Chirurgia stereotaktyczna do implantacji układów mikroelektrod w marmozecie zwyczajnej (Callithrix jacchus)

Ogólnym celem tej procedury jest nakreślenie etapów chirurgicznych związanych z implantacją matryc mikroelektrod do przewlekłego zapisu elektrofizjologicznego u swobodnie zachowujących się marmozet. Marmozety to małe naczelne, które są coraz częściej wykorzystywane w badaniach neurobiologicznych. Zwierzęta te mają wiele praktycznych i logistycznych zalet gryzoni.

Ich skłonność do bliźniaków i wysoka płodność w młodym wieku oznaczają łatwy dostęp do dużych i genetycznie podobnych kohort. Ponadto ich mały rozmiar ciała sprawia, że są łatwe i stosunkowo tanie w pielęgnacji. Jako naczelne, marmozety mają ośrodkowy układ nerwowy, który jest znacznie bardziej podobny do człowieka niż do gryzonia.

Obejmuje to wysoko rozwiniętą korę przedczołową i układ wzrokowy. Przewagą marmozet nad wieloma innymi gatunkami naczelnych jest jednak postęp w ich genetycznej modyfikacji. Dzięki głęboko zsekwencjonowanemu genomowi i sukcesom generującym zwierzęta typu knock-in i knock-out, jasne jest, że marmozeta ma szansę stać się potężnym modelem do badania funkcji mózgu w zdrowiu i chorobie.

Powszechna metoda badania funkcji mózgu polega na wszczepianiu elektrod w anatomicznie określonych miejscach. Pozwala to na chroniczne rejestrowanie aktywności neuronalnej w różnych obszarach docelowych u obudzonych i swobodnie zachowujących się zwierząt. Przed zabiegiem należy określić wewnątrzustną współrzędną zerową dla wszystkich implantów i szablonów.

Aby to zrobić, przymocuj każdą matrycę elektrod, która zostanie wszczepiona, do uchwytu elektrody i ustaw jeden mikroprzewód na zero wewnątrzustne. W tym miejscu spotykają się nauszniki. W razie potrzeby powtórz to dla dodatkowych matryc elektrod i uchwytów.

Ponadto powtórz to z igłą o rozmiarze 24, podobnie przymocowaną do uchwytu sondy stereotaktycznej. W przypadku układów elektrofizjologicznych przewód uziemiający powinien być przylutowany do każdej innej, która będzie używana. Na koniec uporządkuj i wysterylizuj wszystkie narzędzia, sprzęt i przedmioty jednorazowego użytku, przygotowując się do zabiegu chirurgicznego.

W dniu zabiegu upewnij się, że zwierzę nie jadło przez sześć godzin przed rozpoczęciem znieczulenia. Atropina i ketamina będą stosowane do wywołania znieczulenia poprzez sekwencyjne wstrzyknięcia domięśniowe. Następnie ogol głowę zwierzęcia za pomocą maszynki do strzyżenia fryzjera.

Ważne jest, aby zaintubować zwierzę podczas operacji. Nasza preferowana metoda polega na przymocowaniu elastycznej opaski do stołu operacyjnego, którą wkładamy za kły zwierzęcia, gdy znajduje się on w pozycji leżącej. Następnie używamy sondy z bawełnianą końcówką, aby wytrzeć język marmozety i chwycić go jedną ręką.

Dzięki temu technik może otworzyć usta i drogi oddechowe tylko jedną ręką. Po założeniu rurki dotchawiczej należy ją podłączyć do zespołu anestezjologicznego ze sztucznym respiratorem ustawionym na 40 oddechów na minutę. W razie potrzeby zabezpiecz rurkę i zespół taśmą.

Gdy marmozeta znajduje się teraz w pozycji leżącej, przymocuj głowę zwierzęcia do ramy stereotaktycznej. Aby to zrobić, najpierw włóż końcówkę prawego paska słuchowego do prawego kanału słuchowego zwierzęcia. Następnie lewy pasek uszny do lewego przewodu słuchowego.

Następnie głowę należy wypoziomować tak, aby płaszczyzna pozioma była równoległa do ramy, podczas gdy płaszczyzna przednia/tylna była wyśrodkowana. Osiąga się to poprzez uprzednie wyśrodkowanie głowy zwierzęcia za pomocą wymiarów paska słuchowego zabezpieczonych w równych odległościach. Następnie ustnik wkłada się do pyska zwierzęcia i reguluje, aż dotknie palety zwierzęcia, podczas gdy pręty oczodołu dotykają tylko dolnego brzegu kości oczodołu.

Ponieważ płaszczyzna pozioma jest definiowana jako płaszczyzna przechodząca przez dolny brzeg kości oczodołu i środek zewnętrznego słuchu środkowego, przed kontynuowaniem należy upewnić się, że dolna powierzchnia kości oczodołu jest teraz poziomo wyrównana ze środkiem prętów nausznych. Podczas zabiegu ważne jest utrzymanie wszystkich parametrów życiowych. Dlatego należy podłączyć przenośny pulsoksymetr do ręki marmozety, aby upewnić się, że tętno i nasycenie tlenem mieszczą się w dopuszczalnych zakresach.

Ponadto sonda temperatury doodbytniczej podłączona do homeotermicznej poduszki grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza i przyklejona do ogona, zapewni, że znieczulenie nie wpłynie negatywnie na temperaturę ciała marmozety. Ostatnim krokiem przedoperacyjnym jest oczyszczenie i zdezynfekowanie ogolonej głowy zwierzęcia chlorheksydyną i jodem, przed pokryciem zwierzęcia wysterylizowanym polem operacyjnym. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy po zastosowaniu miejscowego środka przeciwbólowego w tym miejscu.

Aby przygotować powierzchnię czaszki, najpierw ostrożnie odłącz mięsień skroniowy od czaszki. Odbywa się to poprzez przecięcie dołu w momencie jego wprowadzenia do czaszki za pomocą skalpela. Następnie mięsień skroniowy należy delikatnie oddzielić od czaszki za pomocą okostnej raspatory.

Kontynuując zgrzyt okostny, usuń okostną ze wszystkich odsłoniętych czaszki przez skrobanie. Następnie zaznacz lokalizację kraniotomii, tworząc płytkie otwory w powierzchni kości i wiercąc obwód kraniotomii. W razie potrzeby wywierć sześć do ośmiu otworów na w czaszce i wszczep.

W tym czasie nawiń przewody uziemiające przylutowane do danej wokół sąsiedniej nieprzylutowanej. Usuń kość w środku kraniotomii za pomocą kleszczy McPhersona. Podczas gdy mózg i opona twarda są odkryte, utrzymuj je nawodnione sterylną solą fizjologiczną.

Aby usunąć oponę twardą, igłę o rozmiarze 25 lub 26 należy zgiąć pod kątem około 90 stopni, aby ułatwić nakłucie i uniesienie powierzchni opony twardej z dala od powierzchni mózgu. W tym momencie do wycinania opony twardej używa się mikronożyczek. Przymocuj elektrody do stereotaktycznego mikromanipulatora i ustaw go tak, aby elektroda znajdowała się w pożądanych współrzędnych przednich/tylnych i przyśrodkowych/bocznych.

Teraz opuść końcówkę elektrody, aż dotknie powierzchni mózgu. Powoli włóż tablicę do mózgu, aż osiągnie pożądane współrzędne grzbietowe/brzuszne. Dodaj kroplę srebrnej farby między przewód uziemiający a każdą, aby zapewnić połączenie elektryczne.

Przymocuj elektrodę do czaszki, nakładając akryl dentystyczny na odsłoniętą czaszkę, jedną i układ elektrod. Powtórz tę procedurę implantacji z dowolnymi dodatkowymi matrycami. Na koniec, używając akrylu dentystycznego, wykonaj solidną nasadkę głowicy wokół bocznego zakresu matryc i całkowicie w przypadku przewodów uziemiających i odsłoniętej czaszki lub.

W razie potrzeby można włożyć belkę nośną do nasadki głowicy i uszczelnić ją na miejscu akrylem dentystycznym. Po utworzeniu czapki na głowę zszyj skórę, jeśli odsłonięta jest tkanka mięśniowa lub kostna. W tym czasie należy również nałożyć roztwór antyseptyczny na ranę.

Po zakończonej operacji nadszedł czas, aby rozpocząć rekonwalescencję. Najpierw wyłącz dopływ izofluranu, ale nie tlenu, i usuń zwierzę z ramy stereotaktycznej. Umieść zwierzę na stronie grzewczej, z tlenem utrzymywanym przez rurkę dotchawiczą.

Kiedy pojawią się pierwsze oznaki odruchów neurogennych, takich jak skurcze krtani, usuń rurkę dotchawiczą. Tlen powinien być teraz dostarczany z maską, dopóki zwierzę nie wykaże wyraźnych oznak powrotu do zdrowia po znieczuleniu, takich jak odruchy ochronne, ton posturalny i próby poruszania się. Marmozeta powinna być trzymana indywidualnie i pozostawiona do wyzdrowienia w czystej klatce i pomieszczeniu na 24 do 48 godzin, zanim wróci do klatki domowej.

Wszczepione zwierzęta powinny być trzymane w oddzielnych klatkach. Ważne jest, aby obserwować zwierzę przez co najmniej godzinę po operacji, aby zwrócić uwagę na oznaki niepokoju, a w szczególności na nieskoordynowane ruchy. Antybiotyki, leki przeciwbólowe i przeciwzapalne należy podawać w ciągu kilku dni po zabiegu, aby opanować ból i zapobiec infekcji.

W przypadku udanych operacji zwierzę powinno całkowicie wyzdrowieć w ciągu trzech do pięciu dni. Zalecamy, aby sesje rejestracji elektrofizjologicznej rozpoczęły się co najmniej tydzień po zabiegu. Na początku każdej sesji nagraniowej należy lekko znieczulić zwierzę za pomocą izofluranu i podłączyć złącze matrycy elektrod do neuronowego systemu rejestracji.

Umieść zwierzę w komorze doświadczalnej i poczekaj na pełne odzyskanie znieczulenia przed rozpoczęciem nagrań. Po udanej operacji możliwe jest rejestrowanie skoków i lokalnych potencjałów pola z wszczepionych elektrod przez kilka tygodni. Ostatecznie, ostateczne potwierdzenie, że matryce elektrod zostały pomyślnie wszczepione w docelowe struktury, powinno zostać przeprowadzone pośmiertnie.

Odcinki barwione Nisslem zawierające ścieżki elektryczne mogą być używane do określenia położenia każdego wszczepionego mikroprzewodu. Przewlekłe zapisy elektrofizjologiczne u obudzonych zwierząt zachowujących się w stanie czuwania są potężnymi technikami stosowanymi w wielu dziedzinach badań neurobiologicznych. Ponieważ marmozeta pospolita ma wiele zalet w porównaniu z historycznie popularnymi modelami, celem tego filmu jest pomoc innym neurobiologom w przyjęciu marmozety pospolitej do swoich badań.

Oprócz wszczepienia przewlekłych elektrod rejestrujących, jak opisano w tym filmie, ten sam protokół chirurgii stereotaktycznej można dostosować do wielu innych celów eksperymentalnych, w tym implantacji elektrod stymulujących, kaniul prowadzących i mikroiniekcji. Dostosowując ten protokół do jednej z wyżej wymienionych technik, chirurg zasadniczo zmodyfikuje procedurę wiercenia, aby dostosować ją do rozmiaru pożądanego implantu. Ponadto procedura naziemna nie jest konieczna w przypadku wielu z tych technik i dlatego można ją pominąć.

Niezależnie od celu eksperymentu, po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak skutecznie przeprowadzić neurochirurgię stereotaktyczną u marmozety zwyczajnej.