Charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości

Protokół ten pokazuje, że możemy teraz szczegółowo określić wpływ inhibitorów migracji w modelach 3D raka. Główną zaletą jest łatwość i kompleksowe podejście, z jakim można przeprowadzić tę technikę. Technika ta umożliwia ocenę leków migrastatycznych w badaniach nad rakiem w warunkach 3D, co pozwala na testowanie leków w warunkach bardziej istotnych dla środowiska nowotworowego.

Metoda ta może być stosowana do badania leków cytotoksycznych w nowotworach lub np. do oceny wpływu promieniowania na proliferację nowotworu i migrację komórek. Przydatne jest ćwiczenie etapu usuwania pożywki i wymiany kolagenu za pomocą zwykłych 96-dołkowych płytek, aby nabrać pewności siebie. Niezbędne jest również szkolenie z obsługi mikroskopu konfokalnego.

Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie dla naukowców, aby zrozumieć wymaganą delikatność obchodzenia się ze sferoidami i ich zastosowanie w mikroskopii konfokalnej. W pierwszym dniu eksperymentów przygotuj standardową pożywkę hodowlaną, w tym przypadku U251, dla odpowiedniej linii komórkowej. W kapturze do hodowli tkankowej dodaj 0,5 mililitra trypsyny do kultury, aby trypsynizować komórki rakowe.

Policz komórki rakowe na hemocytometrze i rozcieńcz do stężenia pięć razy 10 do trzeciej komórki na mililitr. Zawiesiny komórek należy przechowywać w wyraźnie oznakowanych, sterylnych probówkach uniwersalnych. Ponownie zawieś komórki przez delikatne odwrócenie, aby uniknąć zlepiania się komórek.

Użyj pipety, aby dodać 200 mikrolitrów kultury komórkowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Dodaj 200 mikrolitrów 1X PBS do każdej pustej studzienki, aby uniknąć parowania. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 24 godzinach sprawdź komórki za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Linie komórkowe, takie jak linie komórkowe raka glejaka, tworzą sferoidy na dnie studzienki w ciągu 24 godzin. Inkubuj sferoidy przez kolejne 48 godzin, aby umożliwić uformowanie się architektury komórkowej 3D.

Trzeciego dnia umieść kolagen, pożywkę hodowlaną 5X, jednomolowy wodorotlenek sodu i jedną 20-mililitrową probówkę na lodzie. Ostrożnie i powoli dodaj 10,4 mililitra zimnego kolagenu do schłodzonej probówki hodowlanej. Unikaj bąbelków.

Następnie delikatnie dodaj 1,52 mililitra zimnej sterylnej pożywki hodowlanej 5X. Unikaj bąbelków. Tuż przed użyciem delikatnie dodaj 72 mikrolitry zimnego, sterylnego, jednomolowego wodorotlenku sodu i trzymaj roztwór na lodzie.

Mieszać delikatnie, pipetując, unikając pęcherzyków. Wydajne mieszanie prowadzi do zmiany koloru z czerwonego na pomarańczowo-czerwony w pożywce. Pozostaw mieszaninę na lodzie do czasu użycia.

Następnie, aby usunąć 190 mikrolitrów supernatantu z 96-dołkowej płytki przygotowanej pierwszego dnia, użyj pipety pod kątem w kierunku boku studzienki. Uważaj, aby nie przeszkadzać sferoidom, które utworzyły się na dnie studni. Delikatnie dodaj 100 mikrolitrów mieszanki kolagenowej do każdej studzienki, pipetując bok dołka.

Unikaj pęcherzyków i wszelkich zakłóceń sferoidalnych. Pozostałą mieszankę kolagenu w 20-mililitrowej probówce należy przechowywać w temperaturze pokojowej, aby ocenić polimeryzację. Inkubować płytkę w inkubatorze przez co najmniej 10 minut, aby umożliwić polimeryzację kolagenu.

Kiedy resztki kolagenu stają się półstałe i gąbczaste, sferoidy są gotowe do leczenia inhibitorem. Dodaj inhibitory o stężeniu 2X do pięciu mililitrów pożywki hodowlanej. Delikatnie odpipetować 100 mikrolitrów pożywki po boku każdej studzienki, aby uniknąć zaburzeń sferoidalnych.

Obserwuj i obrazuj każdą sferoidę za pomocą mikroskopii jasnego pola w godzinach zero, 24 godzin, 48 godzin i 72 godzin, aby ocenić aktywność leku. Następnie należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Teraz umieść płytkę w kapturze do hodowli tkankowej i delikatnie zastąp supernatant 100 mikrolitrami 1X PBS.

Uważaj, aby nie naruszyć sferoidy i unikaj dotykania kolagenu. Powtórz ten krok prania jeszcze trzy razy. Usuń końcowe płukanie w każdym dołku i zastąp 100 mikrolitrami 4% formaldehydu w 1X PBS.

Umieść 96-dołkową płytkę na stole laboratoryjnym, przykryj folią i pozostaw na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Następnego dnia ostrożnie usuń formaldehyd i zastąp go 1X PBS. Powtórz to pranie jeszcze trzy razy.

Następnie zastąp mycie 1X PBS 100 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu Triton X-100. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj roztwór blokujący z 50 mililitrami 1X PBS i 05% odtłuszczonego mleka w proszku w 50-mililitrowej tubce i dokładnie wymieszaj.

Po 30 minutach wyjmij Triton X-100 i umyj go trzykrotnie 1X PBS. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut. Następnie rozcieńczyć przeciwciało anty-mysie IgG acetylowanej tubuliny w buforze blokującym w stosunku jeden do 100.

Odwirować pierwotną mieszaninę blokujących przeciwciała przez pięć minut w temperaturze 15 682 razy g. Ostrożnie usunąć roztwór blokujący z każdej studzienki i dodać 25 do 50 mikrolitrów supernatantu buforowego blokującego przeciwciała z probówki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Następnie usuń roztwór przeciwciał z każdej studzienki i przemyj trzy razy 100 mikrolitrami 1X PBS. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym w zalecanym stężeniu, oprócz wszelkich dodatkowych barwników fluorescencyjnych. Ponownie odwirować roztwór przeciwciał drugorzędowych przez pięć minut w temperaturze 15 682 razy g.

Usuń roztwór blokujący z każdej studzienki i dodaj 25 do 50 mikrolitrów wtórnego supernatantu przeciwciała. Inkubować w ciemności przez 1 1/2 godziny w temperaturze pokojowej. Usuń wtórny roztwór barwnika przeciwciał i przemyj trzy razy 1X PBS, 100 mikrolitrów na studzienkę.

Ostrożnie podnieś poszczególne zatyczki kolagenowe przez odsysanie plastikową pipetą o pojemności 200 mikrolitrów na środek szklanego szkiełka. Dodaj jedną kroplę odpowiedniego mocowania, aby zakryć korek kolagenowy. Umieścić szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki i przechowywać szkiełko w temperaturze pokojowej w ciemności.

Trójwymiarowa technologia sferoidalna przyczynia się do lepszego zrozumienia interakcji między lekiem a nowotworem, ponieważ jest bardziej reprezentatywna dla środowiska specyficznego dla nowotworu. W badaniu tym wykryto potencjalne efekty anty- lub promigracyjne. Jest to szczególnie widoczne w KNS42, gdzie pozornie nie ma migracji ani w sferoidach kontrolnych, ani poddanych obróbce.

Śmierć komórki obserwowano przy najwyższym stężeniu inhibitora wynoszącym 10 mikromolów. Fragmentacja jądrowa i migrujące komórki były widoczne w komórkach U251. Sferoidy komórkowe U251 miały kolce promieniujące od pierwotnej sferoidy, przy czym rosnące zaokrąglenie komórek w komórkach było widoczne wraz ze wzrostem stężenia inhibitora.

W KNS42 zaobserwowano zapadnięte mikrotubule i fragmentację jądrową. Arkuszowe wypukłości z pojedynczymi kolcami komórkowymi wskazują na migrację KNS42. Przy najniższym stężeniu inhibitora fenotyp ten był wyraźny, ale zanikał wraz ze wzrostem stężenia inhibitora.

Bardzo ważne jest, aby pozostawić wszystkie odczynniki na lodzie, aż będą gotowe. W przeciwnym razie kolagen zaczyna polimeryzować, zanim zostanie w całości dodany do sferoidów. Istnieje możliwość ilościowego określenia obrazów generowanych za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu oceny wpływu, na przykład, leków migrastatycznych na morfologię komórek.

Pozwoliło nam to po raz pierwszy potwierdzić wpływ inhibitora migracji MI-192 na poziom acetylacji mikrotubul i zbadać to dalej pod kątem migracji komórek. Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z formaldehydem na etapie utrwalania. Obowiązują zwykłe wytyczne dotyczące zdrowia i bezpieczeństwa.