Name: Kwantyfikacja samoodnowy w mysich kulturach mammosfery (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji samoodnowy w kulturach mammosfery mysich. Technika ta umożliwia obiektywną ocenę tempa wzrostu komórek macierzystych raka piersi w różnych warunkach eksperymentalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bruno Amati za miły prezent w postaci transgenicznego modelu myszy Rosa26-MycER. Prace te zostały sfinansowane z grantów WWCR, AIRC, ERC i włoskiego Ministerstwa Zdrowia dla P.G.P. T.V. i X.A. były wspierane przez FIRC i A.S. przez grant FUV.

Procedury in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą UE 2010/63 i po zatwierdzeniu przez naszą instytucjonalną komisję etyki (Organizm dla Dobrostanu Zwierząt - OPBA) oraz włoskie Ministerstwo Zdrowia (numery IACUC 762/2015 i 537/2017).
1. Pobieranie i trawienie mysiego gruczołu sutkowego
<ol>
	<li>W typowym eksperymencie należy złożyć w ofierze 8-10 tygodniowe dziewicze samice myszy przez wdychanie CO2 . W zależności od celów eksperymentu użyj 5-30 myszy. Umieść myszy na deskach sekcyjnych pod maską. Użyj igieł, aby rozciągnąć kończyny przednie i zmyć sierść zwierzęcia etanolem.</li>
	<li>Podnieś skórę kleszczami i wykonaj pionowe nacięcie, zaczynając od poziomu obszaru miednicy i przesuwając się aż do szyjki macicy, pozostawiając nienaruszoną otrzewną. Aby uniknąć pęknięcia skóry lub otrzewnej, użyj nożyczek o zaokrąglonych krawędziach.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij skórę od ciała delikatnymi ruchami nożyczek po bocznej osi ciała.</li>
	<li>Gdy skóra zostanie całkowicie oderwana od klatki piersiowej i brzucha, wykonaj cztery nacięcia w poprzek czterech kończyn zwierzęcia i przygwoźdź skórę igłami. Użyj nożyczek i kleszczy, aby całkowicie oderwać ciało zwierzęcia od przedłużonej skóry.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie podnieść poduszeczki tłuszczowe sutka, które są teraz całkowicie odsłonięte, i ostrożnie oderwij je od skóry za pomocą nożyczek. Zbierz dolną część klatki piersiowej i jamę brzuszną gruczołów sutkowych każdej myszy i zanurz je w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zbierz do 20 gruczołów na probówkę. Chusteczki higieniczne należy trzymać na lodzie. 
	nuta: W razie potrzeby gruczoły mogą pozostać na lodzie przez noc. Jest to bezpieczny punkt postoju. Poniższe czynności należy wykonywać w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Przygotuj i przefiltruj pożywkę wytrawiającą: zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnioną 2 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 200 U/ml kolagenazy i 100 μg/ml hialuronidazy (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieś do 20 gruczołów na szalkę Petriego o średnicy 100 mm i zmiel tkankę za pomocą skalpela lub zakrzywionych nożyczek. Unikaj przenoszenia dużych ilości DPBS do naczynia.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki wytrawiającej do każdej płytki Petriego i przenieść zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml.</li>
	<li>Uszczelnij rurki parafilmem i umieść je na rotatorze. Ustawić rotator na niską prędkość (0,03 x g) i inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 .</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo zawieszenie przed przejściem do kolejnych kroków. Jeżeli duże kawałki tkanki pozostają niestrawione, należy przedłużyć inkubację w temperaturze 37 °C o kolejne 30 minut. 
	nuta: Alternatywnie, trawienie można przeprowadzić przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , przy użyciu delikatnej mieszanki kolagenazy i enzymu hialuronidazy13.</li>
</ol>
2. Izolacja pierwotnych mysich MEC
<ol>
	<li>Zatrzymaj rotator i wyjmij rurki z inkubatora. Wyreguluj końcówkę P1000 przy otworze pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Jeśli zawieszenie przechodzi przez końcówkę P1000, przejdź do kolejnych kroków. W przeciwnym razie przedłużyć inkubację w temperaturze 37 °C o kolejne 30 minut.</li>
	<li>Wirować przy 100 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad z każdej probówki w 3 ml DPBS. 
	nuta: Niska prędkość wirowania pozwala na usunięcie limfocytów i komórek tkanki tłuszczowej. Wymagana jest delikatna manipulacja, aby uniknąć przemieszczenia się granulki na tym etapie.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę komórek w każdej probówce oddzielnie, używając filtrów siatkowych o średnicy 100, 70 i 40 μm. Na każdym etapie filtrowania umyj sitka 2 ml DPBS przed zebraniem przepustu. 
	nuta: Od tego momentu zawiesiny komórek mogą być łączone i przetwarzane razem.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości DPBS.</li>
	<li>Przystąpić do lizy krwinek czerwonych (RBC), dodając równą objętość buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) (patrz tabela materiałów). Mieszać pipetując i inkubować na lodzie do 5 minut.</li>
	<li>Dodać 10 ml DPBS i odwirować przy 300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant i dokonać oględzin osadu. Jeśli granulka jest biała, przejdź do następnego kroku. W przeciwnym razie powtórzyć etap lizy RBC (krok 2.5).</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1-5 ml pożywki mammosfery: pożywka do wzrostu komórek nabłonka sutka (MEBM), uzupełniona 2 mM glutaminą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 5 μg/ml insuliny, 0,5 μg/ml hydrokortyzonu, 2% B27, 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 20 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 0,4 IU/ml heparyny (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
3. Ponowne powlekanie seryjnej mammosfery
<ol>
	<li>W celu założenia kultur mammosfery, umieść komórki na 6-dołkowych płytkach poddanych działaniu kultur nietkankowych (o bardzo niskiej adhezji) o gęstości 200 000 żywych komórek/ml w pożywce mammosfery. Inkubować komórki przez 7-10 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Przygotować i przefiltrować 1% roztwór poli-HEMA w 95% etanolu (patrz Tabela materiałów). Pokryj 6-dołkowe płytki o bardzo niskiej przyczepności dla następujących przejść, dodając 400 μl 1% roztworu poli-HEMA na dołek i pozwalając etanolowi całkowicie wyschnąć. Aby uzyskać lepsze rezultaty, powtórz powlekanie dwukrotnie. 
	nuta: Zastosowanie niepowlekanych płytek podczas pierwszego pasażu pozwala na selektywne usuwanie fibroblastów z hodowli.</li>
	<li>Pod koniec 7-10 dni hodowli zebrać pierwotne mammosfery ze wszystkich studzienek i odwirować w temperaturze 300 x g, przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować supernatant i przystąpić do mechanicznej dysocjacji mammosfer za pomocą pipety P200 z filtrowanymi końcówkami. Odpipetować około 100 razy i wizualnie sprawdzić zawiesinę pod kątem obecności dużych sferoidów. 
	nuta: Krótka inkubacja (2-5 min) kuli w małej objętości (0,2-0,5 ml) trypsyny lub Accutazy w temperaturze 37 °C, 5% CO2 może być zastosowana w celu ułatwienia dysocjacji mechanicznej. Przygotować świeżą pożywkę mammosfery (krok 2.7) do posiewu każdego przejścia.</li>
	<li>Zawiesić w 1-5 ml świeżej pożywki mammosfery i policzyć żywe komórki. W stosownych przypadkach należy podzielić komórki na grupy poddane działaniu substancji lub w warunkach hodowli.</li>
	<li>Umieść 20 000 żywotnych komórek/ml na 6-dołkowych płytkach o bardzo niskiej przyczepności pokrytych poli-HEMA i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 
	nuta: Mammosfery osiągają maksymalny rozmiar w ciągu 5-7 dni po posiewie komórek. Jeśli to możliwe, należy rozmieścić komórki każdej próbki lub stanu do wielu studzienek, aby uzyskać kontrpróby techniczne. Gęstość posiewu powinna być utrzymywana na niskim poziomie, aby uniknąć agregacji komórek. Zaleca się maksymalnie 20 000 komórek/ml dla płytek 6-dołkowych i 5 000 komórek/ml dla płytek 24-dołkowych.</li>
	<li>Po 5-7 dniach policz liczbę kulek w studzience. Można to zrobić ręcznie, za pomocą mikroskopu wyposażonego w soczewkę o 10-krotnym powiększeniu lub za pomocą cyfrowej analizy obrazu (patrz krok 4).</li>
	<li>Zebrać mammosfery z każdej studzienki oddzielnie i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować supernatant i przystąpić do mechanicznej dysocjacji mammosfer za pomocą pipety P200 z filtrowanymi końcówkami. Odpipetować około 100 razy i wizualnie sprawdzić zawiesinę pod kątem obecności dużych sferoid.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 1 ml świeżej pożywki mammosfery i policzyć żywe komórki. Połączyć komórki każdej próbki lub warunku i powtórzyć kroki 3.6-3.10. Zapisać liczbę posianych komórek oraz liczbę kulek i komórek zliczonych w każdym dołku dla każdego przejścia. Przejdź do kroku 5 w celu obliczenia skumulowanego wzrostu.</li>
</ol>
4. Wyliczanie sfer za pomocą cyfrowej analizy obrazu (DIA)
<ol>
	<li>Na końcu każdego przejścia zeskanuj całą powierzchnię wszystkich studni i uzyskaj obrazy kul za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na stereoskopie. Zapisz obrazy jako pliki .tif.</li>
	<li>Zaimportuj obrazy stereoskopowe jako sekwencję obrazów za pomocą klasy ImageJ<sup="xref">14. Ustaw skalę i typ obrazu na 8-bitowy.</li>
	<li>Zduplikuj stos obrazów i wybierz opcję Odejmij tło z zakładki Proces na pasku menu. Zaznacz opcje Jasne tło i Paraboloida przesuwna i kliknij przycisk OK. Przetwórz wszystkie obrazy stosu.</li>
	<li>Wybierz Dostosuj, a następnie Próg z zakładki Obraz paska menu. Klikając Zastosuj, pojawi się okno dialogowe zatytułowane Konwertuj stos na binarny. Wybierz opcję Domyślne jako metodę i Światło jako tło. Zaznacz pole Oblicz próg dla każdego obrazu i kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Wybierz kolejno polecenia Zlewnia, Otwórz i Erozja z listy binarnej na karcie Proces paska menu. Przetwarzaj wszystkie obrazy stosu, klikając przycisk Tak w wyświetlonym oknie dialogowym. 
	nuta: Procesy te pozwalają na wizualną segmentację obiektów, które się stykają, wygładzanie obiektów i usuwanie pikseli z krawędzi obiektów.</li>
	<li>Wybierz funkcję Analizuj cząstki z menu Analizuj. Ustaw minimalny próg rozmiaru na 10 000 μm2 i okrągłość w zakresie od 0,50 do 1,00. Wybierz opcję Wielokropek z menu rozwijanego Pokaż. Zaznacz opcję Sumuj, Wyklucz na krawędziach i Pokaż na miejscu i kliknij przycisk OK. Przetwarzaj wszystkie obrazy stosu.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo zgodność elipsy ze sferami i, jeśli to konieczne, odpowiednio skoryguj liczbę cząstek. Zsumuj liczby ze wszystkich ramek każdej studzienki, aby uzyskać całkowitą liczbę mammosfer na studzienkę.</li>
</ol>
5. Obliczanie skumulowanej krzywej wzrostu
UWAGA: Liczba mammosfer zliczonych w każdym dołku na końcu każdego przejścia (PN) odzwierciedla liczbę komórek inicjujących mammosferę zasianych na początku PN.
<ol>
	<li>Dla każdego przejścia (PN) zarejestruj liczbę posianych komórek oraz liczbę komórek i kulek zliczonych na studzienkę. Oblicz rozmiar kuli na końcu każdego przejścia: 
	rozmiar kuli PN (komórki / kula) = komórki liczone PN / kule liczone PN 
	nuta: Rozmiar kuli wP N jest miarą potencjału proliferacyjnego każdej komórki inicjującej mammosferę zasianej w PN.</li>
	<li>Wywnioskuj liczbę platerowanych kulek, dzieląc liczbę komórek posianych dlaP N przez rozmiar kuli obliczony na końcu poprzedniego przejścia (PN-1): 
	kule platerowane PN = komórki platerowaneP N / rozmiar kuli PN-1 
	nuta: Zgodnie z konwencją, przyjmuje się, że rozmiar kuli jest stabilny podczas pierwszego przejścia kultury (tj. rozmiar kuli P0 = rozmiar kuli P1). Jeśli jako kontrpróby techniczne używa się wielu odwiertów, jako mianownik należy użyć średniej wielkości kuli w PN-1.</li>
	<li>Oblicz skumulowaną liczbę komórek i kul dla każdej studzienki na przejście: 
	liczba skumulowana PN = (liczba PN / platerowana PN) X liczba skumulowana PN-1, 
	nuta: Zgodnie z konwencją, łączna liczba P0 = platerowana P1. Jeżeli jako kontrpróby techniczne wykorzystuje się wiele studzienek, należy obliczyć średnią łączną liczbę odwiertów na próbkę lub warunek dla każdego przejścia.</li>
	<li>Wykreśl punkty danych w skali półlogarytmicznej. Wyświetla numer przejścia (odP 0 do PN) na osi x (skala liniowa) oraz skumulowany numer komórki lub sfery na osi y (skala logarytmiczna).</li>
	<li>Dopasuj wykładniczą linię trendu do punktów danych i oblicz współczynnik determinacji (R2), aby zmierzyć dobroć dopasowania. 
	nuta: Linia trendu dopasowana do punktów danych powinna być zbliżona do krzywej wykładniczej, zgodnie z oczekiwaniami dla populacji komórek, która rośnie lub umiera ze stałą szybkością. R2 przyjmuje wartości z zakresu od 0 do 1, przy czym wartości najbliższe 1 wskazują na lepsze dopasowanie.</li>
	<li>Przedstaw równanie linii trendu jako naturalną funkcję wykładniczą, aby wywnioskować tempo wzrostu (GR) kultury: 
	y = y0 e(GR)x, gdzie y0 jest wartością y, gdy x = 0.</li>
</ol>

<ol><li>Kordon, E. C., Smith, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entire+functional+mammary+gland+may+comprise+the+progeny+from+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell.</a> Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage+and+time+dictate+the+fate+of+Wnt%2Fbeta-catenin-responsive+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stem+cells+contribute+to+mammary+gland+development+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance.</a> Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).</li>
<li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Research. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Pece, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140 (1), 62-73 (2010).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Santoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Loss+in+Breast+Cancer+Leads+to+Myc+Activation%2C+Increased+Cell+Plasticity%2C+and+Expression+of+a+Mitotic+Signature+with+Prognostic+Value%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value.</a> Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+mammary+stem%2Fprogenitor+cell+isolation%3A+Different+method+matters%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Springerplus%22%5BJournal%5D)">Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters?</a> Springerplus. 5, 140(2016).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Murphy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+thresholds+govern+Myc%27s+biological+output+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct thresholds govern Myc's biological output in vivo.</a> Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).</li>
<li>Bailey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Tracking+of+Breast+Cancer+Cells+Enables+Prediction+of+Sphere+Formation+from+Early+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions.</a> iScience. 8, 29-39 (2018).</li>
<li>Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+formation+assay+from+human+breast+cancer+tissues+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+sphere+culture+cannot+maintain+a+high+ratio+of+cancer+stem+cells%3A+a+mathematical+model+and+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li>
<li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Generation+of+Somatic+Stem+Cells+by+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisano protokół ilościowego opisu właściwości wzrostu MaSC in vitro. Jako przykład przedstawiamy wpływ niskopoziomowej konstytutywnej ekspresji Myc na normalne mysie MaSC. Podejście to można jednak w równym stopniu zastosować do różnych kontekstów. Ludzkie lub mysie komórki pierwotne, a także ustalone linie komórkowe, mogą być hodowane w warunkach niezależnych od zakotwiczenia w celu stworzenia kultur mammosfery, które mogą być szeregowo pasażowane. Nadekspresję genów i interferencję RNA można łatwo wprowadzić do protokołu poprzez dodanie etapu transdukcji wirusa na końcu pierwszego pasażu (po kroku 3.5). Alternatywnie, komórki mogą być infekowane adhezją, a następnie powlekane jako mammosfery.
Krytycznym aspektem przedstawionego tutaj testu jest gęstość komórek wysiewu, która powinna być na tyle niska, aby uniknąć generowania agregatów zakłócających interpretację wyników16,17. Morfologia mammosfer może być pouczająca w rozwiązywaniu tej niejasności. Tylko zwarte, okrągłe kule powinny być wyliczone na końcu każdego przejścia. Należy wziąć pod uwagę zarówno okrągłość sferoid, jak i rozmiar. Korzystając ze zautomatyzowanego procesu DIA, etap ten jest zapewniony za pomocą odpowiednich progów w sposób obiektywny i bezwzględny. Często przodkowie tworzą struktury groniaste lub mniejsze skupiska komórek, które powinny być wykluczone z liczby mammosfery. Z reguły stosujemy próg o średnicy 100 μm. Na koniec należy zachować ostrożność, aby uniknąć przenoszenia nienaruszonych lub nie w pełni zdysocjowanych mamopferów z jednego kanału do drugiego. Z drugiej strony, nadmierne pipetowanie prowadzi do zwiększonej śmierci komórek. Tak więc, jeśli napotkasz takie trudności, zalecamy zastosowanie łagodnej trypsynizacji lub leczenia Accutase i przepuszczenie zdysocjowanych kulek przez sitko 40 μm, aby zapewnić wytworzenie zawiesin jednokomórkowych.
Efektywność formowania kul (SFE) była stosowana alternatywnie, jako substytut kwantyfikacji SC lub CSC ex vivo w kulturach mammosfery. SFE jest rzeczywiście miarą komórek macierzystych podobnych do komórek w danej populacji komórek. Reprezentuje jednak mniej sumienne podejście, ponieważ dostarcza informacji tylko w różnych punktach czasowych. Obliczanie skumulowanych liczb kul i generowanie skumulowanych krzywych wzrostu umożliwia natomiast wnioskowanie o tempie wzrostu kultury od początkowego etapu wysiewu komórek do wyczerpania kultury lub, w przypadku kultur unieśmiertelnionych, dla pożądanej liczby pasaży. Ocena właściwości wzrostu pozwala na ocenę odchylenia od wykładniczego wzrostu za pomocą współczynnika R2 oraz, w drugim etapie, ocenę samej wartości GR.
Co ważne, skumulowane krzywe wzrostu mammosfery mogą być wykorzystane do selektywnej oceny wpływu inhibitorów małocząsteczkowych lub innych leków chemioterapeutycznych na poziomie CSC 6,11. W przeciwieństwie do normalnych mammosfer pierwotnych, które funkcjonalnie wyczerpują się w 5-7 przejściach, mammosfery nowotworowe mają tendencję do rozszerzania się w nieskończoność. Ta funkcja jest powiązana z nieograniczoną możliwością samoodnawiania CSC. Wpływ na proliferację i samoodnawianie CSC można rozłączyć poprzez generowanie odpowiednio krzywych wzrostu komórek nowotworowych i mammosfery. Oczekuje się, że efekt specyficzny dla CSC spowoduje zmniejszenie skumulowanego tempa wzrostu mammosfery, z lub bez wpływu na skumulowane tempo wzrostu komórek 6,11.
Wreszcie, kolejnym obszarem zainteresowań jest przeprogramowanie SC tkanek dorosłych. W pełni rozwinięte mamosfery składają się z fenotypowo heterogenicznej populacji komórek, w której tylko niewielka część zachowuje cechy podobne do łodygi, w tym zdolność inicjowania mammosfery i regenerację gruczołu sutkowego po przeszczepie in vivo 6,9,11,18,19. Progenitorzy sutka mogą być zatem izolowani albo za pomocą testów in vitrozachowujących znaczniki 6,9,11, albo, ex vivo, przy użyciu ustalonych markerów powierzchniowych 2,3. Warto zauważyć, że przodkowie sutka nie przeżywają anoikis i nie są w stanie tworzyć mammosfer. Wykazano, że wymuszona ekspresja Myc nadaje potencjał inicjacji mammosfery przodkom sutka izolowanym jako PKHneg11, co skutkuje generowaniem kultury, która może być pasażowana w nieskończoność. Podobnie, interferencja negatywnych regulatorów fizjologicznego przeprogramowania może być testowana przy użyciu tego samego testu. W tym kontekście częstym problemem, który może się pojawić, jest ograniczona liczba komórek wejściowych. Jeśli wejście komórek jest mniejsze niż 10 000 komórek, zalecamy wysiew na płytkach 24-dołkowych (maksymalnie 5 000 żywych komórek/ml). Niemniej jednak może się okazać, że warunki hodowli niezależne od zakotwiczenia są zbyt surowe dla przeprogramowania punktacji, zwłaszcza w przypadkach, gdy efekt przeprogramowania nie jest natychmiastowy. W takich przypadkach bardziej odpowiednie może być zastosowanie matrycy nośnej i trójwymiarowych kultur organoidowych20.
Ogólnie rzecz biorąc, test mammosfery jest opłacalną opcją, którą można łatwo zastosować do oceny właściwości podobnych do łodygi w normalnych i nowotworowych populacjach MEC. Podejście ilościowe przyjęte w tym protokole ułatwia porównania między kulturami prowadzonymi w różnych warunkach lub narażonymi na różne bodźce. Przy rygorystycznym przestrzeganiu, zapewnia stosunkowo prosty system modeli ex vivo, który pozwala na rozprzęganie wielu czynników, które definiują właściwości łodygi in vivo, oferując możliwość bardziej szczegółowych badań mechanistycznych.

Izolacja i hodowla in vitro komórek macierzystych i progenitorowych nabłonka sutka stały się niezbędne do zrozumienia ich właściwości w biologii komórek sutkowych. Eleganckie śledzenie linii i testy seryjnych przeszczepów umożliwiły badanie komórek macierzystych (SC) i innych podzbiorów tkanek w kontekście ich niszy in vivo. Jednak takie podejście jest czasochłonne i wymaga generowania modeli myszy reporterskich1,2,3,4,5. W związku z tym hodowla in vitro i namnażanie komórek macierzystych sutka (MaSC) przy jednoczesnym zachowaniu kluczowych cech macierzystych, a mianowicie zdolności do samoodnawiania się i różnicowania, jest jednym z największych wyzwań w tej dziedzinie. W ostatnich latach test mammosfery był szeroko stosowany do modelowania zarówno prawidłowej tkanki sutka, jak i wzrostu raka piersi, do ilościowego określania normalnych lub nowotworowych SC (CSC) i oceny ich zdolności do samoodnawiania się jako zastępczego reportera ich aktywności w odpowiednim kontekście in vivo6,7,8,9,10,11.
Test mammosfery jest efektywnym i opłacalnym podejściem, w którym świeżo izolowane komórki nabłonka sutka (MEC) są hodowane w warunkach nieprzylegających, z założeniem, że tylko MaSC przetrwają i utworzą kule w zawiesinie, podczas gdy wszystkie inne typy komórek umrą z powodu anoikis. Co więcej, zdolność do formowania kilku generacji mammosfer w szeregowych nieprzylegających przejściach jest związana ze zdolnością do samoodnawiania się MaSCs6,9,11. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół ilościowego testu mammosfery, który został pierwotnie opracowany przez Dontu i współpracowników7 jako modyfikacja pionierskiego testu neurosfery12, umożliwiający wzrost przypuszczalnych SC w nieprzylegających, wolnych od surowicy warunkach z dodatkiem odpowiednich czynników wzrostu7,12.

<table><tbody><tr><td>Bufor do lizy ACK</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Bufer do lizy chlorku amonu i potasu, 100 mL.</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 suplement 50X (10 mL). Stężenie końcowe 2% v/v.</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Ludzki rekombinowany czynnik wzrostu fibroblastów - zasadowy, 50 &mu;g. Roztwór podstawowy 100 &mu; g/&mu; L w Tris 5 mM pH 7,6. Rozcieńczenie końcowe 0,02% v/v.</td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>Kolagenaza z Clostridium histolyticum. Typ I-A, proszek liofilizowany, 1 g. Zapas 20 000 U/ml w DMEM. Rozcieńczenie końcowe 1% v/v.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle's Eagle's</td></tr><tr><td></td><td>Microgem</td><td>firmy Dulbecco S17859L0615</td><td>buforowana fosforanem sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Tebu-Bio</td><td>AF-100-15</td><td>Rekombinowany ludzki nabłonkowy czynnik wzrostu. Roztwór podstawowy 100 &mu; g/ml w sterylnym dH2O. Końcowe rozcieńczenie 0,02% v/v.</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>L-glutamina, 200 mM. Rozcieńczenie końcowe 1% v/v.</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>PharmaTex</td><td>34692032</td><td>Stężenie magazynowe 5 000 j.m./ml. Rozcieńczenie końcowe 0,008% v/v.</td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>Typ IV-S, proszek, 750-3,000 U/mg w postaci stałej, 30 mg. Roztwór podstawowy 10 mg/ml w sterylnym dH2O. Końcowe rozcieńczenie 1% v/v.</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>Stężenie zapasowe 100 &mu; g/ml. Rozcieńczenie końcowe 0,5% v/v.</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>SAFCBiosciences</td><td>91077C</td><td>Insulina rekombinowana ludzka, suchy proszek, 250 mg. Stężenie podstawowe 1 mg/mL. Rozcieńczenie końcowe 0,5% v/v.</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe o niskim nasadce</td><td>Corning</td><td>351146</td><td>Sterylne 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych bez obróbki z przezroczystym płaskim dnem i pokrywką.</td></tr><tr><td>MEBM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td>Wzrost komórek nabłonka sutka podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>Mieszanina Penicllin-Streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>Zawiera 10 000 U penicyliny potasowej i 10 000 &mikro; g siarczan streptomycyny na ml w 0,85% soli fizjologicznej. Rozcieńczenie końcowe 1% v/v.</td></tr><tr><td>Poly-HEMA</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>Rozpuścić w 95% EtOH przez noc w temperaturze 55 & st. C. Stężenie podstawowe 12% w/v. Końcowe rozcieńczenie 1% v/v w 95% EtOH. Filtr (0,22 &mu; m) przed użyciem.</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja samoodnowy w mysich kulturach mammosfery

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Gruczoł sutkowy charakteryzuje się rozległą zdolnością do regeneracji, ponieważ przechodzi ogromne zmiany hormonalne przez cały cykl życia samicy. Rola komórek macierzystych sutka (MaSC) jest szeroko badana zarówno w kontekście fizjologicznym/rozwojowym, jak i w odniesieniu do kancerogenezy piersi. W tym aspekcie bardzo poszukiwane są badania ex vivo skoncentrowane na właściwościach MaSC. Kultury mammosfery stanowią substytut tworzenia się narządów i stały się cennym narzędziem zarówno w badaniach podstawowych, jak i translacyjnych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania mysich pierwotnych kultur mammosfery oraz ilościowe określenie właściwości wzrostu MaSC. Protokół obejmuje pobieranie i trawienie gruczołu sutkowego, izolację pierwotnych komórek nabłonka sutka (MEC), ustanowienie pierwotnych kultur mammosfery, seryjne pasażowanie, ilościowe określenie parametrów wzrostu mammosfery i interpretację wyników. Jako przykład przedstawiamy wpływ niskopoziomowej konstytutywnej ekspresji Myc na normalne MEC, co prowadzi do zwiększonej samoodnowy i proliferacji.

Nadekspresja Myc w prawidłowych MEC prowadzi do zwiększenia częstotliwości występowania komórek inicjujących tworzenie mammosfer. Jest to osiągane poprzez podwójny mechanizm: Myc zwiększa tempo symetrycznych podziałów MaSC oraz częstotliwość przeprogramowania komórek progenitorowych w nowe MaSC1. Aby przetestować efekt niskiej konstytutywnej ekspresji Myc, zastosowaliśmy transgeniczny model myszy Rosa26-MycER, w którym aktywność Myc może być indukowana przez 4-hydroksytamoksifen (4-OHT)15. Najpierw wysialiśmy MEC na płytkach 6-dołkowych o ultra-niskim stopniu adhezji w celu usunięcia fibroblastów, bez dodatku 4-OHT. Po pierwszym pasażu podzieliliśmy kulturę na dwie części: dwie dołki pozostały nieleczone (kontrola), a w dwóch dołkach zastosowano 20 nM 4-OHT (MycER). Przeliczono liczbę sfer i komórek w 5 kolejnych pasażach dla trzech niezależnych eksperymentów (Tabela 1). Skumulowana liczba komórek i sfer na pasaż przedstawiona jest w Tabeli 2. Indukcja za pomocą 4-OHT prowadzi do zwiększenia tempa wzrostu sfer i komórek, co pokazano na Rysunku 1.
<img alt="Porównanie wzrostu komórek na wykresach; MycER vs kontrola; skala logarytmiczna; wyniki analizy pasaży." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne wyniki. Sfera kumulacyjna (A) oraz komórka (B) krzywe wzrostu mammosfer kontrolnych i MycER. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe z 3 niezależnych eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/60256fig1alarge.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Pierwsze wysianie</td>
			<td colspan="3">drugie wysiewanie</td>
			<td colspan="3">3. posiew</td>
			<td colspan="3">4. wysiewanie na podłoża</td>
			<td colspan="3">5. pasażowanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Posiane komórki</td>
			<td>Liczenie komórek</td>
			<td>Liczenie sfer</td>
			<td>Liczba wysianych komórek</td>
			<td>Liczenie komórek</td>
			<td>Liczba sfer</td>
			<td>Liczba wysianych komórek</td>
			<td>Liczenie komórek</td>
			<td>Liczenie sfer</td>
			<td>Liczba wysianych komórek</td>
			<td>Liczenie komórek</td>
			<td>Liczenie sfer</td>
			<td>Liczba wysianych komórek</td>
			<td>Liczenie komórek</td>
			<td>Zliczanie sfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Eksperyment 1</td>
			<td rowspan="2">Kontrola</td>
			<td>77,000</td>
			<td>50,000</td>
			<td>31</td>
			<td>65,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>41</td>
			<td>57,000</td>
			<td>30,000</td>
			<td>32</td>
			<td>30,000</td>
			<td>22,000</td>
			<td>5</td>
			<td>22,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>77,000</td>
			<td>81,000</td>
			<td>41</td>
			<td>65,000</td>
			<td>55,000</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">MycER</td>
			<td>77,000</td>
			<td>31,0000</td>
			<td>193</td>
			<td>80,000</td>
			<td>375,000</td>
			<td>323</td>
			<td>80,000</td>
			<td>380,000</td>
			<td>217</td>
			<td>80,000</td>
			<td>220,000</td>
			<td>223</td>
			<td>80,000</td>
			<td>170,000</td>
			<td>155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>77,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>142</td>
			<td>80,000</td>
			<td>505,000</td>
			<td>396</td>
			<td>80,000</td>
			<td>270,000</td>
			<td>149</td>
			<td>80,000</td>
			<td>290,000</td>
			<td>194</td>
			<td>80,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Exp2</td>
			<td rowspan="2">Kontrola</td>
			<td>75,000</td>
			<td>75,000</td>
			<td>71</td>
			<td>60,000</td>
			<td>17,000</td>
			<td>34</td>
			<td>28,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>29</td>
			<td>45,000</td>
			<td>13,000</td>
			<td>2</td>
			<td>13,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75,000</td>
			<td>47,000</td>
			<td>45</td>
			<td>60,000</td>
			<td>11,000</td>
			<td>47</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">MycER</td>
			<td>75,000</td>
			<td>200,000</td>
			<td>188</td>
			<td>80,000</td>
			<td>225,000</td>
			<td>277</td>
			<td>80,000</td>
			<td>230,000</td>
			<td>155</td>
			<td>80,000</td>
			<td>210,000</td>
			<td>211</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>192</td>
			<td>80,000</td>
			<td>202,500</td>
			<td>283</td>
			<td>80,000</td>
			<td>305,000</td>
			<td>185</td>
			<td>80,000</td>
			<td>160,000</td>
			<td>237</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Eksperyment 3</td>
			<td rowspan="2">Kontrola</td>
			<td>82,500</td>
			<td>130,000</td>
			<td>121</td>
			<td>80,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>105</td>
			<td>80,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>86</td>
			<td>80,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>75</td>
			<td>58,500</td>
			<td>58,500</td>
			<td>78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>82,500</td>
			<td>125,000</td>
			<td>177</td>
			<td>80,000</td>
			<td>71,250</td>
			<td>42</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">MycER</td>
			<td>82,500</td>
			<td>325,000</td>
			<td>457</td>
			<td>80,000</td>
			<td>610,000</td>
			<td>327</td>
			<td>80,000</td>
			<td>367,000</td>
			<td>309</td>
			<td>80,000</td>
			<td>500,000</td>
			<td>260</td>
			<td>80,000</td>
			<td>115,000</td>
			<td>146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>82,500</td>
			<td>475,000</td>
			<td>463</td>
			<td>80,000</td>
			<td>455,000</td>
			<td>392</td>
			<td>80,000</td>
			<td>415,000</td>
			<td>204</td>
			<td>80,000</td>
			<td>470,000</td>
			<td>295</td>
			<td>80,000</td>
			<td>185,000</td>
			<td>161</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Liczba przeliczonych sfer oraz liczba wysianych i przeliczonych komórek w każdym pasażu.
<img alt="Tabela danych eksperymentalnych przedstawiająca liczbę komórek w warunkach kontrolnych oraz MycER w kolejnych pasażach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256table2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2: Obliczanie liczby wysianych sfer oraz skumulowanej liczby sfer i komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/Table2.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Tutaj opisujemy implementację i interpretację wyników ilościowego testu samoodnawiania mammosfery in vitro.

Kwantyfikacja samoodnowy w mysich kulturach mammosfery

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

Tak więc hodowle mammosfery zapewniają łatwo dostępny układ motoryczny do badania i analizowania ważnych aspektów prawidłowych zachowań komórek macierzystych piersi w raku, w tym ich zdolności do samoodnawiania się i różnicowania. Nasze podejście ilościowe ma na celu ocenę tempa wzrostu kultur mammosfery w sposób obiektywny, umożliwiający bezpośrednie porównanie różnych typów komórek i warunków. W przypadku pierwszej próby radziłbym ściśle kontrolować czas inkubacji, aby uniknąć nadmiernego trawienia i zapewnić dokładną liczbę komórek przed każdym posiewem.Procedurę z Charolaise Bull zademonstruje Errico D'Elia, technik z mojego laboratorium. Po zebraniu czterech gruczołów sutkowych w jamie brzusznej i dolnej części klatki piersiowej od 5 do 30, 8 do 10 tygodniowych samic myszy, umieść do 20 gruczołów na 100 milimetrów szalki Petriego w minimalnej objętości DPBS. Zmiel tkanki na mniejsze kawałki i dodaj do nich 10 mililitrów pożywki trawiennej.Użyj pipety serologicznej o pojemności 25 mililitrów, aby przenieść kawałki tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i uszczelnić probówkę folią parafinową. Następnie inkubuj fragmenty na rotatorze w temperaturze 0,03 X G przez 2 1/2 godziny w temperaturze 37 stopni i 5% dwutlenku węgla z wilgotnością. Pod koniec inkubacji, jeśli wszystkie fragmenty mogą zostać przepuszczone przez końcówkę pipety P1000, należy rozprowadzić zawiesinę tkankową przez odwirowanie i ostrożnie zdekantować supernatant.Ponownie zawiesić osad w 3 mililitrach PBS i przefiltrować zawartość probówki sekwencyjnie przez jedno sitko o średnicy 100, 170, 140 mikrometrów do nowej stożkowej probówki, myjąc każde sitko 2 mililitrami świeżego DPBS po każdym filtrze. Osadzać komórki przez odwirowanie i dekantować supernatant, ponownie zawieszając komórki w pozostałym DPBS. Wymieszać komórki z równą objętością buforu do lizy chlorku amonu potasu i lizować czerwone krwinki na lodzie przez okres do 5 minut.Pod koniec inkubacji zatrzymać lizę za pomocą 10 mililitrów DPBS i zebrać komórki przez odwirowanie. Potwierdź obecność białej pożywki i ponownie zawieś ją w 1 do 5 mililitrach pożywki mammosfery w celu zliczenia. Następnie umieść komórki na niepoddanych hodowli tkankowej sześciodołkowych płytkach o bardzo niskiej przyczepności w proporcji 2 x 10 do piątej żywej komórki na mililitr stężenia pożywki mammosfery przez 7 do 10 dni inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Pod koniec hodowli trwającej od 7 do 10 dni należy zebrać pierwotne mammosfery z każdej studzienki płytki do hodowli komórkowej i rozprowadzić mammosfery przez cetrifugację. Po dekantacji supernatantu użyj pipety P200 z końcówką z filtrem, aby odpipetować mammosfery około 100 razy. Generowanie pacjentów z pojedynczymi komórkami ma kluczowe znaczenie dla dokładnej kwantyfikacji komórki mammosfery w celu uzyskania nowej labilności.Sprawdź wzrokowo zakres segregacji i w razie potrzeby użyj sitka do komórek. Ponownie zawiesić odłączone mammosfery za pomocą 1 do 5 mililitrów świeżej pożywki mammosfery do liczenia i płytki 2 X 10 do czwartej żywotnej komórki na mililitr na pokrytych polihemą sześciodołkowych płytkach o bardzo niskiej przyczepności na 5 do 7 dniowej hodowli. Następnie, po 5 do 7 dniach, policz liczbę kulek w dołku.Na końcu każdego przejścia użyj kamery cyfrowej zamontowanej na stereoskopie, aby zeskanować całą powierzchnię wszystkich studni, aby zobrazować kule. Po zapisaniu obrazów, jako plików tif, zaimportuj obrazy stereoskopowe jako sekwencję obrazów do ImageJ i ustaw skalę i typ obrazu na 8-bitowy. Zduplikuj stos obrazów i wybierz opcję Odejmij tło z karty Proces.Zaznacz opcje Jasne tło i Paraboloida przesuwna, a następnie kliknij przycisk OK, aby przetworzyć wszystkie obrazy stosu. Wybierz opcję Dostosuj i próg na karcie Obraz i kliknij przycisk Zastosuj. Pojawi się wyskakujące okienko.Wybierz opcję Domyślne jako metodę i Światło jako tło. Zaznacz pole Oblicz próg dla każdego obrazu i kliknij przycisk OK.To przetworzyć wszystkie obrazy w stosie, wybierz opcję Zlewnia i kliknij przycisk Tak. Wybierz opcję Otwórz i kliknij przycisk Tak, a następnie wybierz opcję Eroduj i kliknij przycisk Tak.Następnie wybierz opcję Analizuj cząstki z menu Analizuj i ustaw minimalny próg rozmiaru na 10 000 mikrometrów kwadratowych i okrągłość w zakresie od 0,50 do 1,00. Wybierz opcję Wielokropek z menu rozwijanego Pokaż i zaznacz opcje Sumuj, Wyklucz na krawędziach i Pokaż in situ. Następnie kliknij przycisk OK, aby przetworzyć wszystkie obrazy stosu.Aby obliczyć skumulowaną krzywą wzrostu dla każdego przejścia, zarejestruj liczbę posianych komórek i liczbę komórek w kulach zliczonych na studzienkę i oblicz rozmiar kuli na końcu każdego przejścia. Wywnioskuj liczbę platerowanych kulek, dzieląc liczbę komórek posianych dla każdego przejścia przez rozmiar kuli obliczony na końcu poprzedniego przejścia. Oblicz skumulowaną liczbę komórek dla każdego dołka na przejście i skumulowaną liczbę kuli dla każdego dołka na przejście i wykreśl punkty danych w skali półlogarytmicznej.Następnie wykładnicza linia trendu do punktów danych i oblicz współczynnik determinacji, aby zmierzyć dobroć dopasowania. Następnie przedstaw równanie linii trendu jako naturalną funkcję wykładniczą, aby wywnioskować tempo wzrostu kultury. W tym eksperymencie określono liczbę sfer i komórek w pięciu kolejnych przejściach dla trzech niezależnych eksperymentów.Tutaj w skumulowanej liczbie komórek i sfer pokazane są liczby poszczególnych fragmentów. Jak zaobserwowano, aktywacja Myc prowadzi do zwiększonego tempa wzrostu sfery i komórek. Biologiczne i odpowiednie punkty czasowe można wybrać do pobrania komórek lub do przeprowadzenia analizy ekspresji genów lub innych zasobów funkcjonalnych w celu oceny różnicowania, migracji i inwazji komórek.Jest to proste i ekonomiczne podejście z wieloma zastosowaniami. Na przykład może być wykorzystany w bezpośrednim odkryciu do pomiaru wpływu na proliferację i samoodnawianie się komórek macierzystych raka.

quantification-of-self-renewal-in-murine-mammosphere-cultures

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Różnicowanie laktogenne komórek HC11 można scharakteryzować poprzez tworzenie się struktur kopułkowatych, określanych jako mammosfery. Struktury te można zliczyć za pomocą mikroskopii fazowej, co ułatwia ilościowe określenie stopnia różnicowania laktogennego.

Mysie komórki nabłonka gruczołu mlekowego tworzą mammosfery podczas różnicowania laktogennego

Ten film opisuje izolowanie komórek macierzystych raka piersi od linii komórkowych raka piersi. Hodujemy te nowotworowe komórki macierzyste w celu wygenerowania pierwotnych mammosfer do oceny samoodnawiania się i obliczania wydajności formowania kul, co pozwala na porównanie różnych gęstości wysiewu.

Wytwarzanie mammosfer pierwotnych: technika określania siły działania komórek

Opisano metodę przetwarzania materiału chirurgicznego ludzkiego sutka. Przetworzona tkanka, w postaci organoidów, może być przechowywana w stanie zamrożonym w nieskończoność lub umieszczona w kulturze w celu długotrwałego wzrostu.  Metoda ta umożliwia eksperymentalne badanie prawidłowej biologii komórek nabłonkowych człowieka oraz skutków zaburzeń egzogennych.

Przetwarzanie tkanek ludzkiej mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii do hodowli komórkowych

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Pływające testy mammosfery mogą badać podzbiór komórek raka piersi podobnych do macierzystych, które przeżywają w warunkach zawieszenia i wykazują zwiększoną nowotworzenie po wszczepieniu myszom.  Protokół ten zapewnia wygodny pomiar in vitro zdolności do tworzenia kul, wskaźnik zastępczy dla nowotworzenia nowotworów in vivo, ułatwiając jednocześnie analizę krajobrazu transkrypcyjnego związanego z pniem.

Test tworzenia mammosfery z tkanek ludzkiego raka piersi i linii komórkowych

Dostępność somatycznych SC jest kluczowa dla medycyny regeneracyjnej, modelowania chorób i uzyskania wglądu we właściwości SC. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalne strategie przeprogramowania, in vitro, zróżnicowanych dorosłych komórek w odpowiadające im ekspandowalne tkankowo specyficzne komórki macierzyste / progenitorowe poprzez przejściową ekspresję pojedynczego koaktywatora transkrypcji YAP.

De Novo Generowanie somatycznych komórek macierzystych metodą YAP/TAZ

System modelowy in vitro został opracowany w celu uchwycenia zmian architektonicznych tkanek podczas progresji raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC) w trójwymiarowej (3D) kohodowli z fibroblastami związanymi z rakiem (CAF). Ten system organoidów stanowi unikalną platformę do badania ról różnych zmian wewnętrznych i zewnętrznych komórek nowotworowych, które modulują fenotyp guza.

Wielowymiarowy system kokultury do modelowania progresji raka płaskonabłonkowego płuca

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Ten protokół opisuje metodę ustawiania assayu formacji mammosfer w celu badania inhibitora apoptozy 5 (Api5) wywołanej skurczliwości komórek macierzystych raka w nienowotworowych komórkach nabłonkowych piersi. Lizat zebrany z mammosfer pierwszej generacji jest analizowany pod kątem różnych markerów skurczliwości w celu oceny indukcji właściwości przypominających komórki macierzyste.

Badanie mammosfer ujawnia indukowaną przez Api5 cechę komórkową w nie nowotworzących liniach komórek nabłonkowych piersi

Poznaj metodę kwantyfikacji samoodnowy w kulturach mammosfery mysich. Technika ta umożliwia obiektywną ocenę tempa wzrostu komórek macierzystych raka piersi w różnych warunkach eksperymentalnych.

Kwantyfikacja samoodnowy w mysich kulturach mammosfery

Przeglądaj więcej filmów