Name: Wykrywanie raka jajnika za pomocą fotoakustycznej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę wykrywania komórek nowotworowych w krwi obwodowej za pomocą fotoakustycznej cytometrii przepływowej z nanocząstkami siarczku miedzi. Ta technika oferuje specyficzną i niskokosztową diagnostykę raka jajnika.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Madeleine Howell za pomoc w syntezie, Matthew Chestowi za pomoc w projektowaniu systemu przepływu oraz Ethanowi Marschallowi za pomoc w SolidWorks.

1. Synteza i funkcjonalizacja nanocząsteczek
UWAGA: Synteza NPs FA-CuS jest przeprowadzana przy użyciu metody syntezy w jednym naczyniu (one pot), zaadaptowanej z wcześniej opublikowanego protokołu21. 
OSTRZEŻENIE: Wszystkie etapy syntezy powinny odbywać się w wentylowanej dygestorium chemicznym.
<ol>
	<li>Przed syntezą przefiltrować około 300 mL wody dejonizowanej (DI) przez sterylny filtr 0,2 µm.</li>
	<li>Umyć szklaną kolbę okrągło dnną o pojemności 250 mL roztworem detergentu i wypłukać wodą DI. Dodać 0,0134 g CuCl2 do 100 mL wody DI, aby przygotować roztwór 1 mM.</li>
	<li>Dodać 0,015 g kwasu foliowego (FA) do roztworu CuCl2 i mieszać przez około 5 min za pomocą magnetycznego mieszadła.</li>
	<li>Dodać Na2S·9H2O (0,024 g w 100 µL wody DI) do mieszaniny reakcyjnej w czasie około 10 s, używając pipety 200 µL. 
	UWAGA: Po dodaniu Na2S·9H2O roztwór zmieni kolor z jasnohżółtego na ciemnobrązowy.</li>
	<li>Zamknąć naczynie reakcyjne i umieścić w kąpieli olejowej ustawionej na 90 °C, kontynuując mieszanie za pomocą mieszadła magnetycznego. Po około 15 min lub gdy kąpiel olejowa osiągnie 85−90 °C, kontynuować reakcję przez kolejną godzinę. Mieszanina powinna stopniowo przybrać ciemnozielony kolor. 
	UWAGA: Należy zapewnić odpowietrzenie układu podczas ogrzewania mieszaniny reakcyjnej, aby uniknąć wzrostu ciśnienia.</li>
	<li>Wyjąć naczynie reakcyjne z kąpieli olejowej i krótko chłodzić w temperaturze pokojowej przez około 10 do 15 min przed przeniesieniem do kąpieli lodowej.</li>
	<li>Gdy mieszanina reakcyjna ochłodzi się poniżej 20 °C, dostosować pH do wartości 10 za pomocą 1M NaOH, aby rozpuścić pozostały w roztworze kwas foliowy.</li>
	<li>Oczyścić mieszaninę reakcyjną FA-CuS za pomocą kolumny do wirowania 30 kDa. Nakładać roztwór na kolumnę partiami po 15 mL i wirować przy 3 082 x g przez 15 min.</li>
	<li>Po zagęszczeniu całej mieszaniny reakcyjnej połączyć zagęszczone frakcje i przemyć 4x 15 mL NaOH o pH 10 w kolumnie do wirowania 30 kDa.</li>
	<li>Do pomiarów masy pobrać 1/3 roztworu (~66 µL) i rozdzielić do trzech szklanych fiolek. Suszyć w suszarce próżniowej przez noc w temperaturze 40 °C pod próżnią ~27 mmHg.</li>
	<li>Pozostałe 2/3 zagęszczonego roztworu rozpuścić w 250 µL PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.</li>
	<li>Przed wykorzystaniem NP FA-CuS poddać je sonikacji przez 30 min w kąpieli ultradźwiękowej na wysokim ustawieniu.</li>
</ol>
2. Charakterystyka NP
<ol>
	<li>Przeprowadź dynamiczne rozpraszanie światła (DLS). Dodaj 10 µL stężonych FA-CuS NPS w roztworze PBS z kroku 1.1.14 do 2 mL wody DI. Przed charakterystyką metodą DLS poddaj cząstki sonikacji przez 30 min w myjce ultradźwiękowej na wysokim ustawieniu i przefiltruj przez sterylny filtr 0,2 µm w celu usunięcia pozostałości kurzu.</li>
	<li>Przeprowadź transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM): Nałóż 10 µL stężonych FA-CuS NPS w roztworze PBS na kawałek papieru woskowanego. Odwróć miedzianą siatkę pokrytą formvarem i umieść ją na kropli, pozostawiając na 2 min. Dotknij krawędzi siatki pokrytej formvarem kawałkiem papieru filtracyjnego, aby usunąć nadmiar cieczy. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Wykonaj obrazowanie siatki miedzianej przy użyciu mikroskopu elektronowego przy napięciu przyspieszającym 80 kV. 
	UWAGA: Typowe wyniki charakterystyki FA-CuS NPS przedstawiono na Rysunku 1.</li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Niniejszy protokół wykorzystuje komórki SKOV-3. O ile nie zaznaczono inaczej, hodować komórki SKOV-3 w pożywce McCoy's 5A uzupełnionej o 10% FBS, 100 U/mL penicyliny oraz 100 µg/mL streptomycyny, utrzymując je w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżeniem i 5% CO2).</li>
</ol>
4. Znakowanie fluorescencyjne NP FA-CuS do mikroskopii
<ol>
	<li>Dodaj ester sukcesynimidowy Texas-Red-X (0,2 mg rozpuszczone w DMSO w stężeniu 10 mg/mL) do roztworu zawierającego 2 mg NP FA-CuS w 1 mL buforu 0,1 M NaHCO3 (pH ~9).</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną mieszaj za pomocą magnetycznego mieszadła przez 1 h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Skoncentruj mieszaninę reakcyjną w kolumnie do wirowania 4 mL o MWCO 30 kDa, wirując przy 4 000 x g przez 10 min.</li>
	<li>Przemyj skoncentrowany roztwór 3x za pomocą 4 mL buforu 0,1 M NaHCO3 (pH ~9) w kolumnie do wirowania. Następnie przemyj skoncentrowany roztwór 4 mL wody DI 3x lub do momentu, aż w filtracie zaobserwowane zostaną jedynie śladowe ilości fluorescencji w pomiarze UV-VIS.</li>
</ol>
5. Pobieranie nanocząsteczek FA-CuS przez komórki raka jajnika
<ol>
	<li>Przed inkubacją z nanocząstkami FA-CuS, inkubować komórki SKOV-3 w kolbie T75 w 8−15 mL pożywki RPMI-1640 bez kwasu foliowego z dodatkiem 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny przez co najmniej 24 h.</li>
	<li>Wysiać komórki w 0,5 mL pełnej pożywki wzrostowej RPMI-1640 bez kwasu foliowego z gęstością 0,1 x 106 komórek/mL do płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Następnego dnia inkubować komórki z 400 µg/mL FA-CuS NPS w 0,5 mL pełnej pożywki wzrostowej RPMI-1640 bez kwasu foliowego przez 2 h.</li>
	<li>Po tej inkubacji poddać komórki trypsynizacji przy użyciu 0,5 mL 0,25% trypsyny z EDTA. Dodać co najmniej 1 mL pełnej pożywki wzrostowej RPMI-1640 bez kwasu foliowego w celu neutralizacji trypsyny, a następnie odwirować komórki przy 123 x g przez 6 min.</li>
	<li>Usunąć nadsącz, zawiesić komórki ponownie w 2 mL PBS i odwirować przy 123 x g przez 6 min. Powtórzyć ten etap płukania 2x, aby usunąć wszystkie niezwiązane nanocząstki.</li>
	<li>Zawiesić komórki ponownie w 1−2 mL PBS z 2% roztworem Tween.</li>
	<li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypanu. W razie zbyt wysokiej liczby komórek, rozcieńczyć je dalej. Rozcieńczyć komórki w PBS z 2% Tween do wybranego stężenia do detekcji.</li>
	<li>Komórki są teraz gotowe do analizy za pomocą systemu PAFC.</li>
</ol>
6. Mikroskopia fluorescencyjna pobierania FA-CuS NPs
<ol>
	<li>Powtórzyć etapy opisane w punkcie 5.1 i przejść do poniższego protokołu mikroskopii.</li>
	<li>Wysiej komórki w gęstości 0,1 x 106 komórek/ml w 0,5 ml pełnej pożywki wzrostowej RPMI-1640 bez kwasu foliowego na szkiełkach podstawkowych w płytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Następnego dnia inkubować komórki z NPs FA-CuS znakowanymi fluorescencyjnie w trzech powtórzeniach, w stężeniach 100 µg/mL, 200 µg/mL, 300 µg/mL, i 400 µg/mL w 0,5 ml kompletnego medium wzrostowego RPMI-1640 pozbawionego kwasu foliowego.</li>
	<li>Inkubować komórki z nanocząsteczkami przez 2 h w 37 °C inkubator</li>
	<li>Po tym okresie inkubacji komórki należy przemyć 3 razy roztworem PBS. 
	UWAGA: Podczas wszystkich etapów płukania należy ostrożnie dodawać roztwór ze ścianki dołka płytki, aby nie naruszyć komórek. Po dodaniu roztworu należy ostrożnie przechylić płytkę i odessać go ze ścianki dołka.</li>
	<li>Inkubować komórki z 0,5 ml 3,7% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 15 min, a następnie przenieść szklane laminki do nowej płytki 24-dołkowej. 
	UWAGA: PFA jest znanym kancerogenem. Wszystkie czynności związane z utrwalaniem należy przeprowadzać w wentylowanej dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej.</li>
	<li>Inkubować komórki w roztworze 3,7% PFA z 0,1% Triton-X w PBS przez 5 min.</li>
	<li>Przemyj komórki 0,5 ml PBS (3 razy, po 5 min za każdym razem), a następnie przenieś szkiełka podstawowe na nową płytkę.</li>
	<li>Inkubować komórki z 0,5 ml roztworu PBS zawierającego DAPI (20 µL/mL (do barwienia używa się roztworu roboczego przygotowanego z roztworu zapasowego o stężeniu 0,5 mg/ml) przez 5 min, w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki trzy razy roztworem PBS.</li>
	<li>Po końcowym przemyciu w PBS, przymocuj szkiełka nakrywkowe do szkiełek podstawowych za pomocą medium montażowego.</li>
	<li>Komórki są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Rysunek 2 przedstawia przykład typowej charakterystyki komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
7. Architektura systemu przepływowego
<ol>
	<li>Konstrukcja komory przepływowej 
	UWAGA: Plik SolidWorks do wydruku 3D zbiornika przepływowego znajduje się w Materiałach uzupełniających.
	<ol>
		<li>Korzystając z dostarczonego pliku SolidWorks, wydrukuj w technologii 3D zbiornik przepływowy z termoplastu ABS lub plastiku PLA. Wymiary podano poniżej, jeśli SolidWorks jest niedostępny. Rycina 3A przedstawia schemat tego modelu. Korpus zbiornika przepływowego ma wymiary 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Na obu końcach zbiornika przepływowego znajdują się otwory o średnicy około 5 mm, umożliwiające wprowadzenie przewodów zawierających kapilarę. 
		UWAGA: Zbiornik przepływowy posiada otwór o średnicy 1 cm, prostopadły do orientacji kapilary, służący do umieszczenia przetwornika ultradźwiękowego. Występ cylindryczny o takiej samej średnicy wewnętrznej jak otwór wchodzi w głąb zbiornika na 6 mm. Do obrazowania w czasie rzeczywistym zbiornik przepływowy posiada szczelinę o wymiarach 1 mm x 3 mm bezpośrednio pod kapilarą.</li>
		<li>Po wydrukowaniu 3D zbiornika przepływowego, oczyść i zmontuj system do użytku.</li>
		<li>Umieść szklane lamie nad szczeliną 1 mm x 3 mm oraz otworem 1 cm w układzie przepływowym.</li>
		<li>Kąśliwie uszczelnij silikonem, aby zapobiec wyciekom.</li>
		<li>Wsuń kapilarę do utwardzonych silikonem przewodów. Wprowadź przewody do komory przepływowej przez bok zbiornika przepływowego w taki sposób, aby szklana kapilara znajdowała się bezpośrednio nad szczeliną 3 mm i otworem 1 cm oraz przed nimi.</li>
		<li>Uszczelnij przewody za pomocą silikonu, aby zapobiec wyciekom.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja fotoakustycznego systemu przepływowego 
	UWAGA: Rycina 3B oraz Rycina 3C przedstawiają przykład architektury systemu przepływowego.
	<ol>
		<li>Podłącz przetwornik do generatora impulsów/odbiornika ultradźwiękowego. Wzmocnij sygnał przy wzmocnieniu 59 dB.</li>
		<li>Podłącz wyjście filtra do wielofunkcyjnego rekonfigurowalnego oscyloskopu wyposażonego w wbudowaną programowalną macierz bramek (FPGA).</li>
		<li>Podłącz jeden z przewodów wychodzących z komory przepływowej do złączki T, połączonej z dwiema pompami strzykawkowymi w każdym odgałęzieniu.</li>
		<li>Napełnij jedną z pomp strzykawkowych powietrzem, a drugą próbką do analizy. Ustaw pompę z powietrzem na szybkość przepływu 40 µL/min, a pompę z próbką na szybkość przepływu 20 µL/min. W wyniku powstania przepływu dwufazowego uzyskiwane będą objętości próbki wynoszące 1 µL. Przy tej szybkości przepływu system będzie testował około 6,4 próbki na minutę. 
		UWAGA: Aby utrzymać jednorodne rozłożenie komórek, lekko wymieszaj każdą próbkę w wirówce typu vortex bezpośrednio przed testowaniem. Dodatkowo obracaj strzykawkę co kilka minut, aby zapobiec sedymentacji komórek w roztworze.</li>
		<li>Podłącz pozostały przewód wychodzący z systemu przepływowego do pojemnika z 10% roztworem wybielacza, aby zutylizować komórki po ich opuszczeniu systemu. 
		UWAGA: Przed uruchomieniem systemu przepływowego sprawdź szczelność, ponieważ wycieki mogą wpływać na przepływ. Komórki muszą znajdować się w układzie zamkniętym, aby zachować bezpieczeństwo biologiczne podczas procedury.</li>
		<li>Konstrukcja wydrukowanego w 3D zbiornika umożliwia spójne i powtarzalne wyrównanie przetwornika i wiązki laserowej przy minimalnej kalibracji. Po prawidłowym umieszczeniu w dedykowanym zbiorniku, kwarcowa kapilara zapewnia bezpośrednie wyrównanie przetwornika i lasera.</li>
		<li>Umieść odcinek kwarcowej kapilary w bezpośredniej linii z przetwornikiem, w polu widzenia mikroskopu, co pozwoli na dokładne umieszczenie światłowodu nad próbką w taki sposób, aby oświetlał on całą szerokość rurki.</li>
		<li>Naświetlaj próbkę za pomocą światłowodu prowadzącego wiązkę z laserowego emitera w stanie stałym pompowanego diodami, pracującego na długości fali 1,053 nm. Zarówno światło lasera padające na próbkę, jak i przetwornik używany do pomiaru efektu fotoakustycznego, pozostają nieogniskowane.</li>
		<li>Energia lasera padająca na próbkę wynosi około 8 mJ, a częstotliwość lasera 10 Hz jest wystarczająca, aby naświetlić każdą próbkę wielokrotnie podczas jej przechodzenia przez system.</li>
		<li>Umieść system przepływowy na mikroskopie odwróconym i upewnij się, że zarówno impuls lasera, jak i droga próbki są widoczne podczas przechodzenia próbki przez system. Rejestruj przepływ za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie.</li>
		<li>Rejestruj akwizycje ultradźwiękowe przy użyciu oprogramowania do akwizycji danych (patrz Tabela materiałów). Wyzwalaj ultradźwięki i impulsowy laser za pomocą FPGA. W jako kontroli ujemnej i dodatniej wykorzystaj odpowiednio PBS z 2% Tween oraz FA-CuS NPs w stężeniu 100 µg/mL w PBS 2% Tween.</li>
		<li>Za pomocą kamery zamontowanej na mikroskopie zarejestruj zarówno wystrzały lasera, jak i przechodzenie próbek przez system przepływowy. Nagrania te będą wykorzystane do skorelowania sygnału akustycznego zarejestrowanego przez przetwornik z momentem wystrzału lasera. Gdy próbki przechodzą przed wiązką lasera, sygnał może zostać skorelowany z wynikającym sygnałem fotoakustycznym w celu analizy. Przy częstotliwości próbkowania 10 Hz laser naświetli każdą porcję próbki kilka razy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Obróbka końcowa
<ol>
	<li>Dla każdego rejestrowanego sygnału, s(t), oblicz transformatę Hilberta, H[s(t)], w celu utworzenia sygnału analitycznego.</li>
	<li>Utwórz obwiednię zespoloną, se(t), obliczając moduł sygnału analitycznego, tak aby <img src="/files/ftp_upload/60279/60279eq1.jpg" alt="Równanie przedstawiające przetwarzanie sygnału, z pierwiastkiem kwadratowym i składnikami transformaty Hilberta, w formie wzoru matematycznego." data-altupdatedat="1788282455000">, a następnie zintegruj obwiednię, aby zmierzyć całkowity sygnał uzyskany z każdego pomiaru. Porównaj sygnały z każdej grupy testowej (tj. PBS, komórki znakowane, nanocząstki FA-CuS NPs, same komórki), wykorzystując test t w oprogramowaniu statystycznym R. Surowe sygnały fotoakustyczne oraz ich transformaty Hilberta przedstawiono na Rysunku 4.</li>
	<li>W celu rekonstrukcji obrazu znormalizuj obwiednię zespoloną w oparciu o maksymalny szczyt z całego pomiaru. W przypadku porównywania serii pomiarów, znormalizuj obwiednię zespoloną, używając maksymalnego szczytu z całej serii. Po normalizacji przekształć każdy pomiar w serię wartości pikseli. Przedstaw każdą serię wartości pikseli jako kolumnę w rekonstrukcji obrazu. Reprezentatywne rekonstrukcje sygnałów PBS oraz FA-CuS NPs pokazano na Rysunku 5, gdzie oba obrazy zostały znormalizowane przy użyciu maksymalnego szczytu z obu pomiarów.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+global+cancer+incidence+and+mortality+in+2018%3A+GLOBOCAN+sources+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Estimating the global cancer incidence and mortality in 2018: GLOBOCAN sources and methods.</a> International Journal of Cancer. 144 (8), 1941-1953 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer+and+their+clinical+value+as+a+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor cells in ovarian cancer and their clinical value as a biomarker.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (5), 1983-1994 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of circulating tumor cells in ovarian cancer: a meta-analysis.</a> PLoS One. 10 (6), e0130873(2015).</li>
<li>Guo, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value+of+HE4%2B+circulating+tumor+cells+in+patients+with+suspicious+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value of HE4+ circulating tumor cells in patients with suspicious ovarian cancer.</a> Oncotarget. 9 (7), 7522-7533 (2018).</li>
<li>Lianidou, E., Hoon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((9+-+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Principles+and+Applications+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">9 - Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA.</a> Principles and Applications of Molecular Diagnostics. , 235-281 (2018).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC cancer. 12 (1), 178(2012).</li>
<li>Galanzha, E., Zharov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+detection+and+capture+by+photoacoustic+flow+cytometry+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell detection and capture by photoacoustic flow cytometry in vivo and ex vivo.</a> Cancers. 5 (4), 1691-1738 (2013).</li>
<li>Nedosekin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+noninvasive+analysis+of+graphene+nanomaterial+pharmacokinetics+using+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">In vivo noninvasive analysis of graphene nanomaterial pharmacokinetics using photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Applied Toxicology. 37 (11), 1297-1304 (2017).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Kim, J., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry%3A+principle+and+application+for+real-time+detection+of+circulating+single+nanoparticles%2C+pathogens%2C+and+contrast+dyes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optic%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry: principle and application for real-time detection of circulating single nanoparticles, pathogens, and contrast dyes in vivo.</a> Journal of Biomedical Optic. 12 (5), 1-14 (2007).</li>
<li>Miranda, C., Sampath Kumar, S., Muthuswamy, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic micropipette.</a> Applied Physics Letters. 113 (26), 264103(2018).</li>
<li>Miranda, C., Barkley, J., Smith, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrauterine+photoacoustic+and+ultrasound+imaging+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Intrauterine photoacoustic and ultrasound imaging probe.</a> Journal of Biomedical Optics. 23 (4), 1-9 (2018).</li>
<li>Galanzha, E. I., Zharov, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry.</a> Methods. 57 (3), 280-296 (2012).</li>
<li>O'Brien, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+of+circulating+tumor+cells+using+photoacoustic+flowmetry+and+two+phase+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Capture of circulating tumor cells using photoacoustic flowmetry and two phase flow.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (6), 061221(2012).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+flow+cytometry+for+single+sickle+cell+detection+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic flow cytometry for single sickle cell detection in vitro and in vivo.</a> Analytical Cellular Pathology. 2016, 11(2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment%2C+photoacoustic+diagnosis%2C+and+photothermal+purging+of+infected+blood+using+multifunctional+gold+and+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles.</a> PLoS One. 7 (9), e45557(2012).</li>
<li>Hannah, A., Luke, G., Wilson, K., Homan, K., Emelianov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indocyanine+green-loaded+photoacoustic+nanodroplets%3A+dual+contrast+nanoconstructs+for+enhanced+photoacoustic+and+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Indocyanine green-loaded photoacoustic nanodroplets: dual contrast nanoconstructs for enhanced photoacoustic and ultrasound imaging.</a> ACS Nano. 8 (1), 250-259 (2013).</li>
<li>Kim, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+plasmonic+assemblies+of+gold+nanoparticles+with+multimodal+function+for+targeted+cancer+theragnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Near-infrared plasmonic assemblies of gold nanoparticles with multimodal function for targeted cancer theragnosis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17327(2017).</li>
<li>Ku, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+sulfide+nanoparticles+as+a+new+class+of+photoacoustic+contrast+agent+for+deep+tissue+imaging+at+1064+nm%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm.</a> ACS Nano. 6 (8), 7489-7496 (2012).</li>
<li>Parker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor+expression+in+carcinomas+and+normal+tissues+determined+by+a+quantitative+radioligand+binding+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay.</a> Analytical Biochemistry. 338 (2), 284-293 (2005).</li>
<li>Cheung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+folate+receptor+alpha+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Targeting folate receptor alpha for cancer treatment.</a> Oncotarget. 7 (32), 52553(2016).</li>
<li>Zhou, M., Song, S., Zhao, J., Tian, M., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theranostic+CuS+nanoparticles+targeting+folate+receptors+for+PET+image-guided+photothermal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Theranostic CuS nanoparticles targeting folate receptors for PET image-guided photothermal therapy.</a> Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 8939-8948 (2015).</li>
<li>Lusk, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+Flow+System+for+the+Detection+of+Ovarian+Circulating+Tumor+Cells+Utilizing+Copper+Sulfide+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic Flow System for the Detection of Ovarian Circulating Tumor Cells Utilizing Copper Sulfide Nanoparticles.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (3), 1553-1560 (2019).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+circulating+tumor+cells+%28CTCs%29+captured+by+microfluidic+device+in+patients+with+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Predictive value of circulating tumor cells (CTCs) captured by microfluidic device in patients with epithelial ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 145 (2), 361-365 (2017).</li>
<li>Blassl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+single+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer-Establishment+of+a+multi-marker+gene+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel.</a> Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+living+circulating+tumor+cells+in+patients+by+immunomagnetic+negative+enrichment+coupled+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry.</a> Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).</li>
<li>Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+capture+of+breast+cancer+cells+with+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007(2016).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+monitoring+of+circulating+single+cancer+cells+and+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents.</a> Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten jest prostą metodą wykrywania CTC jajników przy użyciu PAFC i celowanego środka kontrastowego CuS. Zbadano wiele metod wykrywania CTC jajników, w tym urządzenia mikroprzepływowe, RT-PCR i fluorescencyjną cytometrię przepływową 23,24,25. Różnią się one złożonością, kosztem i dokładnością, co ogranicza ich skuteczność w warunkach klinicznych. PAFC wprowadza kilka zalet w porównaniu z tymi tradycyjnymi metodami wykrywa...

Rak jajnika jest jednym z najbardziej śmiertelnych nowotworów ginekologicznych i spowodował około 184 800 zgonów na całym świecie w 2018 roku1. Wiele badań wykazało korelację między progresją raka jajnika (tj. przerzutami) a obecnością CTCs2,3,4. Najpopularniejszą metodą wykrywania i izolacji CTC jest system Cellsearch, który jest ukierunkowany na receptor EpCam5. Ekspresja EpCam jest jednak obniżona w przejściu nabłonkowym do mezenchymalnym, co jest związane z przerzutami raka6. Pomimo postępów, obecne technologie kliniczne nadal borykają się z niską dokładnością, wysokimi kosztami i złożonością. Ze względu na te wady, nowe technologie odkrywania i liczenia CTC jajników stały się ważnym obszarem badań.
Ostatnio PAFC okazał się skuteczną metodą do nieinwazyjnego wykrywania komórek nowotworowych, analizy nanomateriałów i identyfikacji bakterii7,8,9. PAFC różni się od tradycyjnej fluorescencyjnej cytometrii przepływowej wykrywaniem analitów w przepływie za pomocą fotoakustyki. Efekt fotoakustyczny powstaje, gdy światło laserowe jest pochłaniane przez materiał, który powoduje rozszerzanie się termosprężystości, wytwarzając falę akustyczną, która może być wykryta przez przetwornik ultradźwiękowy10,11. Zalety PAFC w porównaniu z tradycyjnymi metodami cytometrii przepływowej obejmują prostotę, łatwość translacji do warunków klinicznych oraz wykrywanie CTC na niespotykanych dotąd głębokościach w próbkach pacjentów12,13. Ostatnie badania wykorzystały systemy PAFC do wykrywania komórek za pomocą endogennego i egzogennego kontrastu14,15. Pochłaniające światło w bliskiej podczerwieni (NIR) środki kontrastowe, takie jak zielony barwnik indocyjaniny i nanocząsteczki metali (np. złoto i CuS), zostały użyte do selektywnego znakowania komórek i tkanek w połączeniu z obrazowaniem fotoakustycznym16,17,18. Ze względu na zwiększoną głębokość przenikania światła NIR w tkankach biologicznych, detekcja fotoakustyczna absorberów może być wykonywana na większych głębokościach do zastosowań klinicznych. Ze względu na duży potencjał do zastosowania w klinice, połączenie celowanych środków kontrastowych NIR z PAFC wzbudziło duże zainteresowanie w wykrywaniu CTC.
PAFC w połączeniu z celowanymi środkami kontrastowymi zapewnia ulepszone podejście do wysokoprzepustowej analizy próbek pacjentów z większą dokładnością i ukierunkowanym wykrywaniem CTC. Jedną z głównych strategii wykrywania CTC jest specyficzne celowanie w białka błonowe obecne w komórce będącej przedmiotem zainteresowania. Jedną z godnych uwagi cech CTC jajników jest nadekspresja receptorów kwasu foliowego zlokalizowanych na ich zewnętrznej błonie19. Ukierunkowanie na receptor kwasu foliowego jest idealną strategią identyfikacji CTC jajników we krwi, ponieważ komórki endogenne, które mają wyższą ekspresję receptorów kwasu foliowego, są na ogół jasne i mają ograniczoną ekspozycję na krwioobieg20. Siarczek miedzi NP (CuS NPs) został niedawno uznany za zdolny do celowania w receptory kwasu foliowego ulegające ekspresji na komórkach nowotworowych21. W połączeniu z ich biokompatybilnością, łatwością syntezy i wchłanianiem głęboko w NIR, te środki kontrastowe NP stanowią idealną strategię celowania do wykrywania CTC jajników z wykorzystaniem PAFC.
Ta praca opisuje przygotowanie NPs FA-CuS i ich użycie do wykrywania komórek raka jajnika w systemie przepływu fotoakustycznego. Nanocząsteczki CuS są modyfikowane kwasem foliowym, aby specyficznie celować w CTC jajników i emitować sygnał fotoakustyczny po stymulacji laserem o długości fali 1053 nm. Wyniki wskazują na skuteczne wykrycie komórek raka jajnika inkubowanych z tymi fotoakustycznymi środkami kontrastowymi w systemie PAFC. Wyniki te wskazują na wykrywanie komórek raka jajnika do stężeń 1 komórki/μl, a mikroskopia fluorescencyjna potwierdza pomyślne wychwytywanie tych cząstek przez komórki raka jajnika SKOV-322. W pracy przedstawiono szczegółowy opis syntezy nanocząsteczek FA-CuS, przygotowania próbek do mikroskopii fluorescencyjnej, budowy systemu przepływu fotoakustycznego oraz detekcji fotoakustycznej komórek raka jajnika. Przedstawiona metoda pokazuje udaną identyfikację CTC jajników w przepływie z wykorzystaniem nanocząsteczek FA-CuS. Przyszłe prace będą koncentrować się na klinicznym zastosowaniu tej technologii w kierunku wczesnego wykrywania przerzutów raka jajnika.

<table><tbody><tr><td>0,025% trypsyna z EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>0,2 i mikro; m 1 000 ml Jednostka filtracji próżniowej</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td>Do filtrowania większych ilości wody DI.</td></tr><tr><td>0,2 &mikro; m sterylny filtr strzykawkowy</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr>Zbiornik <td></td><td>drukowany w 3D</td><td>Niestandardowa</td><td></td></tr><tr><td>karta akwizycyjna</td><td>National Instruments</td><td>PXIe-5170R</td><td>250 MS/s, 8-kanałowy, 14-bitowy</td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985-1.8KG</td><td>Detergent używany do czyszczenia naczyń szklanych.</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4</td><td></td><td>Hematocytometr Millipore</td> UFC803024 <td></td></tr><tr><td>Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek miedzi(II)</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>206532500</td><td></td></tr><tr><td>Cel sprzęgający</td><td>Thorlabs</td><td>LMH-10x-532</td><td>Do pary światło pulsacyjne do światłowodu.</td></tr><tr><td>Stopień sprzęgający</td><td>Newport</td><td>F-91-C1-T</td><td>Stopień do sprzężenia światła pulsacyjnego z obiektywem. Posiada FP-1A i LMH-10x-532</td></tr><tr><td>CPX Series Cyfrowa ultradźwiękowa kąpiel czyszcząca</td><td>Fisherbrand</td><td>Model CPX3800</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>National Instruments</td><td>NI LabVIEW 2017 (32-bit)</td><td>LabVIEW służy do synchronizacji impulsów laserowych z akwizycją danych.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania danych</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2016a</td><td>Rekonstrukcje i wykresy wykonane za pomocą oprogramowania Matlab.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt światłowodowy</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td>Służy do trzymania gołego włókna.</td></tr><tr><td>Łącznik światłowodowy</td><td>Newport</td><td>FP-1A</td><td>3-osiowy stopień do pozycjonowania uchwytu światłowodowego i światłowodu w ognisku obiektywu.</td></tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7876-10G</td><td></td></tr><tr><td>Siatki TEM powlekane formvarem</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>FCF300-CU-SB</td><td></td></tr><tr><td>Rurki</td><td>Masterflex Cole Parmer</td><td>EW-96420-14</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2007</td><td></td></tr><tr><td>Norm-Ject 10 mL Strzykawki</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>4100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Światłowód</td><td>Thorlabs</td><td>FG550LEC</td><td>Służy do wystawiania próbki na działanie światła pulsacyjnego.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62036</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Laser impulsowy</td><td>RPMC Lasers Inc</td><td>Quantus-Q1D-1053</td><td>Impulsowe źródło lasera o specyfikacjach 1053 nm, impuls 8 ns, maksymalnie 10 Hz.</td></tr><tr><td>Odbiornik impulsowy</td><td>Olympus</td><td>5077PR</td><td>Odbiera, filtruje i wzmacnia sygnały fotoakustyczne. Praca z wzmocnieniem 59 dB.</td></tr><tr><td>Kwarcowa rurka kapilarna</td><td>Sutter Instrument</td><td>QF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Midum 1640 (1x) Bez kwasu foliowego</td><td>Gibco</td><td>27016-021</td><td></td></tr><tr><td>Silikon</td><td>Momentive Performance Materials, Inc.</td><td>GE284</td><td></td></tr><tr><td>SKOV-3 Ogniwa</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki wodorotlenku sodu</td><td>BDH</td><td>BDH9292-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny siarczek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431648-50G</td><td></td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>DUAL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X-Succinimydl ester</td><td>Invitrogen</td><td>1949071</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik</td><td>Olynmpus</td><td>V214-BB-RM</td><td>Detektor ultradźwiękowy o częstotliwości centralnej 50 MHz i ułamkowej szerokości pasma -6 dB 82%.</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego 0,4%</td> <td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Żel ultrasonograficzny</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>Aquasonic 100</td><td>Żel ultradźwiękowy do sprzęgania przetwornika</td></tr></tbody></table>

wykrywanie raka jajnika za pomocą fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Wiele badań sugeruje, że liczenie krążących komórek nowotworowych (CTC) może okazać się obiecującym narzędziem prognostycznym dla raka jajnika. Obecne strategie wykrywania CTC obejmują cytometrię przepływową, urządzenia mikroprzepływowe i reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Pomimo najnowszych osiągnięć, metodom wykrywania wczesnych przerzutów raka jajnika nadal brakuje czułości i swoistości wymaganych do translacji klinicznej. W tym miejscu przedstawiono nowatorską metodę wykrywania krążących komórek nowotworowych jajników za pomocą fotoakustycznej cytometrii przepływowej (PAFC) z wykorzystaniem niestandardowego trójwymiarowego (3D) drukowanego systemu, w tym komory przepływowej i pompy strzykawkowej. Metoda ta wykorzystuje nanocząstki siarczku miedzi zamknięte kwasem foliowym (NP FA-CuS) do celowania w komórki raka jajnika SKOV-3 za pomocą PAFC. Praca ta wykazuje powinowactwo tych środków kontrastowych do komórek raka jajnika. Wyniki pokazują charakterystykę NP, wykrywanie PAFC i wychwyt NP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, demonstrując w ten sposób potencjał tego nowego systemu do wykrywania CTC jajników w fizjologicznie istotnych stężeniach.

Rysunek 1A przedstawia typowy obraz TEM zsyntetyzowanych nanocząsteczek. Średnia wielkość typowej nanocząsteczki wynosi około 8,6 nm ± 2,5 nm. Pomiar nanocząsteczek przeprowadzono w programie ImageJ. W celu oddzielenia cząsteczek do pomiaru zastosowano funkcje progowania (threshold) i podziału zlewnych obszarów (watershed). Średnice pozioma i pionowa każdej cząsteczki były mierzone prostopadle do siebie, a następnie wyciągnięto z nich średnią...

Przedstawiono protokół wykrywania krążących komórek nowotworowych jajnika za pomocą specjalnie zaprojektowanego systemu przepływu fotoakustycznego i ukierunkowanych nanocząsteczek siarczku miedzi z kwasem foliowym.

Wykrywanie raka jajnika za pomocą fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Obecne kliniczne metody wykrywania raka jajnika są niespecyficzne i brakuje w nich wykrywania krążących komórek nowotworowych w miejscu opieki. Nasz fotoakustyczny system przepływu umożliwia badanie próbek od pacjentek pod kątem określonych markerów raka jajnika w krwiobiegu. Procedura ta zapewnia unikalną technologię platformy z ulepszeniami w stosunku do obecnych technik pod względem prostoty, niskich kosztów, obiecujących granic wykrywania i możliwości zastosowania w szerokich zastosowaniach.Dzięki tym pracom zamierzamy wykorzystać nasz ukierunkowany system nanocząstek do leczenia raka jajnika w celu badania próbek pobranych ex vivo od pacjentek pod kątem CTC. Ten wysoce wszechstronny system PAFC jest w stanie rozszerzyć się do zastosowań klinicznych, testując obecność szerokiej gamy biomarkerów we krwi. Prawidłowe ustawienie optyczne ma kluczowe znaczenie dla wykrywania celów w systemie fotoakustycznej cytometrii przepływowej.Ponadto, aby zapewnić prawidłowe sprzężenie akustyczne, upewnij się, że między szklanym szkiełkiem a przetwornikiem nie ma pęcherzyków powietrza. Ze względu na niestandardowy charakter systemu przepływu i jego elementów, wizualizacja metody jest korzystna dla dokładnej reprodukcji. W wentylowanym dygestoriach chemicznych przefiltruj około 300 mililitrów wody dejonizowanej przez sterylny filtr 0,2 mikrometra.Dodaj 0,0134 grama chlorku miedzi i 100 mililitrów wody dejonizowanej do czystej kolby okrągłodennej o pojemności 250 mililitrów, aby uzyskać jednomilimolowy roztwór chlorku miedzi. Dodaj 0,015 grama kwasu foliowego do kolby i za pomocą mieszadła magnetycznego mieszaj roztwór przez około pięć minut. Następnie wymieszaj 0,024 grama bezwodnego siarczku sodu ze 100 mikrolitrami wody dejonizowanej.Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów powoli dodawać ten roztwór do mieszaniny reakcyjnej przez około 10 sekund. Zakryj naczynie reakcyjne. Umieść naczynie w kąpieli olejowej ustawionej na 90 stopni Celsjusza i kontynuuj mieszanie.Po około 15 minutach lub gdy kąpiel olejowa osiągnie zakres temperatur od 85 do 90 stopni Celsjusza, pozwól reakcji postępować przez dodatkową godzinę. Po zakończeniu reakcji wyjmij naczynie reakcyjne z łaźni olejowej i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut przed przeniesieniem do łaźni lodowej. Po schłodzeniu reakcji dostosuj pH do około 10 za pomocą jednego molowego wodorotlenku sodu.Dodać mieszaninę do 30-kilodaltonowej kolumny wirowej w 15-mililitrowych partiach i odwirować przy 3 082 razy g przez 15 minut w celu oczyszczenia mieszaniny reakcyjnej. Najpierw wymieszaj nanocząstki siarczku miedzi pokryte kwasem foliowym o odpowiednim stężeniu w świeżych pożywkach RPMI. Dodaj ten roztwór nanocząstek do każdego dołka przygotowanej 24-dołkowej płytki, która zawiera komórki SK-OV-3 w stężeniu 400 mikrogramów na mililitr.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwie godziny. Następnie trypsynizuj komórki za pomocą 0,5 mililitra 0,25% trypsyny i EDTA. Aby zneutralizować trypsynę, dodaj co najmniej jeden mililitr kompletnej pożywki wzrostowej RPMI 1640 bez kwasu foliowego i odwiruj komórki pod ciśnieniem 123 razy g przez sześć minut.Aby umyć komórki, usuń supernatant, ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach PBS i odwiruj przy 123 gach przez sześć minut. Powtórz ten krok prania dwukrotnie, aby usunąć wszelkie niezwiązane nanocząsteczki. Następnie ponownie zawiesić komórki jednym do dwóch mililitrów roztworu 2%Tween w PBS.Policz komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Rozcieńczyć komórki w roztworze 2%Tween w PBS do wybranego stężenia w celu wykrycia. Użyj dostarczonego trójwymiarowego pliku STL, aby wydrukować 3D zbiornik przepływowy z tworzywa termoplastycznego ABS lub tworzywa PLA.Po wydrukowaniu zbiornika wyczyść i zmontuj system do użytku. Umieść szklane szkiełka nakrywkowe nad szczeliną o wymiarach jeden milimetr na trzy milimetry i jednocentymetrowym otworem w systemie przepływowym i ostrożnie uszczelnij silikonem, aby zapobiec wyciekom. Następnie włóż rurkę kapilarną do rurek utwardzanych silikonem.Włóż rurki do komory przepływowej przez bok zbiornika przepływowego tak, aby szklana rurka kapilarna znajdowała się bezpośrednio nad i przed trzymilimetrową szczeliną i jednocentymetrowym otworem. Uszczelnij rurkę silikonem. Następnie podłącz przetwornik do pulsera i odbiornika ultradźwiękowego.Wzmocnij sygnał dzięki wzmocnieniu 59 decybeli. Podłącz wyjście filtra do wielofunkcyjnego oscyloskopu rekonfigurowalnego wyposażonego we wbudowaną programowalną matrycę bramek. Podłącz jedną z rurek wychodzących z komory przepływowej do trójnika, który jest podłączony do dwóch pomp strzykawkowych na każdym odgałęzieniu.Napełnić jedną z pomp strzykawkowych powietrzem, a drugą pompę próbką, która ma być poddana analizie. Ustawić pompę zawierającą powietrze na natężenie przepływu 40 mikrolitrów na minutę i ustawić pompę zawierającą próbkę na natężenie przepływu 20 mikrolitrów na minutę. Następnie podłącz pozostałą rurkę wychodzącą z systemu przepływowego do pojemnika z 10% wybielaczem, aby usunąć komórki po ich opuszczeniu systemu przepływowego.Umieść przekrój kwarcowej rurki kapilarnej w bezpośredniej linii z przetwornikiem w polu view mikroskopu, aby umożliwić staranne umieszczenie światłowodu nad próbką tak, aby oświetlał całą szerokość rurki. Naświetlić próbkę za pomocą światłowodu kierującego pompowanym diodą laserem na ciele stałym działającym na długości fali 1 053 nanometrów. Użyj kamery zamontowanej na mikroskopie, aby zarejestrować przepływ, odpalanie lasera i przechodzenie próbek przez system przepływu.W tym badaniu fotoakustyczna cytometria przepływowa i celowany środek ukierunkowany na siarczek miedzi są wykorzystywane do wykrywania krążących komórek nowotworowych jajników. Typowy obraz TEM zsyntetyzowanych nanocząstek pokazuje, że średnia wielkość typowej nanocząstki wynosi około 8,6 nanometra. Średnice poziome i pionowe każdej cząstki są następnie mierzone prostopadle do siebie i dalej uśredniane.Średnia średnica hydrodynamiczna tych cząstek wynosi 73,6 nanometra. Nanocząstki siarczku miedzi mają charakterystyczną krzywą absorbancji, która rozciąga się na bliską podczerwień. Istnieje niewielki artefakt o długości około 850 nanometrów, który jest spowodowany przełączaniem laserów przez spektrofotometr.Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej komórek inkubowanych z fluorescencyjnie znakowanymi nanocząstkami pokazują, że wychwyt nanocząstek można uwidocznić poprzez obecność fluorescencji w całej komórce. Komórki, które nie są inkubowane z nanocząstkami, nie wykazują sygnału fluorescencyjnego. Obecność tego sygnału fluorescencyjnego wskazuje na pomyślne wychwytywanie cząstek i ich zdolność do wykrycia w systemie przepływowym.Przykłady typowych sygnałów akwizycji danych przedstawiono tutaj. Surowe dane wskazują na różnice w sygnale między komórkami znakowanymi nanocząstkami, PBS i nanocząstkami siarczku miedzi pokrytymi kwasem foliowym. Wykorzystując niestandardowy widok laboratorium i oprogramowanie MATLAB, rekonstrukcje obrazów są wykonywane z kontroli pozytywnych i ujemnych odpowiednio w czasie rzeczywistym i po akwizycji.Poszczególne obwiedni są następnie konwertowane na wartości pikseli i wyświetlane jako niezależne kolumny. Wyraźne różnice w sygnale fotoakustycznym występują między PBS a nanocząstkami siarczku miedzi pokrytymi kwasem foliowym w stężeniu 100 mikrogramów na mililitr. Podczas tej procedury bardzo ważne jest prawidłowe ustawienie przetwornika ultradźwiękowego, mikroskopu i światłowodu w systemie fotoakustycznej cytometrii przepływowej.Potwierdź zgodność systemu, testując kontrole dodatnie i ujemne. Ze względu na wszechstronność technik celowania fotoakustycznego i szeroki zakres zastosowań możliwych do zastosowania przy użyciu PAFC, technika ta toruje drogę do zastosowań klinicznych i badawczych o znaczeniu translacyjnym. Aby zapewnić zastosowanie kliniczne, dalsze badania powinny koncentrować się na badaniu próbek pobranych od pacjentów i ograniczeniu etapów proceduralnych.Synteza nanocząstek powinna odbywać się w dygestorium chemicznym przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego. Ludzkie linie komórkowe muszą być obsługiwane zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji. Korzystanie z lasera wymaga przeszkolenia w zakresie bezpieczeństwa radiacyjnego i odpowiednich środków ochrony osobistej.Użycie lasera i testy fotoakustyczne powinny być wykonywane wyłącznie przez wysoko wykwalifikowany personel.

ovarian-cancer-detection-using-photoacoustic-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy cytometr przepływowy wykorzystujący ultradźwięki indukowane laserem do wykrywania krążących komórek czerniaka jako wczesnego wskaźnika choroby przerzutowej.

Detekcja i izolacja krążących komórek czerniaka z wykorzystaniem fotoakustycznej cytometrii przepływowej

W tym filmie demonstrujemy technikę ułatwiającą internalizację nanocząstek siarczku miedzi z kwasem foliowym (CuS NPs). Funkcjonalizowane kwasem foliowym nanocząsteczki CuS mają zdolność celowania w receptory kwasu foliowego, które ulegają nadekspresji w wielu komórkach raka jajnika.

Funkcjonalizowane celowanie w nanocząstki raka jajnika: technika ułatwiająca wychwyt nanocząsteczkowego środka kontrastowego sprzężonego z kwasem foliowym przez komórki raka jajnika

W tym filmie prezentujemy fotoakustyczną cytometryczną detekcję komórek raka jajnika zawierających nanocząstki w komorze przepływowej in vitro. Ta nieinwazyjna technika z powodzeniem identyfikuje krążące komórki nowotworowe w systemie przepływowym z wykorzystaniem środka kontrastowego.

Fotoakustyczna cytometria przepływowa in vitro: nieinwazyjna technika fotoakustyczna do wykrywania krążących komórek raka jajnika zawierających nanocząstki

Ten protokół opisuje technikę przygotowania próbki poprzez kokulturację eksplantatów jajników z komórkami raka jajowodu. Próbki te są wizualizowane za pomocą obrazowej spektroskopii mas lub IMS w celu wykrycia wymiany małych cząsteczek między komórkami i tkankami, co prowadzi do rozwoju guza.

Modelowanie komunikacji raka jajnika do obrazowania analizy spektrometrii mas: metoda identyfikacji małocząsteczkowych komunikatorów chemicznych w rozwoju przerzutowego guza jajnika

Cystografia fotoakustyczna (PAC) ma ogromny potencjał do mapowania pęcherzy moczowych, wrażliwego na promieniowanie narządu wewnętrznego u pacjentów pediatrycznych, bez użycia promieniowania jonizującego lub toksycznego środka kontrastowego. Tutaj demonstrujemy zastosowanie PAC do mapowania pęcherzy moczowych z wstrzyknięciem nieprzezroczystych optycznie znaczników u szczurów in vivo.

Cystografia fotoakustyczna

Opisujemy nieinwazyjną platformę obrazowania zwierząt, która pozwala na wykrywanie, kwantyfikację i monitorowanie wzrostu i nawrotów raka jajnika. Ten model ksenoprzeszczepu dootrzewnowego naśladuje profil kliniczny pacjentek z rakiem jajnika.

Mysi model do nieinwazyjnego obrazowania w celu wykrywania i monitorowania nawrotu raka jajnika

Przerzuty raka jajnika charakteryzują się licznymi rozlanymi zmianami wewnątrzotrzewnowymi, tak że dokładne wizualne określenie obciążenia guzem jest trudne.  W niniejszym artykule opisano metodę ilościowego oznaczania obciążenia guzem przerzutowym in situ i ex vivo przy użyciu komórek nowotworowych znakowanych białkiem czerwonej fluorescencji (RFP) i obrazowania optycznego.

Kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej

Tutaj prezentujemy protokół do szacowania właściwości optycznych materiału i powierzchni za pomocą efektu fotoakustycznego połączonego z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Technika ta, która eliminuje fotoakustykę opartą na polu, może być wykorzystana do stworzenia fotoakustycznego systemu metrologicznego do szacowania grubości materiałów, współczynników załamania światła objętościowych i cienkowarstwowych oraz badania ich właściwości optycznych.

Fotoakustyka oparta na polu ulotnym: ocena właściwości optycznych na powierzchniach

Rak jajnika tworzy przerzuty w całej jamie otrzewnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół tworzenia i stosowania nanosond rozpraszających Ramana z rezonansem wzmocnionym powierzchniowo, ukierunkowanych na receptor kwasu foliowego, które ujawniają te zmiany z wysoką swoistością za pomocą obrazowania ratiometrycznego. Nanosondy podaje się dootrzewnowo żywym myszom, a uzyskane obrazy dobrze korelują z histologią.

Nanosonda rezonansowa o zwiększonym rezonansie powierzchniowym i nanosonda rozpraszania Ramana do wykrywania mikroskopijnego raka jajnika poprzez celowanie w receptor kwasu foliowego

Zgłaszamy jednocześnie protokół obrazowania ultrasonograficznego i fotoakustycznego dla przezpochwowego obrazowania zmian w jajnikach/przydatkach. Protokół może być cenny dla innych translacyjnych badań obrazowania fotoakustycznego, zwłaszcza tych wykorzystujących komercyjne matryce ultradźwiękowe do wykrywania sygnałów fotoakustycznych i standardowe algorytmy kształtowania wiązki z opóźnieniem i sumą do obrazowania.

Jednoczesny protokół obrazowania ultrasonograficznego i fotoakustycznego do przezpochwowego obrazowania zmian w jajnikach

Zmiany w przepływie krwi w jajnikach w okresie przedowulacyjnym są niezbędne do owulacji. Ultrasonografia Dopplera była stosowana u ludzi i dużych zwierząt do oceny hemodynamiki jajnika i perfuzji. Przedstawiono protokół stosowania ultrasonografii Dopplera w celu oceny hemodynamiki jajników w fazie przedowulacyjnej i okołoowulacyjnej u myszy.

Ultrasonografia Dopplera do obrazowania na żywo i ilościowej funkcji naczyń jajników u myszy

Poznaj metodę wykrywania komórek nowotworowych w krwi obwodowej za pomocą fotoakustycznej cytometrii przepływowej z nanocząstkami siarczku miedzi. Ta technika oferuje specyficzną i niskokosztową diagnostykę raka jajnika.

Wykrywanie raka jajnika za pomocą fotoakustycznej cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów