Kwantyfikacja samoodnowy w mysich kulturach mammosfery

Tak więc hodowle mammosfery zapewniają łatwo dostępny układ motoryczny do badania i analizowania ważnych aspektów prawidłowych zachowań komórek macierzystych piersi w raku, w tym ich zdolności do samoodnawiania się i różnicowania. Nasze podejście ilościowe ma na celu ocenę tempa wzrostu kultur mammosfery w sposób obiektywny, umożliwiający bezpośrednie porównanie różnych typów komórek i warunków. W przypadku pierwszej próby radziłbym ściśle kontrolować czas inkubacji, aby uniknąć nadmiernego trawienia i zapewnić dokładną liczbę komórek przed każdym posiewem.

Procedurę z Charolaise Bull zademonstruje Errico D'Elia, technik z mojego laboratorium. Po zebraniu czterech gruczołów sutkowych w jamie brzusznej i dolnej części klatki piersiowej od 5 do 30, 8 do 10 tygodniowych samic myszy, umieść do 20 gruczołów na 100 milimetrów szalki Petriego w minimalnej objętości DPBS. Zmiel tkanki na mniejsze kawałki i dodaj do nich 10 mililitrów pożywki trawiennej.

Użyj pipety serologicznej o pojemności 25 mililitrów, aby przenieść kawałki tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i uszczelnić probówkę folią parafinową. Następnie inkubuj fragmenty na rotatorze w temperaturze 0,03 X G przez 2 1/2 godziny w temperaturze 37 stopni i 5% dwutlenku węgla z wilgotnością. Pod koniec inkubacji, jeśli wszystkie fragmenty mogą zostać przepuszczone przez końcówkę pipety P1000, należy rozprowadzić zawiesinę tkankową przez odwirowanie i ostrożnie zdekantować supernatant.

Ponownie zawiesić osad w 3 mililitrach PBS i przefiltrować zawartość probówki sekwencyjnie przez jedno sitko o średnicy 100, 170, 140 mikrometrów do nowej stożkowej probówki, myjąc każde sitko 2 mililitrami świeżego DPBS po każdym filtrze. Osadzać komórki przez odwirowanie i dekantować supernatant, ponownie zawieszając komórki w pozostałym DPBS. Wymieszać komórki z równą objętością buforu do lizy chlorku amonu potasu i lizować czerwone krwinki na lodzie przez okres do 5 minut.

Pod koniec inkubacji zatrzymać lizę za pomocą 10 mililitrów DPBS i zebrać komórki przez odwirowanie. Potwierdź obecność białej pożywki i ponownie zawieś ją w 1 do 5 mililitrach pożywki mammosfery w celu zliczenia. Następnie umieść komórki na niepoddanych hodowli tkankowej sześciodołkowych płytkach o bardzo niskiej przyczepności w proporcji 2 x 10 do piątej żywej komórki na mililitr stężenia pożywki mammosfery przez 7 do 10 dni inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Pod koniec hodowli trwającej od 7 do 10 dni należy zebrać pierwotne mammosfery z każdej studzienki płytki do hodowli komórkowej i rozprowadzić mammosfery przez cetrifugację. Po dekantacji supernatantu użyj pipety P200 z końcówką z filtrem, aby odpipetować mammosfery około 100 razy. Generowanie pacjentów z pojedynczymi komórkami ma kluczowe znaczenie dla dokładnej kwantyfikacji komórki mammosfery w celu uzyskania nowej labilności.

Sprawdź wzrokowo zakres segregacji i w razie potrzeby użyj sitka do komórek. Ponownie zawiesić odłączone mammosfery za pomocą 1 do 5 mililitrów świeżej pożywki mammosfery do liczenia i płytki 2 X 10 do czwartej żywotnej komórki na mililitr na pokrytych polihemą sześciodołkowych płytkach o bardzo niskiej przyczepności na 5 do 7 dniowej hodowli. Następnie, po 5 do 7 dniach, policz liczbę kulek w dołku.

Na końcu każdego przejścia użyj kamery cyfrowej zamontowanej na stereoskopie, aby zeskanować całą powierzchnię wszystkich studni, aby zobrazować kule. Po zapisaniu obrazów, jako plików tif, zaimportuj obrazy stereoskopowe jako sekwencję obrazów do ImageJ i ustaw skalę i typ obrazu na 8-bitowy. Zduplikuj stos obrazów i wybierz opcję Odejmij tło z karty Proces.

Zaznacz opcje Jasne tło i Paraboloida przesuwna, a następnie kliknij przycisk OK, aby przetworzyć wszystkie obrazy stosu. Wybierz opcję Dostosuj i próg na karcie Obraz i kliknij przycisk Zastosuj. Pojawi się wyskakujące okienko.

Wybierz opcję Domyślne jako metodę i Światło jako tło. Zaznacz pole Oblicz próg dla każdego obrazu i kliknij przycisk OK.To przetworzyć wszystkie obrazy w stosie, wybierz opcję Zlewnia i kliknij przycisk Tak. Wybierz opcję Otwórz i kliknij przycisk Tak, a następnie wybierz opcję Eroduj i kliknij przycisk Tak.

Następnie wybierz opcję Analizuj cząstki z menu Analizuj i ustaw minimalny próg rozmiaru na 10 000 mikrometrów kwadratowych i okrągłość w zakresie od 0,50 do 1,00. Wybierz opcję Wielokropek z menu rozwijanego Pokaż i zaznacz opcje Sumuj, Wyklucz na krawędziach i Pokaż in situ. Następnie kliknij przycisk OK, aby przetworzyć wszystkie obrazy stosu.

Aby obliczyć skumulowaną krzywą wzrostu dla każdego przejścia, zarejestruj liczbę posianych komórek i liczbę komórek w kulach zliczonych na studzienkę i oblicz rozmiar kuli na końcu każdego przejścia. Wywnioskuj liczbę platerowanych kulek, dzieląc liczbę komórek posianych dla każdego przejścia przez rozmiar kuli obliczony na końcu poprzedniego przejścia. Oblicz skumulowaną liczbę komórek dla każdego dołka na przejście i skumulowaną liczbę kuli dla każdego dołka na przejście i wykreśl punkty danych w skali półlogarytmicznej.

Następnie wykładnicza linia trendu do punktów danych i oblicz współczynnik determinacji, aby zmierzyć dobroć dopasowania. Następnie przedstaw równanie linii trendu jako naturalną funkcję wykładniczą, aby wywnioskować tempo wzrostu kultury. W tym eksperymencie określono liczbę sfer i komórek w pięciu kolejnych przejściach dla trzech niezależnych eksperymentów.

Tutaj w skumulowanej liczbie komórek i sfer pokazane są liczby poszczególnych fragmentów. Jak zaobserwowano, aktywacja Myc prowadzi do zwiększonego tempa wzrostu sfery i komórek. Biologiczne i odpowiednie punkty czasowe można wybrać do pobrania komórek lub do przeprowadzenia analizy ekspresji genów lub innych zasobów funkcjonalnych w celu oceny różnicowania, migracji i inwazji komórek.

Jest to proste i ekonomiczne podejście z wieloma zastosowaniami. Na przykład może być wykorzystany w bezpośrednim odkryciu do pomiaru wpływu na proliferację i samoodnawianie się komórek macierzystych raka.