Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Ogólnym celem tego badania jest uzyskanie poklatkowego obrazowania 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophages 4T1 w kokulturach. Stworzono model kokultur komórek życiowych i obserwowano go przy użyciu kombinacji mikroskopii fluorescencyjnej i interferencyjnej z kontrastem. Ocena aktywności fagocytozy przez makrofagi była obrazowa; Używanie oprogramowania do obrazowania w celu podwojenia wielopunktowego filmu poklatkowego przed przetestowaniem naszej inkubacji.

Sprawa, którą przeprowadziliśmy, ma na celu zaspokojenie potrzeb i korzyści płynących z doskonalenia zachowania makrofagów i ich aktywności fagocytarnej z komórkami nowotworowymi. W szczególności w badaniu jest rak sutka myszy. Pierwsza część tego badania rozpoczyna się od modelu kohodowli żywych komórek komórek raka sutka myszy 4T1 i makrofagów myszy RAW 2647.

Rozpocznij eksperyment od wyhodowania 41 komórek raka sutka myszy i makrofagów myszy RAW 2647. Najpierw rozmrozić fiolkę z komórkami 4T1 i RAW 2647. Rozcieńczyć rozmrożone komórki w 10 milimetrach w stożkowej probówce o pojemności 15 młynów.

Następnie odwiruj komórki z siłą 660 g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy. Ostrożnie odessać pożywkę, ponownie zawiesić komórki w 8 milionach kompletnych pożywek i przenieść komórki do kolby do hodowli tkankowej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5 procentami dwutlenku węgla.

Po tygodniu hodowli w warunkach przylegania należy codziennie monitorować kolbę i w razie potrzeby uzupełniać ją pożywką atmil complete. Kolejnym krokiem jest barwienie immunologiczne makrofagów RAW 2647 spolaryzowanych M1. Ten krok ma na celu zapewnienie pełnej polaryzacji makrofagów M1.

Gdy zbieg RAW 2647 osiągnął 70 do 80 procent, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie spłucz dwukrotnie PBS. Przygotuj makrofagi do zebrania, delikatnie usuwając przylegające komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenosząc do stożkowej probówki o pojemności 50 milimetrów. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj komórkę zawieszoną w gęstości 100 000 komórek na naczynie, dodając pozostały roztwór do gęstości siedzenia.

Usiądź 2 młyny zawiesiny makrofagów w dwóch naczyniach do obrazowania. Inkubuj komórki przez 2 do 3 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5-procentową zawartością dwutlenku węgla, aby umożliwić przyleganie komórek. Przygotuj pożywkę polaryzacyjną M1, dodając 100 nilligramów na promilę LPS i 20 nilligramów na promilę interferonu-gamma do kompletnego podłoża uzupełnionego 10-procentowym FBS.

Odrzucić kultury sklarowane nad osadem z inkubowanych wcześniej makrofagów i ostrożnie umyć monowarstwy w naczyniu dwukrotnie za pomocą PBS. Dodaj 2 młyny pożywki polaryzacyjnej M1 do jednej z pasujących naczyń i pozwól komórkom opony twardej wstrzyknąć się do finnatypu makrofagów M1. Przed barwieniem immunologicznym utrwal komórki makrofagów RAW i M1 za pomocą 2 młynów 4% paraformaldehydu i inkubuj przez 50 minut w temperaturze pokojowej.

Usunąć supernatant i przemyć monowarstwę komórek za pomocą PBS, co najmniej trzy razy. Stłumić 2 młynami 50 milimetrowego chlorku amonu w PBS i inkubować przez 50 minut w temperaturze pokojowej. Przepuszczalność za pomocą 0,3 procent Triton X-100 w PBS przez 50 minut w temperaturze pokojowej.

Krok blokowania przy użyciu 10 procent FBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej PBS. Inkubować z przeciwciałem anty-iNOS sprzężonym z FITC w PBS i jednym procentem FBS przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Inkubować 1 młyn DAPI w naczyniach do obrazowania przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemnych warunkach, przykrywając folią aluminiową.

Umyj komórki za pomocą PBS co najmniej 3 razy i dodaj 1 młyn DMEM do pasujących naczyń i gotowych do obrazowania fluorescencyjnego. Kolejnym krokiem jest wysiew komórek raka sutka myszy 4T1. Gdy zbieg komórek 4T1 osiągnie 70 do 80 procent, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie przepłucz dwukrotnie PBS.

Dodaj 1 młyn wstępnie podgrzanej trypsyny, aby usunąć skojarzenie komórek i inkubować do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki wydają się odczepione, przenieś je do stożkowej rurki o średnicy 15 młynów. I dodaj 2 młyny wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża, aby dezaktywować widoczną rurkę.

Wirować z siłą 600 g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić pelety w 10 młynach do pobierania próbek wstępnych DMEM. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 100 000 komórek w młynie DMEM.

Do obrazowania tych z leczeniem TC. Następnym krokiem jest znakowanie żywych komórek raka sutka myszy 4T1 za pomocą barwienia CFSE. Najpierw usuń istniejące pożywki z naczynia do obrazowania, które wcześniej zostało zasiane komórkami 4T1.

Przygotuj roztwór do barwienia CFSE, rozcieńczając barwienie CFSE w 1 młynie PBS, aby uzyskać 5 macrmalnych zgód roboczych. Dodaj 1 młyn roztworu barwiącego CFSE do naczynia do obrazowania, aby inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub 37 stopni Celsjusza w ciemności. Dodaj równą ilość DMEM do komórek wraz z roztworem barwiącym i pozostaw do wysiewu na 5 minut.

Następnym krokiem jest wysianie RAW2647 mysich makrofagów i współhodowla z 4T1. Po wyrównaniu CFSE komórek 4T1 umyj naczynie do obrazowania dwukrotnie, używając PBS. Nasiona 2 młyny zawiesiny makrofagów w naczyniu do obrazowania 4T1.

Kolejnym krokiem jest polaryzacja makrofagów RAW 4627 do finnatypu M1. Dodaj 2 młyny pożywki polaryzacyjnej M1 do naczynia do wyobrażeń i pozwól komórkom RAW przeniknąć do finnatypu makrofagów M1. Drugą częścią badania jest ocena poklatkowa komórek 4T1 makrofagów M1

Kolejnym krokiem jest ocena fagocytozy za pomocą wideomikroskopii na żywych komórkach. Najpierw włącz mikroskop. Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza.

I 5 procent gazowego dwutlenku węgla. Umieść komórki kohodowli na środku stolika i delikatnie przykręć górną komorę. Użyj joysticka, aby zmotoryzować scenę, wybierając inną pozycję do uchwycenia.

Istnieje wiele czynników, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania obrazowania żywych komórek. Aby uzyskać dość mały filmik. Wymaga to optymalizacji obrazowania, ekspozycji i pomiaru czasu, a także automatyzacji korekcji ostrości.

W przypadku, gdy film jest prześwietlony, nieprawidłowy interwał czasowy, a także nieostry, spowoduje, że film stanie się bezużyteczny. Powtórzenie eksperymentu należy wykonać, jeśli wykryto jeden z tych czynników. Rysunek pierwszy przedstawia immunofluorescencje obracające się z anty-iNOS na zielono.

Marker jądrowy DAPI w kolorze niebieskim. I ulepszone wersje większości obrazów. Film 1 jest reprezentatywnym filmem z żywymi komórkami, który pozwala zrozumieć makrofagi M1 i 4T1.

CFSE wybarwił większość kokultur komórek raka sutka uchwyconych przy użyciu wielokanałowej akwizycji fluorescencji i mikroskopii IC. Film 2 filmy z mikroskopii wideo na żywo z wielu punktów w jednym naczyniu małżeńskim. Wykazując fagocytozę 4T1 przez indukowane makrofagi M1.

Zdjęcia były wykonywane w odstępach 50-minutowych przez 13 godzin. Film 3 film z mikroskopii wideo na żywych komórkach, przedstawiający pojedynczy punkt współrzędnych wybrany w celu pokazania dogłębnej wizualizacji fagocytozy 4T1 przez makrofagi M1. Czerwone strzałki pokazują makrofagi M1, żółte kółko pokazuje, że pewna liczba komórek 4T1 wygasza fluoren, a Goffman komórek 4T1.

Makrofagi M1 opisana jako porocytoplazma były rakami pamięci myszy 4T1 mają morfologię nabłonka. Można zaobserwować, jak makrofagi poruszają się, aby dodać komórki 4T1 w celu nawiązania kontaktu między komórkami. Po czym następuje wychwyt komórek 4T1 na makrofagi M1.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić eksperyment z mikroskopią wideo na żywych komórkach; z rakiem sutka myszy 4T1 i makrofagami merad RAW 2647. Powinieneś także być w stanie skonfigurować nocne kokultury obu typów komórek, aby wykonać esej fagocytozy. Powinieneś również zrozumieć, w jaki sposób współkulturowcy 4T1 z LPS i makrofagami interferonu gamma.