Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Protokół ten zapewnia wysoce skuteczny bakteryjny system wyświetlania do izolacji nowych wariantów BirA, który pozwala na specyficzną biotynylację natywnych białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że selekcjonuje ona warianty BirA za pomocą selekcji streptawidyny o wysokim powinowactwie. Gwarantuje to, że nieaktywne klony są usuwane, tworząc w ten sposób wysoce wydajny proces selekcji.

Aby rozpocząć, w edytorze plazmidów, zaprojektuj starter do przodu tak, aby zawierał ostatnie 30 nukleotydów odwrotnego dopełniacza sekwencji kodującej peptydy i dodaj sekwencję nukleotydową wiążącą plazmid do jej pięciopierwszego końca. Zaprojektuj starter odwrotny tak, aby zawierał pierwsze 30 nukleotydów odwrotnego dopełniacza sekwencji kodującej peptydy i dodaj sekwencję nukleotydową wiążącą plazmid do jej pięciopierwszego końca. Następnie, aby uruchomić 20-mikrolitrową reakcję PCR, dodaj odczynniki do cienkościennej probówki PCR.

Przenieś probówkę do termocyklera i wykonaj PCR zgodnie z rękopisem. Następnie uruchom pięć mikrolitrów reakcji PCR na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację sześciokilozasadowego produktu PCR i postępuj zgodnie z manuskryptem. Teraz, aby zsyntetyzować zmutowane megaprimery ze starterami do przodu i do tyłu heksahistydyny BirA, w probówce PCR dodaj jeden nanogram pBAD-BirA-eCPX z przygotowaną docelową sekwencją peptydową jako matrycę.

Ustaw 35 cykli PCR z temperaturą wyżarzania 60 stopni Celsjusza zgodnie z instrukcją producenta. Następnie uruchom pięć mikrolitrów reakcji amplifikacji na 1% żelu agarozowym, aby zweryfikować amplifikację produktu PCR o parach 984 zasad. Oczyść produkt PCR z pozostałych 45 mikrolitrów reakcji amplifikacji za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR i użyj spektrofotometru do ilościowego określenia wydajności DNA.

W cienkościennej probówce do PCR dodaj odczynniki do przygotowanych zmutowanych megastarterów, aby przygotować reakcję próbki. Przenieś mieszaninę reakcyjną do termocyklera i przeprowadź PCR zgodnie z manuskryptem. Przechowywać reakcję amplifikacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie.

Następnie dodaj jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego Dpn1 bezpośrednio do reakcji amplifikacji i delikatnie wymieszaj. Odwirować mieszaninę reakcyjną i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch godzinach przekształć kompetentne komórki E. coli T7 Express lysY/Iq w probówkę z dwoma mikrolitrami reakcji Dpn1.

Najpierw zaszczepić 100 mililitrów LB zawierających 1% glukozy i 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny jednym mililitrem biblioteki BirA i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Następnie zaszczepić pięć mililitrów LB zawierających 1% glukozy i 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny 100 mikrolitrami nocnej hodowli. Inkubować przez dwie godziny i 30 minut lub do momentu, gdy kultura osiągnie OD600 około 0,5.

Następnie indukuj ekspresję eCPX i BirA z L-arabinozą 0,2% objętościowo, 100-mikromolowym IPTG i 100-mikromolową biotyną. Potrząsaj kulturą z prędkością 200 obr./min przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwirować kulturę przez 10 minut w temperaturze 5 000 razy g i usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze lodowatego PBS i odwirować przy 5 000 g przez pięć minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 400 mikrolitrach lodowatego PBS i przechowuj komórki na lodzie. Następnie przenieś 10 mikrolitrów zawieszonych komórek do 1,5-mililitrowej probówki oznaczonej jako wejście.

Przechowywać na lodzie. Następnie umyj 20 mikrolitrów kulek magnetycznych streptawidyny w jednym mililitrze lodowatego PBS w probówce i umieść probówkę w laboratoryjnym magnetycznym separatorze cząstek na dwie minuty i ostrożnie usuń supernatant. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne streptawidyny w 20 mikrolitrach lodowatego PBS i przenieść roztwór kulek do wcześniej przygotowanych 390 mikrolitrów zawieszonych komórek.

Wymieszać delikatnie pipetując. Następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść kolumnę z kulkami ferromagnetycznymi w magnetycznym separatorze cząstek i przemyj pięcioma mililitrami lodowatego PBS.

Przenieś komórki i kulki magnetyczne streptawidyny z rurki do kolumny przymocowanej w separatorze. Gdy zbiornik kolumny jest pusty, umyj kolumnę całkowitą objętością pięciu mililitrów lodowatego PBS przy 500 mikrolitrach za każdym razem. Następnie wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją w 1,5-mililitrowej probówce.

Odpipetować jeden mililitr lodowatego PBS na kolumnę i użyć tłoka do elucji magnetycznie znakowanych komórek. Następnie umieść 1,5-mililitrową rurkę w separatorze stołowym i umyj magnetycznie oznakowaną komórkę jednym mililitrem lodowatego PBS. Delikatnie zawieś ponownie magnetycznie znakowane ogniwa w jednym mililitrze lodowatego PBS.

Przenieś 10 mikrolitrów reprodukcji do 1,5-mililitrowej rurki z oznaczeniem wyjściowym. Zaszczepić 100 mililitrów LB zawierających 1% glukozy i 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny magnetycznie znakowanymi komórkami i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Następnego dnia połącz 10 mililitrów nocnej kultury w LB z glicerolem do końcowego stężenia 15% i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby uzyskać zapasy do zamrażania.

Użyj 100 mikrolitrów kultury przez noc do następnej rundy selekcji. Teraz dodaj 990 mikrolitrów lodowatego PBS zarówno do próbek wejściowych, jak i wyjściowych, a następnie oznacz probówki odpowiednio na wejściu 10 do minus dwa i na wyjściu 10 do minus dwa. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia dwóch próbek w lodowatym PBS, aż do osiągnięcia końcowego rozcieńczenia 10 do minus 10 w próbce wejściowej i 10 do minus 4 w próbce wyjściowej.

Umieść 100 mikrolitrów próbek od wejścia 10 do minus sześciu, wejścia 10 do minus osiem, wejścia 10 do minus 10, wyjścia 10 do minus dwa, wyjścia 10 do minus trzech i wyjścia 10 do minus cztery na indywidualnych płytkach LB-ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rano policz liczbę kolonii na tabliczkach z wyraźnie oddzielonymi koloniami. Pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, aby uzyskać liczbę stężeń bakterii na 100 mikrolitrów.

W tym protokole, po wygenerowaniu losowo zmutowanej biblioteki wariantów BirA, indukowano ekspresję BirA i eCPX-AP. Bakterie inkubowano z odczynnikiem powinowactwa, niezwiązane bakterie odrzucano, a wybrane bakterie amplifikowano. Western blot bakterii eksprymujących pBAD-BirA-eCPX-AP wytworzył 22-kilodaltonowe prążko reagujące na streptawidynę, zgodne z masą cząsteczkową eCPX zarówno w hodowlach nieindukowanych, jak i indukowanych.

Nie były one jednak obecne w heksahistydynie BirA. Silna biotynylacja powierzchniowa w bakteriach eksprymujących eCPX-AP powodowała agregację po dodaniu kulek magnetycznych streptawidyny i tworzenie się osadu na dnie probówki, czego nie zaobserwowano w przypadku eCPX z bakteriami ekspresyjnymi mutacji lizyny do alaniny. Analiza osadu z pulldown streptawidyny wykazała wyraźne 22-kilodaltonowe prążki reagujące na streptawidynę i anty-heksahistydynę w próbkach z kultur eCPX-AP, ale nie eCPX-AP z kulturami mutacji lizyny do alaniny.

Podobnie, liczba bakterii związanych z kulkami streptawidyny była znacznie wyższa w kulturach mutacji eCPX-AP niż eCPX-AP z mutacją lizyny do alaniny. Najważniejszym krokiem jest dokładne umycie bakterii związanych ze streptawidyną. Rygorystyczne mycie zapewnia, że wybierane są tylko bakterie z biotyną eksponowaną powierzchniowo.

Po zaobserwowaniu wyraźnego wzbogacenia bakterii, izolowane klony mogą być dalej mutowane, a tym samym rozwijać wysoce aktywne warianty BirA, które pozwalają na specyficzną biotynylację natywnych białek.