Określenie relacji między sobą i między (nie)zgodnością w moreli za pomocą zapylania ręcznego, mikroskopii i analiz genetycznych
16 czerwca 2020
Przedstawiamy metodologię ustalania wymagań dotyczących zapylania odmian moreli (Prunus armeniaca L.), łącząc określenie samo(nie)zgodności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z identyfikacją genotypu S za pomocą analizy PCR.
Ta metoda może pomóc w określeniu wymagań dotyczących zapylania u różnych gatunków i ustaleniu relacji niezgodności między odmianami. Główną zaletą tego podejścia jest to, że pozwala ocenić kilka niezgodności w warunkach laboratoryjnych. Unikanie licznych problemów, które mogą wystąpić w eksperymentach przeprowadzanych w warunkach polowych.
Pozwala to na identyfikację wraz z przyporządkowaniem pewnej liczby odmian do odpowiednich grup niezgodności. Określenie zależności między odmianami. Takie podejście może być również przydatne do określenia relacji samoniezgodności i niezgodności w innych uprawach drzew owocowych, takich jak wiśnia lub śliwka.
Zacznij od pobrania próbek kwiatów na polu. Kwiaty zbiera się na etapie balonu, który odpowiada etapowi 58 w skali BBCH dla moreli, aby uniknąć wcześniejszego zapylenia. W laboratorium usuń pylniki kwiatów i umieść je na kartce papieru do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
Po 24 godzinach przesiej ziarna pyłku drobnymi oczkami o średnicy 26 milimetrów. Wykastruj grupę 30 kwiatów na tym samym etapie rozwoju balonu dla każdego samozapylenia i zapylenia krzyżowego, a 24 godziny po wykastrowaniu umieść pistolety na piance florystycznej w wodzie i zapyl pistolety za pomocą pędzla pyłkiem z kwiatów tej samej odmiany. Zapylić kolejny zestaw pistoletów każdej odmiany pyłkiem z kwiatów kompatybilnego zapylacza jako kontrolę.
Po 72 godzinach wyjmij pistolety z mokrej pianki florystycznej i zamocuj pistolety w roztworze utrwalającym etanol 3:1 z kwasem octowym na co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć utrwalacz i dodaj 75% etanolu, upewniając się, że próbki są całkowicie zanurzone w roztworze. Próbki można przechowywać w etanolu w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia.
Ziarna pyłku tych samych odmian, które są używane do kontroli zapylania, rozsypać w zestalonej pożywce do kiełkowania pyłku i obserwować je pod mikroskopem po 24 godzinach. Przygotuj pistolety do mikroskopii, myjąc je 3 razy wodą destylowaną przez godzinę na pranie. Po ostatnim praniu pozostaw je w 5% siarczynu sodu w temperaturze 4 stopni Celsjusza na 24 godziny.
Następnie sterylizuj je w autoklawie na poziomie jednego kilograma na centymetr kwadratowy przez 10 minut w siarczynach sodu, aby zmiękczyć tkankę. Umieść autoklawowane pistolety na szklanym szkiełku i użyj skalpela, aby usunąć trichomy wokół jajnika. Następnie zgnieć pistolet szkłem nakrywkowym.
Nałóż kroplę błękitu anilinowego na preparaty, aby zabarwić zrogowaciałe osady podczas wzrostu łagiewki pyłkowej i obserwuj łagiewki pyłkowe wzdłuż stylu pod mikroskopem zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Użyj komercyjnego zestawu do ekstrakcji genomowego DNA z młodych liści zebranych wiosną. Następnie skonfiguruj PCR, łącząc odczynniki zgodnie ze wskazówkami rękopisu.
Wirowanie mieszaniny reakcyjnej i rozprowadzanie jej między studzienkami na płytce PCR. Dodaj 1 mikrolitr rozcieńczenia DNA do każdej studzienki i przeprowadź PCR przy użyciu programu termocyklicznego opisanego w manuskrypcie. Po zakończeniu reakcji przeanalizuj wyniki za pomocą elektroforezy kapilarnej lub elektroforezy w żelu agarozowym.
W przypadku elektroforezy kapilarnej dodaj 1 mikrolitr produktu PCR do dołka płytki czytnika wraz z 1 kroplą oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu wody. Następnie przygotuj płytkę separacyjną, dodając bufor separacyjny. Użyj komercyjnego oprogramowania do analizatora genów, aby utworzyć nową płytkę próbki i zapisać nazwy próbek dla wszystkich studzienek na płytce.
Następnie wybierz metodę analizy i włóż dwie płytki do analizatora genów. Napełnij układ kapilarny wodą destylowaną. Załaduj liniowy żel poliakryloamidowy i kliknij przycisk uruchom.
W przypadku analizy wyników PCR za pomocą elektroforezy żelowej, należy przygotować 1% żel agarozowy, rozpuszczając agarozę w buforze do elektroforezy zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Następnie dodaj 4 mikrolitry barwnika kwasu nukleinowego do żelu i delikatnie wymieszaj. Ustaw tackę na żel z grzebieniem i spowalniając, wlej żel na środek, uważając, aby nie powstały bąbelki.
Pozostaw żel w temperaturze pokojowej do całkowitego zestalenia, około 30-45 minut. Następnie włóż do komory elektroforezy. Wyjmij grzebień i przykryj go 1x buforem TAE.
Załaduj żel drabinką DNA, a następnie produktami PCR zmieszanymi z barwnikiem ładującym. Następnie uruchom żel pod napięciem 90 woltów przez 60-90 minut, aż niebieska linia barwnika znajdzie się na około 75% pasa żelu. Po zakończeniu biegu zwizualizuj żel za pomocą transiluminatora.
Wzrost łagiewki pyłkowej w samozapyleniu i zapyleniu krzyżowym obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu określenia samo(nie)zgodności dla każdej odmiany. Odmiany uznano za samoniezgodne, gdy wzrost łagiewki pyłkowej został zatrzymany, i za samozgodne, gdy co najmniej jedna łagiewka pyłkowa dotarła do podstawy stylu. Do identyfikacji alleli S za pomocą PCR w połączeniu z elektroforezą kapilarną lub żelową wykorzystano 5 kombinacji par starterów.
Po pierwsze, allele S zidentyfikowano przez amplifikację pierwszego intronu S-RNazy przy użyciu pary starterów SRc. Następnie drugi intron RNazy został amplifikowany trzema zestawami starterów w celu rozróżnienia alleli S6, S9, S1 i S7. Zmienne regiony V2 i HVB genu SFB amplifikowano zestawem starterów AprFBC8 w celu identyfikacji alleli Sc i S8.
Po zidentyfikowaniu alleli S można ustalić różne grupy niezgodności z genotypami, które są wzajemnie niezgodne. Ważne jest, aby pamiętać o stosowaniu kontroli w elektroforezie kapilarnej, ponieważ używają one automatycznego systemu analizy fragmentów, który może zgłaszać więcej różnic w wielkości fragmentów, powodując niedokładną identyfikację alleli. Połączenie obserwacji mikroskopowych i analizy genetycznej zaowocowało bardzo użytecznym podejściem do określenia samoniezgodności moreli i ustalenia relacji niezgodności między odmianami.
Niekompatybilność z samym sobą jest teraz łącznikiem z mieszkańcami w moreli. Wydaje się, że w grę wchodzi określenie czynników. Przyszłe wysiłki muszą być skoncentrowane na genetycznym wzmocnieniu tej odmiany moreli.
Połączenie tego dokumentalnego podejścia skutkuje cennymi informacjami dla odpowiedniego doboru odmian w sadach komercyjnych i genotypów wzorcowych w programach hodowli moreli. Podobne podejście można zastosować w innych wieloletnich uprawach drzewiastych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W tym artykule przedstawiono metodologię określania wymagań zapylania odmian moreli poprzez ocenę samo-(nie)kompatybilności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz identyfikację S-genotypów za pomocą analizy PCR. To podejście można również zastosować do innych drzew owocowych, co poprawia nasze zrozumienie relacji niekompatybilności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Biologia zapylania
- Genetyka
Wprowadzenie
- Zrozumienie wymagań zapylania ma zasadnicze znaczenie dla produkcji owoców.
- Samo-niekompatybilność wpływa na zawiązywanie owoców i plony.
- Tradycyjne eksperymenty polowe mogą być problematyczne ze względu na zmienne środowiskowe.
- Metody laboratoryjne mogą zapewnić bardziej kontrolowane warunki analizy.
Cel badania
- Ustalenie wymagań zapylania dla odmian moreli.
- Identyfikacja samo-niekompatybilności i relacji niekompatybilności.
- Zapewnienie wiarygodnej metody oceny odmian w warunkach laboratoryjnych.
Wykorzystane metody
- Mikroskopia fluorescencyjna do oceny samo-(nie)kompatybilności.
- Analiza PCR do identyfikacji S-genotypów.
- Kontrolowane eksperymenty laboratoryjne w celu oceny niekompatybilności.
- Analiza porównawcza między różnymi odmianami.
Główne wyniki
- Identyfikacja kilku grup niekompatybilności wśród odmian moreli.
- Ustalenie relacji wzajemnej kompatybilności.
- Wykażanie zastosowalności metody do innych drzew owocowych.
- Poprawa zrozumienia mechanizmów samo-niekompatybilności.
Wnioski
- Metodologia stanowi solidną podstawę do badania zapylania moreli.
- Można ją dostosować do użytku w innych gatunkach drzew owocowych.
- Wyniki mogą informować o programach hodowlanych i praktykach uprawnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Determining self- and inter-incompatibility relationships in apricot cultivars provides critical data for optimizing pollination strategies in commercial orchards and breeding programs. This laboratory-based approach reduces reliance on field trials, enabling predictive assessment of cultivar compatibility under controlled conditions. The methodology supports risk-adjusted decisions in cultivar selection and parent line identification for fruit tree improvement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gametophytic self-incompatibility mechanisms through direct observation of pollen tube arrest or growth.
- Operational Value: Standardizes compatibility assessment via microscopy and PCR, reducing variability from environmental factors.
- Predictive Value: Supports identification of S-alleles to predict crossability and inform parental selection in breeding pipelines.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Combines fluorescence microscopy and genetic analysis to create a reproducible workflow for incompatibility screening.
- Scalability: Allows evaluation of multiple cultivars using standardized hand-pollination and electrophoresis protocols.
- Platform Reuse: Methodology can be adapted to other Rosaceae species such as cherry and plum for broader application.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular S-genotype data to phenotypic pollen tube behavior for validation of incompatibility relationships.
- Breeding Support: Establishes incompatibility groups to guide pollinizer selection in orchard design and cross planning.
- Risk Mitigation: Reduces failure in hybridization efforts by pre-screening for genetic compatibility before field planting.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates phenotypic observation and genotypic analysis to support early-stage discovery in fruit tree breeding, from hypothesis testing to lead selection.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis of self-(in)compatibility by correlating pollen tube fluorescence with S-genotype profiles.
- Analytics: Uses capillary or gel electrophoresis to quantify S-allele fragments, enabling objective genotyping.
- Translational Research: Connects genetic markers to functional outcomes in pollen tube growth, supporting biomarker-like validation.
- Enterprise Reuse: Standardized protocol allows cross-cultivar and cross-species application in germplasm evaluation pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into GSI by linking S-RNase and SFB gene variants to pollen tube inhibition.
- Operational Value: Enables high-throughput compatibility testing independent of seasonal field constraints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in breeding by identifying compatible pairs early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement of cultivars with confirmed pollination reliability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, pollen handling, and molecular genotyping techniques.
- Dependent on access to thermocyclers, electrophoresis systems, and fluorescent microscopes with appropriate filter sets.
- Necessitates standardized sample preparation for pistols and pollen to ensure consistent staining and visualization.
- Must account for allele-specific primer efficiency when designing PCR panels for S-genotype identification.
- Limited to species with characterized S-locus primers; adaptation to new crops requires primer validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Self- and Cross-Pollination in the Laboratory
2:14
Evaluating Pollen Viability through In Vitro Pollen Germination
2:30
Evaluating Self(in)compatibility by the Observation of Pollen Tube Growth
3:22
S-allele Identification
5:40
Results: Determination of Self-(in)compatibility and Identification of S-genotype in Apricot Cultivars
6:58
Conclusion
