Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura
29 października 2019
Tutaj opisujemy metodę dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez wszczepienie cewnika w śródoponową przestrzeń lędźwiową kręgosłupa. Koncentrujemy się na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych, chociaż ta metoda nadaje się również do dostarczania innych metod terapeutycznych.
Protokół ten umożliwia bezpośrednie dostarczanie środków terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego szczura w celu oceny farmakokinetyki, farmakodynamiki i skuteczności nowych terapii w modelach chorób szczurów. Ta procedura jest bezpieczna, skuteczna i nie wymaga drogiego sprzętu ani narzędzi chirurgicznych. Procedurę zademonstrują Yi Chen i Yi Luo, naukowcy z mojego laboratorium.
Aby przygotować specjalne kaniule prowadzące, użyj narzędzia obrotowego z kołem do odcięcia, aby odciąć oba końce igły o rozmiarze 19, aby uzyskać kaniulę prowadzącą o długości około półtora do dwóch centymetrów. Następnie użyj ściernicy narzędzia obrotowego, aby wygładzić oba końce. Aby przygotować zespół drutu cewnika, wytnij jeden ośmiocentymetrowy kawałek rurki PE10 o średnicy 011 cali, który będzie służył jako cewnik dokanałowy dla każdego zwierzęcia.
Użyj markera odpornego na etanol, aby zaznaczyć dwa centymetry od jednego końca każdego kawałka rurki. Dla każdego zwierzęcia należy wprowadzić 11-centymetrowy drut stylikowy wycięty z drutu ze stali nierdzewnej pokrytej politetrafluoroetylenem do światła ośmiocentymetrowego cewnika PE10. Aby przygotować zespół cewnika do podania, wytnij kawałek cewnika PE50 o średnicy od pięciu do 10 centymetrów i średnicy 023 cali i włóż adapter rurki o rozmiarze 23 do jednego końca cewnika.
Następnie włóż igłę o rozmiarze 30 z odciętym piastą w około 0,5-centymetrowy kawałek rurki PE10 i podłącz rurkę PE10 do drugiego końca cewnika. Aby przygotować zespół kaniuli prowadzącej i igły, umieść kaniulę prowadzącą na końcu igły o rozmiarze 23. Przed przystąpieniem do zabiegu należy położyć poduszkę grzewczą na stole operacyjnym i przykryć ją sterylnym prześcieradłem.
Umieść stożkową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na arkuszu i potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego szczura doświadczalnego. Po zważeniu zwierzęcia ogol grzbiet od ogona do ogonowego odcinka piersiowego kręgosłupa i połóż ogolonego szczura na sterylnym prześcieradle w pozycji leżącej. Umieść rurkę o pojemności 50 ml pod brzuchem, aby zgiąć kręgosłup w okolicy lędźwiowej i nałóż maść okulistyczną na oczy.
Następnie wstrzyknąć podskórnie jeden miligram na kilogram buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu i oczyścić odsłoniętą skórę sekwencyjnym peelingiem powidonowym i alkoholowym. Ułóż zwierzę sterylnym przezroczystym arkuszem z fenestracją. W celu umieszczenia cewnika i wstrzyknięcia związku zidentyfikuj dwa naturalne wgłębienia między mięśniami nad ogoloną miednicą, a jedną ręką trzymając doły, drugą ręką delikatnie naciśnij i poczuj kręgosłup od kierunku ogonowego do rostralnego, aby zlokalizować pierwsze główne wgłębienie między kręgami.
Po zidentyfikowaniu przestrzeni międzykręgowej między kręgami S1 i L6, przesuń się lekko rostralnie, aby zidentyfikować przestrzeń międzykręgową między kręgami L5 i L6. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie o długości nie większej niż dwa centymetry w skórze i torebce mięśniowej w tym miejscu wzdłuż linii środkowej od kierunku rostralnego do ogonowego, tak aby miejsce wstrzyknięcia znajdowało się w środku nacięcia. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wypreparować tkankę łączną, aż będzie można uwidocznić warstwę mięśniową.
Wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w torebce mięśniowej bezpośrednio po stronie grzbietowego wyrostka rdzeniowego kręgu lędźwiowego L6. Umieść zespół igły kaniuli prowadzącej w pobliżu przedniej części szóstego kręgu lędźwiowego i wepchnij zespół do przestrzeni międzykręgowej wzdłuż przedniej części szóstego kręgu tak, aby koniec igły przechodził przez kanał kręgowy. Użyj kleszczy, aby zlokalizować grzbietowy wyrostek rdzeniowy kręgu lędźwiowego L6, a następnie wepchnij igłę wzdłuż przedniej części szóstego kręgu do przestrzeni bezkręgowców.
Wciśnij kaniulę prowadzącą na miejsce wzdłuż igły, wyjmij igłę i włóż zespół drutu cewnika do kaniuli prowadzącej. Ustawiając cewnik pod kątem około 45 stopni do kanału kręgowego, wciśnij koniec cewnika na około 0,3 centymetra do kanału. Usuń drut stylizowany około 2,5 centymetra od śródoponowej końcówki cewnika i wsuń cewnik do kanału kręgowego, aż dwucentymetrowe oznaczenie na cewniku będzie widoczne poniżej mięśnia.
Gdy cewnik jest na swoim miejscu, wyjmij kaniulę prowadzącą, aby pozostawić cewnik i drut sztyftowy na miejscu. Wsuń cewnik do kanału kręgowego, aż dwucentymetrowy znak znajdzie się przy wejściu do kanału i całkowicie wycofaj drut sztyftowy. Płyn mózgowo-rdzeniowy może być uwidoczniony wchodzący do wszczepionego cewnika.
Następnie podłącz zespół cewnika podającego do dystalnego końca wszczepionego cewnika za pomocą końcówki igły o rozmiarze 30. Następnie załadować 60 mikrolitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej do strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów i załadować bolus 30 mikrolitrów badanego związku do drugiej strzykawki. Podłącz strzykawkę z solą fizjologiczną do końcówki adaptera rurki zespołu cewnika doprowadzającego i przepłucz 20 mikrolitrów sterylnego soli fizjologicznej do przestrzeni dooponowej.
Po przepłukaniu całego roztworu soli fizjologicznej zastąpić strzykawkę z solą fizjologiczną strzykawką z bolusem i wstrzyknąć 30 mikrolitrów badanego związku do przestrzeni dokanałowej przez okres 30 sekund. Po dostarczeniu całego bolusa zastąpić strzykawkę z bolusem inną strzykawką z solą fizjologiczną i przepłukać cewnik dodatkowymi 40 mikrolitrami soli fizjologicznej. Po dostarczeniu drugiej objętości soli fizjologicznej odłącz zespół cewnika podającego od wszczepionego cewnika i użyj pary bardzo gorących, sterylizowanych termicznie kleszczy preparacyjnych, aby zacisnąć rurkę, aby aseptycznie przeciąć i uszczelnić wszczepiony cewnik
.Użyj wchłanialnych szwów monofilamentowych, aby przymocować zgrzewalny cewnik do tkanki łącznej, a następnie użyj szwów niewchłanialnych, aby zamknąć skórę. Następnie użyj gazy i soli fizjologicznej, aby zmyć krew ze skóry i umieść szczura w podgrzewanym inkubatorze z monitorowaniem aż do pełnego odzyskania sprawności. W tym reprezentatywnym eksperymencie uzyskano bardzo dobry knockdown we wszystkich regionach pobranych po podaniu oligonukleotydu antysensownego w pojedynczym bolusie, jak pokazano.
Mierzono jednak pewien stopień zmienności regionalnej, przy czym rdzeń kręgowy wykazywał najwyższy odsetek knockdownu. Po udanym wstrzyknięciu oligonukleotydu antysensownego lub innych środków terapeutycznych do odpowiedniego modelu, można ocenić farmakokinetykę, farmakodynamikę i skuteczność środków terapeutycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę dostarczania leków, a konkretnie oligonukleotydów antysensownych, bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez implantację cewnika w lędźwiową przestrzeń dokanałową. Protokół kładzie nacisk na bezpieczeństwo, skuteczność i dostępność, ponieważ nie wymaga on kosztownego sprzętu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Farmakologia
- Metody eksperymentalne
Wstęp
- Ośrodkowy układ nerwowy odgrywa kluczową rolę w licznych procesach biologicznych i chorobach.
- ukierunkowane dostarczanie leków może zwiększyć skuteczność środków terapeutycznych.
- Oligonukleotydy antysensowne stanowią obiecującą metodę terapeutyczną w leczeniu zaburzeń OUN.
- Wcześniejsze metody mogły być kosztowne lub trudne technicznie, co ograniczało ich zastosowanie w badaniach.
Cel badania
- Ustanowienie prostego protokołu dostarczania leków do OUN szczura.
- Ocena farmakokinetyki, farmakodynamiki oraz skuteczności nowych preparatów terapeutycznych w modelach chorób.
- Umożliwienie dalszych badań przy użyciu metody bezpiecznej i kosztowo efektywnej.
Zastosowane metody
- W badaniu zastosowano technikę implantacji cewnika.
- Wykorzystanym modelem biologicznym jest szczur, konkretnie w celu podawania substancji do przestrzeni intratekalnej kręgosłupa.
- Nie wspomniano o żadnych przepływach pracy multiomicznych.
- Przedstawiono szczegółowe protokoły chirurgiczne, w tym miejsca nacięć i rozmieszczenie cewników.
- Podkreślono środki bezpieczeństwa oraz opiekę pooperacyjną w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt podczas procedury.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia skuteczne podawanie środków terapeutycznych, z sukcesem wizualizując wnikanie płynu mózgowo-rdzeniowego do cewnika.
- Wykazano efektywność w osiąganiu knock-downu związków w różnych obszarach, co wskazuje na udane dostarczenie leku.
- Wyniki sugerują potencjalny postęp w zastosowaniach terapeutycznych w przypadku leczenia celowanego w OUN.
Wnioski
- Niniejsza praca przedstawia niezawodną metodę dostarczania czynników terapeutycznych do OUN, co toruje drogę do usprawnienia badań eksperymentalnych.
- W badaniu nie przeprowadzono analizy wieloomicznej.
- Wyniki podkreślają użyteczność tej metody w badaniu mechanizmów neuronalnych oraz skuteczności leków w modelach chorób.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednie podanie do przestrzeni ciszcowej oligonukleotydów antysensownych umożliwia precyzyjną ocenę farmakokinetyczną i farmakodynamiczną w przedklinicznych modelach chorób OUN, omijając ograniczenia wynikające z bariery krew-mózg. Podejście to wspomaga walidację celu i minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzenie ekspozycji w OUN oraz zaangażowania celu. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących kandydatów na lek, dostarczając ilościowych danych o regionalnym wyciszeniu genów w tkankach rdzenia kręgowego i mózgu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośrednie podanie oligonukleotydów antysensownych do OUN w celu oceny wyciszenia docelowego RNA.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny protokół chirurgiczny dla spójnego dostarczania związków we wszystkich kohortach badawczych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu poprzez wykazanie zależnej od dawki regionalnej zmienności wydajności wyciszania.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszych badań skuteczności poprzez zapewnienie niezawodnego podawania związków drogą dokanałową.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację analizy dzięki mierzalnym objętościom podawanych bolusów oraz wymianie płynów za pomocą cewnika.
- Skalowalność: Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy w wielu różnych modalnościach terapeutycznych poza oligonukleotydami antysensownymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy walidację celu w fazie odkryć z oceną przedkliniczną poprzez mierzalne wyniki farmakodynamiczne w tkankach OUN.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zdefiniowanie regionalnych progów wyciszenia korelujących z zaangażowaniem celu.
- System istotny dla choroby: Wykorzystuje OUN szczura jako model predykcyjny do oceny dystrybucji i skuteczności oligosunukleotydów antysensownych.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności – umożliwiając bezpośrednie dostarczanie związków do OUN oraz ocenę stopnia ekspozycji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie kontrolowanego dostarczania terapeutyków celujących w OUN w celu oceny efektów w obrębie celu molekularnego.
- Przesiewy: Opisuje gotowość testu poprzez standaryzowane procedury implantacji cewnika i iniekcji bolusa, zapewniając powtarzalną ekspozycję związku.
- Analityka: Podkreśla ilościowe pomiary zmiennych zależnych, takich jak procentowe poziomy wyciszania RNA w poszczególnych regionach, umożliwiając porównania między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez wykazanie biodystrybucji w OUN oraz modulacji celu istotnych dla skuteczności terapeutycznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia technikę implantacji cewnika jako wielokrotnie wykorzystywalną metodę oceny różnorodnych modalności dostarczanych do OUN, w tym oligonukleotydów, peptydów i małych cząsteczek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu poprzez bezpośrednią demonstrację ekspozycji w OUN oraz mechanistycznego wyciszenia celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki określonym krokom chirurgicznym, markerom rozmieszczenia cewników oraz protokołom wymiany płynów.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje typu go/no-go poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w angażowaniu celu w OUN.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o ilościowe dane dotyczące regionalnego wyciszenia, informujące o decyzjach dotyczących dalszego rozwoju.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w stereotaksycznym chirurgicznym operowaniu gryzoni oraz w technikach dostępu do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).
- Konieczne jest zastosowanie sterylnego instrumentarium chirurgicznego, w tym skalpeli, pincet i materiałów szewnych do implantacji cewnika.
- Niezbędna jest standaryzacja działań pomiędzy zespołami chirurgicznymi, farmakologicznymi i analitycznymi w celu zapewnienia spójnej interpretacji wyników.
- Należy uwzględnić różnice między szczepami gryzoni a modelami wiekowymi, które wpływają na anatomię kręgosłupa i objętość CSF.
- Ograniczenia praktyczne obejmują przeżywalność pooperacyjną oraz drożność cewnika, co wymaga monitorowania pooperacyjnego w celu zapewnienia wiarygodności danych.
