Name: Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzyludzkich za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę hodowli biofilmów międzyludzkich Candida albicans i Streptococcus mutans oraz monitorowania pH zewnątrzkomórkowego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie gradientów pH w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Anette Aakjær Thomsen i Javier E. Garcia są doceniani za doskonałe wsparcie techniczne. Autorzy dziękują Rubensowi Spin-Neto za owocne dyskusje na temat analizy obrazu.

Protokół pobierania śliny został sprawdzony i zatwierdzony przez Komisję Etyki Hrabstwa Aarhus (M-20100032).
1. Uprawa biofilmów między królestwami
<ol>
	<li>Uprawiaj S. mutans DSM 20523 i C. albicans NCPF 3179 na płytkach z agarem z krwią w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych.</li>
	<li>Przenieś pojedyncze kolonie każdego organizmu do probówek wypełnionych 5 ml naparu z mózgu, serca (BHI). Rosnąć przez 18 godzin w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować nocne kultury przy 1 200 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w soli fizjologicznej i dostosować OD550 nm do 0,5 dla C. albicans (~107 komórek/ml) i S. mutans (~108 komórek/ml). Rozcieńczyć zawiesinę S. mutans w stosunku 1:10 sterylną solą fizjologiczną (~107 komórek/ml).</li>
	<li>Odpipetować 50 μl sterylnego roztworu śliny, przygotowanego zgodnie z metodą de Jong et al.19, do studzienek 96-dołkowej płytki optycznej w celu mikroskopii. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć studzienki 3x 100 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Opróżnij studnie.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawiesiny C. albicans do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 min. Przemyć 3x sterylnym roztworem soli fizjologicznej. 
	UWAGA: Nie opróżniaj całkowicie studzienek podczas mycia. Pozostaw zbiornik o pojemności 20 μl, aby uniknąć nadmiernych sił ścinających.</li>
	<li>Dodać 100 μl inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (inaktywowanej w temperaturze 56 °C przez 30 min) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Przemyć 3x sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Opróżnij studzienki, pozostawiając zbiornik o pojemności 20 μl.</li>
	<li>Dodać 100 μl zawiesiny S. mutans (przygotowanej w kroku 1.3) do każdej studzienki. Dodać 150 μl BHI zawierającego 5% sacharozy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny lub dłużej. W przypadku uprawy starszych biofilmów należy codziennie zmieniać podłoże na świeże BHI. Pod koniec fazy wzrostu biofilmu między królestwami przemyj 5x sterylną solą fizjologiczną.</li>
</ol>
2. Ratiometryczne obrazowanie pH
UWAGA:Obrazowanie ratiometryczne pH musi być wykonane natychmiast po zakończeniu wzrostu biofilmu.
<ol>
	<li>Do ratiometrycznego obrazowania pH należy użyć odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z 63-krotną soczewką zanurzeniową w oleju lub wodzie, linią laserową 543 nm i systemem obrazowania spektralnego (tj. detektorem META), aby umożliwić obrazowanie nakładających się sygnałów fluorescencyjnych. Za pomocą inkubatora ogrzać stolik mikroskopu do temperatury 35 °C.</li>
	<li>Ustaw detektor tak, aby zapewniał detekcję zielonej fluorescencji od 576−608 nm i jednoczesną detekcję czerwonej fluorescencji od 629−661 nm. Wybierz odpowiednią moc i wzmocnienie lasera, aby uniknąć prześwietlenia i niedoświetlenia. 
	UWAGA: Ekspozycja obrazów jest najlepiej widoczna na obrazach z paletą z fałszywym kolorowaniem.</li>
	<li>Ustaw rozmiar otworka na 1 jednostkę Airy lub plasterek optyczny ~0,8 μm. Ustaw rozmiar obrazu na 512 x 512 pikseli, a szybkość skanowania na 2. Wybierz średnią liniową z liczby 2, używając opcji średniej. 
	UWAGA: Na początku serii eksperymentów sprawdź, czy wybrane ustawienia mikroskopu zapewniają wyraźny kontrast między komórkami bakteryjnymi, ścianami komórkowymi grzybów, matrycą biofilmu i cytoplazmą grzyba.</li>
	<li>Przygotować 100 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej zawierającego 0,4% (w/v) glukozy, miareczkowanego do pH 7. Przygotować roztwór podstawowy C-SNARF-4 (1 mM w dimetylosulfotlenku). Dodać barwnik do końcowego stężenia 30 μM. 
	UWAGA: Podczas pracy z barwnikiem ratiometrycznym należy nosić rękawice nitrylowe.</li>
	<li>Opróżnij jedną ze studzienek biofilmem międzykrólestwowym, pozostawiając zbiornik o pojemności 20 μl. Dodać sterylną sól fizjologiczną zawierającą glukozę i barwnik ratiometryczny. Umieść 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie biofilmu.</li>
	<li>Pozyskiwanie pojedynczych obrazów lub stosów Z w różnych miejscach biofilmu. Zaznacz pozycję X-Y w oprogramowaniu mikroskopu, aby śledzić zmiany pH w określonych polach widzenia w czasie. W regularnych odstępach czasu rób zdjęcia z wyłączonym laserem, aby skorygować przesunięcie detektora.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.4–2.6 dla analizy każdego biofilmu wyhodowanego w innym dołku.</li>
</ol>
3. Kalibracja barwnika ratiometrycznego
UWAGA: Kalibracja barwnika i dopasowanie krzywej kalibracyjnej mogą być wykonane w innym dniu niż obrazowanie ratiometryczne pH.
<ol>
	<li>Przygotować serię 50 mM buforu kwasu 2-morfolinoetanosulfonowego (MES) miareczkowanego do pH 4,0−7,8 w krokach co 0,2 jednostki pH w temperaturze 35 °C. Odpipetować 150 μl każdego roztworu buforowego do studzienek 96-dołkowej płytki z dnem optycznym do mikroskopii.</li>
	<li>Dodać barwnik do wypełnionych buforem studzienek 96-dołkowej płytki do końcowego stężenia 30 μM. Pozostaw do równowagi przez 5 minut.</li>
	<li>Podgrzej stolik mikroskopu do temperatury 35 °C. Wybierz te same ustawienia mikroskopu, co w przypadku ratiometrycznego obrazowania pH. Umieść 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu. Skoncentruj się na dnie studni. Uzyskaj dwa obrazy (kanał zielony i czerwony) dla wszystkich roztworów buforowych, 5 μm powyżej dna studni. W regularnych odstępach czasu rób zdjęcia z wyłączonym laserem, aby skorygować przesunięcie detektora.</li>
	<li>Przeprowadzić eksperyment kalibracyjny w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Eksportuj wszystkie obrazy jako pliki TIF. Zaimportuj je do dedykowanego oprogramowania do analizy obrazów (np. ImageJ20). Odejmij obrazy wykonane przy wyłączonym laserze od odpowiednich obrazów roztworów buforowych, klikając przycisk Process (Proces) | Kalkulator obrazów | Odejmowanie). 
	UWAGA: W razie potrzeby przytnij obrazy, aby wyeliminować artefakty na obramowaniach obrazu, wykonując prostokątne zaznaczenie za pomocą opcji Obraz | Przyciąć.</li>
	<li>Podziel obrazy kanału zielonego na obrazy kanału czerwonego i oblicz średnią intensywność fluorescencji na wynikowych obrazach, klikając przycisk Analizuj | Histogram.</li>
	<li>Na podstawie potrójnych doświadczeń wykreśl średnie proporcje koloru zielonego i czerwonego w stosunku do pH. Użyj dedykowanego oprogramowania, aby dopasować funkcję do danych kalibracyjnych (np. MyCurveFit).</li>
</ol>
4. Cyfrowa analiza obrazu
UWAGA:Cyfrowa analiza obrazu może być przeprowadzona w dowolnym momencie po kalibracji barwnika i ratiometrycznym obrazowaniu pH.
<ol>
	<li>Przechowuj obrazy biofilmu kanału zielonego i czerwonego w osobnych folderach i zmień nazwy obu serii plików na kolejne numery (np. GREEN_0001). Zaimportuj obrazy do dedykowanego oprogramowania do analizy obrazów (np. ImageJ). Kliknij pozycję Analizuj | Histogram, aby określić średnią intensywność fluorescencji na zdjęciach wykonanych przy wyłączonym laserze i odjąć wartość od obrazów biofilmu, klikając przycisk Process | Matematyka | Odejmować.</li>
	<li>Zaimportuj 2 serie obrazów do dedykowanego oprogramowania do analizy obrazów (np. daime21). Wykonaj segmentację obrazów kanału czerwonego na podstawie progów (Segment | Automatyczna segmentacja | Próg niestandardowy). Ustaw "niski" próg powyżej intensywności fluorescencji cytoplazmy grzyba, a "wysoki" próg poniżej intensywności ścian komórkowych grzyba i bakterii. 
	UWAGA: Po wybraniu odpowiednich progów tylko obszary zewnątrzkomórkowe są rozpoznawane jako obiekty.</li>
	<li>Przenieś warstwę obiektów z serii obrazów podzielonych na segmenty do serii obrazów z kanałem zielonym. Aby to zrobić, kliknij Segment | Przenieś warstwę obiektu. 
	UWAGA: Jeśli kontrast między obszarami zewnątrzkomórkowymi a cytoplazmą grzyba jest zbyt słaby w poszczególnych kanałach kolorów, dodaj serię obrazów kanału zielonego do serii kanałów czerwonych przed segmentacją, klikając Edytuj | Kalkulator obrazów | Dodatek. Wykonaj segmentację zgodnie z opisem w punkcie 4.2 i przenieś warstwę obiektów serii obrazów podzielonych na segmenty zarówno do serii obrazów kanału zielonego, jak i czerwonego.</li>
	<li>Użyj edytora obiektów, aby usunąć piksele niebędące obiektami z serii obrazów kanału czerwonego i zielonego (Visualizer | Edytor obiektów | Na wszystkich zdjęciach | Usuń piksele niebędące obiektami). Teraz obrazy biofilmu są usuwane zarówno z komórek bakteryjnych, jak i grzybiczych. Eksportuj przetworzone serie obrazów jako pliki TIF.</li>
	<li>Zaimportuj obie serie obrazów do ImageJ. ImageJ przypisuje intensywność 0 do wszystkich pikseli niebędących obiektami. Usuń te piksele, dzieląc czerwoną serię obrazów (R1) przez siebie (Process | Kalkulator obrazów | Obraz 1: R1; Operacja: Podziel; Rysunek 2: R1) i pomnożąc wynikową serię obrazów (R2) przez oryginalną czerwoną serię obrazów (Process | Kalkulator obrazów | Obraz 1: R1; Operacja: Mnożenie; Obraz 2: R2). Powstaje trzecia seria obrazów (R3), identyczna z R1, z wyjątkiem tego, że NaN jest przypisane do wszystkich pikseli o intensywności 0 w R1. Postępuj w ten sam sposób z serią zielonych obrazów.</li>
	<li>Użyj filtru "Średnia" (punkt menu Proces | Filtry | Średnia | Promień | 1 piksel) na serii obrazów kanału czerwonego i zielonego, aby skompensować szumy detektora. Podziel serię obrazów kanału zielonego przez serię obrazów kanału czerwonego (punkt menu Process | Kalkulator obrazów | Obraz 1: G3; Operacja: Podziel; Zdjęcie 2: R3). Wynikowa seria obrazów (G3/R3) pokazuje stosunek koloru zielonego/czerwonego dla wszystkich pikseli obiektu.</li>
	<li>Obliczanie średniego współczynnika dla każdego obrazu (Analizuj | Histogram). Zastosuj fałszywe kolorowanie, aby uzyskać lepszą wizualną reprezentację proporcji na obrazach (punkt menu Obraz | Tabele przeglądowe). Przeliczyć stosunek koloru zielonego/czerwonego na wartości pH, stosując funkcję zamontowaną w ppkt 3.6.</li>
</ol>

<ol><li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungi+in+endodontic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surgery%2C+Oral+Medicine%2C+Oral+Pathology%2C+Oral+Radiology%2C+and+Endodontics%22%5BJournal%5D)">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li>
<li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527(2019).</li>
<li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Iberoamericana+De+Micologia%22%5BJournal%5D)">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li>
<li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+%CE%BC-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li>
<li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967(2009).</li>
<li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Caries+Research%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li>
<li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li>
<li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407(2017).</li>
<li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exopolysaccharide+matrix%3A+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li>
<li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622(2016).</li>
<li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li>
<li>Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li>
<li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li>
<li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li>
<li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li>
<li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities%3A+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environmental+Science%22%5BJournal%5D)">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li>
<li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daime%2C+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li>
<li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457(2016).</li>
<li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li>
<li>Krzyściak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242(2017).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920(2017).</li>
<li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li>
<li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li>
<li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li>
<li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299(2011).</li>
<li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries%3A+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics%2C+Metatranscriptomics%2C+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).</li>
<li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini+review%3A+convection+around+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li>
<li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Flow+disrupts+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Różne protokoły hodowli międzykrólestwowych biofilmów z udziałem C. albicans i Streptococcus spp. zostały opisane wcześniej 9,22,23,24,25. Jednak obecna konfiguracja koncentruje się na prostych warunkach wzrostu, harmonogramie zgodnym z regularnymi dniami roboczymi, zrównoważonym składzie gatunkowym i rozwoju obszernej matrycy biofil...

Biofilmy między królestwami, zawierające zarówno gatunki grzybów, jak i bakterii, są zaangażowane w kilka stanów patologicznych w jamie ustnej. Candida spp. były często izolowane od zakażeń endodontycznych1 oraz od zmian w przyzębiu2,3. Wykazano, że w infekcjach błony śluzowej gatunki paciorkowców z grupy mitis zwiększają tworzenie biofilmu grzybów, inwazję tkanek i rozprzestrzenianie się zarówno w modelach in vitro, jak i mysich4,5,6,7. Co najciekawsze, udowodniono, że doustne nosicielstwo Candida spp. jest związane z występowaniem próchnicy u dzieci8. Jak wykazano w modelach gryzoni, symbiotyczny związek między Streptococcus mutans i Candidas albicans zwiększa produkcję zewnątrzkomórkowych polisacharydów i prowadzi do powstawania grubszych i bardziej próchnicotwórczych biofilmów9,10.
We wszystkich wyżej wymienionych warunkach, w szczególności w próchnicy we wczesnym dzieciństwie, pH biofilmu ma znaczenie dla postępu choroby, a wybitna rola matrycy biofilmu w rozwoju mikrośrodowisk kwasotwórczych11 wymaga metodologii, które pozwalają badać zmiany pH wewnątrz biofilmów między królestwami. Opracowano proste i dokładne podejścia oparte na mikroskopii konfokalnej do monitorowania pH w biofilmach bakteryjnych12 i fungal13. Dzięki barwnikowi ratiometrycznemu C-SNARF-4 i procesowi końcowemu obrazu opartemu na progach, zewnątrzkomórkowe pH można określić w czasie rzeczywistym we wszystkich trzech wymiarach biofilmu14. W porównaniu z innymi opublikowanymi technikami monitorowania pH biofilmów na podstawie mikroskopii, ratiometria pH z C-SNARF-4 jest prosta i tania, ponieważ nie wymaga syntezy cząstek lub związków, które zawierają referencyjny barwnik 15 ani stosowania wzbudzenia dwufotonowego16. Użycie tylko jednego barwnika zapobiega problemom z komoracją sondy, fluorescencyjnym przebijaniem i selektywnym wybielaniem16,17,18, jednocześnie umożliwiając niezawodne różnicowanie między wewnątrz- i zewnątrzkomórkowym pH. Wreszcie inkubacja z barwnikiem odbywa się po wzroście biofilmu, co pozwala na badanie zarówno biofilmów laboratoryjnych, jak i hodowanych in situ.
Celem obecnej pracy jest rozszerzenie zastosowania ratiometrii pH i dostarczenie metody badania zmian pH w biofilmach między królestwami. Jako dowód słuszności koncepcji, metodę tę stosuje się do monitorowania pH w dwugatunkowych biofilmach składających się z S. mutans i C. albicans narażonych na działanie glukozy.

<table><tbody><tr><td>Płytki z agarem do krwi</td><td>Statens Serum Institut</td><td>677</td><td></td></tr><tr><td>Napar z mózgu na serce</td><td>Oxoid</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Napar z serca mózgu + 5 % sacharozy</td><td>Materiały laboratoryjne BDH</td><td>10274</td><td></td></tr><tr><td>Candida albicans</td><td>Narodowa Kolekcja Grzybów Chorobotwórczych</td><td>NCPF 3179</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>daime: cyfrowa analiza obrazu w ekologii mikrobiologicznej</td><td>Universit&auml; t Wien</td><td>N/A Freeware</td><td>; Wersja 2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco Life technologies</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem GS-6R</td><td>Beckman</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>Nie dotyczy</td><td>darmowego oprogramowania; Wersja 1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>Java</td><td>Oracle</td><td>N/A Freeware</td><td>niezbędne do uruchomienia ImageJ; Wersja 8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td></tr><tr><td>&micro;-Płytka 96 Well Black</td><td>Ibidi</td><td>89626</td><td></td></tr><tr><td>MyCurveFit</td><td>MyAssays Ltd.</td>Bufor <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES)</td><td>Bioworld</td><td>700728</td><td></td></tr><tr><td>PHM210 pH-metr</td><td>Radiometr Analityczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63-krotny obiektyw zanurzeniowy w oleju</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>NA=1,4</td></tr><tr><td>SNARF&reg;-4F Kwas 5-(i-6)-karboksylowy Life</td><td>Technologies</td><td>S23920</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>VWR</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus mutans</td><td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td><td>DSM 20523</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr VWR V-3000PC</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XL Inkubator</td><td>PeCON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 META</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie ph zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzyludzkich za pomocą mikroskopii konfokalnej

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Biofilmy między królestwami, składające się zarówno z komórek grzybowych, jak i bakteryjnych, są zaangażowane w różne choroby jamy ustnej, takie jak infekcje endodontyczne, zapalenie przyzębia, infekcje błony śluzowej i, przede wszystkim, próchnica we wczesnym dzieciństwie. We wszystkich tych warunkach pH w matrycy biofilmu wpływa na interakcje między drobnoustrojami a gospodarzem, a tym samym na postęp choroby. Niniejszy protokół opisuje metodę opartą na mikroskopii konfokalnej do monitorowania dynamiki pH wewnątrz biofilmów między królestwami, w tym Candida albicans i Streptococcus mutans. Widmo podwójnej emisji zależne od pH i właściwości barwiące sondy ratiometrycznej C-SNARF-4 są wykorzystywane do określania spadków pH w zewnątrzkomórkowych obszarach biofilmów. Zastosowanie ratiometrii pH z sondą wymaga skrupulatnego doboru parametrów obrazowania, dokładnej kalibracji barwnika oraz starannego, opartego na progach przetwarzania końcowego danych obrazu. Przy prawidłowym zastosowaniu technika ta pozwala na szybką ocenę pH zewnątrzkomórkowego w różnych obszarach biofilmu, a tym samym na monitorowanie zarówno poziomych, jak i pionowych gradientów pH w czasie. Podczas gdy zastosowanie mikroskopii konfokalnej ogranicza profilowanie Z do cienkich biofilmów o wielkości 75 μm lub mniejszej, zastosowanie ratiometrii pH idealnie nadaje się do nieinwazyjnego badania ważnego czynnika wirulencji w biofilmach między królestwami.

Po 24 h i 48 h w płytkach wielodobowych rozwinęły się stabilne biofilmy międzykrólestwa. C. albicans wykazywał różny stopień wzrostu nitkowatego, a S. mutans tworzył gęste skupiska o wysokości do 35 µm. Pojedyncze komórki i łańcuchy S. mutans grupowały się wokół strzępek grzybowych, a duże przestrzenie międzykomórkowe wskazywały na obecność objętościowej macierzy (Rycina S1).
Kalibracja barwnika ratiometrycznego daje niesymetryczną krzywą sigmoidalną...

Protokół opisuje hodowlę międzykrólestwowych biofilmów składających się z Candida albicans i Streptococcus mutans oraz przedstawia metodę opartą na mikroskopii konfokalnej do monitorowania pH zewnątrzkomórkowego wewnątrz tych biofilmów.

Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzyludzkich za pomocą mikroskopii konfokalnej

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

W protokole przedstawiono łatwą do wykonania metodę hodowli międzykrólestwowych biofilmów składających się z StreptococcuS. mutans i Candida albicans. Późniejsza proporcjometria pH oparta na mikroskopii konfokalnej pozwala na dokładne monitorowanie zmian pH wewnątrz macierzy zewnątrzkomórkowej tych biofilmów.Staranny dobór parametrów akwizycji obrazu ma ogromne znaczenie dla uzyskania danych obrazu o wystarczającym kontraście do późniejszej analizy. Ratiometria pH to szybka, precyzyjna i niedroga metoda badania w czasie rzeczywistym zarówno poziomych, jak i pionowych gradientów pH w biofilmach między królestwami. Ratiometrię pH można również przeprowadzić w biofilmach czysto grzybowych i bakteryjnych.Metoda ta przyczynia się do pogłębienia naszej wiedzy na temat metabolizmu drobnoustrojów w biofilmach. Procedurę wzrostu biofilmu zademonstruje Anette Aakjaer Thomsen, technik z mojego laboratorium. Uprawiaj S.mutans i C.albicans na płytkach z agarem do krwi w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach tlenowych.Następnie przenieś pojedyncze kolonie każdego organizmu do probówek wypełnionych pięcioma mililitrami naparu z serca i hoduj je przez dodatkowe 18 godzin. Następnego dnia odwirować kultury w temperaturze 1 200 razy g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w soli fizjologicznej i dostosować OD 550 do 0,5 zarówno dla C.albicans, jak i S. mutans.Następnie rozcieńczyć zawiesinę S.mutans w proporcji 1 do 10 w celu uzyskania równoważnych stężeń. Odpipetować 50 mikrolitrów sterylnego roztworu śliny do studzienek 96-dołkowej płytki z dnem optycznym do mikroskopii. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, następnie umyć płytkę trzykrotnie 100 mikrolitrami sterylnej soli fizjologicznej i opróżnić studzienki.Dodać 100 mikrolitrów zawiesiny C.albicans do każdej studzienki, inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut, a następnie trzykrotnie umyć studzienkę solą fizjologiczną. Następnie dodaj 100 mikrolitrów inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej do każdej studzienki. Inkubuj płytkę przez dwie godziny, a następnie umyj ją trzykrotnie solą fizjologiczną.Opróżnij studnie, ale pozostaw zbiornik o pojemności 20 mikrolitrów, aby uniknąć nadmiernych sił ścinających. Do każdej studzienki dodać 100 mikrolitrów zawiesiny S.mutans i 150 mikrolitrów BHI z 5% sacharozą. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny lub dłużej.W przypadku uprawy starszych biofilmów należy codziennie wymieniać podłoże. Pod koniec fazy wzrostu między królestwami umyj płytkę pięciokrotnie sterylną solą fizjologiczną. Do ratiometrycznego obrazowania pH należy użyć odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z 63-krotną soczewką zanurzeniową w oleju lub wodzie, linią laserową 543 nanometrów i systemem obrazowania spektralnego.Użyj inkubatora, aby ogrzać stolik mikroskopu do 35 stopni Celsjusza. Ustaw detektor do jednoczesnej detekcji zielonej fluorescencji od 576 do 608 nanometrów i czerwonej fluorescencji od 629 do 661 nanometrów. Następnie wybierz odpowiednią moc i wzmocnienie lasera, aby uniknąć prześwietlenia i niedoświetlenia.Ustaw rozmiar otworka na jedną jednostkę powietrzną lub plasterek optyczny o wielkości około 0.8 mikrometra. Następnie ustaw rozmiar obrazu na 512 na 512 pikseli, a szybkość skanowania na dwa. Wybierz średnią liniową z dwóch, korzystając z opcji średniej.Przygotuj 100 mikrolitrów sterylnej soli fizjologicznej z 0,4% glukozy miareczkowanej do pH siedem. Następnie przygotuj roztwór podstawowy C-SNARF-4 i dodaj barwnik do końcowego stężenia 30 mikromolów. Opróżnij jedną ze studzienek biofilmem międzykrólestwowym, pozostawiając zbiornik o pojemności 20 mikrolitrów i dodaj sól fizjologiczną z glukozą i barwnikiem ratiometrycznym.Umieść płytkę na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie. Przygotować serię 50-milimolowego buforu MES miareczkowanego do pH od 4 do 7,8 w krokach co 0,2 jednostki pH w temperaturze 35 stopni Celsjusza. Odpipetować 150 mikrolitrów każdego roztworu buforowego do studzienek 96-dołkowej płytki z dnem optycznym.Dodaj barwnik do studzienek wypełnionych buforem o stężeniu 30 mikromolów i pozwól mu zachować równowagę przez pięć minut. Rozgrzej stolik mikroskopu do 35 stopni Celsjusza i wybierz te same ustawienia, co w przypadku opisanego wcześniej ratiometrycznego obrazowania pH. Umieść 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu i skup się na dnie studzienek.Pobieraj obrazy kanałów zielonych i czerwonych dla wszystkich rozwiązań buforowych. W regularnych odstępach czasu rób zdjęcia z wyłączonym laserem, aby skorygować przesunięcie detektora. Wykonaj eksperyment kalibracyjny w trzech egzemplarzach i wyeksportuj wszystkie obrazy jako pliki TIFF.Przechowuj zielone i czerwone obrazy w osobnych folderach i zmień nazwy obu serii plików na kolejne numery. Zaimportuj obrazy do dedykowanego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ. Na zdjęciach wykonanych przy wyłączonym laserze kliknij przycisk Analizuj i histogram, aby określić średnią intensywność fluorescencji.Odejmij tę wartość od obrazów biofilmu, klikając proces, matematyka i odejmij. Następnie zaimportuj dwie serie obrazów do daime i wykonaj segmentację obrazów kanału czerwonego na podstawie progu, klikając segment, automatyczną segmentację i niestandardowy próg. Ustaw dolny próg powyżej intensywności fluorescencji cytoplazmy grzyba, a wysoki próg poniżej intensywności ścian komórkowych grzyba i bakterii.Następnie przenieś warstwę obiektów z segmentowanej serii obrazów do serii obrazów z zielonym kanałem, klikając opcję segmentuj i przenieś warstwę obiektu. Usuń piksele niebędące obiektami z serii kanałów czerwonego i zielonego. Teraz obrazy biofilmów są usuwane z komórek bakteryjnych i grzybiczych i mogą być eksportowane jako pliki TIFF.Zaimportuj serię obrazów z powrotem do ImageJ i podziel czerwoną serię obrazów według siebie. Następnie pomnóż wynik przez oryginalną serię obrazów. Wynikowa seria obrazów jest identyczna z oryginałem, z wyjątkiem tego, że wszystkie piksele o zerowej intensywności są usuwane.Powtórz ten proces z serią zielonych obrazów. Następnie użyj filtra średniej dla obu serii obrazów, aby skompensować szum detektora. Podziel kolor zielony przez czerwoną serię obrazów, co spowoduje uzyskanie proporcji koloru zielonego do czerwonego dla wszystkich pikseli obiektu.Po 24 i 48 godzinach w płytkach studzienek rozwinęły się wytrzymałe biofilmy międzyziemskie. Pojedyncze komórki i łańcuchy S. mutans zgrupowane wokół strzępek grzybów i dużych przestrzeni wewnątrzkomórkowych wskazywały na obecność obszernej matrycy. pH w przestrzeni zewnątrzkomórkowej zostało zobrazowane za pomocą tabeli przeglądowej.Zewnątrzkomórkowe pH w biofilmach szybko spadło w ciągu pierwszych pięciu minut po ekspozycji na glukozę. Następnie zakwaszenie zwalniało, osiągając zwykle wartości od 5,5 do 5,8 po 15 minutach. Ze względu na lokalne zmiany pH, intensywność fluorescencji w biofilmach zmieniała się w czasie.Podczas segmentacji obrazu dobrano wysokie i niskie progi, aby odpowiednio wyeliminować wszystkie obszary pokryte komórkami bakteryjnymi i grzybiczymi. Niebieskie i zielone obszary zostały wyeliminowane odpowiednio przez dolny i wysoki próg. Staranny dobór parametrów akwizycji obrazu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrego kontrastu między komórkami bakteryjnymi, komórkami grzybów i matrycą biofilmu.Jeśli biofilmy krzyżowe są hodowane w komórkach przepływowych, zmiany pH mogą być monitorowane w warunkach przepływu naśladujących te w jamie ustnej. Ratiometria pH została wykorzystana do identyfikacji lokalnych obszarów w biofilmach zębowych o szczególnie niskim pH, tzw. gorących punktów kwasowości.

monitoring-extracellular-ph-cross-kingdom-biofilms-using-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy artykuł opisuje procedurę tworzenia i wizualizacji biofilmu bakteryjnego hodowanego w szkiełku przedmiotowym z komorą...

In vitro tworzenie biofilmu w szkiełku przedmiotowym z 8-komorowym układem

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i narażone na stałe wrodzone oraz egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię oraz transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów w biofilmach jamy ustnej, które można zaadaptować do innych obszarów badań nad biofilmami.

Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Przedstawiamy protokół analizy strukturalnej i składu naturalnego biofilmu jamy ustnej pobranego z aparatów ortodontycznych z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) oraz konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM). Próbki biofilmu jamy ustnej pobrano z aparatów do rozszerzania podniebienia, zeskrobując z ich powierzchni płatki żywicy akrylowej i przekazując je do obróbki molekularnej.

Analiza biofilmu jamy ustnej w aparatach do rozszerzania podniebienia z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej i konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej

Źródło: Schlafer, S, i Frost Kristensen, M. Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzykrólestwowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje hodowlę biofilmów Streptococcus mutans i Candida albicans w międzykrólestwowych warunkach w warunkach podobnych do jamy ustnej, aby modelować interakcje bakteria-grzyb, umożliwiając badanie synergii mikroorganizmów, adhezji pośredniczonej glukanem oraz kwasowej zjadliwości w patogenezie jamy ustnej.

Ustanowienie biofilmów międzykrólestwowych bakterii i grzybów do badania patogenezy jamy ustnej

Ten film opisuje metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii. Biofilmy bakteryjne często tworzą się na powierzchniach grzybów i obejmują liczne procesy interakcji bakteryjno-grzybiczych, takie jak współpraca metaboliczna, konkurencja lub drapieżnictwo.

Metoda przygotowania próbki w celu wizualizacji bakterii tworzących biofilm na strzępkach grzybów

Ten film demonstruje test w czasie rzeczywistym do monitorowania zewnątrzkomórkowego pH w biofilmach zębowych za pomocą czułej na pH sondy ratiometrycznej. Kiedy biofilm bakteryjny wyhodowany in situ jest wystawiony na działanie glukozy, obniżenie pH zewnątrzkomórkowego w pobliżu biomasy bakteryjnej protonuje sondę, prowadząc do jej zwiększonego stężenia wewnątrz bakterii. Rozbieżność w długości fali emisji między sondą protonowaną i nieprotonowaną jest wykorzystywana do obliczania pH w całej...

Test do monitorowania w czasie rzeczywistym zewnątrzkomórkowego pH w biofilmach dentystycznych

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Barwnik ratiometryczny o pH wrażliwym na pH jest używany w połączeniu z konfokalną laserową mikroskopią skaningową i cyfrową analizą obrazu do monitorowania zewnątrzkomórkowego pH w biofilmach zębowych w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie ratiometryczne zewnątrzkomórkowego pH w biofilmach zębowych

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Cytometria przepływowa w połączeniu z wizualnym grupowaniem oferuje łatwą w użyciu i szybką metodę badania biofilmów wodnych. Może być stosowany do charakteryzowania biofilmu, wykrywania zmian w strukturze zbiorowiska biofilmu oraz wykrywania cząstek abiotycznych osadzonych w biofilmie.

Charakterystyka biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę hodowli biofilmów międzyludzkich Candida albicans i Streptococcus mutans oraz monitorowania pH zewnątrzkomórkowego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie gradientów pH w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzyludzkich za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów