Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych
June 2nd, 2020
Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.
W organizmach wielokomórkowych tkanka wykazuje wysoki stopień dalszej orientacji przestrzennej. Komórki wyrównują się i wykazują zakres pierwszeństwa na duże odległości w trakcie morfogenezy. Aby zrozumieć, w jaki sposób osiąga się płaskie układy nabłonka podczas rozwoju, kluczowe jest śledzenie orientacji komórek i dynamiki wzrostu z wysoką dokładnością przestrzenną in vivo.
Opisany protokół ma na celu obrazowanie i analizę zachowań komórek na poziomie globalnym i lokalnym w naskórku poczwarki drosophila. Metodologia ta może zapewnić wgląd w różne teorie badań, biologię komórki, morfogenezę i polaryzację planarną oraz może być zastosowana do analizy innych tkanek, struktur i modeli. Wszystkie kroki można łatwo wykonać po odrobinie praktyki.
Wymagają precyzji. Wizualizacja tego protokołu pomaga osiągnąć optymalne wyniki w krótszym czasie. Rozwarstwienie poczwarki jest złożone.
Na początek użyj zwilżonego pędzla, aby przenieść białe poczwarki do świeżej plastikowej fiolki i trzymaj je tam tak długo, jak to konieczne, w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie usuń każdą poczwarkę ze ścianki fiolki za pomocą kleszczy. Przyklej brzuszną stronę każdej poczwarki na szklanym szkiełku pokrytym dwustronną taśmą klejącą.
Delikatnie postukaj końcówkami kleszczyków w przetchlinki głowy i grzbietową powierzchnię poczwarki, aby zapewnić przyleganie etui poczwarki do taśmy. Rozpocznij sekcję pod mikroskopem stereoskopowym, delikatnie usuwając wieczko z poczwarki za pomocą kleszczy. Włóż jedną końcówkę kleszczy w płytkie miejsce między obudową poczwarki a powierzchnią poczwarki przez otwór wieczkowy.
Rozerwij obudowę od głowy do ogona na boki jednym lub kilkoma zamachami, unikając szczypania poczwarki. Złóż pękniętą obudowę poczwarki na boczne strony, przechodząc do tylnego końca. Wyjmij poczwarkę z otwartego etui na poczwarkę, ostrożnie wkładając kleszcze pod zwierzę i delikatnie pociągając do góry.
Poczwarka przykleja się do czubka kleszczy. Delikatnie trzymaj poczwarkę za stronę brzuszną i przenieś poczwarkę do naczynia ze szklanym dnem na małej kropli przepuszczalnego dla gazu oleju halowęglowego. Zwiń kawałek mokrej bibuły na brzegach naczynia i przykryj naczynie, aby utrzymać wilgotność.
Ustaw poczwarkę nad kroplą oleju na naczyniach ze szklanym dnem zgodnie z domeną i procesem, który ma być oceniany. W celu długoterminowego obrazowania na żywo wczesnej ekspansji gniazd grzbietowych, grzbietowo bocznie orientuj poczwarkę. Aby zobrazować ich późną ekspansję i przebudowę tkanki, ustaw poczwarkę w orientacji grzbietowej.
Przenieś naczynie ze szklanym dnem zawierające zamontowane poczwarki do stolika mikroskopowego i skup się na powierzchni brzucha za pomocą światła przechodzącego. Aby zastosować rekombinację mitotyczną w celu wywołania mozaiki genetycznej w nabłonku brzusznym, przygotuj dziewicze samice z indukowaną szokiem cieplnym flipazą, miejscem FRT w określonej lokalizacji genomowej i rozpoznawalnym markerem komórkowym dystalnym do miejsca FRT. Przygotować zmutowane samce z miejscem FRT w równoważnej lokalizacji genomowej.
Krzyżuj kilka samic i samców w proporcji trzy do jednego w plastikowej fiolce w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu dni. Aby wygenerować klony somatyczne w histoblastach, należy przeprowadzić szok cieplny w trzecim stadium larwalnym potomstwa krzyżówki, zanurzając plastikowe fiolki zawierające zwierzęta w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 45 minut do godziny. W oprogramowaniu obrazu J użyj funkcji projekcji maksymalnej intensywności, aby chronić warstwy stosu Z uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej w 2D.
Gniazda mają charakterystyczny kształt, który orientuje je w płaskim układzie współrzędnych z przodu po lewej stronie i grzbietowo do góry. Aby osiągnąć optymalne wyniki tej analizy, obraz wejściowy musi być uzyskany w wysokiej rozdzielczości. Aby uzyskać jakościowe wartości orientacji na lokalnych krawędziach komórek, kliknij menu wtyczki i wybierz opcję rozkładu orientacji J.
Ustaw sigma okna Gaussa na jeden piksel, krzywą sześcienną na gradient, minimalną spójność na 20 procent, a minimalną energię na jeden procent. Skorzystaj z opcji ankiety kolorystycznej wtyczki. Ustaw barwę na orientację, nasycenie na spójność i jasność na obraz wejściowy.
Ten kolor koduje orientacje krawędzi komórki względem ustawionego płaskiego układu współrzędnych. Następnie w menu wtyczki użyj opcji pomiaru orientacji J, aby określić ilościowo orientacje komórkowe i kierunkowe wyrównanie komórki do komórki. Wygeneruj małe, przylegające do siebie, nienakładające się obszary zainteresowania o jednolitej masie około 20 mikrometrów razy 20 mikrometrów w obszarze zajmowanym przez histoblasty.
Miara tłoczenia oblicza dominującą orientację lokalną i spójność na podstawie ROI. W tym badaniu zastosowana metodologia jest w stanie wygenerować filmy o wysokiej rozdzielczości rozwijających się poczwarek przez okres do 48 godzin bez znacznego wybielania zdjęć lub fototoksyczności. Przykłady klonów typu dzikiego charakteryzujących się brakiem RFP NLS i ich bliźniaczymi plamkami po 26 godzinach od powstania poczwarki przedstawiono tutaj.
Klony wydłużyły się wzdłuż granic segmentów. Bliźniacze klony ułożone równolegle lub w tandemie. Morfologia klonu typu dzikiego po 26 godzinach i 47 godzinach od powstania poczwarki wykazuje złożoną morfologię graniczną na obu etapach.
Wykresy pudełkowe i wąsowe dla parametrów geometrycznych po 26 godzinach i 47 godzinach od powstania poczwarki pokazują, że uśredniony obszar i obwód znacznie wzrosły w tym oknie czasowym. Orientacja klona została zachowana podczas rozbudowy i przebudowy. Parametry kształtu po 26 godzinach i 47 godzinach od powstania poczwarki wskazują na szorstkość, okrągłość i okrągłość prawie nie zmienione u klonów typu dzikiego.
Pamiętaj, aby nie uszkodzić poczwarki, w przeciwnym razie umrze w ciągu kilku godzin, wpływając na obrazowanie na żywo. Protokół ten nie wymaga użycia odczynnika ani przyrządu do sartusa. Unikaj szczypania się podczas sekcji.
Dzięki zastosowaniu tych metodologii możliwe jest generowanie filmów w wysokiej rozdzielczości przez długi czas przy użyciu różnych technik wyobrażania sobie. Ogniskowe do fotonów lub wirujących dysków. Analiza chloralu może być wykorzystana do zbadania nieautonomicznych reakcji, ponieważ losowe komórki ułatwiają identyfikację przesłuchów krzyżowych lub mechanizmów komunikacji komórkowej.
Metody te można łatwo dostosować do badania pełnego zakresu zjawisk morfogenetycznych, w tym koordynacji rozwoju naskórka, mięśni i neurorozwoju podczas metamorfozy.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół jest zaprojektowany do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanki w epiteliach odwłoka Drosophila podczas przemiany larwalnej muchówki owocowej. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwoju, tkanek i subkomórkowych struktur w Drosophila lub innych organizmach modelowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Morfogeneza
- Polarność płaszczyznowa
Tło
- Tkanka wykazuje wysoki stopień orientacji przestrzennej w wielokomórkowych organizmach.
- Komórki układają się i wykazują pierwszeństwo na duże odległości podczas morfogenezy.
- Śledzenie orientacji komórek i dynamiki wzrostu jest kluczowe dla zrozumienia układów nabłonkowych.
- To badanie koncentruje się na naskórku poczwarki Drosophila.
Cel badania
- Aby obrazować i analizować zachowania komórek na poziomie globalnym i lokalnym.
- Aby zapewnić wgląd w teorie biologii komórki i morfogenezy.
- Aby zastosować metodologię do różnych tkanek i organizmów modelowych.
Stosowane metody
- Techniki obrazowania do śledzenia orientacji komórek.
- Analiza dynamiki wzrostu tkanki.
- Obserwacja in vivo rozwoju Drosophila.
- Zastosowanie protokołu do różnych etapów rozwoju.
Główne wyniki
- Wysoka wierność przestrzenno-czasowa w śledzeniu zachowań komórek.
- Wgląd w dynamikę orientacji komórek podczas metamorfozy.
- Potencjalne zastosowania do innych tkanek i organizmów modelowych.
- Metodologia staje się dostępna po praktyce.
Wnioski
- Protokół poprawia zrozumienie morfogenezy nabłonka.
- Może być dostosowany do różnych zastosowań badawczych w biologii komórki.
- Przyszłe badania mogą wykorzystywać tę metodologię dla szerszych wglądów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding tissue-level organization and growth dynamics is critical for de-risking target validation in complex disease models. This protocol enables high-fidelity tracking of cellular alignment and morphogenetic processes, supporting mechanistic insights into epithelial patterning. Such quantitative spatial-temporal data enhances predictive confidence in preclinical models by linking cellular behaviors to tissue-scale outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-scale organization to validate hypotheses about planar polarity and cellular coordination in morphogenesis.
- Operational Value: Provides reproducible imaging and analysis workflows for assessing cellular alignment and directional growth in epithelial systems.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking molecular perturbations to measurable changes in tissue orientation and clonally resolved growth dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative orientation and coherency metrics from defined regions of interest, enabling objective comparison of cellular behaviors across conditions.
- Operational Value: Standardizes live imaging protocols using gas-permeable halocarbon oil and mounted pupae for long-term, high-resolution time-lapse acquisition.
- Assay Readiness: Facilitates screening-ready readouts such as clone elongation, border morphology, and area/perimeter changes over time for phenotypic assessment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage observations of histoblast clone dynamics to broader tissue remodeling processes relevant to wound healing and regeneration models.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of non-autonomous responses via clonal analysis and genetic mosaics to dissect cell communication mechanisms in developing epithelia.
- Predictive Confidence: Sustained orientation and stable shape parameters during expansion provide baseline benchmarks for assessing aberrant morphogenesis in disease-relevant perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of planar cell polarity and extends to lead identification by enabling quantitative assessment of cellular responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cellular alignment and tissue orientation during morphogenetic events such as histoblast nest expansion and remodeling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized live imaging and orientation analysis of epithelial sheets over 48-hour periods with minimal photo toxicity.
- Analytics: Generates dominant local orientation and coherency measurements from 20x20 micrometer regions of interest using OrientationJ plugins for objective, quantitative comparison.
- Translational Research: Connects clonal dynamics and border morphology changes to preclinical continuity in tissue repair and regeneration models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform adaptable to other tissues, developmental stages, and model organisms beyond Drosophila pupal epidermis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epithelial morphogenesis and planar polarity pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of live imaging and quantitative orientation analysis across laboratories and model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of aberrant tissue organization, reducing late-stage biological risk in preclinical programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, morphology-based readouts that correlate with functional tissue states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, pupal dissection, and live imaging under stereo and confocal microscopy.
- Dependent on gas-permeable halocarbon oil, glass-bottomed dishes, and stable humidity maintenance for long-term imaging.
- Necessitates standardized image acquisition protocols and plugin-based analysis (OrientationJ) for consistent orientation and coherency quantification.
- Requires adaptation of mounting orientation (dorsal vs. dorsal-lateral) based on the specific biological process being imaged (early expansion vs. late remodeling).
- Practical limitations include sensitivity to dissection-induced damage, which can compromise pupal viability and live imaging quality if not performed with precision.
