Name: Charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj ocenę inhibitorów migrastatycznych w inwazji sferoidalnej guza 3D przy użyciu mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę wpływu leków na migrację komórek glejaka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować profesorowi Chrisowi Jonesowi za wkład w rozwój linii komórkowej KNS42. Mikroskop konfokalny Zeiss LSM880 z AiryScan wykorzystany w tej pracy jest częścią projektu Huddersfield Innovation and Incubation Project (HIIP) finansowanego w ramach Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) Growth Deal. Źródło obrazu mikroskopowego Rysunek 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. Generowanie sferoid komórkowych
Dzień 1
<ol>
	<li>Przygotować wzorcową pożywkę hodowlaną zgodnie z wymaganiami badanej linii komórkowej.</li>
	<li>Wszystkie etapy związane z hodowlą tkankową należy przeprowadzić w kapturze do hodowli tkankowej przy użyciu sterylnych technik obchodzenia się z nimi.</li>
	<li>Trypsynizuj i policz komórki rakowe. Użyć 20 ml zawiesiny komórkowej na płytkę. Zawiesiny komórek należy przechowywać w wyraźnie oznakowanych, sterylnych probówkach uniwersalnych.</li>
	<li>Dodaj z góry określoną liczbę komórek do każdej studzienki. Zarówno początkowa liczba komórek, jak i ostateczny wymagany rozmiar sferoidy zależą od tempa proliferacji badanej linii komórkowej. 
	nuta: W przypadku ustalonych linii komórkowych glejaka, takich jak U251 i KNS429,10, 5 x 103 komórki/ml wytworzą mikroskopijnie widoczną sferoidę (200 lub 800 μm) po 4 dniach inkubacji.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w uniwersalnych probówkach przez delikatne odwrócenie, aby uniknąć zlepiania się komórek. Odpipetować 200 μl zawiesiny komórek do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Jeśli wszystkie studzienki nie są wymagane, zaleca się dodanie 200 μl 1x PBS do każdej pustej studzienki, aby uniknąć parowania.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w normalny sposób w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Linie komórkowe, takie jak linie komórkowe raka glejaka, utworzą sferoidy w ciągu 24 godzin. Pozwól na uformowanie się architektury komórkowej 3D poprzez inkubację sferoidy przez 72 godziny.</li>
</ol>
Dzień 2
<ol start="7">
	<li>Sprawdź komórki za pomocą mikroskopii w jasnym polu po 24 godzinach. W zależności od linii komórkowej, komórki mogły utworzyć sferoidę wykrywalną na dnie studzienki. 
	nuta: Ustalone linie komórkowe raka glejaka łatwo tworzą sferoidy w ciągu 24 godzin. Linie komórkowe raka glejaka pochodzące od pacjenta mogą trwać do 1-2 tygodni.</li>
</ol>
2. Test inwazji kolagenu
Dzień 3
<ol>
	<li>Umieść kolagen, 5x pożywkę hodowlaną, 1 M NaOH i jedną probówkę 20 ml na lodzie.</li>
	<li>Ostrożnie i powoli dodaj 10,4 ml zimnego kolagenu do schłodzonej probówki hodowlanej. Unikaj bąbelków. Taka ilość kolagenu wystarcza na jedną płytkę 96-dołkową. Skalowanie w górę jest możliwe, ale zaleca się przygotowanie jednej probówki o pojemności 20 ml na płytkę na raz.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 1,52 ml zimnej sterylnej pożywki 5x. Unikaj bąbelków.</li>
	<li>Tuż przed użyciem delikatnie dodać 72 μL zimnego, sterylnego 1 M NaOH. Roztwór należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać, pipetując. Unikaj bąbelków. Wydajne mieszanie prowadzi do zmiany koloru (z czerwonego na pomarańczowo-czerwony (pH 7,4) w pożywce. Pozostaw mieszaninę na lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Kluczowy krok: Usunąć 190 μl supernatantu z 96-dołkowej płytki przygotowanej w dniu 1. Uważaj, aby nie przeszkadzać sferoidom, które utworzyły się na dnie studni. Używaj pipety pod kątem w stronę boku, a nie do środka studni.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 100 μl mieszanki kolagenowej do każdego dołka. Aby zapobiec zakłóceniom sferoidalnym, odpipetuj mieszaninę wzdłuż boku studzienki. Unikaj bąbelków. Pozostałą mieszankę kolagenu w probówce o pojemności 20 ml należy przechowywać w temperaturze pokojowej, aby ocenić polimeryzację.</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze przez co najmniej 10 minut, aby umożliwić polimeryzację kolagenu. Jako wskazówkę, jeśli resztki kolagenu stwardniały, stając się półstałe i gąbczaste, sferoidy są gotowe do leczenia inhibitorem.</li>
	<li>Dodaj leki lub inhibitory w stężeniu 2x do pożywki hodowlanej. Delikatnie dodaj pożywkę do każdej studzienki (100 μl na studzienkę). Ponownie odpipetuj pożywkę z boku studzienki, aby uniknąć zakłóceń sferoidalnych.</li>
	<li>Obserwuj i zobrazuj każdą sferoidę za pomocą mikroskopii jasnego pola w czasie T = 0 h, 24 h, 48 h i 72 h, aby ocenić aktywność leku. Następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. 
	nuta: W zależności od inwazyjnego zachowania linii komórkowej, migrację od pierwotnego rdzenia sferoidalnego można zaobserwować od 24 godzin.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sferoid osadzonych w kolagenie i komórek migrujących do mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Umieścić płytkę w kapturze do hodowli tkankowej i delikatnie usunąć supernatant (200 μl). Ponownie należy uważać, aby nie naruszyć sferoidy i unikać dotykania kolagenu, ponieważ może to kolidować z korkiem kolagenowym.</li>
	<li>Zastąp supernatant 100 μl 1x PBS. Powtórz ten krok prania 3 razy.</li>
	<li>Usuń końcowe płukanie i zastąp 4% formaldehydem w 1x PBS (100 μL na studzienkę). 
	ostrożność: Formaldehyd jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. Obchodź się z nią ostrożnie, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa.</li>
	<li>Umieść 96-dołkową płytkę na stole laboratoryjnym, przykryj folią i pozostaw na 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usuń formaldehyd i zastąp go 1x PBS. Powtórz to 1x pranie PBS 3x.</li>
	<li>Przygotuj 0,1% Triton X-100 w 1x PBS. Usunąć 1x PBS wash i zastąpić 100 μl roztworu Triton X-100. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj roztwór blokujący z 1x PBS i 0,05% odtłuszczonego mleka w proszku i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Wyjmij Triton X-100 i umyj 3x 1x PBS. Dodać 100 μl roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć wymagane przeciwciało pierwszorzędowe w buforze blokującym w ustalonym stężeniu. Tutaj użyj przeciwciała przeciwko mysiej acetylowanej tubulinie IgG (1:100).</li>
	<li>Odwirować mieszaninę pierwotnych blokujących przeciwciała przez 5 minut przy 15 682 x g. Ostrożnie usunąć roztwór blokujący i dodać supernatant (25−50 μl) do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciała i przemyć 3x 1x PBS (100 μL na studzienkę).</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym w zalecanym lub z góry określonym stężeniu, jako dodatek do wszelkich dodatkowych barwników fluorescencyjnych. Tutaj użyj przeciwciała sprzężonego 1:500 anty-mysiego fluoroforu-488, falloidyny-594 (1:500) do barwienia aktyny i barwienia DNA (DAPI).</li>
	<li>Ponownie odwirować wtórny roztwór przeciwciała przez 5 minut przy 13 000 obr./min.</li>
	<li>Usuń roztwór blokujący z każdej studzienki i dodaj 25-50 μl mieszanki przeciwciał drugorzędowych / falloidyny / DAPI. Inkubować w ciemności przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć wtórny roztwór barwnika przeciwciała i przemyć 3x 1x PBS (100 μL na studzienkę).</li>
	<li>Ostrożnie podnieś poszczególne korki kolagenowe przez odsysanie plastikową pipetą (200 μl) na środek wysokiej jakości szkiełka podstawowego ze szkła.</li>
	<li>Dodaj jedną kroplę odpowiedniego mocowania do korka kolagenowego, upewniając się, że korek jest całkowicie zakryty. Unikaj bąbelków.</li>
	<li>Nałożyć szkiełko nakrywkowe o grubości optymalnej dla obiektywu mikroskopu, który będzie używany do obrazowania i pozostawić na noc. Przechowuj szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
</ol>
4. Mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Uchwyć obrazy fluorescencyjne za pomocą odpowiedniego mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Gandalovičová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li>
<li>Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+glioblastoma%3A+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).</li>
<li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333(2017).</li>
<li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics+Technologies%22%5BJournal%5D)">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li>
<li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).</li>
<li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microwell-mesh%3A+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253(2018).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPont%C3%A9n%2C+J+%22Human+Tumor+Cells+in+Vitro%22">Human Tumor Cells in Vitro</a>. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).</li>
<li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line%2C+KNS-42%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologica+Medico+Chirurgica%22%5BJournal%5D)">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li>
<li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li>
<li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li>
<li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors%2C+a+promising+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li>
<li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li>
<li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+preparation+from+hanging+drops%3A+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li>
<li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Härmä, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisano nowy sposób tworzenia sferoid komórek nowotworowych w celu identyfikacji migracyjnej aktywności leków za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Zastosowanie płytek o niskiej przyczepności w porównaniu z innymi technikami, takimi jak wiszące krople15, ułatwiło generowanie powtarzalnych i jednolitych sferoid do stosowania w testach migracji i inwazji kolagenu. Punktami krytycznymi w tym protokole są usunięcie pożywki wzrostowej z płytki 96-dołkowej przed osadzeniem sferoid...

Trójwymiarowe technologie sferoidalne do przedklinicznego odkrywania leków i rozwoju potencjalnych leków na raka są coraz częściej preferowane w stosunku do konwencjonalnych badań przesiewowych leków; dlatego też obserwuje się większy rozwój leków migrastatycznych - zapobiegających migracji i inwazji. Uzasadnienie tych postępów w leczeniu nowotworów jest jasne: testy sferoidalne 3D reprezentują bardziej realistyczne podejście do badań przesiewowych potencjalnych leków przeciwnowotworowych, ponieważ wierniej naśladują architekturę guza 3D niż hodowle jednowarstwowe komórek, dokładniej podsumowują interakcje lek-guz (kinetykę) i umożliwiają charakterystykę aktywności leku w warunkach związanych z nowotworem. Ponadto, wzrost oporności na leki chemotoksyczne w wielu typach nowotworów i wysoka śmiertelność wśród pacjentów z rakiem z powodu przerzutów wzmocnionych przez zdolność komórek rakowych do migracji do odległych miejsc nowotworu przemawia za włączeniem chemioterapeutyków ukierunkowanych na potencjał migracyjny komórek nowotworowych jako leczenia uzupełniającego w przyszłych klinicznych badaniach klinicznych nad rakiem1. Dzieje się tak szczególnie w przypadku nowotworów wysoce inwazyjnych, takich jak glejaki wielopostaciowy o wysokim stopniu złośliwości (GBM). Leczenie GBM obejmuje chirurgię, radioterapię i chemioterapię. Jednak nawet w przypadku leczenia skojarzonego u większości pacjentów dochodzi do nawrotu choroby w ciągu 1 roku od wstępnej diagnozy, a mediana przeżycia wynosi 11-15 miesięcy2,3. W ciągu ostatnich kilku lat poczyniono ogromne postępy w dziedzinie technologii 3D: systemy obrotowe, mikrofabrykowane struktury i rusztowania 3D oraz inne indywidualne testy są stale ulepszane, aby umożliwić rutynowe testy na dużą skalę4,5,6,7. Jednak wyniki uzyskane z tych testów muszą być analizowane w sensowny sposób, ponieważ interpretacja danych jest często utrudniana przez próby analizy danych generowanych w 3D za pomocą systemów analizy obrazów 2D.
Pomimo tego, że są preferowane pod względem szybkości pozyskiwania obrazów i zmniejszonej fototoksyczności, większość systemów o szerokim polu widzenia pozostaje ograniczona przez rozdzielczość8. Tak więc, oprócz odczytów danych dotyczących skuteczności leku, szczegółowy wpływ działania leku na struktury komórkowe 3D migrujących komórek jest nieuchronnie utracony, jeśli jest obrazowany przy użyciu systemu szerokokątnego. I odwrotnie, konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM) rejestruje wysokiej jakości, optycznie przekrojone obrazy, które można zrekonstruować i renderować w 3D po akwizycji za pomocą oprogramowania komputerowego. W związku z tym CLSM można łatwo zastosować do obrazowania złożonych struktur komórkowych 3D, umożliwiając w ten sposób badanie wpływu inhibitorów antymigrastatycznych na struktury 3D i dogłębne analizy mechanizmów migracji komórek. Niewątpliwie będzie to miało wpływ na przyszły rozwój leków migrastatycznych. W tym miejscu opisano połączony proces generowania sferoidów, leczenia farmakologicznego, protokołu barwienia i charakterystyki za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości.

<table><tbody><tr><td>Kolagen I, ogon szczura, 100 mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>do testu inwazji glejaka; jest on oferowany przez wielu dystrybutorów/producentów i będzie musiał zostać określony zarówno dla rodzaju zamierzonego testu, jak i użytych linii komórkowych. W przypadku linii komórkowych raka glejaka preferowanym wyborem jest kolagen szczurzego ogona typu 1 (np. Corning). Kolagen powinien być przechowywany w temperaturze 4 stopni; C, w ciemności, dopóki nie będzie to wymagane. Nie zaleca się mieszania kolagenu z różnych partii, ponieważ może to wpłynąć na konsystencję spolimeryzowanego kolagenu. &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>różne</td><td></td><td>do obrazowania mikroskopowego,</td></tr><tr><td>proszek DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5648</td><td>potrzebny w stężeniu 5x do roztworu kolagenu do testu inwazji glejaka; &nbsp; Można go nabyć w postaci sproszkowanej, przygotowanej w podwójnie destylowanej wodzie i, w zależności od końcowego składu pożywki, uzupełnionej wszelkimi wymaganymi dodatkami. Kompletny roztwór 5x należy przefiltrować przez strzykawkowy system filtracyjny (0,22 &mu; m) przed użyciem.</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td>potrzebna do hodowli komórek linii komórkowych glejaka</td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>podstawowe różne</td><td></td><td>do obrazowania mikroskopowego</td></tr><tr><td>DMEM o wysokim poziomie glukozy</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>potrzebne do hodowli komórkowej linii komórkowych glejaka</td></tr><tr><td>Inhibitor</td><td>Tocris</td><td>różne</td><td>różne - według projektu eksperymentalnego; inhibitory można kupić od producentów takich jak Selleckchem i Tocris. Producenci ci oferują szczegółowy opis charakterystyki inhibitora, linki do powiązanych odniesień i sugestie dotyczące stężeń roboczych. Podobnie jak w przypadku wszystkich inhibitorów, mogą one być potencjalnie toksyczne i należy się z nimi obchodzić zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa. Inhibitory są przygotowywane w postaci roztworów podstawowych zgodnie z zaleceniami producenta. Jako przykład użyliśmy inhibitora migrastatycznego MI-192, aby zademonstrować zastosowanie takich inhibitorów. Przetestowaliśmy w ten sposób szereg inhibitorów migrastatycznych z porównywalnymi wynikami.</td></tr><tr><td>Mocowanie</td><td>różne</td><td>różne</td><td>do obrazowania mikroskopowego</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>różne&nbsp;</td><td>różne</td><td>NaOH można kupić o wymaganej molowości lub przygotować z postaci stałej. Przygotowany roztwór należy wysterylizować filtrem za pomocą systemu filtrów strzykawkowych. Jeden M NaOH jest i należy zachować ostrożność podczas przygotowywania roztworu.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>różne</td><td>różne</td><td>do mocowania sferoid i komórek; uzupełniać w 4%, zachować ostrożność zagrożenie dla zdrowia, upewnić się, że przestrzegane są przepisy BHP dotyczące roztworu kolagenu do testu inwazji</td></tr><tr><td>Pasety (pipeta z podziałką, 3 ml)</td><td>różne</td><td>różne</td><td>do testu inwazji, usuwanie</td></tr><tr><td>roztworu PBS, sterylne do hodowli tkankowej</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td>potrzebne do hodowli komórkowej linii komórkowych glejaka i myjek do barwienia</td></tr><tr><td>Pióro / paciorkowiec (antybiotyki)</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>potrzebna do hodowli komórkowej linii komórkowych glejaka</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe, przeciwciało drugorzędowe, DAPI, falloidyna</td><td>różne</td><td>różne</td><td>istnieje wielu producentów tych odczynników, dla przeciwciał znakowanych wtórnie zalecamy Alexa Fluor (sondy molekularne). Tutaj użyliśmy mysiego przeciwciała przeciwko acetylowanej tubulinie (1/100, Abcam). Do przeciwciał drugorzędowych użyliśmy przeciwciała skoniugowanego 1/500 anty-mysiego Alexa Fluor 488, sondy molekularne. Do barwienia jądrowego użyliśmy DAPI (wielu producentów) i barwnika aktynowego Phalloidin (wielu producentów), oba w zalecanym rozcieńczeniu 1/500.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>potrzebny do roztworu kolagenu do testu inwazji glejaka w stężeniu 5x</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>potrzebny do roztworu kolagenu do testu inwazji glejaka w stężeniu 5x</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>do trypsynizacji</td></tr><tr><td>Płytki mocujące o ultra niskim poziomie</td><td>Sigma/Nunc</td><td>CLS7007-24EA</td><td>do testu inwazji glejaka; Wymagana jest płytka o niskiej przyczepności, przy czym preferowane są płytki 96-dołkowe, aby umożliwić badania przesiewowe badanych związków na dużą skalę. Na rynku dostępnych jest kilka płyt o niskiej przyczepności; Zaleca się testowanie różnych płytek w celu optymalnego generowania sferoidów. Z naszego doświadczenia wynika, że Costar Ultra Low Cluster z pokrywką, z okrągłym dnem, najlepiej sprawdza się w generowaniu sferoid z komórek raka glejaka pod względem 100% tworzenia sferoidów i odtwarzalności. Płytki te zostały również z powodzeniem wykorzystane do wytworzenia sferoid glejaka z materiału pochodzącego od pacjenta, komórek raka pęcherza moczowego i jajnika w naszym laboratorium. Ponadto w tych płytkach można zastosować neurosfery pnia lub progenitorowe, aby ułatwić generowanie standaryzowanych neurosferyczno-sferoidalnych</td></tr><tr><td>Pasiaków (pipety serologiczne, sterylne, 5 ml i 10 ml)</td><td>różne, np. Costar</td><td>CLS4488-50; CLS4487-50</td><td>do hodowli tkankowych i preparatu kolagenu</td></tr><tr><td>Różne wielokanałowe (50 - 250 &mu; L) i pipety jednokanałowe (10 &mu; L, 50 i mu; L, 200 &mu; L 1 mL)</td> <td>różne</td><td></td><td>różne do obsługi komórek i sferoid</td></tr><tr><td>Mikroskopia szerokokątna</td><td>różne&nbsp;</td><td>różne</td><td>do obserwacji generowania sferoidów i obrazowania sferoidalnego; tutaj obrazy fluorescencji szerokokątnej zostały wykonane za pomocą systemu obrazowania komórek EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 CLSM wyposażony w obiektyw olejowy Plan Apochromat 63x 1.4 NA</td><td>Cytat Zeiss</td><td>od producenta</td><td>Obrazy konfokalne zostały wykonane za pomocą obiektywu olejowego Zeiss LSM 880 CLSM wyposażonego w obiektyw olejowy Plan Apochromat 63x 1.4 NA. Diody 405nm, 458/488/514 nm argon multiline i HeNe 594nm zostały użyte do wzbudzenia odpowiednio Phalloidine 594, Alexa Fluor 488 i DAPI. Dla każdego obrazu zarejestrowano pojedynczy reprezentatywny przekrój optyczny, przy czym wszystkie ustawienia, zarówno przed, jak i po zarejestrowaniu obrazu, zostały zachowane w celach porównawczych. Wszystkie obrazy zostały następnie przetworzone przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do obrazowania Zen i programu Adobe Photoshop.</td></tr></tbody></table>

charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3d za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Odkrywanie i opracowywanie leków w badaniach nad rakiem coraz częściej opiera się na badaniach przesiewowych leków w formacie 3D. Nowe inhibitory ukierunkowane na potencjał migracyjny i inwazyjny komórek nowotworowych, a w konsekwencji na przerzutowe rozprzestrzenianie się choroby, są odkrywane i rozważane jako uzupełniające metody leczenia wysoce inwazyjnych nowotworów, takich jak glejaki. W związku z tym wymagane jest generowanie danych umożliwiających szczegółową analizę komórek w środowisku 3D po dodaniu leku. Opisana tutaj metodologia, łącząca testy inwazji sferoidalnej z przechwytywaniem obrazu o wysokiej rozdzielczości i analizą danych za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM), umożliwiła szczegółową charakterystykę wpływu potencjalnego inhibitora antymigracyjnego MI-192 na komórki glejaka. Sferoidy wygenerowano z linii komórkowych do testów inwazji na 96-dołkowych płytkach o niskiej przyczepności, a następnie przygotowano do analizy CLSM. Opisany przebieg pracy był preferowany w stosunku do innych powszechnie stosowanych technik generowania sferoid zarówno ze względu na łatwość, jak i powtarzalność. To, w połączeniu ze zwiększoną rozdzielczością obrazu uzyskaną za pomocą mikroskopii konfokalnej w porównaniu z konwencjonalnymi metodami szerokokątnymi, umożliwiło identyfikację i analizę wyraźnych zmian morfologicznych w komórkach migrujących w środowisku 3D po leczeniu migrastatycznym lekiem MI-192.

Technologia trójwymiarowych sferoidów przyczynia się do lepszego zrozumienia oddziaływań między lekami a guzami, ponieważ w większym stopniu odzwierciedla ona specyficzne środowisko nowotworowe. Generowanie sferoidów można przeprowadzić na kilka sposobów; w niniejszym protokole wykorzystano płytki 96-dołkowe o niskim stopniu przylegania. Po przetestowaniu kilku produktów różnych producentów, wybrano płytki użyte w tej metodzie, ponieważ wykazywały one najstabilniejsze wyniki pod kątem sku...

Wpływ inhibitorów migracji na migrację komórek raka glejaka w trójwymiarowych (3D) testach inwazji z użyciem inhibitora deacetylazy histonowej (HDAC) charakteryzuje się mikroskopią konfokalną o wysokiej rozdzielczości.

Charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Protokół ten pokazuje, że możemy teraz szczegółowo określić wpływ inhibitorów migracji w modelach 3D raka. Główną zaletą jest łatwość i kompleksowe podejście, z jakim można przeprowadzić tę technikę. Technika ta umożliwia ocenę leków migrastatycznych w badaniach nad rakiem w warunkach 3D, co pozwala na testowanie leków w warunkach bardziej istotnych dla środowiska nowotworowego.Metoda ta może być stosowana do badania leków cytotoksycznych w nowotworach lub np. do oceny wpływu promieniowania na proliferację nowotworu i migrację komórek. Przydatne jest ćwiczenie etapu usuwania pożywki i wymiany kolagenu za pomocą zwykłych 96-dołkowych płytek, aby nabrać pewności siebie. Niezbędne jest również szkolenie z obsługi mikroskopu konfokalnego.Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie dla naukowców, aby zrozumieć wymaganą delikatność obchodzenia się ze sferoidami i ich zastosowanie w mikroskopii konfokalnej. W pierwszym dniu eksperymentów przygotuj standardową pożywkę hodowlaną, w tym przypadku U251, dla odpowiedniej linii komórkowej. W kapturze do hodowli tkankowej dodaj 0,5 mililitra trypsyny do kultury, aby trypsynizować komórki rakowe.Policz komórki rakowe na hemocytometrze i rozcieńcz do stężenia pięć razy 10 do trzeciej komórki na mililitr. Zawiesiny komórek należy przechowywać w wyraźnie oznakowanych, sterylnych probówkach uniwersalnych. Ponownie zawieś komórki przez delikatne odwrócenie, aby uniknąć zlepiania się komórek.Użyj pipety, aby dodać 200 mikrolitrów kultury komórkowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Dodaj 200 mikrolitrów 1X PBS do każdej pustej studzienki, aby uniknąć parowania. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po 24 godzinach sprawdź komórki za pomocą mikroskopii w jasnym polu. Linie komórkowe, takie jak linie komórkowe raka glejaka, tworzą sferoidy na dnie studzienki w ciągu 24 godzin. Inkubuj sferoidy przez kolejne 48 godzin, aby umożliwić uformowanie się architektury komórkowej 3D.Trzeciego dnia umieść kolagen, pożywkę hodowlaną 5X, jednomolowy wodorotlenek sodu i jedną 20-mililitrową probówkę na lodzie. Ostrożnie i powoli dodaj 10,4 mililitra zimnego kolagenu do schłodzonej probówki hodowlanej. Unikaj bąbelków.Następnie delikatnie dodaj 1,52 mililitra zimnej sterylnej pożywki hodowlanej 5X. Unikaj bąbelków. Tuż przed użyciem delikatnie dodaj 72 mikrolitry zimnego, sterylnego, jednomolowego wodorotlenku sodu i trzymaj roztwór na lodzie.Mieszać delikatnie, pipetując, unikając pęcherzyków. Wydajne mieszanie prowadzi do zmiany koloru z czerwonego na pomarańczowo-czerwony w pożywce. Pozostaw mieszaninę na lodzie do czasu użycia.Następnie, aby usunąć 190 mikrolitrów supernatantu z 96-dołkowej płytki przygotowanej pierwszego dnia, użyj pipety pod kątem w kierunku boku studzienki. Uważaj, aby nie przeszkadzać sferoidom, które utworzyły się na dnie studni. Delikatnie dodaj 100 mikrolitrów mieszanki kolagenowej do każdej studzienki, pipetując bok dołka.Unikaj pęcherzyków i wszelkich zakłóceń sferoidalnych. Pozostałą mieszankę kolagenu w 20-mililitrowej probówce należy przechowywać w temperaturze pokojowej, aby ocenić polimeryzację. Inkubować płytkę w inkubatorze przez co najmniej 10 minut, aby umożliwić polimeryzację kolagenu.Kiedy resztki kolagenu stają się półstałe i gąbczaste, sferoidy są gotowe do leczenia inhibitorem. Dodaj inhibitory o stężeniu 2X do pięciu mililitrów pożywki hodowlanej. Delikatnie odpipetować 100 mikrolitrów pożywki po boku każdej studzienki, aby uniknąć zaburzeń sferoidalnych.Obserwuj i obrazuj każdą sferoidę za pomocą mikroskopii jasnego pola w godzinach zero, 24 godzin, 48 godzin i 72 godzin, aby ocenić aktywność leku. Następnie należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Teraz umieść płytkę w kapturze do hodowli tkankowej i delikatnie zastąp supernatant 100 mikrolitrami 1X PBS.Uważaj, aby nie naruszyć sferoidy i unikaj dotykania kolagenu. Powtórz ten krok prania jeszcze trzy razy. Usuń końcowe płukanie w każdym dołku i zastąp 100 mikrolitrami 4% formaldehydu w 1X PBS.Umieść 96-dołkową płytkę na stole laboratoryjnym, przykryj folią i pozostaw na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Następnego dnia ostrożnie usuń formaldehyd i zastąp go 1X PBS. Powtórz to pranie jeszcze trzy razy.Następnie zastąp mycie 1X PBS 100 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu Triton X-100. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj roztwór blokujący z 50 mililitrami 1X PBS i 05% odtłuszczonego mleka w proszku w 50-mililitrowej tubce i dokładnie wymieszaj.Po 30 minutach wyjmij Triton X-100 i umyj go trzykrotnie 1X PBS. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut. Następnie rozcieńczyć przeciwciało anty-mysie IgG acetylowanej tubuliny w buforze blokującym w stosunku jeden do 100.Odwirować pierwotną mieszaninę blokujących przeciwciała przez pięć minut w temperaturze 15 682 razy g. Ostrożnie usunąć roztwór blokujący z każdej studzienki i dodać 25 do 50 mikrolitrów supernatantu buforowego blokującego przeciwciała z probówki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez godzinę.Następnie usuń roztwór przeciwciał z każdej studzienki i przemyj trzy razy 100 mikrolitrami 1X PBS. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym w zalecanym stężeniu, oprócz wszelkich dodatkowych barwników fluorescencyjnych. Ponownie odwirować roztwór przeciwciał drugorzędowych przez pięć minut w temperaturze 15 682 razy g.Usuń roztwór blokujący z każdej studzienki i dodaj 25 do 50 mikrolitrów wtórnego supernatantu przeciwciała. Inkubować w ciemności przez 1 1/2 godziny w temperaturze pokojowej. Usuń wtórny roztwór barwnika przeciwciał i przemyj trzy razy 1X PBS, 100 mikrolitrów na studzienkę.Ostrożnie podnieś poszczególne zatyczki kolagenowe przez odsysanie plastikową pipetą o pojemności 200 mikrolitrów na środek szklanego szkiełka. Dodaj jedną kroplę odpowiedniego mocowania, aby zakryć korek kolagenowy. Umieścić szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki i przechowywać szkiełko w temperaturze pokojowej w ciemności.Trójwymiarowa technologia sferoidalna przyczynia się do lepszego zrozumienia interakcji między lekiem a nowotworem, ponieważ jest bardziej reprezentatywna dla środowiska specyficznego dla nowotworu. W badaniu tym wykryto potencjalne efekty anty- lub promigracyjne. Jest to szczególnie widoczne w KNS42, gdzie pozornie nie ma migracji ani w sferoidach kontrolnych, ani poddanych obróbce.Śmierć komórki obserwowano przy najwyższym stężeniu inhibitora wynoszącym 10 mikromolów. Fragmentacja jądrowa i migrujące komórki były widoczne w komórkach U251. Sferoidy komórkowe U251 miały kolce promieniujące od pierwotnej sferoidy, przy czym rosnące zaokrąglenie komórek w komórkach było widoczne wraz ze wzrostem stężenia inhibitora.W KNS42 zaobserwowano zapadnięte mikrotubule i fragmentację jądrową. Arkuszowe wypukłości z pojedynczymi kolcami komórkowymi wskazują na migrację KNS42. Przy najniższym stężeniu inhibitora fenotyp ten był wyraźny, ale zanikał wraz ze wzrostem stężenia inhibitora.Bardzo ważne jest, aby pozostawić wszystkie odczynniki na lodzie, aż będą gotowe. W przeciwnym razie kolagen zaczyna polimeryzować, zanim zostanie w całości dodany do sferoidów. Istnieje możliwość ilościowego określenia obrazów generowanych za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu oceny wpływu, na przykład, leków migrastatycznych na morfologię komórek.Pozwoliło nam to po raz pierwszy potwierdzić wpływ inhibitora migracji MI-192 na poziom acetylacji mikrotubul i zbadać to dalej pod kątem migracji komórek. Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z formaldehydem na etapie utrwalania. Obowiązują zwykłe wytyczne dotyczące zdrowia i bezpieczeństwa.

characterization-effects-migrastatic-inhibitors-on-3d-tumor-spheroid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Celem tego protokołu jest ocena wpływu czynników pro- i antymigracyjnych na migrację komórek w trójwymiarowej matrycy fibryny.

Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Tutaj opisujemy łatwy w użyciu test na inwazję glejaka. Ten test jest odpowiedni dla komórek macierzystych podobnych do glejaka. Opisano również makro Fidżi do łatwego ilościowego określania inwazji, migracji i proliferacji.

Model sferoidalny 3D glejaka wielopostaciowego

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Poznaj ocenę inhibitorów migrastatycznych w inwazji sferoidalnej guza 3D przy użyciu mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę wpływu leków na migrację komórek glejaka.

Charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka wpływu inhibitorów migrastatycznych na inwazję sferoidalną guza 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów