Name: Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj metodę wyświetlania bakteryjnego do izolacji nowych wariantów ligazy biotynowo-białkowejj BirA z E. coli. Technika umożliwia specyficzną biotynylację białek natywnych dzięki selekcji z użyciem streptawidyny o wysokim powinowactwie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Mohamedowi Abdullahi Ahmedowi za pomoc technika. Prace te były wspierane przez granty Fundacji Lundbeck, Fundacji Novo Nordisk, Duńskiego Towarzystwa Nerek, Fundacji Aase og Ejnar Danielsen, Fundacji A.P. Møllera na rzecz Rozwoju Nauk Medycznych oraz Fundacji Pamięci Knuda i Edith Eriksenów.

1. Wprowadzenie sekwencji sekwencjonowania kodującego peptydy w pBAD BirA-eCPX-AP
UWAGA: Aby wybrać warianty BirA, które biotynylują natywne białko docelowe, zacznij od zidentyfikowania 15-aminokwasowej sekwencji peptydowej w podstawowej sekwencji białek, która zawiera co najmniej jedną resztę lizyny (K).
<ol>
	<li>Przejdź do zestawu do manipulacji sekwencjami12.</li>
	<li>Wklej zidentyfikowaną sekwencję peptydów 15-aminokwasowych w polu wejściowym w formacie FASTA i naciśnij Prześlij.</li>
	<li>Wybierz i skopiuj odwrotną translację 45 nukleotydów sekwencji peptydowej.</li>
	<li>Pobierz plik GenBank dla pBAD-BirA-eCPX-AP z http://n2t.net/addgene:121907.</li>
	<li>Załaduj plik do edytora plazmidów (np. ApE) i w oknie funkcji wybierz sekwencję AP oznaczoną jako "AviTag™".</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy podświetloną sekwencję AP w oknie sekwencji DNA i wybierz Wklej Rev-Com z menu kontekstowego. 
	nuta: Sekwencja kodująca eCPX jest w odwrotnym kierunku, a zatem sekwencja kodująca peptydy powinna być wklejona jako odwrotne uzupełnienie.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy podświetloną sekwencję i wybierz opcję Nowy obiekt.</li>
	<li>Dodaj opisową nazwę wstawionej sekwencji i naciśnij OK.</li>
	<li>Wybierz opcję Zapisz jako w menu Plik, aby zapisać zmodyfikowany plik.</li>
	<li>Zaprojektuj starter do przodu tak, aby zawierał ostatnie 30 nukleotydów odwrotnego dopełniacza sekwencji kodującej peptydy i dodaj sekwencję nukleotydową wiążącą plazmid (3'-GCGGCCGCCTGC-5') do jej końca 5'.</li>
	<li>Zaprojektuj odwrotny starter tak, aby zawierał pierwsze 30 nukleotydów odwrotnego dopełniacza sekwencji kodującej peptyd i dodaj sekwencję nukleotydową wiążącą plazmid (3'- CTTAAGTAATGTTTAACGAATTCGAG-5') do jej końca 5'.</li>
	<li>Ustawić reakcję PCR o objętości 20 μl w cienkościennej probówce do PCR, dodając odczynniki wymienione w tabeli 1.</li>
	<li>Przenieść probówkę do termocyklera i przeprowadzić PCR przy użyciu programu z początkową denaturacją w temperaturze 98 °C przez 30 s, 30 cyklami [15 s w 98 °C, 15 s w 60 °C i 3 min w 72 °C], końcowym przedłużeniem przez 2 minuty w temperaturze 72 °C i utrzymaniem w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić 5 μl reakcji PCR na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację produktu PCR o zawartości ~6 kb. 
	nuta: Jeśli nie zaobserwuje się żadnego produktu PCR, zoptymalizuj warunki PCR zgodnie z instrukcjami producenta. W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Dodać 1 μl DpnI do reakcji PCR i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C</li>
	<li>Przekształć kompetentną E. coli za pomocą 2 μl strawionej reakcji PCR z dpnI i umieść ją na płytkach bulionu lizogenicznego (LB)/Amp. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny pojedynczą kolonią. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. 
	nuta: Zaleca się przetestowanie co najmniej 6 kolonii.</li>
	<li>Przygotuj zapasy do zamrożenia 850 μl każdej kultury przez noc, dodając glicerol do końcowego stężenia 15% do kultury. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Ekstrahuj plazmidowe DNA z pozostałych 4 ml kultury za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA mini-prep.</li>
	<li>Potwierdź prawidłowe wprowadzenie sekwencji kodującej peptyd przez sekwencjonowanie DNA przy użyciu startera terminala T7 (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).</li>
</ol>
2. Generowanie biblioteki BirA
UWAGA: Początkowa biblioteka mutacji BirA (Rysunek 1c, krok 1) jest tworzona przez podatny na błędy PCR. Inne metody generowania biblioteki mutacyjnej BirA prawdopodobnie również będą działać.
<ol>
	<li>Zsyntetyzować zmutowane megaprimery ze starterami BirA-6xHis do przodu (ATGAAGGATAACACCGTGCC) i do tyłu (TCAATGATGATGATGATGTTT), używając 1 ng pBAD-BirA-eCPX z docelową sekwencją peptydową (przygotowaną i potwierdzoną w kroku 1.20) jako matrycą i 35 cyklami PCR z temperaturą wyżarzania 60 °C zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Przeprowadzić 5 μl reakcji amplifikacji na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić amplifikację produktu PCR o wartości 984 pz.</li>
	<li>Oczyść produkt PCR z pozostałych 45 μl reakcji amplifikacji za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR i użyj spektrofotometru do ilościowego określenia wydajności DNA. 
	nuta: Oczyszczanie z pojedynczej reakcji amplifikacji o pojemności 45 μl na ogół daje wystarczającą wydajność (>250 ng).</li>
	<li>Przygotować próbkę reakcji w cienkościennej probówce do PCR, dodając odczynniki wymienione w tabeli 2.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę reakcyjną do termocyklera i przeprowadzić PCR ze zmutowanymi megastarterami przygotowanymi w kroku 2.3, stosując następujące parametry: 1 min w temperaturze 95 °C i 25 cykli po 50 s w temperaturze 95 °C, 50 s w temperaturze 60 °C i 12 min w temperaturze 68 °C. Przechowywać reakcję w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1 μl enzymu restrykcyjnego DpnI bezpośrednio do reakcji amplifikacji i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę reakcyjną i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przekształć kompetentne komórki E. coli T7 Express lysY/Iq za pomocą 2 μl reakcji DpnI.</li>
	<li>Zaszczepić 100 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny przekształconymi komórkami i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Przygotować zapasy do zamrażania z 10 ml nocnej kultury w LB z 15% glicerolem i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Wybór bakterii wykazujących ekspresję biotynylowanego peptydu
UWAGA: Ta część protokołu obejmuje kroki 2-5 z Rysunek 1c. Zdecydowanie zaleca się, aby podejście selekcyjne było skonfigurowane przy użyciu pBAD-BirA-eCPX-AP i pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) jako kontroli dodatnich i negatywnych.
<ol>
	<li>Zaszczepić 100 ml LB zawierającego 1% glukozy i 100 μg/ml ampicyliny 1 ml biblioteki BirA i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml LB zawierającego 1% glukozy i 100 μg/ml ampicyliny 100 μl nocnej hodowli.</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny i 30 minut, aż kultura osiągnie OD600 około 0,5.</li>
	<li>Indukować ekspresję eCPX i BirA za pomocą 0,2% w/v L-arabinozy, 100 μM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i 100 μM biotyny i wstrząsać kulturą z prędkością 200 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować kulturę przez 10 minut przy 5 000 x g i usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego PBS i odwirować przy 5 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 400 μl lodowatego PBS i przechowywać komórki na lodzie.</li>
	<li>Usuń 10 μl zawieszonych komórek i przechowuj na lodzie w probówce o pojemności 1,5 ml oznaczonej "Wejście".</li>
	<li>Przemyć 20 μl kulek magnetycznych streptawidyny w 1 ml lodowatego PBS i umieścić probówkę w laboratoryjnym separatorze magnetycznym przed ostrożnym usunięciem supernatantu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić kulki magnetyczne streptawidyny w 20 μl lodowatego PBS i przenieść do 390 μl zawieszonych komórek z kroku 3.8.</li>
	<li>Wymieszać delikatnie pipetując, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Nie należy wirować, ponieważ może to spowodować lizę komórek. Agregacja kulek jest często obserwowana przy dużej liczebności bakterii wykazujących biotynylowany peptyd.</li>
	<li>Umieścić kolumnę z kulkami ferromagnetycznymi w magnetycznym separatorze cząstek i przemyć 5 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Przenieś komórki i kulki magnetyczne streptawidyny do kolumny przymocowanej w separatorze.</li>
	<li>Po opróżnieniu zbiornika kolumny dodać 500 μl lodowatego PBS i powtarzać, aż kolumna zostanie przemyta całkowitą objętością 5 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odpipetować 1 ml lodowatego PBS na kolumnę i wymyć magnetycznie znakowane komórki, nakładając tłok dostarczony z kolumną.</li>
	<li>Przenieś probówkę o pojemności 1,5 ml do separatora stołowego i umyj magnetycznie oznakowaną komórkę 1 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Delikatnie ponownie zawieś magnetycznie znakowane komórki w 1 ml lodowatego PBS przed wyjęciem i przechowywaniem 10 μl reprodukcji w probówce o pojemności 1,5 ml oznaczonej "Wyjście".</li>
	<li>Zaszczepić 100 ml LB zawierającego 1% glukozy i 100 μg/ml ampicyliny magnetycznie znakowanymi komórkami i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Następnego dnia użyj 10 ml kultury przez noc do przygotowania bulionu zamrażarskiego z komórkami w LB z 15% glicerolem i przechowuj w temperaturze -80 °C i 1 ml kultury przez noc do następnej rundy selekcji, tj. kroku 3.2. 
	nuta: Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się 3-5 rund selekcji w celu wzbogacenia bakterii wiążących streptawidynę.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja wzbogacenia
UWAGA: Kwantyfikacja żywych bakterii w próbkach "wejściowych" i "wyjściowych" jest przeprowadzana po każdej rundzie selekcji poprzez posiewanie seryjnych rozcieńczeń próbek i późniejsze liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU).
<ol>
	<li>Dodać 990 μl lodowatego PBS do próbek wejściowych (od kroku 3.8) i wyjściowych (od kroku 3.18) i oznaczyć probówki odpowiednio "Wejście 10-2" i "Wyjście 10-2".</li>
	<li>Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbek "Wejście 10-2" i "Wyjście 10-2" w lodowatym PBS, aż do osiągnięcia końcowego rozcieńczenia 10-10 w próbce wejściowej i 10-4 w próbce wyjściowej.</li>
	<li>Umieścić 100 μl próbek z "wejścia 10-6", "wejścia 10-8", "wejścia 10-10", "wyjścia 10-2", "wyjścia 10-3" i "wyjścia 10-4" na płytkach LB/Amp i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Policz liczbę kolonii na płytkach z wyraźnie oddzielonymi koloniami. Pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, aby uzyskać liczbę stężeń bakterii/100 μl.</li>
	<li>Obliczyć całkowitą liczbę bakterii w próbkach wejściowych i wyjściowych, mnożąc stężenie komórek odpowiednio przez objętość wejściową (400 μl) i wyjściową (1 ml), a następnie oszacuj wzbogacenie, dzieląc wynik wyjściowy przez liczbę komórek wejściowych. 
	nuta: Znaczne wzbogacenie powinno być widoczne po 3-5 rundach selekcyjnych</li>
</ol>
5. Charakterystyka wybranego wariantu BirA
UWAGA: Charakterystykę można przeprowadzić po wybraniu wariantów BirA z pierwszej biblioteki BirA; jednak warianty BirA zazwyczaj mają niską aktywność w stosunku do peptydu. W związku z tym przed charakterystyką można również przeprowadzić dodatkową rundę mutacji i selekcji. Zazwyczaj 10 klonów z ostatniej rundy selekcyjnej jest izolowanych w celu dalszej charakteryzacji.
<ol>
	<li>Zaszczepić 5 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny wybranymi klonami z ostatniej rundy selekcyjnej. Ponadto zaszczepić 5 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny T7 Express lysY/Iq E. coli przekształconym za pomocą pBAD-BirA-eCPX-AP, który zostanie wykorzystany jako kontrola pozytywna dla western blot opisanego poniżej.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Przygotuj zapasy do zamrożenia 850 μl każdej kultury przez noc, dodając glicerol do końcowego stężenia 15% do kultury. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny 100 μl nocnej hodowli i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 2 godziny.</li>
	<li>Wyodrębnij plazmidowe DNA z pozostałych 4 ml kultury za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA mini-prep. Wykonaj sekwencję DNA w kierunku do przodu i do tyłu wariantów BirA za pomocą starterów pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) i pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG).</li>
	<li>Dodać 0,2% w/v L-arabinozy i 100 μM IPTG oraz 100 μM biotyny do kultur z kroku 5.4 i wstrząsać kulturą z prędkością 200 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu wywołania ekspresji wariantów eCPX i BirA.</li>
	<li>Przenieść 65 μl kultury do probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 25 μl buforu ładującego próbkę i 10 μl środka redukującego.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Załadować próbkę (łącznie z kontrolą dodatnią) na 12% żel poliakryloamidowy SDS wraz ze znacznikiem wielkości i przeprowadzić elektroforezę żelową pod napięciem 200 V przez około 45 minut, aż do wyraźnego rozdzielenia standardowych pasm 20, 25 i 37 kDa.</li>
	<li>Uwolnij żel z kasety i zmontuj kanapkę do osuszania żelu na membranie PVDF.</li>
	<li>Elektroblot przy 35 V przez 2 godziny na lodzie.</li>
	<li>Usunąć membranę PVDF i inkubować w buforze blokującym [PBS, 0,05% Tween-20, 3% odtłuszczone mleko w proszku] przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wstrząsaniem.</li>
	<li>Przygotować roztwór do wykrywania biotyny, rozcieńczając streptawidynę-HRP w stosunku 1:1000 w PBST. 
	nuta: Bufor blokujący zawiera biotynę i dlatego nie powinien być stosowany jako bufor rozcieńczający streptawidynę-HRP.</li>
	<li>Odrzucić bufor blokujący, szybko przemyć membranę w PBST [PBS, 0,05% Tween-20] i dodać roztwór do wykrywania biotyny. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór do wykrywania biotyny i dokładnie umyj membranę w PBST przez 5 minut dwa razy i 10 minut raz, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzuć PBST, dodaj 2 ml mieszanki ECL i inkubuj przez 1 minutę z wytrząsaniem.</li>
	<li>Szybko wysuszyć membranę na bibułce i wywołać obraz na kliszy rentgenowskiej lub w cyfrowym systemie obrazowania żelowego. 
	nuta: Na torze obciążonym kontrolą pozytywną powinny być wyraźnie widoczne dwa wyraźne prążki reakcji streptawidyny: biotynylowane białko endogennie eksprymowane o masie 30 kDa i pasmo eCXP-AP o masywie ~22 kDa. Jeśli 10 wybranych kolonii może biotynylować wyświetlany peptyd, powinno być widoczne pasmo o wartości ~22 kDa. Intensywność tych pasm jest na ogół niższa niż w przypadku kontroli dodatniej i w związku z tym może wymagać dłuższych czasów ekspozycji. </li>
</ol>

<ol><li>Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+selective+inhibition+of+bacterial+acetyl-CoA+carboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).</li>
<li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Peptide+Libraries+to+Map+the+Substrate+Specificity+of+a+Peptide-Modifying+Enzyme%3A+A+13+Residue+Consensus+Peptide+Specifies+Biotinylation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li>
<li>de Boer, E., Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li>
<li>Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+biotinylation+of+cell+surface+receptors+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging.</a> Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).</li>
<li>Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+quantum+dots+to+surface+proteins+in+living+cells+with+biotin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).</li>
<li>Michael Green, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Avidin-Biotin+Technology%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Fujita, S., Taki, T., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+Active+Enzyme+by+Phage+Display+on+the+Basis+of+the+Enzyme%27s+Catalytic+Activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo.</a> ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).</li>
<li>Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+biotin+protein+ligase+by+phage+display+using+a+combination+of+in+vitro+selection+and+in+vivo+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).</li>
<li>Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+display+system+for+effective+selection+of+protein-biotin+ligase+BirA+variants+with+novel+peptide+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4118(2019).</li>
<li>Rice, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+display+using+circularly+permuted+outer+membrane+protein+OmpX+yields+high+affinity+peptide+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands.</a> Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).</li>
<li>Rice, J. J., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+biterminal+bacterial+display+scaffold+enhances+the+display+of+diverse+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides.</a> Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).</li>
<li>Stothard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+manipulation+suite%3A+JavaScript+programs+for+analyzing+and+formatting+protein+and+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences.</a> BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jeśli chodzi o wszystkie metody selekcji, ogromne znaczenie ma surowość etapów prania. Ponieważ bakterie nie muszą być eluowane z kulek przed amplifikacją wybranych klonów, do wyboru wariantów BirA 7,8 można zastosować wiązanie o wysokim powinowactwie między biotyną a streptawidyną, zamiast stosowania awidyn o niższym powinowactwie, jak to wcześniej robiono w systemie wyświetlania fagów. Gwarantuje to, że rzadkie klony są wybierane, a niebiotynylowane bakterie są...

Biotynylacja białka tworzy potężny znacznik do jego izolacji i wykrywania powinowactwa. Biotynylacja enzymatyczna białek jest wysoce specyficzną modyfikacją potranslacyjną katalizowaną przez ligazy biotynowo-białkowe. Ligaza białka biotyny E. coli BirA jest niezwykle specyficzna i kowalencyjnie biotynyluje tylko ograniczoną liczbę naturalnie występujących białek przy określonych resztach lizyny1. Zalety katalizowanej biotynylacji BirA są obecnie wykorzystywane poprzez fuzję białka docelowego z małym syntetycznym 15-aminokwasowym peptydem akceptorowym biotyny (AP), który jest skutecznie biotynylowany2 i pozwala na wysoce specyficzną i wydajną biotynylację in vivo i in vitro poprzez koekspresję lub dodanie BirA3,4,5. Chociaż katalizowana in vivo i in vitro ligacja białkiem biotyny z BirA jest atrakcyjną strategią znakowania, jej zastosowanie ogranicza się do próbek zawierających białka skondensowane z AP. Celem tej metody jest opracowanie nowych mutantów ligaz biotynowo-białkowych, które selektywnie biotynylują natywne niemodyfikowane białka, a tym samym rozszerzają liczbę zastosowań, w których można zastosować strategię biotynylacji enzymatycznej.
Funkcja białka może być rozwijana poprzez iteracyjne rundy mutacji genu, selekcji i amplifikacji wariantów genów o pożądanej funkcji. Silna i skuteczna strategia selekcji ma kluczowe znaczenie dla ukierunkowanej ewolucji, a aktywność ligazy biotynowo-białkowej jest łatwo selekcjonowana ze względu na silne wiązanie między biotyną a streptawidyną i jej homologami6. Technologie wyświetlania fagów pozwalają na wybór fagów, które wyświetlają biotynylowane peptydy7,8. Ponieważ jednak amplifikacja izolowanych fagów wymaga zakażenia gospodarza bakteryjnego, selekcja fagów za pomocą streptawidyny tworzy wąskie gardło, ponieważ wiązanie biotyny ze streptawidyną o wysokim powinowactwie jest praktycznie nieodwracalne w warunkach niedenaturacyjnych. Aby zapewnić odwracalne wiązanie biotynylowanych fagów, zastosowano monomeryczne awidyny o niższym powinowactwie, co spowodowało skromne ~10-krotne wzbogacenie7. Niedawno opracowaliśmy metodę ekspozycji bakteryjnej do izolacji nowych wariantów BirA, która eliminuje potrzebę elucji z matrycy powinowactwa, a tym samym usuwa wąskie gardło z poprzednich systemów selekcji BirA9. Rzeczywiście, nasz bakteryjny system wyświetlania pozwala na >1 000 000-krotne wzbogacenie aktywnych klonów w jednym kroku selekcji9, zapewniając w ten sposób skuteczny system selekcji dla ukierunkowanej ewolucji nowych wariantów BirA.
Nasz bakteryjny system wyświetlania składa się z dwóch komponentów, BirA z C-końcowym znacznikiem 6xHis oraz białka rusztowania, które pozwala na wyświetlanie na powierzchni docelowego peptydu. Użyliśmy białka X z permutowaną koliście permutowaną błoną zewnętrzną wzmocnionego białkiem rusztowania (eCPX), ponieważ skuteczne wyświetlanie peptydów można zaobserwować zarówno na N, jak i C-końca<ch klasy sup = "xref">10,< klasa sup = "xref">11. Fuzja docelowej sekwencji peptydowej z C-końcem eCPX zapewnia biotynylację bakterii wykazujących ekspresję aktywnych wariantów BirA. Bakterie pozwalają na efektywną selekcję streptawidyny, ponieważ biotynylowany peptyd jest teraz wyświetlany na powierzchni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1a).
Celem tej metody jest wybranie nowych wariantów BirA, które biotynylują sekwencje peptydowe obecne w natywnych białkach. System jest kodowany przez geny obecne na plazmidzie pBAD-BirA-eCPX-AP, który zawiera indukowany arabinozą promotor kontrolujący BirA (araBAD) i promotor T7 kontrolujący eCPX9 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b). Niniejszy protokół opisuje szczegółową procedurę 1) włączenia peptydu pochodzącego z białka docelowego do C-terminala eCPX, 2) stworzenia biblioteki mutacyjnej BirA przez podatny na błędy PCR, 3) selekcji bakterii wiążących streptawidynę przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie (MACS), 4) kwantyfikacji wzbogacenia bakterii oraz 5) wstępnej charakterystyki izolowanych klonów.

<table><tbody><tr><td>10% prefabrykowany żel poliakrylamidowy</td><td>Bio-Rad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>ApE - Edytor plazmidów v2.0</td><td>NA</td><td>NA</td><td>pobrane z http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x), bez wapnia, bez magnezu</td> Enzym restrykcyjny <td>ThermoFischer Scientific</td><td>14200083</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptawidyna C1</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>GenElute Plasmid Miniprep</td><td>Kit Sigma-Aldrich</td><td>PLN350 PLN350</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mutagenensji GeneMorph II EZClone</td><td>Domain Agilent Technologies</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH15150</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Kompetentny E. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C2987</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor do próbek (4x)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Środek redukujący próbki (10x)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>pBAD-BirA-eCPX-AP</td><td>Addgene</td><td>121907</td><td>Użyto matrycy i kontroli pozytywnej</td></tr><tr><td>pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)</td><td>Addgene</td><td>121908</td><td>kontroli ujemnej</td></tr><tr><td>Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491</td><td>Do insercji sekwencji peptydowej w pBAD-BirA-eCPX-AP wystarczy dowolna polimeraza o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone Proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>Agilent Technologies</td><td>P0397</td><td></td></tr><tr><td>T7 Express lysY/IQ Kompetentny E. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3013</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Millipore</td><td>T9410</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL103001EA</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotyna to atrakcyjna potranslacyjna modyfikacja białek, która dostarcza potężnego znacznika do izolacji i wykrywania białka. Biotynylacja enzymatyczna przez ligazę białka biotyny E. coli BirA jest wysoce specyficzna i pozwala na biotynylację białek docelowych w ich naturalnym środowisku; jednak obecne zastosowanie biotynylacji za pośrednictwem BirA wymaga obecności syntetycznego peptydu akceptorowego (AP) w białku docelowym. Dlatego jego zastosowanie jest ograniczone do białek, które zostały zaprojektowane tak, aby zawierały AP. Celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie bakteryjnego wyświetlacza peptydu pochodzącego z niezmodyfikowanego białka docelowego do selekcji wariantów BirA, które biotynylują peptyd. System oparty jest na pojedynczym plazmidzie, który pozwala na koekspresję wariantów BirA wraz z rusztowaniem do wyświetlania peptydu na powierzchni bakterii. Protokół opisuje szczegółową procedurę włączenia docelowego peptydu do rusztowania wyświetlacza, stworzenia biblioteki BirA, wyboru aktywnych wariantów BirA i wstępnej charakterystyki izolowanych wariantów BirA. Metoda ta zapewnia wysoce skuteczny system selekcji do izolacji nowych wariantów BirA, który może być wykorzystany do dalszej ukierunkowanej ewolucji ligaz biotynowo-białkowych, które biotynylują natywne białko w złożonych roztworach.

Western blot bakterii ekspresyjnych pBAD-BirA-eCPX-AP wykazuje pasmo reagujące ze streptawidyną o masie ~22 kDa, zgodne z masą cząsteczkową eCPX (Rycina 2a). W przeciwieństwie do BirA-6xHis, biotynylowany eCPX-AP występował zarówno w kulturach nieindukowanych, jak i indukowanych (Rycina 2a) z powodu niewielkiej aktywności promotora T7 nawet w kulturach nieindukowanych oraz późniejszej biotynylacji AP przez endogenną BirA. W kult...

Tutaj prezentujemy metodę selekcji nowych wariantów ligazy białkowej biotyny E. coli BirA, która biotynyluje określony peptyd docelowy. Protokół opisuje budowę plazmidu do bakteryjnego wyświetlania docelowego peptydu, generowanie biblioteki BirA, selekcję i charakterystykę wariantów BirA.

Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...

Protokół ten zapewnia wysoce skuteczny bakteryjny system wyświetlania do izolacji nowych wariantów BirA, który pozwala na specyficzną biotynylację natywnych białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że selekcjonuje ona warianty BirA za pomocą selekcji streptawidyny o wysokim powinowactwie. Gwarantuje to, że nieaktywne klony są usuwane, tworząc w ten sposób wysoce wydajny proces selekcji.Aby rozpocząć, w edytorze plazmidów, zaprojektuj starter do przodu tak, aby zawierał ostatnie 30 nukleotydów odwrotnego dopełniacza sekwencji kodującej peptydy i dodaj sekwencję nukleotydową wiążącą plazmid do jej pięciopierwszego końca. Zaprojektuj starter odwrotny tak, aby zawierał pierwsze 30 nukleotydów odwrotnego dopełniacza sekwencji kodującej peptydy i dodaj sekwencję nukleotydową wiążącą plazmid do jej pięciopierwszego końca. Następnie, aby uruchomić 20-mikrolitrową reakcję PCR, dodaj odczynniki do cienkościennej probówki PCR.Przenieś probówkę do termocyklera i wykonaj PCR zgodnie z rękopisem. Następnie uruchom pięć mikrolitrów reakcji PCR na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację sześciokilozasadowego produktu PCR i postępuj zgodnie z manuskryptem. Teraz, aby zsyntetyzować zmuto

bacterial-peptide-display-for-selection-novel-biotinylating

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

AVEXIS to wysokoprzepustowy test interakcji białkowych opracowany w celu systematycznego przesiewania nowych zewnątrzkomórkowych par receptor-ligand zaangażowanych w procesy rozpoznawania komórkowego. Został on zaprojektowany specjalnie do wykrywania przejściowych interakcji białkowych, które są trudne do zidentyfikowania przy użyciu innych metod wysokoprzepustowych.

Przesiewowe badanie oddziaływań pozakomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) w celu skalowalnej detekcji słabych oddziaływań między pozakomórkowymi receptorami a ligandami

W tym filmie demonstrujemy technikę wyświetlania fagów w celu wyizolowania wstępnie zaprojektowanych fagów wyrażających białka o wysokim powinowactwie do docelowego białka.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do wyboru białek o wysokim powinowactwie do białka docelowego

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Rozwój biotynylowalnych białek fuzyjnych ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych dziedzinach badań. Inżynieria białek rekombinowanych to prosta procedura, która jest opłacalna, zapewniając wysoką wydajność niestandardowych białek.

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Oferujemy metodę jednoczesnego badania biblioteki fragmentów przeciwciał pod kątem powinowactwa wiązania i rozpuszczalności cytoplazmatycznej za pomocą szlaku translokacji podwójnej argininy Escherichia coli, który ma nieodłączny mechanizm kontroli jakości dla wewnątrzkomórkowego fałdowania białek, w celu wyświetlenia fragmentów przeciwciała na wewnętrznej błonie.

Bakteryjny wyświetlacz błony wewnętrznej do badania przesiewowego biblioteki fragmentów przeciwciał

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

W tym badaniu ustalamy szczegółowy protokół znakowania zbliżeniowego (PL) opartego na TurboID w jajniku D. melanogaster, obejmujący etapy od suplementacji biotyną i rozwarstwienia jajników do walidacji ekspresji transgenu i wzbogacenia biotynylowanych peptydów do spektrometrii mas.

In vivo (in vivo) Zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na TurboID u Drosophila melanogaster

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj metodę wyświetlania bakteryjnego do izolacji nowych wariantów ligazy biotynowo-białkowejj BirA z E. coli. Technika umożliwia specyficzną biotynylację białek natywnych dzięki selekcji z użyciem streptawidyny o wysokim powinowactwie.

Wyświetlacz peptydów bakteryjnych do wyboru nowych enzymów biotynylujących

Przeglądaj więcej filmów