Name: Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj metodę poklatkowego obrazowania 2D aktywności fagocytarnej makrofagów M1 wobec komórek raka sutka myszy 4T1 w kokulturach. Technika ta umożliwia badanie dynamiki interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana finansowo przez Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Serdecznie dziękujemy Instytutowi Agro-Biotechnologii, laboratoriom Malezji (ABI) oraz zakładowi obrazowania mikroskopowego. Specjalne podziękowania dla Mohda Daniela Hazima za pomoc w montażu i nagraniu eksperymentalnego wideo do tego utworu.

UWAGA: Sekcje 1−6 opisują model kokultury komórek raka sutka myszy 4T1 i makrofagów myszy RAW 264.7. Sekcja 7 opisuje ocenę poklatkową komórek 4T1 z makrofagami M1.
1. Hodowla komórek raka sutka myszy 4T1 i makrofagów myszy RAW 264.7
<ol>
	<li>Rozmrozić fiolkę z kriogenicznie zakonserwowanymi 4T1 i RAW 264.7 przechodzącymi przez 6 komórek przez delikatne mieszanie w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C lub normalnej dla linii komórkowych. 
	UWAGA: Rozmrażanie powinno odbywać się szybko, w ciągu około 2 minut. Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy wyjąć fiolkę z łaźni wodnej i odkazić ją poprzez spryskanie 70% etanolem. Aby uniknąć dryfu genetycznego, szczególnie w przypadku makrofagów, należy użyć niskiej liczby pasaży (tj. mniejszej niż 20).</li>
	<li>Rozcieńczyć rozmrożone komórki w 10 ml kompletnej pożywki DMEM w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 600 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórek. 
	UWAGA: W całym protokole stosuje się kompletną pożywkę DMEM uzupełnioną o 10% (v/v) płodową surowicę bydlęcą (FBS), 200 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę, ponownie zawiesić komórki w 8 ml kompletnego podłoża i przenieść do kolby o długości 25cm2 poddanej działaniu hodowli tkankowej. Hodowla komórek 4T1 i RAW 264,7 w kompletnym podłożu DMEM w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Delikatnie zawiesić osady komórkowe i kropla po kropli dodawać zawiesinę komórek do kolby hodowlanej, aby uniknąć zabicia komórek.</li>
	<li>Po 1 tygodniu hodowli, aby umożliwić przyleganie komórek, codziennie monitoruj kolbę i w razie potrzeby dodaj 8 ml kompletnej pożywki DMEM.</li>
</ol>
2. Barwienie immunologiczne makrofagów RAW 264.7 spolaryzowanych M1
<ol>
	<li>Gdy zbieg komórek RAW 264,7 osiągnie 70−80%, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie spłucz 2x co najmniej 2 ml PBS. 
	UWAGA: Przed wysiewem komórek RAW 264.7 upewnij się, że nie doszło do różnicowania komórek (tj. fenotypu podobnego do dendrytu i/lub zwiększonego rozmiaru komórki). Jeśli widoczne są zmiany morfologii komórek, należy odrzucić hodowlę i rozmrozić nową linię komórkową z wcześniejszej fiolki z pasażem.</li>
	<li>Przygotuj makrofagi do pobrania, delikatnie usuwając przylegające komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę komórek 1 x 105 komórek/naczynie, używając kompletnego podłoża DMEM.</li>
	<li>Wysiewaj 2 ml zawiesiny makrofagów do dwóch szalek do obrazowania. Inkubować komórki przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić przyleganie komórek.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę polaryzacyjną M1, dodając 100 ng/ml LPS i 20 ng/ml IFN-γ do kompletnego medium DMEM10,11.</li>
	<li>Odrzucić supernatant hodowlany z makrofagów i ostrożnie umyć monowarstwy w naczyniu 2x co najmniej 1 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 2 ml pożywki polaryzacyjnej M1 do jednej z naczyń do obrazowania, pozwolić komórkom RAW 264.7 indukować fenotyp makrofagów M1 i inkubować 2-3 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Nasiona RAW 264.7 makrofagów w naczyniu do obrazowania z DMEM uzupełnionym 10% FBS jako kontrola barwienia przeciwciałami anty-iNOS. Oznacz naczynia obrazowania odpowiednio jako RAW (kontrola) i makrofagi M1 (spolaryzowane LPS i IFN-γ).</li>
	<li>Przed barwieniem immunologicznym utrwalić komórki makrofagów RAW 264.7 i M1 za pomocą 2 ml 4% paraformaldehydu i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C (temperatura pokojowa, RT).</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć monowarstwę komórek 1 ml PBS co najmniej 3 razy.</li>
	<li>Stłumić 2 ml 50 mM chlorku amonu w PBS i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Permeabilizować za pomocą 2 ml 0,3% Triton X-100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć monowarstwę komórek 1 ml PBS co najmniej 3 razy.</li>
	<li>Blokuj za pomocą 2 ml 10% FBS w PBS przez 30 minut w RT. 
	UWAGA: Etapem blokowania barwienia immunologicznego jest zminimalizowanie nieswoistego wiązania przeciwciała w komórce.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć monowarstwę komórek 1 ml PBS co najmniej 3 razy.</li>
	<li>Inkubować z 2 ml anty-iNOS-FITC w PBS i 1% FBS przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Oznacz komórki odpowiednim rozcieńczeniem przeciwciał zgodnie z zaleceniami producenta. Chroń naczynia przed światłem, przykrywając je od tego momentu folią aluminiową.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć monowarstwę komórek 1 ml PBS co najmniej 3 razy.</li>
	<li>Inkubować 1 ml 6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) o stężeniu 300 nM w naczyniach do obrazowania przez 10 minut w temperaturze 37 °C, w ciemności, przykrywając folią aluminiową.</li>
	<li>Umyj komórki 1 ml PBS co najmniej 3x i dodaj 1 ml kompletnej pożywki DMEM do naczyń do obrazowania. 
	UWAGA: Komórki są teraz gotowe do obrazowania fluorescencyjnego. Konfiguracja mikroskopu będzie wymagała odwróconego stolika i filtrów wzbudzenia dla wybranych barwień (w tym przypadku FITC i DAPI).</li>
	<li>Włącz mikroskop i załaduj oprogramowanie do obrazowania. Zamontuj czaszę obrazowania na mikroskopie i dostosuj ostrość, aby obserwować makrofagi RAW 264.7 i M1. Zoptymalizuj wygląd obrazów FITC i DAPI z kontrastem fazowym, dostosowując przechodzące światło i czasy ekspozycji. 
	UWAGA: Rozpocznij obrazowanie, gdy wszystkie punkty są ostre, a kanały są zoptymalizowane.</li>
	<li>Przechwytywanie obrazów FITC i DAPI z kontrastem fazowym (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1).</li>
</ol>
3. Wysiewanie komórek raka sutka myszy 4T1
<ol>
	<li>Gdy zbieg komórek 4T1 osiągnie 70−80%, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie spłucz 2x co najmniej 2 ml PBS. Dodać 1 ml podgrzanej trypsyny, aby oddzielić komórki i inkubować do 20 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Obserwuj komórki pod mikroskopem. Odłączone komórki zostaną zaokrąglone.</li>
	<li>Po odłączeniu komórek przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodaj 2 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki DMEM, aby dezaktywować trypsynę. Delikatnie rozprowadzić pożywkę, pipetując powierzchnię warstwy komórkowej w celu odzyskania komórek. Następnie odwirować przy 600 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki DMEM.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 1 x 105 komórek 4T1 w 2 ml kompletnej pożywki DMEM w każdej z dwóch 35-milimetrowych naczyń obrazowych ze szklanym dnem poddanych hodowli tkankowej. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . 
	UWAGA: Hoduj komórki 4T1 w jednej z naczyń obrazowania z pożywką polaryzacyjną M1 i oznacz induktorem 4T1 (kontrola). Ma to na celu zapewnienie prawidłowego wzrostu komórek 4T1 po wystawieniu na działanie induktorów.</li>
</ol>
4. Oznaczanie żywych komórek raka sutka myszy 4T1 za pomocą barwienia CFSE
<ol>
	<li>Najpierw usuń istniejące pożywki z naczyń do obrazowania komórek 4T1. Przemyj monowarstwę komórek co najmniej 2x 1 ml PBS.</li>
	<li>Przygotować 5 μM roztworu barwiącego CFSE, rozcieńczając CFSE w 1 ml PBS. Dodać 1 ml 5 μM roztworu barwiącego CFSE do każdej płytki obrazowania i inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub 37 °C, w ciemności. 
	UWAGA: Oznacz komórki przy użyciu odpowiedniego stężenia roboczego CFSE zgodnie z zaleceniami producenta i wstępnymi eksperymentami, aby uzyskać optymalne stężenie barwienia CFSE. Wydajność etykietowania będzie wyższa, jeśli CFSE zostanie rozcieńczony w PBS.</li>
	<li>Ugasić barwienie, dodając równą objętość kompletnego podłoża DMEM zawierającego 10% FBS i roztwór barwiący do komórek i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Odrzucić roztwór zawierający CFSE i przemyć komórki 1x równą objętością pożywki hodowlanej. 
	UWAGA: Komórki 4T1 są teraz znakowane fluorescencyjnie.</li>
	<li>Przywróć komórki 4T1-CFSE do standardowych warunków hodowli w RT z 5% CO2 .</li>
</ol>
5. Wysiewanie makrofagów myszy RAW 264.7 i kokultura z 4T1
<ol>
	<li>Gdy zbieg RAW 264,7 osiągnie 70−80%, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie spłucz 2x co najmniej 2 ml PBS.</li>
	<li>Przygotuj makrofagi do pobrania, delikatnie usuwając przylegające komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę komórek 1 x 105 komórek/ml, rozcieńczając pozostały roztwór kompletnym podłożem DMEM zgodnie z gęstością wysiewu. 
	UWAGA: Nadmiernie zlewające się komórki w kokulturach mogą poważnie zmniejszyć fagocytozę. W tym badaniu stosunek wysiewu makrofagów: komórek rakowych dostosowano do stosunku 1:1. Stosunek można dostosować w zależności od agresywności komórek nowotworowych i pochodzenia makrofagów.</li>
	<li>Przed hodowlą należy wyrzucić supernatant hodowli z komórek 4T1 wysianych dzień wcześniej (krok 4.5) i ostrożnie umyć monowarstwy 2x co najmniej 1 ml PBS.</li>
	<li>Wysiewaj 1 x 105 RAW 264,7 komórek na 2 ml kompletnej pożywki DMEM do jednej z naczyń do obrazowania 4T1. Inkubować komórki przez 2-3 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić przyleganie komórek. Oznacz naczynie obrazowania 4T1-M1 coculture. 
	UWAGA: Komórki 4T1 (kontrolne) nie były hodowane wspólnie z makrofagami.</li>
</ol>
6. Polaryzacja M1 makrofagów RAW 264.7
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę polaryzacyjną M1, dodając 100 ng/ml LPS i 20 ng/ml IFN-γ do kompletnej pożywki DMEM uzupełnionej 10% (v/v) FBS10,11.</li>
	<li>Odrzucić supernatant hodowli z makrofagów inkubowanych wcześniej (etap 5.5) i ostrożnie umyć monowarstwy w naczyniu 2x z co najmniej 1 ml PBS.</li>
	<li>Następnie dodaj 2 ml pożywki polaryzacyjnej M1 do naczynia do obrazowania i pozwól komórkom RAW 264.7 indukować fenotyp makrofagów M1 przez inkubację w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Komórki makrofagów M1 mogą potrzebować 2-3 godzin inkubacji, aby osiągnąć pełną polaryzację. Należy przeprowadzić wstępne eksperymenty, aby zapewnić odpowiedni okres inkubacji, aby umożliwić pełną polaryzację makrofagów.</li>
</ol>
7. Wideomikroskopia fagocytozy z żywymi komórkami
UWAGA: Podczas wykonywania obrazowania żywych komórek należy wziąć pod uwagę wiele czynników, aby uzyskać możliwe do wyprodukowania wideo, w tym optymalizację ekspozycji obrazu, pomiar czasu i automatyczną korekcję ostrości.
<ol>
	<li>Przed eksperymentem należy ustawić inkubator do hodowli komórkowych, włączając termostat na 37 °C i dostarczając 5% CO2, 
	UWAGA: Konfiguracja mikroskopu wymaga odwróconego stolika, inkubatora ze stopniem górnym, kontroli wilgotności (95%) i systemu inkubacji gazu. Ta konfiguracja ma kluczowe znaczenie dla utrzymania komórek w celu długoterminowej oceny pod mikroskopią wideo na żywych komórkach.</li>
	<li>Włącz mikroskop, w tym stolik piezoelektryczny, i załaduj oprogramowanie do obrazowania mikroskopu.</li>
	<li>Umieść zasiane komórki kokultury w naczyniu do obrazowania ze szklanym dnem o średnicy 35 mm na środku stolika i delikatnie przykręć górną komorę. Użyj joysticka, aby zmotoryzować stolik, wybierając pozycję, która ma zostać zobrazowana.</li>
	<li>Aby wyświetlić próbkę, wybierz filtr kontrastu fazowego na wieżyczce. Po wstępnym obejrzeniu próbki zlokalizuj odpowiednie pola i ustaw ostrość próbki. 
	UWAGA: Oprogramowanie do obrazowania umożliwia korzystanie z w pełni zautomatyzowanego wyboru obiektywu, systemu Perfect Focus, serii poklatkowych, wielokanałowej akwizycji obrazu i wielopunktowej akwizycji obrazu.</li>
	<li>Aby skonfigurować fluorescencję wielokanałową do znakowania CFSE i różnicowej akwizycji kontrastu interferencyjnego, otwórz okno dialogowe akwizycji oprogramowania do obrazowania i zaznacz pole wyboru zakładki [Lambda] (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: W przypadku 13-godzinnego obrazowania poklatkowego należy użyć kanału kontrastu fazowego.</li>
	<li>Wybierz zakładkę [Lambda] | [Konfiguracja optyczna] i wybierz [10X DIC] dla kontrastu zakłóceń różnicowych i [GFP-R] dla zielonego filtra fluorescencji. W ramach [Lambda] | [Ostrość], zaznacz pole wyboru [10X DIC], aby ustawić je jako odniesienie ostrości.</li>
	<li>Otwórz okno dialogowe pobierania oprogramowania do przetwarzania obrazu, kliknij przycisk [Czas XYZ ...] i wybierz zakładkę [XY].</li>
	<li>Przejdź do punktu akwizycji obrazu za pomocą joysticka na zmotoryzowanym stoliku podczas sprawdzania obrazu na żywo lub wybierz inną pozycję za pomocą okularów. Następnie kliknij pole wyboru pod kolumną [Nazwa punktu], aby ustawić każdy punkt w każdej lokalizacji do przechwytywania obrazu (patrz Rysunek 3). 
	UWAGA: Zautomatyzowany stolik umożliwia wielopunktowe pozyskiwanie obrazów o różnych współrzędnych XY w celu przechwycenia wielu pól.</li>
	<li>Dostosuj ostrość dla każdej próbki wyświetlanej na ekranie. Użyj elementów sterujących Korekcja automatycznego ustawiania ostrości.</li>
	<li>Użyj oprogramowania, aby skonfigurować przechwytywanie zdjęć poklatkowych. W oknie dialogowym akwizycji oprogramowania do obrazowania sprawdź zakładkę [Czas] (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Określ [Interwał] (opóźnienie między początkiem jednego punktu czasowego a innym punktem czasowym) i [Czas trwania] (całkowity czas trwania eksperymentu). Jednostki czasu różnią się i można je wybrać w milisekundach (ms), sekundach (s), minutach (m) lub godzinach (h) z menu rozwijanego. 
	UWAGA: Długość okresu obrazowania dla obrazowania poklatkowego fluorescencji i wielokanałowej akwizycji poklatkowej DIC może się różnić w zależności od barwnika fluorescencyjnego użytego w tym teście. Fotowybielanie może wystąpić, jeśli znakowane komórki są wystawione na działanie promieni słonecznych zbyt długo.</li>
	<li>Zaznacz pole wyboru [Zapisz do pliku], aby zapisać pobrane obrazy. Na karcie [Harmonogram] kliknij przycisk [Uruchom teraz], aby pobrać obrazy wielopunktowych szeregów czasowych (patrz Rysunek 5). 
	UWAGA: W oprogramowaniu do obrazowania obrazy są zapisywane w formacie pliku nd2. Każdy film poklatkowy można później indywidualnie zapisać w formacie pliku MP4.</li>
</ol>

<ol><li>Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+based+Machine+Learning+for+identification+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%3A+Tumor-associated+macrophages+as+a+paradigm+for+polarized+M2+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes.</a> Trends in Immunology. , (2002).</li>
<li>Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+KY+%22M1+and+M2+polarization+of+macrophages+a+mini-review%22">M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review</a>. 2 (1), 1-5 (2019).</li>
<li>Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+phagocytic+activity+in+live+macrophages-tumor+cells+cocultures+by+Confocal+and+Nomarski+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy.</a> Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).</li>
<li>Tauber, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metchnikoff+and+the+phagocytosis+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metchnikoff and the phagocytosis theory.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).</li>
<li>Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Tumor+Stroma%3A+Cellular+Components%2C+Phenotypic+Heterogeneity%2C+Intercellular+Communication%2C+Prognostic+ImplicationsTherapeutic+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities.</a> Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).</li>
<li>Larionova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+tumor-associated+macrophages+and+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy.</a> OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).</li>
<li>Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+Random+Migration+of+Cells+Using+Time-lapse+Video+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3585(2012).</li>
<li>Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+Assays+to+Study+Glioblastoma+Brain+Tumor+Stem+Cell+Migration+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58152(2018).</li>
<li>Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+basic+protein+charge+isomers+change+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization.</a> Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+multiple+sclerosis+2015%3A+Methods+of+data+collection%2C+assessment+and+analysis+of+costs%2C+quality+of+life+and+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Journal%22%5BJournal%5D)">The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms.</a> Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).</li>
<li>Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+tumor+cytolysis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of tumor cytolysis by macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).</li>
<li>Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+migratory+properties+of+M1%2C+M2%2C+and+resident+macrophages+are+regulated+by+%CE%B1d%CE%B22and+%CE%B1m%CE%B22integrin-mediated+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).</li>
<li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li>
<li>Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+monitoring+of+live+cell+proliferation+in+presence+of+PVP-Hypericin%3A+A+new+strategy+using+ms+pulses+of+LED+and+the+fluorescent+dye+CFSE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE.</a> Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany protokół wymaga dwóch kroków: 1) kohodowli komórek raka sutka myszy 4T1 i makrofagów spolaryzowanych M1 oraz 2) oceny aktywności fagocytarnej makrofagów za pomocą mikroskopii poklatkowej. Kokultura żywych komórek jest szeroko stosowana w testach fagocytozy i migracji. Model kohodowli żywych komórek jest prostą, adaptowalną procedurą in vitro (ryc. 2), która wykorzystuje barwnik fluorescencyjny, CFSE, który jest używany do znakowania komórek docelowych 4T1. Służy to do prawidłowego śl...

Makrofagi są pierwszą linią obrony immunologicznej i odgrywają rolę w organizowaniu odpowiedzi immunologicznych przeciwko patogenom i obcym materiałom, w tym komórkom rakowym. Są wyspecjalizowanymi fagocytami, które niszczą i pozbywają się niechcianych cząstek z organizmu. Makrofagi pełnią funkcje obronne, takie jak usuwanie komórek apoptotycznych i mikroorganizmów oraz rekrutacja innych komórek odpornościowych1. Makrofagi mogą różnicować się na dwa różne typy, makrofagi M1 i M2, w odpowiedzi na sygnały środowiskowe2. Makrofagi spolaryzowane M1 (tj. klasycznie aktywowane makrofagi) są aktywowane przez cytokiny interferon-γ (IFN-γ) i lipopolisacharydy (LPS) i biorą udział w odpowiedzi zapalnej, usuwaniu patogenów, skutecznej fagocytozie i odporności nowotworobójczej3,4. Makrofagi M2 są ściśle spokrewnione z makrofagami związanymi z nowotworem (TAM) i mają właściwości przeciwzapalne i promujące nowotwór4.
Fagocytoza, wywodząca się ze starożytnej greki (phagein), oznaczająca "pożerać", (kytos), oznaczająca "komórkę" i -osis, oznaczająca "proces"5. Fagocytoza to proces, w którym fagocyty (w tym makrofagi, monocyty i neutrofile) zabijają i pochłaniają atakujące patogeny, usuwają obce cząstki i usuwają apoptotyczne resztki komórek. Makrofagi związane z nowotworem (TAM) znajdują się w zrębie w różnych nowotworach, w tym w raku piersi, i pełnią funkcje pronowotworowe6,7, co skutkuje opornością na fagocytozę. Szczegółowy mechanizm fagocytozy komórek nowotworowych przez makrofagi nie jest jeszcze poznany.
To badanie przedstawia dwuetapową metodę: 1) komórki raka sutka myszy 4T1 i makrofagi spolaryzowane M1 są hodowane, oraz 2) aktywność fagocytarna makrofagów jest oceniana za pomocą mikroskopii wideo z żywymi komórkami. Barwnik fluorescencyjny CFSE użyto do barwienia komórek raka sutka myszy 4T1. Barwienie oznacza komórki 4T1 w celu odróżnienia ich od współhodowanych makrofagów M1 w jednym naczyniu do obrazowania. Makrofagi RAW 264.7 są spolaryzowane za pomocą LPS i IFN-γ do fenotypu M1. Aby zapewnić pełną polaryzację, przeprowadzono barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-iNOS sprzężonym z FITC. Następnie uzyskano wielopunktową serię zdjęć poklatkowych w celu obserwacji wielu zdarzeń, w tym fagocytozy, w kokulturze.
Lepsze zrozumienie interakcji między komórkami nowotworowymi a makrofagami może prowadzić do potencjalnej immunoterapii raka. Obrazowanie żywych komórek oferuje szczegółowy wgląd w dynamikę komórkową w czasie rzeczywistym i zostało wykorzystane do badania migracji komórek, fenotypowych badań przesiewowych, apoptozy i cytotoksyczności8,9 w neurobiologii, biologii rozwojowej i odkrywaniu leków. Chociaż proponowanym nowotworem w tym badaniu jest rak piersi, metoda może być również stosowana do wielu komórek docelowych i odrębnych komórek efektorowych.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-INOS sprzężone z FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>REA982</td><td>150 &micro; g w 1 ml</td></tr><tr><td>estru boksyfluoresceiny sukcynimidylu (CFSE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td>25 mg</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>DMEM/hyklon o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>SH30003.04</td><td>670.0 g</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Tico Europe</td><td>FBSEU500</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy</td><td>Sigma</td><td>L4516-1MG</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Mysi rekombinowany interferon-gamma</td><td>Stemcell Technologies</td><td>78021</td><td>100 &mikro; g</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Cellgro</td><td>30-003-CI</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10 sztuk</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>1X, 100 ml</td></tr><tr><td>1000 &mikro; L końcówki do pipet</td><td>WhiteBox</td><td>WB-301-01-052</td><td>5000 końcówek/opakowanie</td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 2 ml</td><td>JET BIOFIL</td><td>GSP012002</td><td>Non-pryogenic</td></tr><tr><td>200 &micro; L końcówki do pipet</td><td>WhiteBox</td><td>WB-301-02-302</td><td>20 000 tps/opakowanie</td></tr><tr><td>25 cm2 kolba do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>CLS430639</td><td>Hodowla tkankowa poddana działaniu</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Dynamica</td><td>FA15C</td><td>Model: Prędkość 14R</td></tr><tr><td>Bezpieczny biologicznie dygestoria</td><td>Nuaire</td><td>NU-565-400</td><td>Model: Strona główna/ LabGard&reg; ES TE NU-565 Klasa II, typ B2 Bezpieczeństwo biologiczne</td></tr><tr><td>Mieszalnik CO2/powietrza</td><td>Chamlide (przyrząd do żywych komórek)</td><td>FC-R-20</td><td>FC-5 (mieszalnik CO2/powietrza) z przepływomierzem</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>NEST 710001</td><td></td><td>220 mm</td></tr><tr><td>Inkubator komórek CO2</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td>Model: MCO-19M(UV)</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nikon Ti-Eclipse</td></tr><tr><td>Szklana miska dolna</td><td>Ibidi</td><td>81218-200</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>NIS elements oprogramowanie</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Dostępny do pobrania</td><td></td>online</tr><tr><td>Kontroler do pipet</td><td>CappAid</td><td>PA-100</td><td>Kontroler pipet CappController, 0,1-100 ml</td></tr><tr><td>Termostat</td><td>Shinko</td><td>Wycofane</td><td>JCS-33A 48 x 48 x 96,5 mm</td></tr></tbody></table>

poklatkowe obrazowanie 2d aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy m1 macrophage-4t1 w kokulturach

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Makrofagi związane z nowotworami (TAM) zostały zidentyfikowane jako ważny składnik wzrostu guza, inwazji, przerzutów i odporności na terapie przeciwnowotworowe. Jednak makrofagi związane z nowotworem mogą być szkodliwe dla guza w zależności od mikrośrodowiska guza i mogą odwracalnie zmieniać ich cechy fenotypowe poprzez antagonizowanie cytotoksycznej aktywności komórek odpornościowych lub wzmacnianie odpowiedzi przeciwnowotworowej. Molekularne działania makrofagów i ich interakcje z komórkami nowotworowymi (np. fagocytoza) nie zostały dokładnie zbadane. Dlatego interakcja między komórkami odpornościowymi (podtyp M1/M2 TAM) a komórkami nowotworowymi w mikrośrodowisku guza jest obecnie przedmiotem badań nad immunoterapią nowotworów. W niniejszym badaniu opracowano model kohodowli żywych komórek indukowanych makrofagów M1 i mysich komórek raka sutka 4T1 w celu oceny aktywności fagocytarnej makrofagów przy użyciu funkcji filmu poklatkowego przy użyciu mikroskopii kontrastu fazowego, fluorescencyjnego i kontrastu różnicowego interferencyjnego (DIC). Obecna metoda pozwala na obserwację i dokumentowanie wielopunktowego obrazowania fagocytozy na żywych komórkach. Fagocytozę komórek 4T1 przez makrofagi M1 można zaobserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przed barwieniem komórek 4T1 estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE). Obecna publikacja opisuje, w jaki sposób kokulturować makrofagi i komórki nowotworowe w jednym naczyniu do obrazowania, polaryzować makrofagi M1 i rejestrować wielopunktowe zdarzenia makrofagów pochłaniających komórki 4T1 podczas 13 godzin kohodowli.

Obrazy dwuwymiarowe (2D) w trybie poklatkowym z modelu kokultury linii komórkowych raka piersi myszy 4T1 pokazują pochłanianie komórek 4T1 przez makrofagi M1 w ciągu 13 h. Ważne jest zapewnienie pełnej polaryzacji makrofagów M1 poprzez wykonanie immunostainingu. Wyniki (Rycina 1) wskazują, że stężenie 100 ng/mL lipopolisacharydów (LPS) oraz 20 ng/mL IFN-γ spolaryzowało makrofagi RAW 264.7 do stanu M1. Oznakowanie komórek docelowych barwnikiem fluorescencyjnym i pozostawienie komórek efektoro...

Aktywność fagocytarna makrofagów przeciwko komórkom rakowym, w szczególności komórkom raka sutka myszy 4T1, została zobrazowana w tym badaniu. Stworzono model kokultury żywych komórek i obserwowano go za pomocą kombinacji fluorescencyjnej i różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej. Ocena ta została zobrazowana za pomocą oprogramowania do obrazowania w celu opracowania wielopunktowego filmu poklatkowego.

Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Ogólnym celem tego badania jest uzyskanie poklatkowego obrazowania 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophages 4T1 w kokulturach. Stworzono model kokultur komórek życiowych i obserwowano go przy użyciu kombinacji mikroskopii fluorescencyjnej i interferencyjnej z kontrastem. Ocena aktywności fagocytozy przez makrofagi była obrazowa; Używanie oprogramowania do obrazowania w celu podwojenia wielopunktowego filmu poklatkowego przed przetestowaniem naszej inkubacji.Sprawa, którą przeprowadziliśmy, ma na celu zaspokojenie potrzeb i korzyści płynących z doskonalenia zachowania makrofagów i ich aktywności fagocytarnej z komórkami nowotworowymi. W szczególności w badaniu jest rak sutka myszy. Pierwsza część tego badania rozpoczyna się od modelu kohodowli żywych komórek komórek raka sutka myszy 4T1 i makrofagów myszy RAW 2647.Rozpocznij eksperyment od wyhodowania 41 komórek raka sutka myszy i makrofagów myszy RAW 2647. Najpierw rozmrozić fiolkę z komórkami 4T1 i RAW 2647. Rozcieńczyć rozmrożone komórki w 10 milimetrach w stożkowej probówce o pojemności 15 młynów.Następnie odwiruj komórki z siłą 660 g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy. Ostrożnie odessać pożywkę, ponownie zawiesić komórki w 8 milionach kompletnych pożywek i przenieść komórki do kolby do hodowli tkankowej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5 procentami dwutlenku węgla.Po tygodniu hodowli w warunkach przylegania należy codziennie monitorować kolbę i w razie potrzeby uzupełniać ją pożywką atmil complete. Kolejnym krokiem jest barwienie immunologiczne makrofagów RAW 2647 spolaryzowanych M1. Ten krok ma na celu zapewnienie pełnej polaryzacji makrofagów M1.Gdy zbieg RAW 2647 osiągnął 70 do 80 procent, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie spłucz dwukrotnie PBS. Przygotuj makrofagi do zebrania, delikatnie usuwając przylegające komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenosząc do stożkowej probówki o pojemności 50 milimetrów. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj komórkę zawieszoną w gęstości 100 000 komórek na naczynie, dodając pozostały roztwór do gęstości siedzenia.Usiądź 2 młyny zawiesiny makrofagów w dwóch naczyniach do obrazowania. Inkubuj komórki przez 2 do 3 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5-procentową zawartością dwutlenku węgla, aby umożliwić przyleganie komórek. Przygotuj pożywkę polaryzacyjną M1, dodając 100 nilligramów na promilę LPS i 20 nilligramów na promilę interferonu-gamma do kompletnego podłoża uzupełnionego 10-procentowym FBS.Odrzucić kultury sklarowane nad osadem z inkubowanych wcześniej makrofagów i ostrożnie umyć monowarstwy w naczyniu dwukrotnie za pomocą PBS. Dodaj 2 młyny pożywki polaryzacyjnej M1 do jednej z pasujących naczyń i pozwól komórkom opony twardej wstrzyknąć się do finnatypu makrofagów M1. Przed barwieniem immunologicznym utrwal komórki makrofagów RAW i M1 za pomocą 2 młynów 4% paraformaldehydu i inkubuj przez 50 minut w temperaturze pokojowej.Usunąć supernatant i przemyć monowarstwę komórek za pomocą PBS, co najmniej trzy razy. Stłumić 2 młynami 50 milimetrowego chlorku amonu w PBS i inkubować przez 50 minut w temperaturze pokojowej. Przepuszczalność za pomocą 0,3 procent Triton X-100 w PBS przez 50 minut w temperaturze pokojowej.Krok blokowania przy użyciu 10 procent FBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej PBS. Inkubować z przeciwciałem anty-iNOS sprzężonym z FITC w PBS i jednym procentem FBS przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Inkubować 1 młyn DAPI w naczyniach do obrazowania przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemnych warunkach, przykrywając folią aluminiową.Umyj komórki za pomocą PBS co najmniej 3 razy i dodaj 1 młyn DMEM do pasujących naczyń i gotowych do obrazowania fluorescencyjnego. Kolejnym krokiem jest wysiew komórek raka sutka myszy 4T1. Gdy zbieg komórek 4T1 osiągnie 70 do 80 procent, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie przepłucz dwukrotnie PBS.Dodaj 1 młyn wstępnie podgrzanej trypsyny, aby usunąć skojarzenie komórek i inkubować do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki wydają się odczepione, przenieś je do stożkowej rurki o średnicy 15 młynów. I dodaj 2 młyny wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża, aby dezaktywować widoczną rurkę.Wirować z siłą 600 g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić pelety w 10 młynach do pobierania próbek wstępnych DMEM. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 100 000 komórek w młynie DMEM.Do obrazowania tych z leczeniem TC. Następnym krokiem jest znakowanie żywych komórek raka sutka myszy 4T1 za pomocą barwienia CFSE. Najpierw usuń istniejące pożywki z naczynia do obrazowania, które wcześniej zostało zasiane komórkami 4T1.Przygotuj roztwór do barwienia CFSE, rozcieńczając barwienie CFSE w 1 młynie PBS, aby uzyskać 5 macrmalnych zgód roboczych. Dodaj 1 młyn roztworu barwiącego CFSE do naczynia do obrazowania, aby inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub 37 stopni Celsjusza w ciemności. Dodaj równą ilość DMEM do komórek wraz z roztworem barwiącym i pozostaw do wysiewu na 5 minut.Następnym krokiem jest wysianie RAW2647 mysich makrofagów i współhodowla z 4T1. Po wyrównaniu CFSE komórek 4T1 umyj naczynie do obrazowania dwukrotnie, używając PBS. Nasiona 2 młyny zawiesiny makrofagów w naczyniu do obrazowania 4T1.Kolejnym krokiem jest polaryzacja makrofagów RAW 4627 do finnatypu M1. Dodaj 2 młyny pożywki polaryzacyjnej M1 do naczynia do wyobrażeń i pozwól komórkom RAW przeniknąć do finnatypu makrofagów M1. Drugą częścią badania jest ocena poklatkowa komórek 4T1 makrofagów M1.Kolejnym krokiem jest ocena fagocytozy za pomocą wideomikroskopii na żywych komórkach. Najpierw włącz mikroskop. Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza.I 5 procent gazowego dwutlenku węgla. Umieść komórki kohodowli na środku stolika i delikatnie przykręć górną komorę. Użyj joysticka, aby zmotoryzować scenę, wybierając inną pozycję do uchwycenia.Istnieje wiele czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania obrazowania żywych komórek. Aby uzyskać dość mały filmik. Wymaga to optymalizacji obrazowania, ekspozycji i pomiaru czasu, a także automatyzacji korekcji ostrości.W przypadku, gdy film jest prześwietlony, nieprawidłowy interwał czasowy, a także nieostry, spowoduje, że film stanie się bezużyteczny. Powtórzenie eksperymentu należy wykonać, jeśli wykryto jeden z tych czynników. Rysunek pierwszy przedstawia immunofluorescencje obracające się z anty-iNOS na zielono.Marker jądrowy DAPI w kolorze niebieskim. I ulepszone wersje większości obrazów. Film 1 jest reprezentatywnym filmem z żywymi komórkami, który pozwala zrozumieć makrofagi M1 i 4T1.CFSE wybarwił większość kokultur komórek raka sutka uchwyconych przy użyciu wielokanałowej akwizycji fluorescencji i mikroskopii IC. Film 2 filmy z mikroskopii wideo na żywo z wielu punktów w jednym naczyniu małżeńskim. Wykazując fagocytozę 4T1 przez indukowane makrofagi M1.Zdjęcia były wykonywane w odstępach 50-minutowych przez 13 godzin. Film 3 film z mikroskopii wideo na żywych komórkach, przedstawiający pojedynczy punkt współrzędnych wybrany w celu pokazania dogłębnej wizualizacji fagocytozy 4T1 przez makrofagi M1. Czerwone strzałki pokazują makrofagi M1, żółte kółko pokazuje, że pewna liczba komórek 4T1 wygasza fluoren, a Goffman komórek 4T1.Makrofagi M1 opisana jako porocytoplazma były rakami pamięci myszy 4T1 mają morfologię nabłonka. Można zaobserwować, jak makrofagi poruszają się, aby dodać komórki 4T1 w celu nawiązania kontaktu między komórkami. Po czym następuje wychwyt komórek 4T1 na makrofagi M1.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić eksperyment z mikroskopią wideo na żywych komórkach; z rakiem sutka myszy 4T1 i makrofagami merad RAW 2647. Powinieneś także być w stanie skonfigurować nocne kokultury obu typów komórek, aby wykonać esej fagocytozy. Powinieneś również zrozumieć, w jaki sposób współkulturowcy 4T1 z LPS i makrofagami interferonu gamma.

time-lapse-2d-imaging-phagocytic-activity-m1-macrophage-4t1-mouse

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, aby badać oddziaływania między komórkami guza piersi a innymi komórkami ich mikrośrodowiska, które wpływają na progresję w kierunku fenotypu inwazyjnego. Modele te mogą służyć jako przesiewy przedkliniczne dla leków ukierunkowanych na indukowane parakrynnie szlaki proteolityczne, szlaki chemokin/cytokin oraz kinaz zaangażowane w inwazyjność.

Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię poklatkową z kontrastem fazowym do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących myszy w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki odpornościowe.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Ten protokół opisuje budowę mikrofizjologicznego systemu do badania raka piersi in vitro przy użyciu pierwotnej ludzkiej tkanki piersi z gotowych materiałów.

Modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Poznaj metodę poklatkowego obrazowania 2D aktywności fagocytarnej makrofagów M1 wobec komórek raka sutka myszy 4T1 w kokulturach. Technika ta umożliwia badanie dynamiki interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym.

Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Przeglądaj więcej filmów