Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzyludzkich za pomocą mikroskopii konfokalnej
30 stycznia 2020
Protokół opisuje hodowlę międzykrólestwowych biofilmów składających się z Candida albicans i Streptococcus mutans oraz przedstawia metodę opartą na mikroskopii konfokalnej do monitorowania pH zewnątrzkomórkowego wewnątrz tych biofilmów.
W protokole przedstawiono łatwą do wykonania metodę hodowli międzykrólestwowych biofilmów składających się z StreptococcuS. mutans i Candida albicans. Późniejsza proporcjometria pH oparta na mikroskopii konfokalnej pozwala na dokładne monitorowanie zmian pH wewnątrz macierzy zewnątrzkomórkowej tych biofilmów.
Staranny dobór parametrów akwizycji obrazu ma ogromne znaczenie dla uzyskania danych obrazu o wystarczającym kontraście do późniejszej analizy. Ratiometria pH to szybka, precyzyjna i niedroga metoda badania w czasie rzeczywistym zarówno poziomych, jak i pionowych gradientów pH w biofilmach między królestwami. Ratiometrię pH można również przeprowadzić w biofilmach czysto grzybowych i bakteryjnych.
Metoda ta przyczynia się do pogłębienia naszej wiedzy na temat metabolizmu drobnoustrojów w biofilmach. Procedurę wzrostu biofilmu zademonstruje Anette Aakjaer Thomsen, technik z mojego laboratorium. Uprawiaj S.mutans i C.albicans na płytkach z agarem do krwi w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach tlenowych.
Następnie przenieś pojedyncze kolonie każdego organizmu do probówek wypełnionych pięcioma mililitrami naparu z serca i hoduj je przez dodatkowe 18 godzin. Następnego dnia odwirować kultury w temperaturze 1 200 razy g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w soli fizjologicznej i dostosować OD 550 do 0,5 zarówno dla C.albicans, jak i S. mutans.
Następnie rozcieńczyć zawiesinę S.mutans w proporcji 1 do 10 w celu uzyskania równoważnych stężeń. Odpipetować 50 mikrolitrów sterylnego roztworu śliny do studzienek 96-dołkowej płytki z dnem optycznym do mikroskopii. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, następnie umyć płytkę trzykrotnie 100 mikrolitrami sterylnej soli fizjologicznej i opróżnić studzienki.
Dodać 100 mikrolitrów zawiesiny C.albicans do każdej studzienki, inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut, a następnie trzykrotnie umyć studzienkę solą fizjologiczną. Następnie dodaj 100 mikrolitrów inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej do każdej studzienki. Inkubuj płytkę przez dwie godziny, a następnie umyj ją trzykrotnie solą fizjologiczną.
Opróżnij studnie, ale pozostaw zbiornik o pojemności 20 mikrolitrów, aby uniknąć nadmiernych sił ścinających. Do każdej studzienki dodać 100 mikrolitrów zawiesiny S.mutans i 150 mikrolitrów BHI z 5% sacharozą. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny lub dłużej.
W przypadku uprawy starszych biofilmów należy codziennie wymieniać podłoże. Pod koniec fazy wzrostu między królestwami umyj płytkę pięciokrotnie sterylną solą fizjologiczną. Do ratiometrycznego obrazowania pH należy użyć odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z 63-krotną soczewką zanurzeniową w oleju lub wodzie, linią laserową 543 nanometrów i systemem obrazowania spektralnego.
Użyj inkubatora, aby ogrzać stolik mikroskopu do 35 stopni Celsjusza. Ustaw detektor do jednoczesnej detekcji zielonej fluorescencji od 576 do 608 nanometrów i czerwonej fluorescencji od 629 do 661 nanometrów. Następnie wybierz odpowiednią moc i wzmocnienie lasera, aby uniknąć prześwietlenia i niedoświetlenia.
Ustaw rozmiar otworka na jedną jednostkę powietrzną lub plasterek optyczny o wielkości około 0.8 mikrometra. Następnie ustaw rozmiar obrazu na 512 na 512 pikseli, a szybkość skanowania na dwa. Wybierz średnią liniową z dwóch, korzystając z opcji średniej.
Przygotuj 100 mikrolitrów sterylnej soli fizjologicznej z 0,4% glukozy miareczkowanej do pH siedem. Następnie przygotuj roztwór podstawowy C-SNARF-4 i dodaj barwnik do końcowego stężenia 30 mikromolów. Opróżnij jedną ze studzienek biofilmem międzykrólestwowym, pozostawiając zbiornik o pojemności 20 mikrolitrów i dodaj sól fizjologiczną z glukozą i barwnikiem ratiometrycznym.
Umieść płytkę na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie. Przygotować serię 50-milimolowego buforu MES miareczkowanego do pH od 4 do 7,8 w krokach co 0,2 jednostki pH w temperaturze 35 stopni Celsjusza. Odpipetować 150 mikrolitrów każdego roztworu buforowego do studzienek 96-dołkowej płytki z dnem optycznym.
Dodaj barwnik do studzienek wypełnionych buforem o stężeniu 30 mikromolów i pozwól mu zachować równowagę przez pięć minut. Rozgrzej stolik mikroskopu do 35 stopni Celsjusza i wybierz te same ustawienia, co w przypadku opisanego wcześniej ratiometrycznego obrazowania pH. Umieść 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu i skup się na dnie studzienek.
Pobieraj obrazy kanałów zielonych i czerwonych dla wszystkich rozwiązań buforowych. W regularnych odstępach czasu rób zdjęcia z wyłączonym laserem, aby skorygować przesunięcie detektora. Wykonaj eksperyment kalibracyjny w trzech egzemplarzach i wyeksportuj wszystkie obrazy jako pliki TIFF.
Przechowuj zielone i czerwone obrazy w osobnych folderach i zmień nazwy obu serii plików na kolejne numery. Zaimportuj obrazy do dedykowanego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ. Na zdjęciach wykonanych przy wyłączonym laserze kliknij przycisk Analizuj i histogram, aby określić średnią intensywność fluorescencji.
Odejmij tę wartość od obrazów biofilmu, klikając proces, matematyka i odejmij. Następnie zaimportuj dwie serie obrazów do daime i wykonaj segmentację obrazów kanału czerwonego na podstawie progu, klikając segment, automatyczną segmentację i niestandardowy próg. Ustaw dolny próg powyżej intensywności fluorescencji cytoplazmy grzyba, a wysoki próg poniżej intensywności ścian komórkowych grzyba i bakterii.
Następnie przenieś warstwę obiektów z segmentowanej serii obrazów do serii obrazów z zielonym kanałem, klikając opcję segmentuj i przenieś warstwę obiektu. Usuń piksele niebędące obiektami z serii kanałów czerwonego i zielonego. Teraz obrazy biofilmów są usuwane z komórek bakteryjnych i grzybiczych i mogą być eksportowane jako pliki TIFF.
Zaimportuj serię obrazów z powrotem do ImageJ i podziel czerwoną serię obrazów według siebie. Następnie pomnóż wynik przez oryginalną serię obrazów. Wynikowa seria obrazów jest identyczna z oryginałem, z wyjątkiem tego, że wszystkie piksele o zerowej intensywności są usuwane.
Powtórz ten proces z serią zielonych obrazów. Następnie użyj filtra średniej dla obu serii obrazów, aby skompensować szum detektora. Podziel kolor zielony przez czerwoną serię obrazów, co spowoduje uzyskanie proporcji koloru zielonego do czerwonego dla wszystkich pikseli obiektu.
Po 24 i 48 godzinach w płytkach studzienek rozwinęły się wytrzymałe biofilmy międzyziemskie. Pojedyncze komórki i łańcuchy S. mutans zgrupowane wokół strzępek grzybów i dużych przestrzeni wewnątrzkomórkowych wskazywały na obecność obszernej matrycy. pH w przestrzeni zewnątrzkomórkowej zostało zobrazowane za pomocą tabeli przeglądowej.
Zewnątrzkomórkowe pH w biofilmach szybko spadło w ciągu pierwszych pięciu minut po ekspozycji na glukozę. Następnie zakwaszenie zwalniało, osiągając zwykle wartości od 5,5 do 5,8 po 15 minutach. Ze względu na lokalne zmiany pH, intensywność fluorescencji w biofilmach zmieniała się w czasie.
Podczas segmentacji obrazu dobrano wysokie i niskie progi, aby odpowiednio wyeliminować wszystkie obszary pokryte komórkami bakteryjnymi i grzybiczymi. Niebieskie i zielone obszary zostały wyeliminowane odpowiednio przez dolny i wysoki próg. Staranny dobór parametrów akwizycji obrazu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrego kontrastu między komórkami bakteryjnymi, komórkami grzybów i matrycą biofilmu.
Jeśli biofilmy krzyżowe są hodowane w komórkach przepływowych, zmiany pH mogą być monitorowane w warunkach przepływu naśladujących te w jamie ustnej. Ratiometria pH została wykorzystana do identyfikacji lokalnych obszarów w biofilmach zębowych o szczególnie niskim pH, tzw. gorących punktów kwasowości.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę hodowli międzykrólestwowych biofilmów składających się z Candida albicans i Streptococcus mutans. Opisuje również technikę opartą na mikroskopii konfokalnej służącą do monitorowania pH zewnątrzkomórkowego wewnątrz tych biofilmów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Badania nad biofilmem
- Biologia komórki
Wstęp
- Biofilmy międzykrólestwowe obejmują interakcje między różnymi gatunkami.
- Candida albicans oraz Streptococcus mutans odgrywają istotną rolę w zdrowiu człowieka.
- Monitorowanie pH jest kluczowe dla zrozumienia dynamiki biofilmu.
- Mikroskopia konfokalna zapewnia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości do celów analizy.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody hodowli wielogatunkowych biofilmów.
- Umożliwienie monitorowania zmian pH w biofilmach w czasie rzeczywistym.
- Ocena wpływu pH na strukturę i funkcję biofilmu.
Zastosowane metody
- Hodowla biofilmów z wykorzystaniem Candida albicans i Streptococcus mutans.
- Zastosowanie mikroskopii konfokalnej do obrazowania.
- Ratiometria pH do pomiaru zewnątrzkomórkowych gradientów pH.
- Optymalizacja parametrów akwizycji obrazu w celu uzyskania wysokiej jakości danych.
Główne wyniki
- Skuteczna hodowla stabilnych międzykrólestwowych biofilmów.
- Monitorowanie gradientów pH wewnątrz biofilmów w czasie rzeczywistym.
- Wykazano znaczenie parametrów obrazowania dla dokładności danych.
- Ratiometria pH okazała się skuteczna zarówno dla biofilmów grzybiczych, jak i bakteryjnych.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na poznanie dynamiki pH w biofilmach wielogatunkowych.
- Mikroskopia konfokalna i ratiometria pH stanowią cenne narzędzia w badaniach nad biofilmami.
- Dalsze badania mogą zgłębiać wpływ pH na zachowanie biofilmów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzykrólestwowymi umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w modelach interakcji mikroba z gospodarzem, istotnych dla progresji chorób jamy ustnej. To ratiometryczne podejście oparte na mikroskopii konfokalnej zapewnia pewność prognostyczną przy ocenie czynników wirulencji napędzanych przez biofilm i wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkryć po badania przedkliniczne. Zdolność tej metody do rozróżniania przestrzennych i czasowych gradientów pH dostarcza informacji niezbędnych do wczesnej walidacji celów oraz selekcji projektów w procesie opracowywania terapeutyków przeciwbiofilmowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów wirulencji zależnych od pH w biofilmach wielogatunkowych.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów mikrobiologicznych wpływających na mikrośrodowiska istotne dla przebiegu choroby.
- Ułatwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację zmian pH zewnątrzkomórkowego powiązanych z patogennością.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia zwalidowany system do ilościowego i powtarzalnego pomiaru pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach.
- Standaryzuje parametry obrazowania i analizy w celu opracowania wiarygodnego testu.
- Umożliwia wysokoprzepustowe badanie (high-content screening) związków wpływających na dynamikę zakwaszania biofilmu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie monitorowania pH in vitro do modeli biofilmu jamy ustnej istotnych dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość między wynikami z etapu odkrywania a przedkliniczną walidacją strategii przeciwbiofilmowych.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, łącząc modulację pH z efektami w zakresie wirulencji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda konfokalnego ratiometrycznego monitorowania pH integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych nad terapeutykami przeciwbiofilmowymi oraz modelami chorób jamy ustnej.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie pH zewnątrzkomórkowego jako funkcjonalnego wskaźnika do testowania hipotez i wyjaśniania szlaków w badaniach nad biofilmem.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary pH odpowiednie do standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza rozdzielczych przestrzennie i zależnych od czasu danych o pH w celu porównania warunków eksperymentalnych i interwencji.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z zachowaniami biofilmu istotnymi dla przebiegu choroby w celu dopasowania do modeli przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje możliwość ponownego wykorzystania przepływu pracy w obrazowaniu i analizie, który można dostosować do różnych systemów biofilmu i programów badawczych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelach chorób wywołanych przez biofilmy.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obrazowanie, kalibrację i analizę w celu zapewnienia powtarzalnego i skalowalnego monitorowania pH.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne pod względem kapitałowym ustalanie priorytetów dla kandydatów na leki przeciwbiofilmowe.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowany do ryzyka postęp oraz porównywalność międzyprogramową w portfolio chorób jamy ustnej i mikrobiomu.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii konfokalnej i ratiometrycznej analizy fluorescencji.
- Wymaga dostępu do skalibrowanego sprzętu obrazującego oraz specjalistycznego oprogramowania do analizy obrazu.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja parametrów akwizycji i progowania pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych modeli biofilmu może wymagać optymalizacji protokołu pod kątem składu i grubości macierzy.
- Ograniczony zakres profilowania w osi Z ogranicza analizę do cienkich biofilmów (≤75 μm), zgodnie z opisem w protokole.
