Name: Określenie relacji między sobą i między (nie)zgodnością w moreli za pomocą zapylania ręcznego, mikroskopii i analiz genetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę oceny samo- i wzajemnej niezgodności u moreli za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizy PCR genotypów S. To podejście pozwala identyfikować grupy niezgodności i relacje między odmianami w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego, Unię Europejską (AGL2016-77267-R, oraz AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón – Europejski Fundusz Społeczny, Unia Europejska (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad i Agroseguro S.A.

1. Określenie samo(nie)zgodności
<ol>
	<li>Spróbuj kwiatów na polu. Konieczne jest zbieranie kwiatów na etapie balonu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), odpowiadający etapowi 58 w skali BBCH dla moreli28, aby uniknąć niepożądanego wcześniejszego zapylenia.</li>
	<li>Samozapylenie i zapylenie krzyżowe w laboratorium
	<ol>
		<li>Usuń pylniki kwiatów na etapie balonu i umieść je na kartce papieru do wyschnięcia w temperaturze laboratoryjnej.</li>
		<li>Po 24 godzinach przesiej ziarna pyłku za pomocą drobnej siatki (0,26 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Wykastruj grupę 30 kwiatów na tym samym etapie balonu dla każdego samozapylenia i zapylenia krzyżowego, a następnie umieść słupki na piance florystycznej w wodzie o temperaturze laboratoryjnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Słupki należy zapylać ręcznie za pomocą pędzla pyłkiem z kwiatów tej samej odmiany 24 godziny po kastracji. Dodatkowo, zapyl inny zestaw słupków każdej odmiany pyłkiem z kwiatów kompatybilnego zapylacza jako kontrolę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
		<li>Po upływie 72 godzin utrwalić słupki w roztworze utrwalającym etanolu/kwasu octowego (3:1) przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C29. Następnie wyrzuć utrwalacz i dodaj 75% etanolu, upewniając się, że próbki są całkowicie zanurzone w roztworze. Próbki można przechowywać w tym roztworze w temperaturze 4 °C do momentu use8,17,30,31,32.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena żywotności pyłku poprzez kiełkowanie pyłku in vitro
	<ol>
		<li>Aby przygotować pożywkę do kiełkowania, należy ważyć 25 g sacharozy, 0,075 g kwasu borowego (H3,BO3) i 0,075 g azotanu wapnia (Ca(NO3)2)<sup class="xref">33.</li>
		<li>Dodać składniki pożywki do 250 ml wody destylowanej i całkowicie rozpuścić.</li>
		<li>Zestalić podłoże, dodając 2 g agarozy i mieszając.</li>
		<li>Sprawdź pH pożywki za pomocą pH-metru i dostosuj wartość do 7,0 za pomocą roztworu NaOH lub HCl.</li>
		<li>Mieszaninę należy sterylizować w autoklawie, aby wysterylizować pożywkę.</li>
		<li>Po autoklawowaniu ostudzić pożywkę i rozprowadzić ją na szalkach Petriego w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Rozsyp ziarna pyłku tych samych odmian, które są używane do kontrolowanych zapyleń, w pożywce do kiełkowania zestalonego pyłku i obserwuj je pod mikroskopem po 24 h6. 
		UWAGA: Aby wysterylizować okap z przepływem laminarnym, oczyść powierzchnię 70% etanolem i włącz lampę UV na 10 minut.</li>
		<li>Przechowywać szalki Petriego w lodówce w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacje mikroskopowe
	<ol>
		<li>Słupki umyć trzykrotnie przez 1 godzinę wodą destylowaną i pozostawić w 5% siarczynach sodu w temperaturze 4 °C. Po 24 godzinach sterylizuj je w autoklawie w ilości 1 kg/cm2 przez 10 minut w siarczynach sodu, aby zmiękczyć tkanki34.</li>
		<li>Umieść autoklawowane słupki na szklanym szkiełku i za pomocą skalpela usuń trichomy wokół jajnika, aby uzyskać lepszą wizualizację łagiewek pyłkowych. Następnie zmiażdż słupki szkłem nakrywkowym.</li>
		<li>Przygotować barwienie błękitem anilinowym o stężeniu 0,1% (v/v): zmieszać 0,1 ml błękitu anilinowego w 100 ml 0,1 N fosforanu potasu trójzasadowego (K3PO4). Nałóż kroplę błękitu anilinowego na preparaty, aby zabarwić osady kalozy podczas wzrostu łagiewki pyłkowej.</li>
		<li>Obserwuj łagiewki pyłkowe wzdłuż fryzury za pomocą mikroskopu z epifluorescencją UV przy użyciu filtrów pasmowych 340-380 i 425 filtrów długoprzepustowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Pobranie próbki 2-3 liści na polu wiosną. Zaleca się pobieranie próbek liści w młodym stadium, ponieważ uzyskane DNA jest wyższej jakości i ma niższy poziom związków fenolowych w porównaniu ze starymi liśćmi.</li>
	<li>Wyodrębnij genomowe DNA, postępując zgodnie z krokami opisanymi w dostępnym na rynku zestawie (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Analizuj ilość i jakość stężeń DNA za pomocą spektrofotometru UV-vis (260 nm).</li>
</ol>
3. Identyfikacja allelu S
<ol>
	<li>Ustawianie reakcji PCR
	<ol>
		<li>Przygotować rozcieńczenie 50 ng/μl w wodzie destylowanej każdej próbki do ekstrakcji DNA.</li>
		<li>Powoli rozmrażaj odczynniki PCR i trzymaj je na lodzie. Pozostaw polimerazę DNA w zamrażarce, aż będzie potrzebna.</li>
		<li>Przygotuj reakcje amplifikacji, używając różnych kombinacji starterów. Utwórz mieszaninę reakcyjną PCR, łącząc składniki z tabeli 1. Dobrze wymieszaj reakcję PCR i rozprowadź objętość wskazaną dla różnych kombinacji starterów do każdego dołka płytki PCR. Następnie dodać 1 μl rozcieńczonego DNA do każdej studzienki.</li>
		<li>Umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom odpowiedni program PCR pokazany w Tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj wzmocnione fragmenty. Istnieją głównie dwa różne sposoby analizy amplifikowanych fragmentów PCR: elektroforeza kapilarna (CE) ze starterami znakowanymi fluorescencyjnie lub jako wizualizacja amplikonów elektroforezy w żelu agarozowym z nieznakowanymi starterami.
	<ol>
		<li>Elektroforeza kapilarna
		<ol>
			<li>Aby przygotować bufor ładujący, należy zmieszać 35 μl dejonizowanego formamidu z 0,45 μl oznakowanego wzorca wielkości. Odczynnik należy wymieszać w wirze, aby dobrze wymieszać, a następnie dozować 35,5 μl do dołka płytki czytnika.</li>
			<li>Dodać 1 μl produktu PCR do dołka. Dodatkowo dodaj kroplę oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu wody.</li>
			<li>Przygotować płytkę separacyjną, dodając bufor separacyjny.</li>
			<li>Należy korzystać z komercyjnego oprogramowania dołączonego do analizatora genów (patrz tabela materiałów). Utwórz nową płytkę próbki i zapisz nazwy próbek dla wszystkich studzienek na płycie.</li>
			<li>Wybierz metodę analizy. W takim przypadku próbki należy poddać denaturacji w temperaturze 90 °C przez 120 s, wstrzykiwać pod napięciem 2,0 kV przez 30 s i rozdzielać przy napięciu 6,0 kV przez 35 minut.</li>
			<li>Włóż dwie płytki do analizatora genów. Napełnij układ kapilarny wodą destylowaną.</li>
			<li>Załaduj opatentowany liniowy żel poliakryloamidowy (LPA). Na koniec kliknij Uruchom.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Elektroforeza żelowa
		<ol>
			<li>Przygotuj 1% żel agarozowy, dodając 1,5 g agarozy klasy biologii molekularnej w 150 ml 1x buforu do elektroforezy TAE (Tris-acetate-EDTA) (40 mM Tris, 20 mM kwasu octowego i 1 mM EDTA przy pH 8,0). Rozpuść agarozę w ogrzewaniu mikrofalowym przez 2-3 minuty.</li>
			<li>Aby uwidocznić DNA, dodaj 4 μl barwnika kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów) i delikatnie wymieszaj.</li>
			<li>Dodaj grzebień żelowy z wystarczającą ilością dołków na drabinki, kontrole i próbki do tacki na żel. Następnie powoli wlej mieszankę na środek tacki na żel i unikaj bąbelków.</li>
			<li>Pozostaw żel do ostygnięcia przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej, aż żel całkowicie stwardnieje. Wprowadzić żel do komory elektroforetycznej, wyjąć grzebień żelowy i napełnić komorę wystarczającą ilością bufora TAE 1x, aby pokryć żel. 
			UWAGA: Sprawdź rozmieszczenie żelu. Studzienki należy umieścić blisko bieguna ujemnego, ponieważ ujemnie naładowane DNA migruje w kierunku katody.</li>
			<li>Dodać 5 μl buforu ładującego (0,1% (v/v) błękitu bromofenolowego) do produktów PCR i dobrze wymieszać.</li>
			<li>Aby oszacować rozmiar prążków, należy załadować 5 μl drabinki masy cząsteczkowej DNA (patrz Tabela materiałów).</li>
			<li>Załaduj próbki do dodatkowych dołków żelu.</li>
			<li>Po załadowaniu wszystkich próbek i drabinki masy cząsteczkowej DNA, uruchom żel pod napięciem 90 V przez 1-1,5 godziny, aż niebieska linia barwnika znajdzie się w przybliżeniu na 75% długości żelu.</li>
			<li>Wizualizuj pasma w transiluminatorze dla kwasów nukleinowych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tradycyjnie, większość komercyjnych europejskich odmian moreli była samokompatybilna36. Niemniej jednak, wykorzystanie samoniezgodnych odmian północnoamerykańskich jako rodziców w programach hodowlanych w ostatnich dziesięcioleciach spowodowało wypuszczenie na rynek coraz większej liczby nowych odmian samoniezgodnych o nieznanych wymaganiach dotyczących zapylania 7,8,37. W związku z tym coraz ważniejsze s...

Samoniezgodność to strategia roślin kwitnących mająca na celu zapobieganie samozapyleniu i promowanie krzyżowania się1. U Rosaceae mechanizm ten jest determinowany przez Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI), który jest głównie kontrolowany przez locus multialleliczny S2. W stylu gen RNazy koduje determinantę S-stylar, RNase3, podczas gdy białko F-box, które określa determinant S-pyłku, jest skodyfikowane przez gen SFB4. Interakcja samoniezgodności odbywa się poprzez hamowanie wzrostu łagiewki pyłkowej wzdłuż stylu, zapobiegając zapłodnieniu owlężki5,6.
W przypadku moreli, w ciągu ostatnich dwóch dekad na całym świecie miała miejsce odnowa odmianowa7,8. Wprowadzenie znacznej liczby nowych odmian, pochodzących z różnych publicznych i prywatnych programów hodowlanych, spowodowało wzrost liczby odmian moreli o nieznanych wymaganiach dotyczących zapylania8.
Różne metodologie zostały użyte do określenia wymagań dotyczących zapylania moreli. W terenie samo(nie)kompatybilność można ustalić poprzez kontrolowane zapylanie drzew w klatkach lub w wykastrowanych kwiatach, a następnie rejestrowanie procentu owoców set9,10,11,12. Ponadto w laboratorium przeprowadzono kontrolowane zapylenia poprzez pół-in vivo hodowlę kwiatów i analizę zachowania łagiewki pyłkowej pod mikroskopią fluorescencyjną8,13,14,15,16,17. Ostatnio techniki molekularne, takie jak analiza PCR i sekwencjonowanie, pozwoliły na scharakteryzowanie relacji niezgodności w oparciu o badanie genów RNazy i SFB18,19. U moreli zgłoszono trzydzieści trzy allele S (S1 do S20, S22 do S30, S52, S53, Sv, Sx), w tym jeden allel związany z samozgodnością (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Do tej pory ustalono 26 grup niezgodności u tego gatunku zgodnie z genotypem S8,9,17,25,26,27. Odmiany z tymi samymi allelami S są wzajemnie niezgodne, podczas gdy odmiany z co najmniej jednym różnym allelem S, a w konsekwencji przyporządkowane do różnych niekompatybilnych grup, są wzajemnie zgodne.
Aby określić wymagania dotyczące zapylania odmian moreli, opisujemy metodologię, która łączy określanie samo(nie)zgodności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z identyfikacją genotypu S za pomocą analizy PCR w odmianach moreli. Takie podejście pozwala na ustalenie grup niezgodności i wyjaśnienie zależności niezgodności między odmianami.

<table><tbody><tr><td>Agaroza D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8010.22</td><td></td></tr><tr><td>BIOTAQ Zestaw polimerazy DNA</td><td>Bioline</td><td>BIO-21060</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop jasnego pola</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>CEQ Oprogramowanie systemowe</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Zestaw QIAGEN</td><td>69106</td><td></td></tr><tr><td>dNTP, 4 x 25 i mikro; mol</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw wzorcowy rozmiaru DNA GenomeLab - 400</td><td>Beckman Coulter</td><td>608098</td><td></td></tr><tr><td>System analizy genetycznej GenomeLab GeXP Bufor</td> separacyjny <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenomeLab</td><td>Beckman Coulter</td><td>608012</td><td></td></tr><tr><td>Żel separacyjny GenomeLab LPA-1</td><td>Beckman Coulter</td><td>391438</td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 100bp</td><td>Bioline</td><td>BIO-33029</td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1kb</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>System analizy obrazu</td> Obrazowanie molekularne <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System VersaDoc MP 4000&nbsp;</td>Spektrofotometr <td>Bio-Rad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr BASIC 20</td><td>Crison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; Zestaw do PCR o wysokiej wierności</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F553S</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack P 25 T</td><td>Biometra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Forward</td><td>Isogen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Reverse</td><td>Isogen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ilość 1 oprogramowanie</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ-16</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell GT</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraza</td><td>QIAGEN</td><td>201203</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy autoklaw</td><td>stojący JP Selecta</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

określenie relacji między sobą i między (nie)zgodnością w moreli za pomocą zapylania ręcznego, mikroskopii i analiz genetycznych

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

Samoniezgodność u Rosaceae jest determinowana przez Gametofityczny System Samoniezgodności (GSI), który jest głównie kontrolowany przez multialleliczny locus S. U moreli określenie relacji między sobą i między (nie)kompatybilnościami jest coraz ważniejsze, ponieważ wypuszczenie dużej liczby nowych odmian spowodowało wzrost liczby odmian o nieznanych wymaganiach dotyczących zapylania. W tym miejscu opisujemy metodologię, która łączy określenie samo(nie)zgodności za pomocą ręcznego zapylania i mikroskopii z identyfikacją genotypu S za pomocą analizy PCR. W celu określenia samo(nie)zgodności, kwiaty każdej odmiany w fazie balonu zebrano na polu, ręcznie zapylono w laboratorium, utrwalono i zabarwiono błękitem anilinowym w celu obserwacji zachowania łagiewki pyłkowej pod mikroskopią fluorescencyjną. W celu ustalenia relacji niezgodności między odmianami, DNA z każdej odmiany wyekstrahowano z młodych liści, a allele S zidentyfikowano metodą PCR. Takie podejście pozwala na ustalenie grup niezgodności i wyjaśnienie zależności niezgodności między odmianami, co dostarcza cennych informacji do wyboru odpowiednich zapylaczy przy projektowaniu nowych sadów oraz doboru odpowiednich rodziców w programach hodowlanych.

Badania zapylania moreli wymagają użycia kwiatów w stadium późnego kulistego jeden dzień przed anabiozą (Rycina 1A). To stadium uważa się za najkorzystniejsze zarówno do pozyskiwania pyłku, jak i słupków, ponieważ struktury kwiatowe są już prawie dojrzałe, ale jeszcze nie doszło do dehisencji pręcików. Zapobiega to interferencji niepożądanych pyłków, nie tylko z tego samego kwiatu, ale także z innych kwiatów, ponieważ zamknięte płatki korony uniemożliwiają przybycie owadów p...

Przedstawiamy metodologię ustalania wymagań dotyczących zapylania odmian moreli (Prunus armeniaca L.), łącząc określenie samo(nie)zgodności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z identyfikacją genotypu S za pomocą analizy PCR.

Określenie relacji między sobą i między (nie)zgodnością w moreli za pomocą zapylania ręcznego, mikroskopii i analiz genetycznych

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Ta metoda może pomóc w określeniu wymagań dotyczących zapylania u różnych gatunków i ustaleniu relacji niezgodności między odmianami. Główną zaletą tego podejścia jest to, że pozwala ocenić kilka niezgodności w warunkach laboratoryjnych. Unikanie licznych problemów, które mogą wystąpić w eksperymentach przeprowadzanych w warunkach polowych.Pozwala to na identyfikację wraz z przyporządkowaniem pewnej liczby odmian do odpowiednich grup niezgodności. Określenie zależności między odmianami. Takie podejście może być również przydatne do określenia relacji samoniezgodności i niezgodności w innych uprawach drzew owocowych, takich jak wiśnia lub śliwka.Zacznij od pobrania próbek kwiatów na polu. Kwiaty zbiera się na etapie balonu, który odpowiada etapowi 58 w skali BBCH dla moreli, aby uniknąć wcześniejszego zapylenia. W laboratorium usuń pylniki kwiatów i umieść je na kartce papieru do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.Po 24 godzinach przesiej ziarna pyłku drobnymi oczkami o średnicy 26 milimetrów. Wykastruj grupę 30 kwiatów na tym samym etapie rozwoju balonu dla każdego samozapylenia i zapylenia krzyżowego, a 24 godziny po wykastrowaniu umieść pistolety na piance florystycznej w wodzie i zapyl pistolety za pomocą pędzla pyłkiem z kwiatów tej samej odmiany. Zapylić kolejny zestaw pistoletów każdej odmiany pyłkiem z kwiatów kompatybilnego zapylacza jako kontrolę.Po 72 godzinach wyjmij pistolety z mokrej pianki florystycznej i zamocuj pistolety w roztworze utrwalającym etanol 3:1 z kwasem octowym na co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć utrwalacz i dodaj 75% etanolu, upewniając się, że próbki są całkowicie zanurzone w roztworze. Próbki można przechowywać w etanolu w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia.Ziarna pyłku tych samych odmian, które są używane do kontroli zapylania, rozsypać w zestalonej pożywce do kiełkowania pyłku i obserwować je pod mikroskopem po 24 godzinach. Przygotuj pistolety do mikroskopii, myjąc je 3 razy wodą destylowaną przez godzinę na pranie. Po ostatnim praniu pozostaw je w 5% siarczynu sodu w temperaturze 4 stopni Celsjusza na 24 godziny.Następnie sterylizuj je w autoklawie na poziomie jednego kilograma na centymetr kwadratowy przez 10 minut w siarczynach sodu, aby zmiękczyć tkankę. Umieść autoklawowane pistolety na szklanym szkiełku i użyj skalpela, aby usunąć trichomy wokół jajnika. Następnie zgnieć pistolet szkłem nakrywkowym.Nałóż kroplę błękitu anilinowego na preparaty, aby zabarwić zrogowaciałe osady podczas wzrostu łagiewki pyłkowej i obserwuj łagiewki pyłkowe wzdłuż stylu pod mikroskopem zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Użyj komercyjnego zestawu do ekstrakcji genomowego DNA z młodych liści zebranych wiosną. Następnie skonfiguruj PCR, łącząc odczynniki zgodnie ze wskazówkami rękopisu.Wirowanie mieszaniny reakcyjnej i rozprowadzanie jej między studzienkami na płytce PCR. Dodaj 1 mikrolitr rozcieńczenia DNA do każdej studzienki i przeprowadź PCR przy użyciu programu termocyklicznego opisanego w manuskrypcie. Po zakończeniu reakcji przeanalizuj wyniki za pomocą elektroforezy kapilarnej lub elektroforezy w żelu agarozowym.W przypadku elektroforezy kapilarnej dodaj 1 mikrolitr produktu PCR do dołka płytki czytnika wraz z 1 kroplą oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu wody. Następnie przygotuj płytkę separacyjną, dodając bufor separacyjny. Użyj komercyjnego oprogramowania do analizatora genów, aby utworzyć nową płytkę próbki i zapisać nazwy próbek dla wszystkich studzienek na płytce.Następnie wybierz metodę analizy i włóż dwie płytki do analizatora genów. Napełnij układ kapilarny wodą destylowaną. Załaduj liniowy żel poliakryloamidowy i kliknij przycisk uruchom.W przypadku analizy wyników PCR za pomocą elektroforezy żelowej, należy przygotować 1% żel agarozowy, rozpuszczając agarozę w buforze do elektroforezy zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Następnie dodaj 4 mikrolitry barwnika kwasu nukleinowego do żelu i delikatnie wymieszaj. Ustaw tackę na żel z grzebieniem i spowalniając, wlej żel na środek, uważając, aby nie powstały bąbelki.Pozostaw żel w temperaturze pokojowej do całkowitego zestalenia, około 30-45 minut. Następnie włóż do komory elektroforezy. Wyjmij grzebień i przykryj go 1x buforem TAE.Załaduj żel drabinką DNA, a następnie produktami PCR zmieszanymi z barwnikiem ładującym. Następnie uruchom żel pod napięciem 90 woltów przez 60-90 minut, aż niebieska linia barwnika znajdzie się na około 75% pasa żelu. Po zakończeniu biegu zwizualizuj żel za pomocą transiluminatora.Wzrost łagiewki pyłkowej w samozapyleniu i zapyleniu krzyżowym obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu określenia samo(nie)zgodności dla każdej odmiany. Odmiany uznano za samoniezgodne, gdy wzrost łagiewki pyłkowej został zatrzymany, i za samozgodne, gdy co najmniej jedna łagiewka pyłkowa dotarła do podstawy stylu. Do identyfikacji alleli S za pomocą PCR w połączeniu z elektroforezą kapilarną lub żelową wykorzystano 5 kombinacji par starterów.Po pierwsze, allele S zidentyfikowano przez amplifikację pierwszego intronu S-RNazy przy użyciu pary starterów SRc. Następnie drugi intron RNazy został amplifikowany trzema zestawami starterów w celu rozróżnienia alleli S6, S9, S1 i S7. Zmienne regiony V2 i HVB genu SFB amplifikowano zestawem starterów AprFBC8 w celu identyfikacji alleli Sc i S8.Po zidentyfikowaniu alleli S można ustalić różne grupy niezgodności z genotypami, które są wzajemnie niezgodne. Ważne jest, aby pamiętać o stosowaniu kontroli w elektroforezie kapilarnej, ponieważ używają one automatycznego systemu analizy fragmentów, który może zgłaszać więcej różnic w wielkości fragmentów, powodując niedokładną identyfikację alleli. Połączenie obserwacji mikroskopowych i analizy genetycznej zaowocowało bardzo użytecznym podejściem do określenia samoniezgodności moreli i ustalenia relacji niezgodności między odmianami.Niekompatybilność z samym sobą jest teraz łącznikiem z mieszkańcami w moreli. Wydaje się, że w grę wchodzi określenie czynników. Przyszłe wysiłki muszą być skoncentrowane na genetycznym wzmocnieniu tej odmiany moreli.Połączenie tego dokumentalnego podejścia skutkuje cennymi informacjami dla odpowiedniego doboru odmian w sadach komercyjnych i genotypów wzorcowych w programach hodowli moreli. Podobne podejście można zastosować w innych wieloletnich uprawach drzewiastych.

determination-self-inter-compatibility-relationships-apricot

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Pokazujemy metodę określania udanego lub nieudanego zapłodnienia na podstawie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Ocena stanu zapłodnienia poprzez śledzenie morfologii jądra plemnika w podwójnym zapłodnieniu Arabidopsis

Opisano metodologię określania wymagań dotyczących zapylania w mieszańcach japońskich śliwek, która łączy polowe i laboratoryjne zapylenia oraz obserwacje łagiewek pyłkowych pod mikroskopią fluorescencyjną z identyfikacją genotypów S metodą PCR i monitorowaniem kwitnienia w celu wyboru zapylaczy.

Ustalenie wymagań dotyczących zapylania śliwki japońskiej poprzez monitorowanie fenologiczne, zapylanie ręczne, mikroskopię fluorescencyjną i genotypowanie molekularne

Opisujemy metody zbierania pyłku sercowego od pszczół miodnych, a także protokoły sortowania kolorów, acetolizy i preparatu mikroskopowego pyłku do identyfikacji taksonomicznej. Ponadto prezentujemy barwę granulek i różnorodność taksonomiczną pyłku guzowatego zebranego z pięciu systemów upraw z wykorzystaniem pułapek pyłkowych.

Zbieranie i identyfikacja pyłku z kolonii pszczół miodnych

W tej pracy opisana jest solidna metoda ilościowego oznaczania efektywności krycia drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta jest szczególnie przydatna do ilościowego oznaczania barier przedzygotycznych w badaniach specjacji.

Oznaczanie efektywności krycia haploidów u Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół zapewnia szybką metodę określania zgodności i niezgodności pyłków w odmianach cytrusowych.

Określanie relacji samo(nie)zgodności i między (nie)zgodnością w cytrusach za pomocą ręcznego zapylania, mikroskopii i analiz genotypu S

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

Tutaj prezentujemy podstawowy protokół indukcji krycia P. blakesleeanus.

Krzyżówki płciowe z Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Kwantyfikacja obrotu kardiomiocytów jest wyzwaniem. Opisany tutaj protokół w istotny sposób przyczynia się do rozwiązania tego wyzwania, umożliwiając dokładne i czułe określenie ilościowe wytwarzania jąder neokardiomiocytów i ploidalności jąder.

Jednoczesna ocena syntezy i ploidalności DNA kardiomiocytów: metoda wspomagająca ilościowe określanie regeneracji i obrotu kardiomiocytów

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Poznaj metodę oceny samo- i wzajemnej niezgodności u moreli za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizy PCR genotypów S. To podejście pozwala identyfikować grupy niezgodności i relacje między odmianami w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Określenie relacji między sobą i między (nie)zgodnością w moreli za pomocą zapylania ręcznego, mikroskopii i analiz genetycznych (Wideo) | JoVE Journal

Określenie relacji między sobą i między (nie)zgodnością w moreli za pomocą zapylania ręcznego, mikroskopii i analiz genetycznych

Przeglądaj więcej filmów