Name: Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę dokanałowego dostarczania oligonukleotydów antysensownych do ośrodkowego układu nerwowego szczura. Ta technika umożliwia badanie farmakokinetyki i skuteczności nowych terapii w modelach chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować firmie Ionis Pharmaceuticals za dostarczenie ASO opisanych w artykule.

Wszystkie procedury in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Biogen Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC), które są zgodne z wytycznymi określonymi przez Narodowy Instytut Zdrowia Stanów Zjednoczonych w zakresie opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie materiału i instrumentu
<ol>
	<li>Przygotuj specjalne kaniule prowadzące.
	<ol>
		<li>Użyj narzędzia obrotowego z tarczą do cięcia (lub ostrą piłą), aby odciąć dwa końce igły 19 G, w wyniku czego powstaje kaniula prowadząca o długości ~1,5−2 cm (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 1Aiii). Użyj ściernicy narzędzia obrotowego, aby wygładzić dwa końce. 
		UWAGA: Alternatywnie, gotowe i sterylne kaniule prowadzące można kupić u komercyjnego sprzedawcy (Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zespół cewnika/drutu.
	<ol>
		<li>Wytnij kawałek rurki PE-10 o długości 8 cm (rurka polietylenowa o średnicy 0.011 cala), aby służył jako cewnik dokanałowy. Zaznacz znak w odległości 2 cm od jednego końca markerem odpornym na etanol. Wytnij drut stylizowany o długości 11 cm z drutu ze stali nierdzewnej pokrytej politetrafluoroetylenem. Włóż drut trzpieniowy (<klasa mocna="xfig">Rysunek 1Aii) do światła cewnika PE-10 (<klasa mocna="xfig">Rysunek 1Ai). 
		UWAGA: Dla każdego zwierzęcia potrzebny jest jeden zestaw cewników/przewodów (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Av). Alternatywnie, cewniki i druty do trzpieni można zakupić u komercyjnego sprzedawcy (tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zespół cewnika do podania.
	<ol>
		<li>Wytnij kawałek cewnika PE-50 (5−10 cm, rurka polietylenowa, średnica 0.023 cala) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Bi). Do jednego końca cewnika PE50 włożyć adapter rurki 23 G (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1Biv). Ten koniec zostanie podłączony do strzykawki o pojemności 100 μl (tabela materiałów) podczas operacji. Włóż zmodyfikowaną igłę 30 G z odciętym piastą (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 1Biii) do około 0,5 cm kawałka rurki PE-10 (<klasa mocna = "xfig" >Rysunek 1Bii) i podłącz rurkę PE-10 do drugiego końca cewnika.</li>
		<li>Końcówka igłowa 30 G zespołu cewnika podającego (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1Bv) zostanie podłączona do dystalnego końca wszczepionego cewnika PE-10 u szczura podczas operacji. 
		UWAGA: Alternatywnie, zespół cewnika do podawania (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1Bv) można zakupić u komercyjnego sprzedawcy (Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zespół kaniuli prowadzącej i igły (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1Avi), umieszczając kaniulę prowadzącą (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Aiii) na końcu igły 23 G. </li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym kaniulę prowadzącą i zestawy drutu/cewnika, za pomocą sterylizatora z tlenku etylenu przez 12 godzin 
	UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne z wyjątkiem cewnika mogą być sterylizowane w autoklawie; cewnik stopi się w wysokiej temperaturze.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do zabiegu
UWAGA: Ta procedura jest rutynowo wykonywana na samcach i samicach szczurów Sprague Dawley o masie ciała od 200 g do 400 g. Dwa szczury są trzymane w klatce w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.
<ol>
	<li>Zważ szczura i umieść go w komorze izofluranu w celu wywołania znieczulenia (1−5% izofluranu wO2, miareczkowane do efektu). 
	UWAGA: Szczur jest następnie stale znieczulany izofluranem w celu utrzymania głębokiego znieczulenia przez stożek nosowy przez cały czas trwania zabiegu. Można zastosować alternatywną metodę znieczulenia (np. podawanie ketaminy w dawce 100 mg/kg i ksylazyny w dawce 10 mg/kg) zatwierdzonej przez IACUC.</li>
	<li>Kiedy szczur nie reaguje na szczypanie palca u nogi, ogol jego grzbiet od ogona do ogonowego odcinka piersiowego kręgosłupa i połóż ogolonego szczura na sterylnym prześcieradle położonym na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Umieść stożkową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml pod brzuchem szczura, aby zgiąć kręgosłup w okolicy lędźwiowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A) i nałóż maść okulistyczną na oczy.</li>
	<li>Wstrzyknąć buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu (1,0 mg/kg; Tabela materiałów) podskórnie u szczura. Oczyść odsłoniętą skórę naprzemiennie peelingami powidonowymi i alkoholowymi i powtórz to trzy razy. 
	UWAGA: Można zastosować alternatywny środek przeciwbólowy zatwierdzony przez protokół IACUC.</li>
	<li>Ułóż zwierzę sterylną przezroczystą serwetą, która została otoczona okienkiem nad polem operacyjnym.</li>
</ol>
3. Chirurgia
<ol>
	<li>Gdy szczur jest podtrzymywany przez stożkową rurkę o pojemności 50 ml, zidentyfikuj dwa naturalne doły między mięśniami nad miednicą (strzałki w <silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Jedną ręką trzymając te doły, drugą ręką delikatnie naciśnij i poczuj kręgosłup od kierunku ogonowego do rostralnego i znajdź pierwsze główne wgłębienie między kręgami, a jest to przestrzeń międzykręgowa między kręgami S1 i L6 (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2B).</li>
	<li>Poruszaj się lekko w kierunku rostralnym, aby zidentyfikować następne wgłębienie, przestrzeń międzykręgową między kręgami L5 i L6 a miejscem wstrzyknięcia (* w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie o długości nie większej niż 2 cm w skórze wzdłuż linii środkowej od rostralu do ogona, tak aby miejsce wstrzyknięcia znajdowało się w środku nacięcia (przerywana linia w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wypreparować tkankę łączną w celu uwidocznienia warstwy mięśniowej. Następnie wykonaj 1 cm nacięcie w torebce mięśniowej bezpośrednio po stronie grzbietowego wyrostka rdzeniowego kręgu lędźwiowego L6. 
	UWAGA: W tym momencie można uwidocznić kości kręgu lędźwiowego L6</li>.
	<li>Umieść zespół kaniuli prowadzącej i igły w pobliżu przedniej części 6. kręgu lędźwiowego i wepchnij go do przestrzeni międzykręgowej wzdłuż przedniej części 6. kręgu tak, aby koniec igły penetrował kanał kręgowy. Wciśnij kaniulę prowadzącą na miejsce wzdłuż igły i wyjmij igłę 23 G, pozostawiając na miejscu tylko kaniulę prowadzącą. 
	UWAGA: Pomocne jest użycie kleszczy w celu zlokalizowania wyrostka grzbietowego kręgu lędźwiowego L6 przed wkłuciem igły. Ogólnie rzecz biorąc, płyn płynu mózgowo-rdzeniowego może być widoczny wchodzący do piasty igły (płyn ten może być zabarwiony nutą krwi, ale nie oznacza to, że wyrządzono szkodę lub że igła nie jest prawidłowo umieszczona). Autorzy nie zaobserwowali dużej ilości krwi ani silnego krwawienia podczas tego zabiegu. W przypadku wystąpienia któregokolwiek z nich należy skontaktować się z weterynarzem w celu ustalenia odpowiedniego leczenia i ustalenia, czy zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji.</li>
	<li>Włóż zespół drutu cewnika do kaniuli prowadzącej. Ustawić zespół drutu cewnika pod kątem około 45° do kanału kręgowego i wcisnąć koniec na około 0,3 cm do kanału kręgowego.</li>
	<li>Wyjmij kaniulę prowadzącą, pozostawiając cewnik z drutem trzpieniowym na miejscu. Usuń drut stylowy około 2,5 cm od dokanałowej końcówki cewnika i wsuń cewnik do kanału kręgowego, aż znak 2 cm znajdzie się przy wejściu do kanału (widoczny tylko poniżej mięśnia), jak pokazano w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Bvi. 
	UWAGA: Wprowadzony cewnik powinien rozciągać się rostralnie do przestrzeni podpajęczynówkowej. Pomyślne umieszczenie powinno umożliwić swobodne przemieszczanie się cewnika w tej przestrzeni.</li>
	<li>Całkowicie wycofaj drut trzpieniowy, a płyn mózgowo-rdzeniowy może być widoczny wchodząc do wszczepionego cewnika.</li>
	<li>Podłącz zespół cewnika podającego do dystalnego końca wszczepionego cewnika za pomocą końcówki igły 30 G (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Bv,vi).</li>
	<li>Załadować 60 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej do strzykawki o pojemności 100 μl (strzykawki do płukania). Załadować bolus 30 μl badanego związku (np. roztworu ASO) do drugiej strzykawki (strzykawki do wstrzykiwań).</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę płuczącą (wypełnioną solą fizjologiczną) do końcówki adaptera rurki zespołu cewnika dostarczającego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Bv). Wstrzyknąć 20 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej do przestrzeni dooponowej (płukanie przed wstrzyknięciem).</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę do wstrzykiwań (wypełnioną badanym związkiem) do końcówki adaptera rurki zespołu cewnika doprowadzającego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Bv). Wstrzyknąć 30 μl badanego związku do przestrzeni dooponowej przez 30 s. 
	UWAGA: Rutynowa objętość wstrzyknięcia ASO wynosi 30 μl, aby uzyskać dobre knockdown w rdzeniu kręgowym i korze mózgowej. Doniesiono, że objętości wstrzyknięć mogą mieć wpływ na rozkład związku12, chociaż nie przetestowano różnych objętości wstrzyknięć. W przypadku stosowania innego związku lub objętości należy empirycznie określić bezpieczeństwo i skuteczność.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.10 i przepłukać cewnik kolejnymi 40 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej (płukanie po wstrzyknięciu). Następnie odłącz zespół cewnika podającego od wszczepionego cewnika. 
	UWAGA: Uważa się, że płukanie przed i po wstrzyknięciu zmniejsza lokalną sekwestrację związków i poprawia ich dystrybucję do struktur rostralnych12.</li>
	<li>Aseptycznie odciąć i uszczelnić wszczepiony cewnik: Umieść parę sterylnych kleszczy preparacyjnych w sterylizatorze kulkowym, aż będą bardzo gorące, a następnie zaciśnij rurkę gorącym końcem kleszczy. 
	UWAGA: To działanie powoduje stopienie cewnika. W ten sposób otwór w rurce jest zapadany i wszystkie boki przylegają do siebie, uszczelniając rurkę w sposób aseptyczny, a następnie umieszcza się ją w przestrzeni podskórnej.</li>
	<li>Użyj wchłanialnych szwów monofilamentowych, aby przymocować pozostały zgrzewany cewnik do tkanki łącznej. Następnie użyj niewchłanialnych szwów monofilamentowych, aby zamknąć skórę nad zabezpieczonym cewnikiem zgrzewanym. 
	UWAGA: Klipsy do nawijania ran mogą być również używane zgodnie z protokołem IACUC. Technika ta jest kompatybilna z wielokrotnymi wstrzyknięciami, chociaż była używana tylko do jednorazowych wstrzyknięć w nasze ręce. Wykonalność powtarzanych wstrzyknięć powinna zostać oceniona empirycznie za zgodą IACUC.</li>
	<li>Użyj gazy i soli fizjologicznej, aby zmyć krew ze skóry i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu w podgrzewanym inkubatorze do momentu, gdy będzie mobilne, po czym wraca do klatki domowej (dwa szczury na klatkę). 
	UWAGA: Wykonując operacje na wielu szczurach tego samego dnia, wyczyść narzędzia wodą w celu usunięcia krwi i ponownie wysterylizuj za pomocą podgrzanego sterylizatora z suchymi kulkami (przez co najmniej 20 sekund, z czasem do ostygnięcia) między zwierzętami. Nowy zestaw instrumentów jest używany co 5 zwierząt.</li>
	<li>Monitorować zwierzęta codziennie przez co najmniej 3 dni po operacji i kontynuować monitorowanie zwierząt co tydzień po powrocie do zdrowia po operacji zgodnie z protokołem IACUC. 
	UWAGA: Jeśli wystąpią jakiekolwiek powikłania (zatrzymanie moczu, infekcje po nacięciach, zaburzenia neurologiczne, takie jak drgawki lub paraliż), należy skontaktować się z weterynarzem w celu ustalenia odpowiedniego leczenia i czy zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji. Jeśli buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu nie jest stosowana, środek przeciwbólowy należy podawać codziennie po zabiegu chirurgicznym zgodnie z protokołem IACUC.</li>
</ol>
4. Ocena specyficznego dla tkanki knockdownu po wstrzyknięciu IT
<ol>
	<li>Dwa tygodnie po wstrzyknięciu ASO w bolusie IT należy pobrać różne obszary mózgu (tj. korę mózgową, prążkowie i móżdżek), a także różne segmenty rdzenia kręgowego (tj. szyjkę macicy, klatkę piersiową i odcinek lędźwiowy). Wyodrębnij całkowite tkankowe RNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA i przeprowadź reakcję syntezy cDNA zgodnie z wcześniejszym opisem13. 
	UWAGA: Do qPCR użyto standardowych odczynników z następującymi testami: szczur Malat1 i szczur GAPDH. Względne poziomy transkryptu obliczono metodą 2-ΔΔCT (CT = cykl progowy).</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CNS+barriers%3A+evolution%2C+differentiation%2C+and+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).</li>
<li>Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+modulation+of+the+blood+brain+barrier%3A+CNS+delivery+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1138017(2016).</li>
<li>Daneman, R., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Brain barriers in health and disease.</a> Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).</li>
<li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%3A+an+overview%3A+structure%2C+regulation%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).</li>
<li>Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+the+blood-brain+barrier%3A+molecular+anatomy+and+possible+investigation+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches.</a> Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).</li>
<li>Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+delivery+through+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in delivery through the blood-brain barrier.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).</li>
<li>Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+look+at+cerebrospinal+fluid+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">A new look at cerebrospinal fluid circulation.</a> Fluids Barriers CNS. 11, 10(2014).</li>
<li>Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loss+of+delta+opioid+analgesia+and+binding+by+antisense+oligodeoxynucleotides+to+a+delta+opioid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor.</a> Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).</li>
<li>Wahlestedt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligodeoxynucleotides+to+NMDA-R1+receptor+channel+protect+cortical+neurons+from+excitotoxicity+and+reduce+focal+ischaemic+infarctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions.</a> Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).</li>
<li>Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+anxiety+and+neuropeptide+Y-Y1+receptors+by+antisense+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides.</a> Science. 259 (5094), 528-531 (1993).</li>
<li>Mazur, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple%2C+rapid%2C+and+robust+intrathecal+catheterization+method+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).</li>
<li>Wolf, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+dual-isotope+molecular+imaging+elucidates+principles+for+optimizing+intrathecal+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311(2016).</li>
<li>Becker, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+reduction+of+ataxin-2+extends+lifespan+and+reduces+pathology+in+TDP-43+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice.</a> Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).</li>
<li>Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+noncoding+RNA+Malat1%3A+Its+physiological+and+pathophysiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions.</a> RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).</li>
<li>Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Targeted+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">RNA-Targeted Therapeutics.</a> Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).</li>
<li>DeVos, S. L., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intraventricular+delivery+of+drugs+to+the+rodent+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. (75), e50326(2013).</li>
<li>McCampbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotides+extend+survival+and+reverse+decrement+in+muscle+response+in+ALS+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).</li>
<li>Schoch, K. M., Miller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+Oligonucleotides%3A+Translation+from+Mouse+Models+to+Human+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases.</a> Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).</li>
<li>Lane, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Antisense+Technology+into+a+Treatment+for+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).</li>
<li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotides+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Neurological+Disorders%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotides in neurological disorders.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li>
<li>Haché, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+Injections+in+Children+With+Spinal+Muscular+Atrophy%3A+Nusinersen+Clinical+Trial+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience.</a> Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).</li>
<li>Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nusinersen+in+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy.</a> Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).</li>
<li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nusinersen+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Neurological+Disorders%22%5BJournal%5D)">Nusinersen for spinal muscular atrophy.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są pracownikami firm Biogen, Inc. lub Ionis Pharmaceuticals. Autorzy otrzymują opisane w artykule oligonukleotydy antysensowne od firmy Ionis Pharmaceuticals.

Niniejszy artykuł przedstawia skuteczną metodę dostarczania środków terapeutycznych bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego szczura. Teoretycznie podobną technikę można również zastosować u myszy, choć ze względu na mniejszy rozmiar metoda może być bardziej wymagająca. Dlatego nasza grupa wykonuje zastrzyki domózgowo-komorowe (ICV) u myszy w celu dostarczenia leku do OUN, które osiągają te same cele poprzez inną drogę podawania. Metoda ta została opisana w innym badaniu16.
<p class="jove_...

Układ naczyniowy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) rozwinął się jako krytyczny regulator homeostazy, kontrolując ruch molekuł, dostarczając składników odżywczych i pozbywając się odpadów. System ten jest również pierwszą linią obrony przed atakami zewnętrznych patogenów, dzięki gęstemu rozmieszczeniu ścisłych połączeń wzdłuż ścian komórek śródbłonka. Te ścisłe połączenia stanowią jeden z aspektów bariery krew-mózg (BBB). Podczas gdy BBB umożliwia transport cząsteczek niezbędnych do zaspokojenia zapotrzebowania na składniki odżywcze i energię (np. jony, glukoza), selektywnie ogranicza również przechodzenie patogenów, a także toksycznych chemikaliów1,2,3.
Jak na ironię, ta sama funkcja ochronna BBB, która ogranicza przenikanie patogenów i toksycznych substancji chemicznych, jest również główną przeszkodą dla naszej zdolności do łatwego dostępu do OUN z leczeniem terapeutycznym po ogólnoustrojowym podaniu do organizmu2,4,5. Ta rola BBB przyczyniła się do opracowania mnóstwa nowych technologii i podejść do dystrybucji leków6.
Jednym ze sposobów pokonania tej przeszkody jest wstrzyknięcie leków bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), który nieustannie przenika zarówno mózg, jak i rdzeń kręgowy7,8,9,10. W tym artykule opisujemy metodę skutecznego dostarczania środków do lędźwiowej przestrzeni śródoponowej poprzez umieszczenie wewnętrznego końca cewnika całkowicie w przestrzeni ogona końskiego kręgosłupa szczura. Opis tej procedury został wcześniej opublikowany przez Mazura i in. w innym miejscu11.
Protokół jest bardzo skuteczny i daje ponad 90% skuteczność dostarczania oligonukleotydów antysensownych (ASO) do OUN, gdy jest oceniany za pomocą ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) docelowego genu knockdown8. Zabieg powoduje minimalny dyskomfort u zwierząt, ponieważ 100% szczurów przeżywa operację i wykazuje minimalny obrzęk wokół rany operacyjnej oraz brak oznak niepokoju (np. nadpobudliwość, odwodnienie, krążenie, utrata równowagi, zmniejszone spożycie pokarmu i odwodnienie) podczas obserwacji pooperacyjnej. Kolejną zaletą opisywanej tutaj metody jest to, że nie wymaga ona drogiego sprzętu, ani żadnych specjalnych narzędzi.

<table><tbody><tr><td>3M Steri-Drape Mała serweta z otworem samoprzylepnym</td><td>3M</td><td></td><td>1020</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Decon Laboratories, Inc</td><td></td><td>8416-160Z</td></tr><tr><td>Patyczki nasączone alkoholem</td><td>Dynarex</td><td></td><td>NO 1204</td></tr><tr><td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD Strzykawki ogólnego użytku 1 ml Końcówka Luer-Lok</a></td><td>BD</td><td>1ml TB Końcówka Luer-Lok</td><td>BD 302830</td></tr><tr><td>Rurka BD Intramedic PE</td><td></td><td>Rurka polietylenowa BD PE50 Średnica 0,023 cala</td><td>BD 427400 (10 stóp, Fischer Scientific 22-204008) lub 427401 (100 stóp, Fischer Scientific 14-170-12P)</td></tr><tr><td>Rurka BD Intramedic PE</td><td></td><td>Rurka polietylenowa BD PE10 Średnica 0,011 cala</td><td>BD 427410 (10 stóp, Fischer Scientific 14-170-11B) lub 4274011 (100 stóp, Fischer Scientific 14-170-12B)</td></tr><tr><td>Adaptery rurek BD Intramedic PE</td><td></td> BD <td>23 gauge intramedic luer stub adaper</td><td>BD 427565 lub Fisher Scientific 14-826-19E</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Igły jednorazowego użytku 30G</td><td>BD</td><td></td><td>BD</td></tr> 305128 <tr><td>Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu-lab</td><td>ZooPharm</td><td>Wymagana</td><td></td></tr><tr><td>recepta Sterylizator tlenku etylenu</td><td>Andersen Sterilizer INC.</td><td>AN 74i, sterylizator gazowy</td><td>Kaniula prowadząca AN 74i</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>19G x 1 WT (1,1 mm x 25mm) igła</td><td>BD 305186</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 100ul</td><td>firma Hamilton</td><td>strzykawka Hamilton 100ul</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator gorących kulek</td><td>Narzędzia</td><td></td> naukowe <td>STERYLIZATOR MODELNO FST 250</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Dechra produkt</td><td></td> weterynaryjny <td>17033-211-38</td></tr><tr><td>Pocket Pro Pet Trymer</td><td>Braintree Scientific</td><td></td><td>CLP-9931 B</td></tr><tr><td>Peeling Povidone</td><td>PDI</td><td></td><td>S48050</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>Chlorek sodu 0,9% Napar dożylny BP 50ml</td><td></td></tr><tr><td>FE1306G Skalpel</td><td>Feather</td><td>jednorazowy skalpel</td><td>nr 10</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza dla małych zwierząt</td><td>K& H Model produkcyjny</td><td></td><td># 1060</td></tr><tr><td>Drut Stylet</td><td>McMaster-Carr</td><td>1749T14</td><td>LH-36233780</td></tr><tr><td>Serweta na ręcznik chirurgiczny</td><td>Dynarex</td><td></td><td>4410</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne i kleszcze</td><td>FST i Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon</td><td></td><td>4-0 lub 5-0</td></tr><tr><td>Narzędzie do wykonania prowadnicy kanciastej</td><td>Grainger</td><td>Narzędzie obrotowe (Dremel)</td><td>14H446 (Mfr: EZ456)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Blokada EZ odcięta Koło</td><td>1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Ściernica, Tlenek glinu</td><td>38EY44 (Mfr: EZ541GR)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Trzpień zamka EZ</td><td>1PKX8 (Mfr: EZ402-01)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Podłoga z tarczą diamentową Płytka</td><td>3DRN4 (Mfr: EZ545)</td></tr><tr><td>Alternatywne źródło gotowych i wysterylizowanych materiałów do tej procedury</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System cewników dozujących</td><td>Systemy infuzyjne SAI</td><td>Prowadnica</td><td></td></tr><tr><td>kaniuli</td> Systemy <td></td><td>infuzyjne SAI Cewniki</td> wewnętrzne <td>RIDC-GCA</td></tr><tr><td></td><td>Systemy infuzyjne SAI Systemy</td><td></td> infuzyjne <td>RIDC-INC</td></tr><tr><td>Stylet Wire</td><td>SAI</td><td></td><td>RIDC-STY</td></tr></tbody></table>

dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

Bariera krew-mózg (BBB) jest ważnym zabezpieczeniem przed przedostaniem się potencjalnie toksycznych lub chorobotwórczych czynników z krwi do ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Jednak jego istnienie drastycznie obniża również dostępność leków podawanych ogólnoustrojowo do OUN. Jedną z metod przezwyciężenia tego problemu jest wstrzyknięcie tych środków bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), omijając w ten sposób barierę krew-mózg. Można to osiągnąć poprzez wszczepienie cewnika do ciągłej infuzji za pomocą pompy osmotycznej lub do podawania w pojedynczym bolusie. W tym artykule opisujemy protokół chirurgiczny dostarczania oligonukleotydów antysensownych (ASO) ukierunkowanych na OUN przez cewnik wszczepiony bezpośrednio w przestrzeń ogona końskiego kręgosłupa dorosłego szczura. Jako reprezentatywne wyniki pokazujemy skuteczność pojedynczego wstrzyknięcia dooponowego ASO w bolusie (IT) za pomocą tego systemu cewnikowania w powalaniu docelowego RNA w różnych regionach OUN szczura. Zabieg jest bezpieczny, skuteczny i nie wymaga drogiego sprzętu ani narzędzi chirurgicznych. Opisana tutaj technika może być zaadaptowana do dostarczania leków również w innych modalnościach.

Stosując opisaną tutaj metodę, wykonaliśmy iniekcje u dwóch grup dorosłych samic szczurów (250−30 g; n = 10/grupa) pojedynczą dawką bolusową soli fizjologicznej PBS lub 30 µg ASO celującego w długi niekodujący (linc) RNA Malat1; w naszym laboratorium rutynowo stosujemy ASO Malat1 jako związek kontrolny, ponieważ Malat1 jest powszechnie i w wysokich poziomach ekspresowany we wszystkich tkankach14, w tym w mózgu i rdzeniu kręgowym. ASO Malat1 działa poprzez mechanizm...

Tutaj opisujemy metodę dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez wszczepienie cewnika w śródoponową przestrzeń lędźwiową kręgosłupa. Koncentrujemy się na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych, chociaż ta metoda nadaje się również do dostarczania innych metod terapeutycznych.

Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Protokół ten umożliwia bezpośrednie dostarczanie środków terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego szczura w celu oceny farmakokinetyki, farmakodynamiki i skuteczności nowych terapii w modelach chorób szczurów. Ta procedura jest bezpieczna, skuteczna i nie wymaga drogiego sprzętu ani narzędzi chirurgicznych. Procedurę zademonstrują Yi Chen i Yi Luo, naukowcy z mojego laboratorium.Aby przygotować specjalne kaniule prowadzące, użyj narzędzia obrotowego z kołem do odcięcia, aby odciąć oba końce igły o rozmiarze 19, aby uzyskać kaniulę prowadzącą o długości około półtora do dwóch centymetrów. Następnie użyj ściernicy narzędzia obrotowego, aby wygładzić oba końce. Aby przygotować zespół drutu cewnika, wytnij jeden ośmiocentymetrowy kawałek rurki PE10 o średnicy 011 cali, który będzie służył jako cewnik dokanałowy dla każdego zwierzęcia.Użyj markera odpornego na etanol, aby zaznaczyć dwa centymetry od jednego końca każdego kawałka rurki. Dla każdego zwierzęcia należy wprowadzić 11-centymetrowy drut stylikowy wycięty z drutu ze stali nierdzewnej pokrytej politetrafluoroetylenem do światła ośmiocentymetrowego cewnika PE10. Aby przygotować zespół cewnika do podania, wytnij kawałek cewnika PE50 o średnicy od pięciu do 10 centymetrów i średnicy 023 cali i włóż adapter rurki o rozmiarze 23 do jednego końca cewnika.Następnie włóż igłę o rozmiarze 30 z odciętym piastą w około 0,5-centymetrowy kawałek rurki PE10 i podłącz rurkę PE10 do drugiego końca cewnika. Aby przygotować zespół kaniuli prowadzącej i igły, umieść kaniulę prowadzącą na końcu igły o rozmiarze 23. Przed przystąpieniem do zabiegu należy położyć poduszkę grzewczą na stole operacyjnym i przykryć ją sterylnym prześcieradłem.Umieść stożkową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na arkuszu i potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego szczura doświadczalnego. Po zważeniu zwierzęcia ogol grzbiet od ogona do ogonowego odcinka piersiowego kręgosłupa i połóż ogolonego szczura na sterylnym prześcieradle w pozycji leżącej. Umieść rurkę o pojemności 50 ml pod brzuchem, aby zgiąć kręgosłup w okolicy lędźwiowej i nałóż maść okulistyczną na oczy.Następnie wstrzyknąć podskórnie jeden miligram na kilogram buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu i oczyścić odsłoniętą skórę sekwencyjnym peelingiem powidonowym i alkoholowym. Ułóż zwierzę sterylnym przezroczystym arkuszem z fenestracją. W celu umieszczenia cewnika i wstrzyknięcia związku zidentyfikuj dwa naturalne wgłębienia między mięśniami nad ogoloną miednicą, a jedną ręką trzymając doły, drugą ręką delikatnie naciśnij i poczuj kręgosłup od kierunku ogonowego do rostralnego, aby zlokalizować pierwsze główne wgłębienie między kręgami.Po zidentyfikowaniu przestrzeni międzykręgowej między kręgami S1 i L6, przesuń się lekko rostralnie, aby zidentyfikować przestrzeń międzykręgową między kręgami L5 i L6. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie o długości nie większej niż dwa centymetry w skórze i torebce mięśniowej w tym miejscu wzdłuż linii środkowej od kierunku rostralnego do ogonowego, tak aby miejsce wstrzyknięcia znajdowało się w środku nacięcia. Użyj nożyczek preparacyjnych, aby wypreparować tkankę łączną, aż będzie można uwidocznić warstwę mięśniową.Wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w torebce mięśniowej bezpośrednio po stronie grzbietowego wyrostka rdzeniowego kręgu lędźwiowego L6. Umieść zespół igły kaniuli prowadzącej w pobliżu przedniej części szóstego kręgu lędźwiowego i wepchnij zespół do przestrzeni międzykręgowej wzdłuż przedniej części szóstego kręgu tak, aby koniec igły przechodził przez kanał kręgowy. Użyj kleszczy, aby zlokalizować grzbietowy wyrostek rdzeniowy kręgu lędźwiowego L6, a następnie wepchnij igłę wzdłuż przedniej części szóstego kręgu do przestrzeni bezkręgowców.Wciśnij kaniulę prowadzącą na miejsce wzdłuż igły, wyjmij igłę i włóż zespół drutu cewnika do kaniuli prowadzącej. Ustawiając cewnik pod kątem około 45 stopni do kanału kręgowego, wciśnij koniec cewnika na około 0,3 centymetra do kanału. Usuń drut stylizowany około 2,5 centymetra od śródoponowej końcówki cewnika i wsuń cewnik do kanału kręgowego, aż dwucentymetrowe oznaczenie na cewniku będzie widoczne poniżej mięśnia.Gdy cewnik jest na swoim miejscu, wyjmij kaniulę prowadzącą, aby pozostawić cewnik i drut sztyftowy na miejscu. Wsuń cewnik do kanału kręgowego, aż dwucentymetrowy znak znajdzie się przy wejściu do kanału i całkowicie wycofaj drut sztyftowy. Płyn mózgowo-rdzeniowy może być uwidoczniony wchodzący do wszczepionego cewnika.Następnie podłącz zespół cewnika podającego do dystalnego końca wszczepionego cewnika za pomocą końcówki igły o rozmiarze 30. Następnie załadować 60 mikrolitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej do strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów i załadować bolus 30 mikrolitrów badanego związku do drugiej strzykawki. Podłącz strzykawkę z solą fizjologiczną do końcówki adaptera rurki zespołu cewnika doprowadzającego i przepłucz 20 mikrolitrów sterylnego soli fizjologicznej do przestrzeni dooponowej.Po przepłukaniu całego roztworu soli fizjologicznej zastąpić strzykawkę z solą fizjologiczną strzykawką z bolusem i wstrzyknąć 30 mikrolitrów badanego związku do przestrzeni dokanałowej przez okres 30 sekund. Po dostarczeniu całego bolusa zastąpić strzykawkę z bolusem inną strzykawką z solą fizjologiczną i przepłukać cewnik dodatkowymi 40 mikrolitrami soli fizjologicznej. Po dostarczeniu drugiej objętości soli fizjologicznej odłącz zespół cewnika podającego od wszczepionego cewnika i użyj pary bardzo gorących, sterylizowanych termicznie kleszczy preparacyjnych, aby zacisnąć rurkę, aby aseptycznie przeciąć i uszczelnić wszczepiony cewnik.Użyj wchłanialnych szwów monofilamentowych, aby przymocować zgrzewalny cewnik do tkanki łącznej, a następnie użyj szwów niewchłanialnych, aby zamknąć skórę. Następnie użyj gazy i soli fizjologicznej, aby zmyć krew ze skóry i umieść szczura w podgrzewanym inkubatorze z monitorowaniem aż do pełnego odzyskania sprawności. W tym reprezentatywnym eksperymencie uzyskano bardzo dobry knockdown we wszystkich regionach pobranych po podaniu oligonukleotydu antysensownego w pojedynczym bolusie, jak pokazano.Mierzono jednak pewien stopień zmienności regionalnej, przy czym rdzeń kręgowy wykazywał najwyższy odsetek knockdownu. Po udanym wstrzyknięciu oligonukleotydu antysensownego lub innych środków terapeutycznych do odpowiedniego modelu, można ocenić farmakokinetykę, farmakodynamikę i skuteczność środków terapeutycznych.

intrathecal-delivery-antisense-oligonucleotides-rat-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Chen, Y., et al. Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje dostarczanie badanego związku do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) przez cewnik wszczepiony w odcinek lędźwiowy kręgosłupa modelu szczurzego. Związek krąży wzdłuż płynu mózgowo-rdzeniowego do mózgu i rdzenia kręgowego, wnika do neuronów i oferuje potencjał terapeutyczny.

Dokanałowe podawanie badanego związku do ośrodkowego układu nerwowego szczura

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Opisujemy metodę kierowania leków do ośrodkowego układu nerwowego poprzez wszczepienie cewnika lub wykonanie wstrzyknięcia bolusa do prawej bocznej komory u myszy. Skupiamy się w szczególności na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych. Technika ta można łatwo dostosować do innych leków i szczurów.

Bezpośrednie dokomorowe dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Ten raport opisuje prostą i szybką technikę dokanałowego nakłuwania igły w celu miejscowej transfekcji siRNA w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy w krótkotrwałym znieczuleniu światłem.

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.

Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego

Tutaj prezentujemy technikę bezpośredniego wstrzykiwania dokanałowego przy użyciu 1% chlorowodorku lidokainy w roztworze wirusa, aby zapewnić efektywne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem małym zwierzętom i ustanowić system punktacji do przewidywania skuteczności transdukcji w ośrodkowym układzie nerwowym w zależności od stopnia przejściowego osłabienia wywołanego przez lidokainę.

Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący urządzenie do pozycjonowania myszy, który umożliwia odpowiednie rozmieszczenie myszy do donosowego podawania preparatu peptydowo-siRNA ukierunkowanego na mózg, umożliwiając skuteczne wyciszanie genów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego

Obecny protokół przedstawia instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy w celu edycji genów i dostarczania leków.

Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków

Opisano procedurę chirurgiczną polegającą na wykonaniu zastrzyków do spłuczki lędźwiowej młodego szczura. Podejście to zostało wykorzystane do dokanałowego dostarczania wektorów terapii genowej, ale przewiduje się, że podejście to może być stosowane w różnych terapiach, w tym komórkach i lekach.

Podanie wektorowe dokanałowo u młodych szczurów przez wstrzyknięcie do spłuczki lędźwiowej

Wstrzyknięcie dooponowe lędźwiowe stanowi translacyjnie istotną drogę podania dla dostarczania terapii genowej do ośrodkowego układu nerwowego. Ten kompleksowy, ustandaryzowany protokół wstrzyknięć dooponowych w odcinek lędźwiowy u noworodków, młodych i dorosłych myszy i szczurów ma na celu pomóc naukowcom w przyjęciu tej techniki do przedklinicznych badań nad terapią genową.

Lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów

Niniejszy artykuł opisuje metody podawania wewnątrz OUN dla terapii ukierunkowanych na OUN u dorosłych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem precyzji protokołu i umożliwienia powtarzanych wstrzykiwań. Zawiera wyniki badania walidacyjnego, w którym oligonukleotydy antysensowne zmniejszały ekspresję mutantnego SOD1 u modelowych myszy SOD1-ALS, co potwierdza przydatność tego podejścia w przedklinicznych badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Intrathekalne wstrzykiwanie SOD1-ASO do lędźwia w celu precyzyjnego celowania i predykcyjnej skuteczności ośrodkowej układu nerwowego (CNS) u ludzkich myszy SOD1-G93A ALS

Poznaj metodę dokanałowego dostarczania oligonukleotydów antysensownych do ośrodkowego układu nerwowego szczura. Ta technika umożliwia badanie farmakokinetyki i skuteczności nowych terapii w modelach chorób.

Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

Przeglądaj więcej filmów