Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych
2 czerwca 2020
Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.
W organizmach wielokomórkowych tkanka wykazuje wysoki stopień dalszej orientacji przestrzennej. Komórki wyrównują się i wykazują zakres pierwszeństwa na duże odległości w trakcie morfogenezy. Aby zrozumieć, w jaki sposób osiąga się płaskie układy nabłonka podczas rozwoju, kluczowe jest śledzenie orientacji komórek i dynamiki wzrostu z wysoką dokładnością przestrzenną in vivo.
Opisany protokół ma na celu obrazowanie i analizę zachowań komórek na poziomie globalnym i lokalnym w naskórku poczwarki drosophila. Metodologia ta może zapewnić wgląd w różne teorie badań, biologię komórki, morfogenezę i polaryzację planarną oraz może być zastosowana do analizy innych tkanek, struktur i modeli. Wszystkie kroki można łatwo wykonać po odrobinie praktyki.
Wymagają precyzji. Wizualizacja tego protokołu pomaga osiągnąć optymalne wyniki w krótszym czasie. Rozwarstwienie poczwarki jest złożone.
Na początek użyj zwilżonego pędzla, aby przenieść białe poczwarki do świeżej plastikowej fiolki i trzymaj je tam tak długo, jak to konieczne, w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie usuń każdą poczwarkę ze ścianki fiolki za pomocą kleszczy. Przyklej brzuszną stronę każdej poczwarki na szklanym szkiełku pokrytym dwustronną taśmą klejącą.
Delikatnie postukaj końcówkami kleszczyków w przetchlinki głowy i grzbietową powierzchnię poczwarki, aby zapewnić przyleganie etui poczwarki do taśmy. Rozpocznij sekcję pod mikroskopem stereoskopowym, delikatnie usuwając wieczko z poczwarki za pomocą kleszczy. Włóż jedną końcówkę kleszczy w płytkie miejsce między obudową poczwarki a powierzchnią poczwarki przez otwór wieczkowy.
Rozerwij obudowę od głowy do ogona na boki jednym lub kilkoma zamachami, unikając szczypania poczwarki. Złóż pękniętą obudowę poczwarki na boczne strony, przechodząc do tylnego końca. Wyjmij poczwarkę z otwartego etui na poczwarkę, ostrożnie wkładając kleszcze pod zwierzę i delikatnie pociągając do góry.
Poczwarka przykleja się do czubka kleszczy. Delikatnie trzymaj poczwarkę za stronę brzuszną i przenieś poczwarkę do naczynia ze szklanym dnem na małej kropli przepuszczalnego dla gazu oleju halowęglowego. Zwiń kawałek mokrej bibuły na brzegach naczynia i przykryj naczynie, aby utrzymać wilgotność.
Ustaw poczwarkę nad kroplą oleju na naczyniach ze szklanym dnem zgodnie z domeną i procesem, który ma być oceniany. W celu długoterminowego obrazowania na żywo wczesnej ekspansji gniazd grzbietowych, grzbietowo bocznie orientuj poczwarkę. Aby zobrazować ich późną ekspansję i przebudowę tkanki, ustaw poczwarkę w orientacji grzbietowej.
Przenieś naczynie ze szklanym dnem zawierające zamontowane poczwarki do stolika mikroskopowego i skup się na powierzchni brzucha za pomocą światła przechodzącego. Aby zastosować rekombinację mitotyczną w celu wywołania mozaiki genetycznej w nabłonku brzusznym, przygotuj dziewicze samice z indukowaną szokiem cieplnym flipazą, miejscem FRT w określonej lokalizacji genomowej i rozpoznawalnym markerem komórkowym dystalnym do miejsca FRT. Przygotować zmutowane samce z miejscem FRT w równoważnej lokalizacji genomowej.
Krzyżuj kilka samic i samców w proporcji trzy do jednego w plastikowej fiolce w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu dni. Aby wygenerować klony somatyczne w histoblastach, należy przeprowadzić szok cieplny w trzecim stadium larwalnym potomstwa krzyżówki, zanurzając plastikowe fiolki zawierające zwierzęta w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 45 minut do godziny. W oprogramowaniu obrazu J użyj funkcji projekcji maksymalnej intensywności, aby chronić warstwy stosu Z uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej w 2D.
Gniazda mają charakterystyczny kształt, który orientuje je w płaskim układzie współrzędnych z przodu po lewej stronie i grzbietowo do góry. Aby osiągnąć optymalne wyniki tej analizy, obraz wejściowy musi być uzyskany w wysokiej rozdzielczości. Aby uzyskać jakościowe wartości orientacji na lokalnych krawędziach komórek, kliknij menu wtyczki i wybierz opcję rozkładu orientacji J.
Ustaw sigma okna Gaussa na jeden piksel, krzywą sześcienną na gradient, minimalną spójność na 20 procent, a minimalną energię na jeden procent. Skorzystaj z opcji ankiety kolorystycznej wtyczki. Ustaw barwę na orientację, nasycenie na spójność i jasność na obraz wejściowy.
Ten kolor koduje orientacje krawędzi komórki względem ustawionego płaskiego układu współrzędnych. Następnie w menu wtyczki użyj opcji pomiaru orientacji J, aby określić ilościowo orientacje komórkowe i kierunkowe wyrównanie komórki do komórki. Wygeneruj małe, przylegające do siebie, nienakładające się obszary zainteresowania o jednolitej masie około 20 mikrometrów razy 20 mikrometrów w obszarze zajmowanym przez histoblasty.
Miara tłoczenia oblicza dominującą orientację lokalną i spójność na podstawie ROI. W tym badaniu zastosowana metodologia jest w stanie wygenerować filmy o wysokiej rozdzielczości rozwijających się poczwarek przez okres do 48 godzin bez znacznego wybielania zdjęć lub fototoksyczności. Przykłady klonów typu dzikiego charakteryzujących się brakiem RFP NLS i ich bliźniaczymi plamkami po 26 godzinach od powstania poczwarki przedstawiono tutaj.
Klony wydłużyły się wzdłuż granic segmentów. Bliźniacze klony ułożone równolegle lub w tandemie. Morfologia klonu typu dzikiego po 26 godzinach i 47 godzinach od powstania poczwarki wykazuje złożoną morfologię graniczną na obu etapach.
Wykresy pudełkowe i wąsowe dla parametrów geometrycznych po 26 godzinach i 47 godzinach od powstania poczwarki pokazują, że uśredniony obszar i obwód znacznie wzrosły w tym oknie czasowym. Orientacja klona została zachowana podczas rozbudowy i przebudowy. Parametry kształtu po 26 godzinach i 47 godzinach od powstania poczwarki wskazują na szorstkość, okrągłość i okrągłość prawie nie zmienione u klonów typu dzikiego.
Pamiętaj, aby nie uszkodzić poczwarki, w przeciwnym razie umrze w ciągu kilku godzin, wpływając na obrazowanie na żywo. Protokół ten nie wymaga użycia odczynnika ani przyrządu do sartusa. Unikaj szczypania się podczas sekcji.
Dzięki zastosowaniu tych metodologii możliwe jest generowanie filmów w wysokiej rozdzielczości przez długi czas przy użyciu różnych technik wyobrażania sobie. Ogniskowe do fotonów lub wirujących dysków. Analiza chloralu może być wykorzystana do zbadania nieautonomicznych reakcji, ponieważ losowe komórki ułatwiają identyfikację przesłuchów krzyżowych lub mechanizmów komunikacji komórkowej.
Metody te można łatwo dostosować do badania pełnego zakresu zjawisk morfogenetycznych, w tym koordynacji rozwoju naskórka, mięśni i neurorozwoju podczas metamorfozy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół został opracowany w celu obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek oraz wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila podczas przechodzenia muchy owocówki przez proces metamorfozy. Opisana tutaj metodologia może zostać zastosowana do badania różnych etapów rozwoju, tkanek oraz struktur wewnątrzkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Morfogeneza
- Polarność płaska
Wprowadzenie
- Tkanka wykazuje wysoki stopień orientacji przestrzennej w organizmach wielokomórkowych.
- Komórki ustawiają się i wykazują priorytet orientacji na dużych dystansach podczas morfogenezy.
- Śledzenie orientacji komórek i dynamiki wzrostu jest kluczowe dla zrozumienia organizacji nabłonka.
- Niniejsze badanie koncentruje się na epidermie poczwarki Drosophila.
Cel badania
- Obrazowanie i analiza zachowań komórek na poziomach globalnym i lokalnym.
- Dostarczenie informacji na temat teorii biologii komórki i morfogenezy.
- Zastosowanie metodologii w odniesieniu do różnych tkanek i organizmów modelowych.
Zastosowane metody
- Techniki obrazowania służące do śledzenia orientacji komórek.
- Analiza dynamiki wzrostu tkanek.
- Obserwacja rozwoju Drosophila in vivo.
- Zastosowanie protokołu w różnych etapach rozwoju.
Główne wyniki
- Wysoka rozdzielczość czasowo-przestrzenna w śledzeniu zachowań komórek.
- Wgląd w dynamikę orientacji komórek podczas przeobrażenia.
- Potencjalne zastosowania w innych tkankach i organizmach modelowych.
- Metodyka staje się przystępna po przeprowadzeniu praktyki.
Wnioski
- Protokół ten pozwala na lepsze zrozumienie morfogenezy nabłonka.
- Można go dostosować do różnych zastosowań badawczych w biologii komórki.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać tę metodologię w celu uzyskania szerszych informacji.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie organizacji na poziomie tkanki oraz dynamiki wzrostu jest kluczowe dla zmniejszenia ryzyka przy walidacji celów w złożonych modelach chorób. Niniejszy protokół umożliwia wysokiej wierności śledzenie orientacji komórkowej i procesów morfogenetycznych, co wspiera uzyskanie wglądu w mechanizmy wzorcowania nabłonkowego. Takie ilościowe dane przestrzenno-czasowe zwiększają pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez powiązanie zachowań komórkowych z efektami w skali tkanki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie organizacji w skali tkanek w celu walidacji hipotez dotyczących polarności planarnej i koordynacji komórkowej w morfogenezie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne przepływy pracy w zakresie obrazowania i analizy do oceny wyrównania komórkowego i wzrostu kierunkowego w systemach nabłonkowych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyznaczonego celu, łącząc perturbacje molekularne z mierzalnymi zmianami orientacji tkanek i dynamiką wzrostu w rozdzielczości klonalnej.
Przesiewanie i rozwój testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie ilościowych miar orientacji i spójności z określonych obszarów zainteresowania, co umożliwia obiektywne porównanie zachowań komórkowych w różnych warunkach.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania na żywo z wykorzystaniem przepuszczalnego dla gazów oleju halocarbonowego oraz zamocowanych poczek, co pozwala na długotrwałe pozyskiwanie obrazów time-lapse o wysokiej rozdzielczości.
- Gotowość analizy: Umożliwia uzyskanie wyników gotowych do przesiewu, takich jak wydłużanie się klonów, morfologia granic oraz zmiany pola i obwodu w czasie, w celu oceny fenotypowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje dynamiki klonów histoblastów na etapie odkryć z szerszymi procesami przebudowy tkanek, istotnymi dla modeli gojenia ran i regeneracji.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę odpowiedzi nieautonomicznych poprzez analizę klonalną i mozaik genetycznych w celu zbadania mechanizmów komunikacji międzykomórkowej w rozwijających się nabłonkach.
- Pewność prognostyczna: Utrzymana orientacja i stabilne parametry kształtu podczas ekspansji stanowią punkty odniesienia do oceny aberrantnej morfogenezy w perturbacjach istotnych z punktu widzenia chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wspiera biologię odkrywczą poprzez weryfikację hipotez dotyczących planarnej polarności komórek oraz służy do identyfikacji związków wiodących, umożliwiając ilościową ocenę odpowiedzi komórkowych na zaburzenia genetyczne lub farmakologiczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących wyrównania komórkowego i orientacji tkanek podczas zdarzeń morfogenetycznych, takich jak ekspansja i przebudowa gniazd histoblastów.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów poprzez standaryzowane obrazowanie żywych komórek i analizę orientacji płatów nabłonkowych w okresach 48-godzinnych przy minimalnej fototoksyczności.
- Analityka: Generuje pomiary dominującej lokalnej orientacji i spójności z obszarów zainteresowania o wymiarach 20x20 mikrometrów przy użyciu wtyczek OrientationJ w celu obiektywnego, ilościowego porównania.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę klonalną i zmiany morfologii granic z ciągłością przedkliniczną w modelach naprawy i regeneracji tkanek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy, którą można dostosować do innych tkanek, etapów rozwoju i organizmów modelowych poza naskórkiem poczwarki Drosophila.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w procesach morfogenezy nabłonka i szlakach polarności planarnej.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje standaryzację, powtarzalność i skalowalność obrazowania na żywo oraz ilościowej analizy orientacji pomiędzy laboratoriami i systemami modelowymi.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dzięki umożliwieniu wczesnego wykrywania aberrantnej organizacji tkanek, co redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach programów przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki mierzalnym odczytom opartym na morfologii, które korelują z funkcjonalnymi stanami tkanki.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z Drosophila, przeprowadzaniu sekcji poczwarek oraz obrazowaniu żywych tkanek przy użyciu mikroskopii stereoskopowej i konfokalnej.
- Zależne od zastosowania przepuszczalnego dla gazów oleju halokarbonowego, naczyń z szklanym dnem oraz utrzymania stabilnej wilgotności w celu długotrwałego obrazowania.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów akwizycji obrazów oraz analizy z wykorzystaniem wtyczki (OrientationJ) w celu spójnej kwantyfikacji orientacji i koherencji.
- Wymaga dostosowania orientacji montażu (grzbietowa vs grzbietowo-boczna) w zależności od obrazowanego procesu biologicznego (wczesna ekspansja vs późniejsza przebudowa).
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na uszkodzenia powstałe podczas sekcji, co może negatywnie wpłynąć na żywotność poczwerek i jakość obrazowania na żywo, jeśli zabiegi nie zostaną wykonane z precyzją.
