieszone komórki w minimalnej pożywce hodowlanej Bushnell Haas (bulion BH) zawierającej EE2 jako jedyne źródło węgla59. 
		UWAGA: EE2 rozpuszcza się w etanolu w końcowym stężeniu 5 mg/l w pożywce hodowlanej. W razie potrzeby należy wprowadzić zmiany w rodzaju i/lub stężeniu zanieczyszczenia.</li>
		<li>Oceń wzrost bakterii na podstawie gęstości optycznej przy 600 nm i/lub jednostkach tworzących kolonie (CFU) na pożywce agarowej LB 33, przez 16−72 h inkubacji. 
		UWAGA: Alternatywnie, mikroorganizmy można bezpośrednio wyizolować na minimalnej pożywce zawierającej EE2 lub inne związki jako jedyne źródło węgla. Ten krok ukierunkowałby selekcję i pozwolił uniknąć niepożądanego wzrostu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja bakterii rozkładających ropę naftową z wody morskiej i/lub koralowców
<ol>
	<li>Przygotuj minimalną ilość pożywki zawierającej frakcję rozpuszczalną w wodzie olejową (oWSF) i frakcję nierozpuszczalną w wodzie oleju (oWIF) jako jedyne źródło węgla21.
	<ol>
		<li>Dodaj 1-2% ropy naftowej do 500 ml sterylnej wody destylowanej. Użyj kolby filtracyjnej otwartej na dnie, aby usunąć frakcję rozpuszczalną bez naruszania górnej warstwy frakcji nierozpuszczalnej.</li>
		<li>Mieszaninę należy stale mieszać w temperaturze 24−28 °C przy 150 x g przez 48 godzin.</li>
		<li>Kolbę filtracyjną zawierającą frakcje ropy naftowej umieścić na stabilnej powierzchni i odczekać 10-20 minut, aby umożliwić oddzielenie frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej.</li>
		<li>Przenieść oWSF do nowej sterylnej kolby, oszczędzając oWIF poprzez otwarcie dolnej kolby filtracyjnej i wyjęcie frakcji rozpuszczalnej.</li>
		<li>Wykorzystując cały oWSF odzyskany w poprzednim kroku (~400 ml), przygotuj 1 l minimalnej pożywki agarowej BH zawierającej oWSF jako jedyne źródło węgla.</li>
		<li>Korzystając z oWIF pozostałego w kolbie z kroku 3.1.4, przygotować 1 l minimalnej pożywki agarowej BH zawierającej oWIF jako jedyne źródło węgla.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizoluj bakterie rozkładające oWSF i oWIF.
	<ol>
		<li>Używając maceratu wodnego i koralowego z etapów odpowiednio 1.1.2 i 1.2.7, rozcieńczyć próbki do 10-6 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, jak opisano w kroku 2.1.1.</li>
		<li>Pobrać pipetą 100 μl każdego rozcieńczenia na szalki Petriego zawierające podłoża agarowe BH-oWSF i BH-oWIF i płytkować je.</li>
		<li>Powtórz procedury opisane od kroku 2.1.3 do kroku 2.1.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wybór członków konsorcjum
<ol>
	<li>Wyodrębnij i zsekwencjonuj DNA w celu identyfikacji taksonomicznej.
	<ol>
		<li>Aktywować izolaty znajdujące się w glicerolu zgodnie z opisem w kroku 2.3.1.</li>
		<li>Ekstrahować DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Użyj starterów 27f (5′-AGA, GTT, TGA, TGA, TGG, CTC, AG-3′) i 1492r (5′-GTT, TAC, CTT, GTT, ACG, ACT, T-3′) do amplifikacji genu 16S rRNA.</li>
		<li>Wykonaj 50 μL reakcji PCR zgodnie z następującym protokołem: 5 μL 10x buforu polimerazy, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 5 mM każdego startera, 10 ng genomowego DNA i 2,5 U polimerazy Taq DNA. Dodać kontrole ujemne (tj. ślepe próby ekstrakcji DNA i reakcje PCR bez matrycowego DNA), aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia.</li>
		<li>Ustaw następujące etapy cykli termicznych: pierwszy cykl denaturacji w temperaturze 94 °C przez 4 minuty; 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 1 minutę, następnie 50 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 2,5 minuty; końcowy cykl przedłużania przez 10 minut w temperaturze 72 °C.</li>
		<li>Sprawdź integralność amplikonu w 1,2% żelu agarozowym przy użyciu 80 V.</li>
		<li>Żel oczyszczać próbki za pomocą zestawu do oczyszczania żelu (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Określ ilościowo produkty PCR za pomocą fluorometru.</li>
		<li>Wyślij produkt do sekwencjonowania. 
		UWAGA: Dla lepszej klasyfikacji taksonomicznej zalecana jest metoda Sangera60, ponieważ zapewnia długie sekwencje. Uniwersalne startery 27f i 1492r mogą być używane do amplifikacji prawie całej długości genu 16S rRNA61. Jeśli kontigi nie mogą być złożone przy użyciu jednej pary starterów, należy rozważyć dodatkową parę w środku sekwencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ krzywą wzrostu.
	<ol>
		<li>Aktywować izolaty w zapasach glicerolu z kroku 2.2.5, jak opisano w kroku 2.3.1, ale używając 5 ml zamiast 2 ml.</li>
		<li>Dodać 1% (v/v) wyhodowanej kultury o pojemności 5 ml z kroku 4.2.1 w trzech powtórzeniach do kolby o pojemności 250 ml zawierającej 100 ml pożywki o stężeniu 3% LB. Upewnij się, że przygotowałeś również trzy egzemplarze kontroli negatywnej (bez inokulum).</li>
		<li>Umieścić kolby w inkubatorze pod stałym mieszaniem (150 x g) w temperaturze 24−28 °C.</li>
		<li>Przyjmować 1 ml porcji co 4 godziny przez 48 godzin. Jeśli szczepy wykazują wysokie tempo wzrostu, zmniejsz odstęp 4 godzin.</li>
		<li>Zmierzyć oszacowanie gęstości optycznej (OD) przy długości fali 600 nm i jednostkach tworzących kolonie (CFU) liczonych z seryjnych rozcieńczeń posianych na płytkach z multimediami (100 μl należy zaszczepić w każdej płytce i znormalizować do objętości 1 ml).</li>
		<li>Wykreślić krzywe OD i CFU i przeanalizować korelację OD/CFU każdego pojedynczego szczepu. Od teraz obliczaj liczbę komórek na podstawie wartości OD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj test antagonizmu.
	<ol>
		<li>Aktywuj izolaty zgodnie z opisem w kroku 2.3.1.</li>
		<li>Zaszczepiaj jeden szczep na raz wzdłuż środka płytek zawierających podłoże agarowe, a pozostałe prostopadłe do środkowej. Powtarzaj, aż każdy wybrany szczep drobnoustrojów zostanie przetestowany pod kątem wszystkich innych.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 24−28 °C i monitorować je codziennie, aby zaobserwować potencjalne halo wskazujące na aktywność antagonistyczną. Jeśli zaobserwuje się aureole wskazujące na antagonistyczną aktywność między dwoma szczepami, jeden z nich powinien zostać wykluczony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj montaż konsorcjum.
	<ol>
		<li>Aktywuj izolaty zgodnie z opisem w kroku 2.3.1.</li>
		<li>Granulować komórki o masie 3 500 x g i delikatnie umyć je 2x w równej objętości roztworu soli fizjologicznej. Ponownie zawiesić komórki w równej objętości (tj. jeśli końcowa objętość wynosiła 2 ml komórek, przemyj je 2 ml roztworu soli fizjologicznej i ponownie zawieś w końcowej objętości 2 ml).</li>
		<li>Zaszczepić 1 ml kultury w 100 ml 3% Pożywki NaCl LB i inkubować ON w temperaturze 150 x g.</li>
		<li>Powtórzyć krok 4.5.2, zaszczepić 100 ml wyhodowanych, umytych i ponownie zawieszonych kultur w 10 litrowych kulturach. Inkubować ON w sterylnych bioreaktorach z podnośnikiem powietrznym, otrzymując przefiltrowane powietrze z pompy. Jeśli potrzebna jest większa liczba kultur, zawsze zaszczepiaj 1% wyhodowanej kultury w świeżej pożywce.</li>
		<li>Odwirować wyhodowane kultury w temperaturze 8 000 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany sklarant.</li>
		<li>Umyj granulkę, delikatnie zawieszając komórki w 500 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.5.5 i 4.5.6.</li>
		<li>Ponownie zawiesić każdą pojedynczą hodowlę w 100 ml roztworu soli i zmierzyć OD, aby oszacować liczbę komórek.</li>
		<li>Obliczyć objętość każdej kultury niezbędną do osiągnięcia końcowego stężenia 10-7 komórek mL-1.</li>
		<li>Wykonaj obliczenia CFU na multimediach w celu ostatecznego potwierdzenia żywotności i stężenia komórek.</li>
		<li>Wymieszać równą objętość każdej kultury w sterylnych kolbach i podzielić konsorcjum na sterylne probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu zaszczepienia. 
		UWAGA: Przygotuj zespół konsorcjum tak świeży, jak to możliwe, aby zagwarantować, że ogniwa będą nadal żywotne. Alternatywnie, liczenie CFU można wykonać przed inokulacją. Aby stworzyć idealne konsorcjum, konieczne jest użycie izolatów o różnych i uzupełniających się zdolnościach metabolicznych. Zwykle do tworzenia konsorcjów używa się 6-10 izolatów, ale liczba ta będzie się różnić w zależności od cech i celów członków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wykrywanie przypuszczalnie korzystnych cech koralowców
<ol>
	<li>Aktywuj izolaty z zapasów glicerolu, rozrzucając je na płytkach agarowych LB i inkubując je w temperaturze 24−28 °C ON, aby uzyskać wzrost pojedynczych kolonii. Wybierz pojedynczą kolonię z płytek i zaszczep ją w 2 ml sterylnego podłoża LB. Umieścić probówkę zawierającą pożywkę LB nachyloną pod stałym mieszaniem (150 x g) w temperaturze 24−28 °C ON.</li>
	<li>Przeprowadzić ekstrakcję DNA w sposób opisany w punkcie 4.1 w celu wykrycia potencjalnie korzystnych genów metodą PCR. 
	UWAGA: Warunki reakcji PCR i startery będą zależeć od docelowego genu. Metodologie badania charakterystyki BMC poszczególnych szczepów i wykrywania PCR pod kątem potencjalnie korzystnych genów opisano w tabeli 1.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ciągu ostatnich 50 lat podejścia bioremediacyjne były szeroko badane. Na przykład ponad 200 mikroorganizmów wśród bakterii, sinic, mikroalg i grzybów w kilku różnych siedliskach zostało wyznaczonych jako zdolne do wskazania obecności i/lub degradacji węglowodorów ropopochodnych 62,63,64. Ponadto inne klasy związków, które mają wpływ na środowisko i ludzi, takie jak plastik, bisfenol A, substancje zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego i metale ciężkie, są celem rozwoju technik bioremediacji 65,66,67. Z drugiej strony, rozwój probiotyków morskich został ograniczony do dziedzin, które mają oczywisty wpływ na gospodarkę, takich jak probiotyki rybne w akwakulturze 68,69. Jednak izolacja i charakterystyka pożytecznych mikroorganizmów w celu ochrony raf koralowych, ekosystemów morskich, które wspierają rybołówstwo, turystykę i inne dochodowe działania, zaczynają być cenione15. W tym miejscu opisano tani, łatwy i dostępny protokół selekcji mikroorganizmów rozkładających zanieczyszczenia, które mogą również wykazywać potencjalnie korzystne cechy dla lokalnych ekosystemów morskich, zwłaszcza przypuszczalnie korzystne mikroorganizmy dla koralowców (pBMC).
Ponadto zaprezentowana tutaj metoda jest wysoce elastyczna w odniesieniu do kilku związków i różnych rodzajów źródeł mikrobiologicznych. Możliwe jest ukierunkowanie na różne zanieczyszczenia poprzez zastąpienie jedynego źródła węgla dodanego do minimalnej ilości mediów. W tym celu zamiast oleju lub EE2 należy dodać inne związki o pożądanym stężeniu. Byłaby to presja selekcyjna mająca na celu wyizolowanie degraderów docelowych zanieczyszczeń. Na przykład mikroorganizmy zdolne do rozkładu innych klas substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego zostały już wybrane i przetestowane przy użyciu tej samej metodyki70. Co więcej, jako źródła mikroorganizmów rozkładających można wykorzystać inne organizmy morskie i lądowe, takie jak gąbki i rośliny71,72, a także różne rodzaje próbek środowiskowych, takie jak gleba, paliwo i skały 25,73,74. Na przykład udało się wykryć i wyizolować bakterie rozkładające węglowodory z różnych próbek gleby i osadów 25,54,63,64,75. Wreszcie, dokonując niewielkich modyfikacji w pożywce, mikroorganizmy inne niż bakterie można łatwo wybrać jako drobnoustroje rozkładające. Na przykład zgłoszono szczep mikroalg zdolny do wydajnej degradacji związków estrogenowych.
Idealnie byłoby, gdyby konsorcja bioremediacyjno-probiotyczne były tworzone dla każdego konkretnego związku lub obszaru. Drobnoustroje, które rozwijają się w określonym środowisku, mogą nie rozwijać się tak dobrze w nowych miejscach w porównaniu z ich naturalnymi warunkami. Ponieważ naukowcy nie znaleźli produktu, który mógłby być skutecznie stosowany we wszystkich różnych warunkach środowiskowych, dla każdej konkretnej sytuacji należy organizować nowe konsorcja. Byłoby to podobne do medycyny spersonalizowanej w celu powrotu do zdrowia dostosowanego do środowiska. Z tego powodu utworzenie centralnego banku szczepów drobnoustrojów o potencjalnych właściwościach probiotycznych i zdolności do degradacji jest kluczowym krokiem dla postępu w tej dziedzinie. Inicjatywa ta pozwoliłaby zaoszczędzić czas i pracę, przyczyniając się do tworzenia nowych konkretnych konsorcjów na całym świecie.
Mikroorganizmy związane z koralowcami (tj. mikroalgi, bakterie, archeony, grzyby i wirusy) odgrywają złożoną i skomplikowaną rolę w utrzymaniu homeostazy gospodarza19. Stresory środowiskowe, takie jak zanieczyszczenie, mogą również destabilizować mikrobiom koralowców, powodując dysbiozę, która może powodować choroby i śmiertelność30. Mechanizmy, za pomocą których mikrobiom koralowców może wspierać zdrowie koralowców, zaczynają być ujawniane. Mechanizmy te są kluczem do zrozumienia odporności koralowców i odporności na stresory środowiskowe, a w konsekwencji do promowania trwałości i ochrony raf. Ponadto odkrycia w tej dziedzinie pomogą zrozumieć ogólne interakcje między gospodarzem a mikrobiomem, co może przyczynić się do opracowania lepszych probiotyków i strategii prozdrowotnych w innych obszarach. Ważne jest również, aby lepiej zbadać, w jaki sposób te szczepienia probiotykami mogą wpływać na zdrowie metaorganizmu podczas zdarzeń stresowych. Na przykład nadal potrzebne są prace wykazujące, że poprawa wydajności koralowców jest spowodowana probiotykami, a nie tylko koralowcami wykorzystującymi bakterie jako źródło pożywienia.
Równolegle ogromne znaczenie ma rozwój nowych podejść do realizacji zadań przez konsorcja i doskonalenie już istniejących. Alternatywne metody unieruchamiania konsorcjum, a także innowacyjne podejścia, takie jak inokulacja pokarmu koralowców (tj. artemii i wrotków) i wykorzystanie ich jako wektorów, są obiecujące. Te systemy dostarczania mogą być również modyfikowane w celu zwalczania innych organizmów morskich i będą miały zasadnicze znaczenie dla sukcesu w dziedzinie probiotyków morskich.
Ograniczanie zanieczyszczeń i trwałość raf koralowych to obecnie dwa główne tematy regularnie poruszane na konferencjach poświęconych ochronie środowiska. Agenda 2030, dokument opublikowany przez Organizację Narodów Zjednoczonych, który opisuje globalne cele, jakie społeczeństwo powinno osiągnąć, aby umożliwić zrównoważoną przyszłość, poświęca konkretne cele dla każdej kwestii. Podczas gdy cel 6 podkreśla znaczenie poprawy jakości wody poprzez zmniejszenie zanieczyszczenia, cel 14 wzmacnia znaczenie ochrony i zrównoważonego wykorzystania oceanów, mórz i zasobów morskich77. W tym kontekście ochrona raf koralowych zależy od zmian, które powinny zostać osiągnięte w najbliższej przyszłości, w tym od ograniczenia zanieczyszczeń. Ma to ogromne znaczenie, ponieważ do największych strat koralowców doszło, gdy do zdarzeń klimatycznych dodano inne czynniki, takie jak niszczenie lokalnych siedlisk i zanieczyszczenie78,79. W artykule tym wykazano, że możliwe jest połączenie bioremediacji i inokulacji pBMC w celu degradacji określonych zanieczyszczeń, przy jednoczesnym zwiększeniu odporności i odporności koralowców na zanieczyszczenia i inne problemy. Optymalizacja istniejących protokołów i/lub opracowanie innowacyjnych metod, połączonych lub stosowanych niezależnie, będzie miało kluczowe znaczenie dla określenia przyszłości ekosystemów morskich.

Zanieczyszczenie jest głównym problemem wpływającym na zdrowie ludzi, zwierząt i roślin na całym świecie. Chociaż zanieczyszczenia mogą być naturalne, takie jak popioły wulkaniczne1, główną przyczyną większości zanieczyszczeń jest działalność człowieka. Działalność antropogeniczna zanieczyszcza glebę, wodę i powietrze, co bezpośrednio lub pośrednio prowadzi do prawie 20 milionów przedwczesnych zgonów ludzi2 i dziesiątkuje miliardy innych form życia rocznie. Zanieczyszczenia są obecne nawet w najodleglejszych zakątkach planety. Na przykład metale ciężkie i trwałe związki organiczne wykryto odpowiednio u bezkręgowców głębinowych i ssaków polarnych3,4.
Środowisko morskie zostało szczególnie dotknięte zanieczyszczeniem. Przez długi czas zakładano, że ocean pozostanie nienaruszony i będzie nieskończonym źródłem dóbr ze względu na ogromną ilość wody5. Z tego powodu wszystkie rodzaje przemysłu i instytucji od wieków swobodnie uwalniają odpady do zbiorników wodnych6,7. Kilka wszelkiego rodzaju zanieczyszczeń, takich jak plastic8, syntetyczne hormony9, pestycydy10, oil11, składniki odżywcze12, heavy metals3 i odpady radioaktywne13 zostały zgłoszone jako wpływające na ekosystemy oceaniczne. W tym kontekście rafy koralowe są jednymi z najważniejszych i najbardziej wrażliwych ekosystemów w środowisku morskim14. Rafy koralowe są obrońcami wybrzeży, kluczowymi dla rozwoju tysięcy gatunków morskich, odgrywając istotną rolę w obiegu składników odżywczych i kontroli klimatu. Rafy koralowe również przyczyniają się do rozwoju gospodarki, dostarczając między innymi ryb, towarów i turystyki15. Na przykład 4,5 miliarda ludzi polega na rybach oceanicznych jako głównym źródle pożywienia16, które są w dużym stopniu wspierane przez rafy koralowe.
Bez względu na ich ekologiczne, społeczne i ekonomiczne znaczenie, rafy koralowe są dziesiątkowane17,18. Działania antropogeniczne są przede wszystkim odpowiedzialne za trzy główne przyczyny śmierci koralowców: zmiany klimatyczne, przełowienie i zanieczyszczenie wody19. Mimo że ważne jest, aby pracować nad łagodzeniem globalnego ocieplenia, ważne jest również, aby pracować nad minimalizacją lokalnych zanieczyszczeń, w tym zanieczyszczenia wody, które może krytycznie przyczynić się do spadku liczebności koralowców20. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania strategii mających na celu wydłużenie życia koralowców, co mogłoby zapewnić im dodatkowy czas na przystosowanie się i przetrwanie.
W związku z tym, niezwykle ważne jest znalezienie rozwiązań minimalizujących zanieczyszczenie i opracowanie strategii zwiększających kondycję koralowców. Strategie remediacji zanieczyszczeń morskich są bardzo zróżnicowane i można je podzielić na podejścia fizyczne, chemiczne i biologiczne. Pomocne są podejścia fizyczne. Nie zawsze jednak są one wydajne. Na przykład odpady z tworzyw sztucznych można zminimalizować poprzez fizyczne usunięcie, podczas gdy związki rozpuszczalne w wodzie wymagają innych metod, aby je wyeliminować. Przykładami takich związków są ropa naftowa, uwalniana w wyniku działalności przemysłu naftowego i wycieków, a także inne mikrozanieczyszczenia, takie jak syntetyczne hormony, zwykle stosowane jako składnik estrogenowy w doustnych środkach antykoncepcyjnych i obecne w ściekach21,22. Stosowanie substancji chemicznych w celu zmniejszenia zanieczyszczenia może rozwiązać konkretny problem, ale może również stanowić dodatkowe źródło zanieczyszczenia. Tak jest w przypadku chemicznych dyspergatorów mających na celu złagodzenie zanieczyszczenia ropą, które zostały opisane jako jeszcze bardziej toksyczne dla ekosystemów morskich niż samo zanieczyszczenie ropą23. Z tych powodów podejścia biologiczne mają kilka zalet w porównaniu z innymi metodami. Bioremediacja to zdolność organizmów żywych lub ich produktów przemiany materii do przekształcania zanieczyszczeń w mniej toksyczne lub nietoksyczne formy24. Głównymi zaletami stosowania metod biologicznych są zrównoważony rozwój, stosunkowo niski koszt, fakt, że są one przyjazne dla środowiska oraz to, że mogą być stosowane w różnych ekosystemach, powodując minimalny lub mniejszy wpływ na środowisko21,25,26,27.
Dodatkowo, manipulacja społecznością mikrobiologiczną obecną w środowisku pozwala na dodatkową potencjalną przewagę. Istnieją mikrobiomy, które są związane z gospodarzami i są niezbędne dla ich zdrowia. Powszechnie wiadomo, że te powiązane symbiotyczne mikrobiomy są niezbędne do utrzymania homeostazy gospodarza19. Manipulacja tymi powiązanymi mikroorganizmami została dobrze zbadana w przypadku gospodarzy takich jak rośliny i ssaki28,29, ale stosowanie probiotyków koralowych jest nadal nowe15. Koralowce są również gospodarzami, oddziałują z dużymi i specyficznymi populacjami mikroorganizmów, aby przetrwać19. Rola tych społeczności mikrobiologicznych w zdrowiu i dysbiozie koralowców jest aktywnie badana, ale wciąż jest daleka od pełnego zrozumienia30. Jedna z najpopularniejszych hipotez nazywa się hipotezą probiotyku koralowców. Sugeruje to istnienie dynamicznego związku między symbiotycznymi mikroorganizmami a warunkami środowiskowymi, który prowadzi do wyboru najkorzystniejszych metaorganizmów koralowych31. Na podstawie tych informacji zaproponowano kluczowe potencjalne mechanizmy probiotyczne, a także strategie izolacji, manipulacji i dostarczania pożytecznych mikroorganizmów dla koralowców (BMC) do kilku celów, zaproponowano 32 i przetestowano33. Te potencjalnie korzystne cechy obejmują między innymi odporność na wzrost temperatury, ochronę przed reaktywnymi formami tlenu (ROS), wiązanie azotu, odporność na zanieczyszczenia i biologiczną kontrolę przed patogenami32.
To badanie skupia się na selekcji BMC i wolno żyjących mikroorganizmów wykazujących zdolność do degradacji dwóch zanieczyszczeń powszechnie występujących w środowisku morskim: syntetycznego estrogenu 17a-etynyloestradiolu (EE2) i ropy naftowej. Zanieczyszczenia zawierające hormony czynne są często obecne w zbiornikach wodnych34,35,36,37,38,39,40,41,42. Wśród nich syntetyczne estrogenowe związki zaburzające gospodarkę hormonalną (EDC) naśladują działanie estrogenów na komórki docelowe, powodując szereg skutków dla zwierząt, w tym raka piersi, bezpłodność i hermafrodytyzm9. EE2 jest wydalany przez ludzi z powodu stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych. Nie jest usuwany ze ścieków przez tradycyjne oczyszczalnie ścieków i ma negatywne skutki nawet przy bardzo niskich stężeniach (np. ng/L lub μg/L)43,44,45. Niewiele wiadomo na temat wpływu estrogenów na fizjologię koralowców46,47. Jednak w przypadku innych bezkręgowców morskich, takich jak gąbki, skorupiaki i, estrogeny powodują kilka negatywnych skutków związanych głównie z reprodukcją, takich jak rozwój i/lub stymulacja gamet, zmiany w działaniu enzymatycznym i białkowym, problemy w procesach embrionalnych i inne48,49,50,51,52. Negatywne konsekwencje spowodowane zanieczyszczeniem EE2 podkreślają konieczność opracowania zrównoważonych metod usuwania tego związku ze środowiska bez wpływu na życie morskie.
Równocześnie, ponieważ ropa naftowa stanowi obecnie prawie 40% światowych źródeł energii53, w pobliżu raf często dochodzi do chronicznych zanieczyszczeń i wycieków ropy11. Stwierdzono, że zanieczyszczenie olejem powoduje negatywne skutki u kilku gatunków zwierząt morskich, ptaków, roślin i ludzi54,55,56,57. Na koralowcach powoduje blaknięcie, zmniejsza odporność larw na stres termiczny58, zakłóca społeczności związane z mikroorganizmami21 i powoduje martwicę tkanek. Ponadto dyspergatory chemiczne, technika remediacji ropy naftowej powszechnie stosowana przez firmy naftowe do remediacji wycieków, są jeszcze bardziej toksyczne dla koralowców niż sama ropa23. Z kolei pożyteczne mikroorganizmy wyizolowane z koralowców są znane z tego, że odgrywają kluczową rolę w zdrowiu gospodarza. Jednak manipulacja tymi potencjalnymi probiotykami musi być lepiej zbadana w celu zbadania możliwych negatywnych skutków ubocznych i zdolności metabolicznych, które można przebadać w celu poprawy sprawności metaorganizmu. W tym kontekście należy skupić się na takich cechach, jak między innymi aktywność przeciwdrobnoustrojowa przeciwko patogenom koralowców, produkcja katalazy w celu zwalczania stresu oksydacyjnego, zdolność do degradacji mocznika (który może odgrywać ważną rolę w procesie zwapnienia) oraz obecność genów, które nadają potencjalnie korzystne cechy. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób bioremediacja i probiotyki mogą być stosowane w celu jednoczesnego łagodzenia skutków zanieczyszczeń i poprawy zdrowia koralowców. Rozwój innowacyjnych podejść, które mogą być wykorzystane jako interwencje mające na celu zwiększenie trwałości gatunków morskich, stanowi krok w kierunku bardziej zrównoważonej i zdrowszej planety.

<table><tbody><tr><td>Butelka do przechowywania mediów PYREX o pojemności 500 ml</td><td>thomas scientific/Corning</td><td>1743E20/1395-500</td><td>Służy do pobierania próbek wody.</td></tr><tr><td>Butelki z aspiratorem 500 ml</td><td>thomas scientific/Corning</td><td>1234B28/1220-2X</td><td>Służy do oddzielania frakcji oleju.</td></tr><tr><td>6-calowe szczypce do cięcia drutu</td><td>thomas scientific/Restek</td><td>1173Y64/23033</td><td>Służy do cięcia fragmentów koralowców.</td></tr><tr><td>17a-etynyloestradiol</td><td>LGC Wzorce</td><td>DRE-C13245100</td><td>Używany jako jedyne źródło węgla do produkcji pożywek selektywnych.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Himedia</td><td>PCT0901-1KG</td><td>Służy do wytwarzania pożywek stałych.</td></tr><tr><td>Bushnell Haas Broth</td><td>Himedia</td><td>M350-500G</td><td>Stosowany jako minimalna pożywka, która ma być uzupełniona źródłami węgla.</td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera</td><td>thomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)</td><td>4882H35/26500-125</td><td>Służy do inkubacji maceratu koralowego ze szklanymi kulkami.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA i opaski żelowej GFX PCR</td> GE <td>Healthcare</td><td>28903470</td><td>Służy do oczyszczania produktów PCR przed wysłaniem ich do sekwencjonowania.</td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>MP Biomedicals</td><td>1177Q81/07DP1070</td><td>Służy do oddzielania mikroorganizmów od struktur koralowców.</td></tr><tr>Okap <td></td><td></td><td>z przepływem laminarnym</td><td>Potrzebny do pracy w sterylnych warunkach.</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth)</td><td>Himedia</td><td>M1245-1KG</td><td>Stosowany jako bogate podłoże do hodowli bakterii.</td></tr><tr><td>Agar morski 2216 (Zobell Marine Agar)</td><td>Himedia</td><td>M384-500G</td><td>Stosowany jako bogate podłoże do hodowli bakterii.</td></tr><tr>Inkubator <td></td><td></td> z <td>wytrząsarką orbitalną</td><td>Służy do inkubacji płynnych pożywek i oleju.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td> płytkowy <td>Służy do inkubacji płytek.</td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek porcelanowy</td><td>Thomas scientific/United Scientific Supplies</td><td>1201U69/JMD150</td><td>Służy do maceracji fragmentów koralowców.</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometr</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Służy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych DNA i produktów PCR.</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td> z chłodzeniem <td>Służy do wirowania kultur bakterii.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td>Służy do pomiaru gęstości optycznej kultur bakteryjnych.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Wizard</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Służy do ekstrakcji DNA szczepów drobnoustrojów.</td></tr></tbody></table>

poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Zanieczyszczenie wpływa na wszystkie biomy. Szczególnie ucierpiały środowiska morskie, zwłaszcza rafy koralowe, jeden z najbardziej wrażliwych ekosystemów na Ziemi. Na całym świecie 4,5 miliarda ludzi jest ekonomicznie zależnych od morza, gdzie większość ich utrzymania zapewniają rafy koralowe. Koralowce mają ogromne znaczenie i dlatego ich wyginięcie prowadzi do katastrofalnych konsekwencji. Istnieje kilka możliwych rozwiązań w zakresie remediacji zanieczyszczeń morskich i lokalnych zanieczyszczeń, w tym bioremediacja. Bioremediacja to zdolność organizmów do rozkładu zanieczyszczeń. Podejście to ma kilka zalet, takich jak zrównoważony rozwój, stosunkowo niski koszt oraz fakt, że można je stosować w różnych ekosystemach, powodując minimalny wpływ na środowisko. Dodatkową zaletą jest to, że manipulowanie endogennymi mikrobiomami, w tym przypuszczalnie korzystnymi mikroorganizmami dla koralowców (pBMC), może mieć działanie probiotyczne dla zwierząt morskich. W tym kontekście zastosowanie dwóch podejść, bioremediacji i inokulacji pBMC w połączeniu, może być obiecujące. Strategia ta promowałaby degradację określonych zanieczyszczeń, które mogą być szkodliwe dla koralowców i innych metaorganizmów, jednocześnie zwiększając odporność i odporność gospodarza na radzenie sobie z zanieczyszczeniami i innymi zagrożeniami. Metoda ta koncentruje się na selekcji pBMC do degradacji dwóch zanieczyszczeń: syntetycznego estrogenu 17a-etynyloestradiolu (EE2) i ropy naftowej. Doniesiono, że oba mają negatywny wpływ na zwierzęta morskie, w tym koralowce i ludzi. Protokół opisuje, w jaki sposób izolować i testować bakterie zdolne do rozkładu określonych zanieczyszczeń, a następnie opisuje, jak wykryć niektóre przypuszczalnie korzystne cechy tych powiązanych mikroorganizmów z ich koralowym gospodarzem. Opisane tutaj metodologie są stosunkowo tanie, łatwe do wykonania i wysoce elastyczne. Zamiast EE2 i oleju można użyć prawie każdego rodzaju rozpuszczalnego związku docelowego.

W oparciu o opisane tutaj metody możliwe było wyizolowanie mikroorganizmów z różnych źródeł wody oraz fragmentów koralowców (nubbins), wykazujących domniemane charakterystyki BMC i zdolność do degradacji różnych klas zanieczyszczeń (Rysunek 1). Wykorzystując próbki wody pobrane w oczyszczalni ścieków, uzyskane z CESA-UFRJ (Experimental Center of Environmental Sanitation of the Federal University of Rio de Janeiro), oraz opierając się na przedstawionej tutaj procedurze, wyizolowano 33 szczepy bakterii zdolnych do degradacji EE2 przy stężeniu końcowym 5mg/L (Rysunek 2A). Ponadto, stosując technikę selekcji bakterii degradujących ropę naftową, wyizolowano 20 szczepów zdolnych do degradacji zarówno oWSF (Rysunek 2B), jak i oWIF (Rysunek 2C).
Domniemane cechy BMC przesiewano w mikroorganizmach izolowanych z różnych gatunków koralowców w zróżnicowanych warunkach. Wśród nich zidentyfikowano szczep wykazujący silną aktywność antagonistyczną wobec patogenu koralowców Vibrio coralliilyticus (Rycina 3A), szczepy zdolne do degradacji mocznika (Rycina 3B), wydajnego producenta katalazy (Rycina 3C) oraz mikroorganizmy posiadające potencjalnie korzystne geny (Rycina 3D).
Zastosowanie obu podejść w połączeniu (tj. bioremediacji i inokulacji BMC) pozwoliło na ochronę koralowców przed skutkami ekspozycji na ropę naftową. W tym celu konsorcjum pBMC bioremediatorów ropy, wyizolowane z koralowca Mussismilia harttii, zaszczepiono na fragmentach koralowców (nubbins) eksponowanych na 1% ropy w trzech powtórzeniach21. W grupach eksponowanych na ropę od czwartego dnia odnotowano progresywny spadek Fv/Fm, który w dziesiątym dniu osiągnął wartości bliskie zeru. Stosunek fluorescencji zmiennej do fluorescencji maksymalnej (Fv/Fm) stanowił miarę maksymalnej wydajności fotochemicznej fotosystemu II (PSII) zooksantelli, będąc pośrednim wskaźnikiem stanu zdrowia koralowców. Z kolei fragmenty koralowców w akwariach zaszczepionych konsorcjum wykazały lepiej zachowaną zdolność fotochemiczną (Rysunek 4).
<img alt="Izolacja bakterii z wody i koralowców; schemat procesu obejmujący macerację, wysiew na płytki, typowanie DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Podsumowanie głównych etapów selekcji i tworzenia konsorcjum bioremediator-pBMC.Schemat etapów selekcji mikroorganizmów degradujących zanieczyszczenia (na szaro) oraz końcowych etapów wykorzystywanych do selekcji mikrobów do konsorcjum (sekwencjonowanie DNA, krzywa wzrostu, test antagonizmu i tworzenie konsorcjum na czerwono). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Eksperyment wzrostu kolonii bakteryjnych, schemat szalki Petriego, porównanie morfologii kolonii, mikrobiologia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Selekcja bakterii degradujących zanieczyszczenia. (A) Izolaty bakteryjne rosnące na płytkach z pożywką minimalną zawierającą EE2 jako jedyne źródło węgla. (B) Kolonie bakterii rosnące na płytkach z pożywką minimalną zawierającą oWSF jako jedyne źródło węgla. (C) Kolonie bakterii rosnące na płytkach z pożywką minimalną zawierającą oWIF jako jedyne źródło węgla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki testu przeciwdrobnoustrojowego, wzrostu bakterii i elektroforezy w żelu; eksperyment mikrobiologiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wykrywanie charakterystyk pBMC. (A) Krople w trzech powtórzeniach szczepu wykazującego aktywność antagonistyczną wobec patogenu koralowców Vibrio coralliilyticus (na czarno) oraz szczepu kontrolnego (na zielono). (B) Szczepy rosnące na pożywce zawierającej mocznik jako jedyne źródło węgla. (C) Szczep produkujący katalazę (+) oraz szczep o słabej produkcji katalazy (-). (D) Przykład detekcji genu nirK metodą PCR (ścieżka 1 = drabinka 1kb; ścieżka 2 = ujemna kontrola ekstrakcji DNA – próbka pusta; ścieżka 3 = detekcja nirK; ścieżka 4 = reakcje PCR bez matrycowego DNA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres analizy fluorescencji chlorofilu, stosunek Fv/Fm w ciągu 10 dni, grupa kontrolna vs traktowanie olejem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60238/60238fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Pomiary Fv/Fm fragmentów M. harttii zaadaptowanych do ciemności o godzinie 17:00, przy użyciu fluorometru chlorofilu diving-PAM. Pomiary Fv/Fm dla grup: konsorcjum kontrolne, olej oraz olej z konsorcjum były wykonywane w trzech powtórzeniach każdego dnia przez 10 dni. Przedstawiono odchylenie standardowe. Elementy wykresu zostały zmodyfikowane na podstawie wcześniejszych wyników21 za zgodą autora, dostępnych pod adresem https://www.nature.com/articles/srep18268 na licencji Creative Commons Attribution 4.0. Pełne warunki dostępne są na stronie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60238/60238fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr>
			<td>Mechanizm działania</td>
			<td>Mikroorganizm</td>
			<td>Technika detekcji</td>
			<td>Literatura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Regulacja klimatu; cykl siarki; związki przeciwdrobnoustrojowe; zwiększenie ochrony przeciwutleniającej komórek.</td>
			<td>Aspergillus sydowii</td>
			<td>PCR dla genu dddP</td>
			<td>81</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudovibrio sp. P12</td>
			<td>Pożywka hodowlana z DMSP</td>
			<td>82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>PCR dla genu dmdA</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Biologiczna regulacja patogenów.</td>
			<td>Mikrobiom z śluzu Acropora palmata</td>
			<td>Przejrzysta strefa zahamowania</td>
			<td>83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekstrakty z koralowców</td>
			<td>Test zahamowania wzrostu</td>
			<td>84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marinobacter sp.</td>
			<td>Testy swarmingowe</td>
			<td>85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>Metoda krzyżowego posiewu na płytkach agarowych</td>
			<td>86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>Metoda dyfuzyjna na agarze</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Wsparcie procesu kalcyfikacji; źródło azotu dla koralowców skleraktiniowych.</td>
			<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Metoda kolorymetryczna</td>
			<td>87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrobiom z śluzu Stylophora pistillata</td>
			<td>___</td>
			<td>88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrobiom z Acropora alciminata</td>
			<td>Metoda według Bollanda i wsp.80</td>
			<td>89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Cykl azotowy; zwiększenie wiązania azotu.</td>
			<td>Społeczność mikrobiologiczna</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Społeczność mikrobiologiczna</td>
			<td>PCR</td>
			<td>91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Społeczność mikrobiologiczna</td>
			<td>qPCR</td>
			<td>92</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Społeczność mikrobiologiczna</td>
			<td>Adaptowana technika redukcji acetylenu (C2H2)</td>
			<td>93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudoalteromonas sp. i Halomonas taeanensis</td>
			<td>PCR</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Cykl azotowy; obniżenie stężenia amonu.</td>
			<td>Pseudoalteromonas sp.</td>
			<td>PCR</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrobiom z Tubastraea coccinea</td>
			<td>PCR</td>
			<td>94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mikrobiom z Xestospongia testudinaria</td>
			<td>Predykcyjna analiza metagenomu</td>
			<td>95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Ochrona holobionta przed reaktywnymi formami tlenu (ROS).</td>
			<td>Pseudoalteromonas sp., Cobetia marina i Halomonas taeanensis</td>
			<td>Test katalazowy</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symbiodinium spp.</td>
			<td>Amplex red</td>
			<td>96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio pelagius i Sync- chococcus sp.</td>
			<td>Metoda z peroksydazą chrzanową i skopoletyną</td>
			<td>97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio fischeri</td>
			<td>Wiele metod</td>
			<td>98</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wykrywanie domniemanych cech BMC, mechanizm działania (MOA), zgłoszone mikroorganizmy wykazujące ten potencjał oraz technika użyta do wykrycia danej cechy.

Zanieczyszczenie wpływa na wszystkie biomy. Szczególnie ucierpiały środowiska morskie, zwłaszcza rafy koralowe, jeden z najbardziej wrażliwych ekosystemów na Ziemi. Bioremediacja to zdolność organizmów do rozkładu zanieczyszczeń. W tym miejscu opisujemy metodologie izolowania i testowania drobnoustrojów prezentujących zdolność bioremediacji i potencjalne cechy probiotyczne dla koralowców.

Poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...

Możemy wyizolować i zebrać probiotyki, które mogą zarówno promować zdrowie koralowców, jak i jednocześnie łagodzić wpływ zanieczyszczeń i które mogą przyczynić się do przetrwania rafy w zmieniającym się świecie. Opisane podejście oparte na izolacji i badaniach przesiewowych można wykorzystać do selekcji mikroorganizmów wykazujących kluczowe działania metaboliczne, takie jak rozkład zanieczyszczeń lub inne korzystne cechy dla organizmów morskich, takich jak koralowce. Metoda ta może być stosowana do izolowania mikroorganizmów zdolnych do rozkładu wszelkich zanieczyszczeń.Ponadto inne źródła materiału mogą być wykorzystane w innych próbkach środowiskowych, takich jak rośliny, gleba, woda, cokolwiek. Zapoznaj się z literaturą i spróbuj skupić się na szczepach, które mogą być dobrymi kandydatami do Twojego celu. Jeśli to możliwe, kieruj metodami izolacji tych szczepów i unikaj znanych patogenów.A jeśli zamierzasz użyć konsorcjum bakterii, bardzo ważne jest również, aby najpierw zbadać, czy członkowie konsorcjum mają antagonistyczną aktywność wobec siebie. Ponieważ koralowce są coraz bardziej zagrożone wyginięciem, metodologia ta zaczyna być wdrażana na całym świecie i istnieje potrzeba rozpowszechnienia i ujednolicenia metody. Ponieważ niektórzy badacze koralowców nie mają doświadczenia w konwencjonalnej mikrobiologii, dlatego często proszą o radę, jak postępować z takim podejściem.Na początek z każdego docelowego miejsca pobierania próbek użyj sterylnych butelek z zakrętkami, aby zebrać 500 mililitrów wody w trzech egzemplarzach. Jeśli przetwarzanie próbki odbywa się później, trzymaj butelki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj sterylnej pary szczypiec i kleszczy, aby wyciąć fragmenty koralowców z tego samego miejsca pobierania próbek, co próbki wody.Opłucz próbkę koralowca za pomocą 20 mililitrów sterylnego 3% roztworu soli fizjologicznej lub sztucznej wody morskiej, aby pozbyć się luźno przyczepionych wolno żyjących bakterii z wody morskiej. Za pomocą kleszczy umieść każdy fragment koralowca w sterylnym pojemniku z zakrętką zawierającą sterylny roztwór soli fizjologicznej. Za pomocą sterylnych kleszczyków i szczypiec zważ na wadze pięć gramów fragmentów koralowców na sterylnych szalkach Petriego.Przenieś pięć gramów próbki koralowca do sterylnego moździerza i zmaceruj ją za pomocą sterylnego tłuczka. Za pomocą sterylnej szpatułki przenieść zmacerowaną próbkę do sterylnej kolby hodowlanej zawierającej 25 mililitrów 3% sterylnego roztworu chlorku sodu i 10 do 15 szklanych kulek o średnicy 2,5 milimetra. Użyj 20 mililitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby przemyć zaprawę do probówki, aby odzyskać maksymalną ilość maceratu.W celu odłączenia mikroorganizmów od różnych komór koralowców, należy utrzymywać kolby w ciągłym mieszaniu pod ciśnieniem 150 g przez 16 godzin w temperaturze wody w miejscu pobierania próbek. Aby wybrać bakterie, najpierw wykonaj seryjne rozcieńczenia do 10 do ujemnej dziewiątki w sterylnym roztworze soli fizjologicznej dla próbek koralowców i do 10 do ujemnych sześciu dla próbek wody. Rozcieńczenia pipety należy pięć razy w górę i w dół przed wyrzuceniem końcówki.Następnie wywiruj każdy z nich. Za każdym razem należy wirować próbki przez pięć sekund przed wykonaniem następnego rozcieńczania seryjnego. Odpipetować 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na szalkach Petriego zawierających 3% chlorku sodu, lizogenii, bulionu agarowego i poczynić je na płytce.Inkubuj płytki przez jeden do trzech dni w temperaturze docelowej, na przykład 26 stopni Celsjusza. Sprawdzaj tabliczki raz dziennie. Selekcjonować i izolować kolonie o odmiennej morfologii wzrostu na nowych płytkach przy użyciu techniki płytki smugowej.Powtórz ten krok tyle razy, ile potrzeba, aby na płytkach wyrosły czyste kolonie. Izolaty należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub w glicerolu zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby wykonać test zdolności degradacji EE2, wybierz pojedynczą kolonię ze świeżych płytek i zaszczepij w dwóch mililitrach sterylnej pożywki LB w probówce.W przypadku, gdy jest to bulion glicerolowy, weź 10 mikrolitrów bulionu bakteryjnego glicerolu i rozprowadź smugi na płytkach agarowych LB. Inkubuj w temperaturze od 24 do 28 stopni Celsjusza przez noc, aby wyrosły pojedyncze kolonie. Umieścić probówkę zawierającą pożywkę LB nachyloną pod stałym mieszaniem 150 razy g w temperaturze od 24 do 28 stopni Celsjusza przez noc.Po wzroście bakterii osadzaj komórki, odwirowując je z prędkością 8 000 razy g przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Aby umyć pozostały bulion LB, dodaj dwa mililitry soli fizjologicznej, aby ponownie zawiesić komórki.Powtórz pranie dwukrotnie, aby upewnić się, że nie ma śladów źródła węgla. Inokulować umyte i ponownie zawieszone komórki w minimalnej pożywce hodowlanej Bushnell Haas zawierającej EE2 jako jedyne źródło węgla. Oceń wzrost bakterii na podstawie gęstości optycznej przy 600 nanometrach i naszych jednostkach tworzących kolonie na podłożu agarowym LB po 16 do 72 godzinach inkubacji.Aby przygotować minimalną ilość pożywki zawierającej frakcję rozpuszczalną w oleju i wodzie oraz frakcję nierozpuszczalną w wodzie i oleju jako jedyne źródło węgla, dodaj 1-2% ropy naftowej do 500 mililitrów sterylnej wody destylowanej w kolbie filtracyjnej zawierającej zawór na dnie. Utrzymywać kolbę w ciągłym mieszaniu w temperaturze od 24 do 28 stopni Celsjusza w temperaturze 150 razy g przez 48 godzin. Następnie umieścić kolbę na stabilnej powierzchni i odczekać 10 do 20 minut, aby umożliwić oddzielenie się frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej.Następnie otwórz dolną kolbę filtracyjną, aby przenieść frakcję rozpuszczalną w oleju i wodzie do nowej sterylnej kolby, oszczędzając frakcję nierozpuszczalną w oleju i wodzie. Następnie przygotuj dwie butelki minimalnej pożywki agarowej Bushnell Haas. Zrób to w autoklawie.Połącz z frakcją rozpuszczalną w oleju i wodzie jako jedynym źródłem węgla, aby uzyskać 500 mililitrów podłoża agarowego. Zrób to samo z frakcją nierozpuszczalną w oleju i wodzie i przenieś około 25 mililitrów każdej pożywki na poszczególne szalki Petriego. Aby wyizolować bakterie rozkładające olej, należy ponownie użyć wcześniej rozcieńczonych próbek i pobrać pipetą 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na szalki Petriego zawierające podłoże agarowe i ułożyć je na płytkach.Pamiętaj o zachowaniu negatywnych kontroli na swoich talerzach. Inkubuj naczynia przez jeden do trzech dni w temperaturze docelowej i powtórz procedury izolacji jak poprzednio. W tym protokole mikroorganizmy zostały wyizolowane z różnych źródeł wody i guzków koralowców o przypuszczalnych cechach BMC i zdolnych do degradacji różnych klas zanieczyszczeń.Korzystając z próbek wody pobranych w oczyszczalni ścieków uzyskanych z Eksperymentalnego Centrum Warunków Sanitarnych Uniwersytetu Federalnego w Rio de Janeiro, wyizolowano 33 szczepy bakterii zdolne do degradacji EE2. Dodatkowo, korzystając z techniki selekcji bakterii rozkładających olej, wyizolowano 20 szczepów zdolnych do degradacji zarówno frakcji rozpuszczalnej w oleju, jak i frakcji nierozpuszczalnej w oleju-wodzie. Przypuszczalne cechy BMC zostały przebadane w mikroorganizmach, wśród których znalazł się szczep wykazujący silne działanie antagonistyczne wobec patogenu koralowców Vibrio cholerae lyticus, szczepy zdolne do degradacji mocznika, który jest dobrym producentem katalazy, oraz mikroorganizmy wykazujące potencjalnie korzystne geny.Wykorzystując zarówno bioremediację, jak i inokulację BMC, możliwe było przewidzenie wpływu narażenia na działanie ropy naftowej na koralowce. Konsorcjum PBMC bioremediatora oleju wyizolowanego z koralowca zaszczepiono na guzkach koralowców wystawionych na działanie 1% oleju. Wykazał on lepiej zachowaną zdolność fotochemiczną w porównaniu ze zdrowiem koralowców bez inokulacji.Nie pozostawiaj próbek w temperaturze pokojowej zbyt długo. W przeciwnym razie społeczność drobnoustrojów może się zmienić, a drobnoustroje związane z chorobami mogą przerastać inne. Ropa naftowa jest toksyczna.Upewnij się, że używasz odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej podczas pracy z tym lub innym zanieczyszczeniem, którego zdecydujesz się użyć. Technika ta utorowała innowacyjną drogę w dziedzinie odbudowy koralowców i bioremediacji oceanów, które mogą być potencjalnie wykorzystane do zminimalizowania skutków gospodarczych, ekologicznych i społecznych spowodowanych globalnymi zmianami.

prospecting-microbial-strains-for-bioremediation-probiotics

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Eukarioty mikrobiologiczne są zarówno źródłem węgla pochodzenia fotosyntetycznego, jak i drapieżnymi gatunkami szczytowymi w stale pokrytych lodem jeziorach Antarktydy. Niniejszy raport opisuje podejście oparte na kulturach wzbogaconych w celu izolacji metabolicznie wszechstronnych eukariotów mikrobiologicznych z antarktycznego jeziora Bonney oraz ocenia potencjał asymilacji węgla nieorganicznego przy użyciu testu radioizotopowego na aktywność rybulozo-1,5-bisfosforanowej...

Ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Źródło: Villela, H. D. M. i in. Poszukiwanie szczepów mikroorganizmów do bioremediacji oraz rozwój probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje izolację bakterii morskich degradujących zanieczyszczenia poprzez seryjne rozcieńczanie, selekcję kolonii oraz wzrost w medium zawierającym EE2. Wykorzystując EE2 jako jedyne źródło węgla, protokół identyfikuje szczepy bakterii zdolne do metabolizowania tego zanieczyszczenia środowiska.

Przesiewowe bakterie morskie pod kątem izolacji szczepów degradujących zanieczyszczenia

Źródło: Villela, H. D. M. i in. Poszukiwanie szczepów mikroorganizmów do bioremediacji oraz rozwój probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje selektywną izolację bakterii morskich degradujących ropę poprzez wzbogacanie próbek wody morskiej na nośnikach olejowych, co umożliwia odzyskiwanie czystych szczepów z potencjalnymi zastosowaniami w bioremediacji ropy naftowej i oczyszczaniu środowiska.

Selektywne wzbogacanie i izolacja bakterii morskich degradujących ropę z próbek wody morskiej

Metoda wyodrębniania endospor bakteryjnych ze złożonych społeczności mikrobiologicznych została opracowana w celu przeprowadzenia dostosowanych kultur lub badań molekularnych tej grupy bakterii.

Fizyczna izolacja przetrwalników z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych

Ponieważ organizmy beztlenowe nie są w stanie rosnąć po ekspozycji na tlen, niezbędne jest stosowanie technik hodowli beztlenowej. W tym miejscu demonstrujemy prostą i skuteczną metodę uprawy mieszanej kultury pochodzącej z biogazowni, od przygotowania pożywki do ilościowego oznaczania gazu i lotnych kwasów tłuszczowych.

Pożywka Preparat do hodowli mikroorganizmów w warunkach ściśle beztlenowych/beztlenowych

Przedstawiamy proces izolacji, rozmnażania i charakteryzowania bakterii rozkładających węglowodory z siedlisk wodnych. W protokole opisano izolację bakterii, identyfikację metodą 16S rRNA oraz badanie ich potencjału degradacji węglowodorów. Ten artykuł pomoże naukowcom w scharakteryzowaniu różnorodności biologicznej drobnoustrojów w próbkach środowiskowych, a w szczególności w badaniach przesiewowych pod kątem drobnoustrojów o potencjale bioremediacji.

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Tutaj prezentujemy protokół badania różnorodności biologicznej gleby w poszukiwaniu szczepów grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów. Najpierw izoluje się szczepy grzybów, które mogą rosnąć na kwasach humusowych lub lignocelulozie. Ich aktywność jest następnie testowana zarówno w testach enzymatycznych, jak i na zanieczyszczeniach, takich jak węglowodory i tworzywa sztuczne.

Izolacja i badania przesiewowe pod kątem różnorodności biologicznej gleby pod kątem grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów

Izolacja odpornych na metale ciężkie mikroorganizmów ze źródeł geotermalnych jest gorącym tematem dla rozwoju biosystemów bioremediacji i monitorowania środowiska. Badanie to zapewnia metodologiczne podejście do izolowania i identyfikacji bakterii tolerujących metale ciężkie z gorących źródeł.

Bioprospekcja mikroorganizmów ekstremofilnych w celu rozwiązania problemu zanieczyszczenia środowiska

Tematem tego artykułu jest szczegółowe opisanie najlepszych praktyk tworzenia pożywek dla wymagających mikroorganizmów beztlenowych pozyskanych ze środowiska. Metody te pomagają w zarządzaniu kulturami beztlenowymi i mogą być stosowane do wspomagania wzrostu nieuchwytnych mikroorganizmów niehodowlanych, "mikrobiologicznej ciemnej materii".

Zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku

Technika iChip wykorzystuje niedrogie i proste urządzenie do izolacji in-situ, które zwiększa tempo odkrywania nowych mikroorganizmów z gleby. Nowe mikroorganizmy mogą być wykorzystywane m.in. do dalszych badań nad mikrobiomem glebowym lub odkrywaniem produktów naturalnych.

Izolacja mikroorganizmów glebowych z wykorzystaniem technologii iChip

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Odkryj metody izolacji mikroorganizmów do bioremediacji i rozwoju probiotyków dla koralowców. Techniki te wspierają ochronę metaorganizmów morskich i zwiększają odporność raf koralowych na zanieczyszczenia.

Poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów

Przeglądaj więcej filmów