Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Protokół ten przyniósł jedne z najlepszych wglądów, jakie do tej pory posiadaliśmy na temat tego, w jaki sposób Candida albicans zamieszkuje przewód pokarmowy ssaków. Na przykład do niedawna tak naprawdę nie wiedzieliśmy, gdzie Candida jest zlokalizowana w jelitach ani którą z wielu form morfologicznych przyjmuje w tej niszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wizualizację Candidy w jej naturalnym środowisku bez zakłócania trójwymiarowych interakcji, jakie grzyb ma ze strukturami gospodarza lub z bakteriami w mikrobiocie.

Ponieważ jelita są złożonym środowiskiem, bardzo trudno jest je modelować w laboratorium, dlatego znalezienie sposobu na zbadanie biologii Candida bezpośrednio w modelu gospodarza było bardzo satysfakcjonujące. Podejrzewa się, że niektóre składniki mikrobioty jelitowej, w tym Candida albicans, odgrywają rolę w chorobach, takich jak nieswoiste zapalenie jelit. Technika ta może być potencjalnie wykorzystana do diagnozowania obecności określonych mikroorganizmów w próbkach biopsyjnych pobranych od pacjentów.

Opanowanie techniki gavage i umiejętność preparowania segmentów przewodu pokarmowego bez rozrywania narządów jest ważne dla uzyskania optymalnych wyników. Na początek należy podać każdemu zwierzęciu obliczoną objętość danego inokulum. Podłącz autoklawowaną igłę do karmienia zwierząt do jednomililitrowej strzykawki i napełnij strzykawkę jedną objętością zgłębnika, upewniając się, że usunąłeś wszystkie pęcherzyki.

Umieścić strzykawkę na sterylnej powierzchni. Aby zabezpieczyć zwierzę, przytrzymaj je u nasady ogona dominującą ręką i przesuń niedominującą rękę w górę grzbietu zwierzęcia do luźnej skóry tuż za uszami. Zbierz mocno kark kciukiem i palcem wskazującym.

Podnieś zwierzę za kark, odwróć je i owiń mały palec tej samej ręki wokół ogona, aby unieruchomić zwierzę na dłoni. Delikatnie wysuń głowę zwierzęcia tak, aby znajdowała się w linii prostej z ciałem. Następnie podnieś strzykawkę dominującą ręką i trzymaj ją prostopadle do zwierzęcia z zakrzywioną igłą skierowaną w dół.

Użyj kulki igły, aby delikatnie zaczepić wewnętrzny kącik ust i przesuń igłę wzdłuż boku jamy ustnej do tylnej części gardła, a następnie przesuń igłę do środka. Gdy kulka igły znajdzie się z tyłu gardła zwierzęcia, przechyl igłę do góry, tak aby była równoległa do linii ciała zwierzęcia i pozwól jej płynnie przesunąć się w dół gardła. Jeśli igła nie przesuwa się płynnie w dół gardła, może to oznaczać, że igła nie jest prawidłowo umieszczona i należy ją wycofać w celu zmiany położenia i ponownej próby.

Płynnie przesuwaj igłę, pozwalając zwierzęciu połknąć igłę, aż pozostanie widocznych tylko kilka milimetrów. Sprawdzić, czy kulka igły znajduje się w żołądku, delikatnie przesuwając tłok i jeśli nie ma oporu, kontynuować podawanie inokulum. Po podaniu inokulum powoli wyjąć igłę i umieścić zwierzę w klatce.

Kontynuuj monitorowanie zwierzęcia przez pięć do 10 minut pod kątem oznak trudności w oddychaniu lub niepokoju i sprawdź, czy wznawia normalną aktywność wkrótce po zgłębniku. Jeśli ten sam inokulum zostanie użyty dla następnego zwierzęcia, wyczyść igłę chusteczką nasączoną alkoholem. Jeśli zostanie użyte inne inokulum, wymień igłę.

Użyj tępo zakończonych kleszczy, aby uszczypnąć fragment skóry brzucha i naciąć skórę i leżącą pod nią powięź w pobliżu podstawy miednicy za pomocą nożyczek. Przedłuż nacięcie w kształcie litery U wzdłuż każdej strony jamy otrzewnej i aż do klatki piersiowej, a następnie unieś skórę z drogi. Użyj tępo zakończonych kleszczy, aby delikatnie usunąć jelito ślepe z jamy otrzewnej, używając nożyczek, aby przeciąć połączenia między jelitem ślepym a jelitem cienkim i grubym.

Umieść całe jelito ślepe w kasecie histologicznej tak, aby było odkręcone i leżało płasko. Umieść drugą podkładkę piankową na górze i zamknij kasetę. Następnie umieść kasetę w zakręcanym słoiku zawierającym metakarnę.

Wyciąć odcinek jelita grubego, który zawiera od jednego do dwóch granulek kału i ma długość mniejszą niż długość kasety. Umieść chusteczkę w kasecie, trzymając ją płasko i nieskręconą. Przykryj go drugą podkładką piankową, zamknij kasetę i umieść ją w metakarnie.

Dla każdego odcinka jelita cienkiego, z którego ma zostać pobrana próbka, należy wyciąć od jednego do dwóch centymetrów odcinka, który zawiera pewną ilość materiału trawiennego. Umieść chusteczkę w kasecie, pokryj drugą podkładką piankową, zamknij kasetę i włóż ją do metakarnu. Podczas wycinania żołądka przerwij połączenia z przełykiem i jelitem cienkim.

Umieść tkankę w kasecie i umieść kasetę w metakarnie. Pozostawić kasety w roztworze metakarny w temperaturze pokojowej na co najmniej trzy godziny, ale krócej niż dwa tygodnie. Po utrwaleniu usuń piankowe podkładki i włóż każdy nienaruszony fragment tkanki do kasety.

Następnie myj chusteczki dwa razy przez 35 minut w 100% metanolu, dwa razy przez 25 minut w 100% etanolu i dwa razy przez 20 minut w ksylenie. Osusz kasety na ręczniku papierowym i umieść je we wstępnie stopionym wosku parafinowym na dwie godziny w temperaturze 70 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji. Następnie wyjmij kasety z wosku, pozwól nadmiarowi wosku spłynąć i przechowuj je w temperaturze pokojowej, aż zostaną osadzone w blokach wosku.

Odwoskuj skrawki histologiczne zatopione w parafinie, wkładając szkiełka do wstępnie podgrzanego słoika wypełnionego ksylenem. Pozostaw słoik w temperaturze 60 stopni Celsjusza na 10 minut, a następnie wyrzuć mycie z ksylenu. Wlej świeży ksylen o temperaturze pokojowej do słoika i powtórz inkubację.

Następnie napełnij słoik 100% etanolem i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji wyjmij szkiełka ze słoika i wysusz je na powietrzu. Aby zabarwić C.albicans za pomocą sondy do ryb, zacznij od narysowania okręgu wokół sekcji tkanki za pomocą Pat Pen.

Odpipetować 50 mikrolitrów sondy zawierającej roztwór hybrydyzacyjny na utrwaloną tkankę i delikatnie rozprowadzić końcówką pipety. Pokryj płyn szkiełkiem nakrywkowym do hybrydyzacji, upewniając się, że zapobiegasz powstawaniu pęcherzyków. Następnie uszczelnij szkiełka w wodoszczelnej komorze hybrydyzacyjnej i inkubuj sekcje przez trzy godziny w temperaturze 50 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji w ciemności.

Po inkubacji dodaj roztwór myjący do słoika Coplin. Ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe z szkiełka za pomocą kleszczy i umieść szkiełko w roztworze myjącym. Przykryj słoik folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie umyj szkiełka, wylewając roztwór myjący i ponownie napełniając słoik PBS. Natychmiast odlej i ponownie napełnij świeżym PBS, powtarzając proces, w sumie dwa prania. Odetnij PBS delikatną chusteczką zadaniową i okrąż odcinek tkanki jelitowej za pomocą Pat Pen.

Umieść szkiełka w nieprzezroczystym plastikowym pojemniku i dodaj 50 mikrolitrów roztworu do barwienia jąder mucyny do sekcji tkanki. Przykryj pojemnik folią aluminiową i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Po inkubacji włóż szkiełka do słoika Coplin i umyj je dwukrotnie PBS.

Stuknij nadmiar PBS na ręcznik papierowy, a następnie odchować ostatnie krople chusteczką. Umieść jedną kroplę podłoża montażowego na każdej sekcji i przykryj ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym, upewniając się, że nie ma pęcherzyków. Pozwól, aby podłoże montażowe rozprowadziło się pod całym szkiełkiem nakrywkowym.

Zakotwicz szkiełko nakrywkowe w miejscu z lakierem do paznokci w rogach i zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Protokół ten może być stosowany do fluorescencyjnego znakowania C.albicans in vitro i w tkankach gospodarza. Strzępki rozmnażane in vitro, okrągłe komórki drożdży, komórki jelitowe i komórki nieprzezroczyste utrwalono, przepuszczalno i rozróżniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i kontrastu fazowego.

Okrągłe drożdże i bardzo wydłużone strzępki zostały zobrazowane w jelicie grubym myszy. Tkanki gospodarza barwiono za pomocą specyficznej sondy C.albicans lub sondy pangrzybiczej. C. albicans oznaczono na czerwono, jądra komórek gospodarza na niebiesko, a warstwę śluzu na zielono.

C. albicans wykryto w różnych segmentach mysiego przewodu pokarmowego, w tym w regionach bezpośrednio przylegających do błony śluzowej gospodarza i bardziej centralnych obszarach światła jelita. Dla naukowców, którzy wcześniej nie stosowali techniki gaveage, ważne jest, aby przed wypróbowaniem tej metody przejść specjalistyczne szkolenie. Po barwieniu ryb można zastosować techniki immunofluorescencyjne do barwienia dodatkowych cech błony śluzowej gospodarza.

Może to pozwolić na scharakteryzowanie uszkodzeń tkanek lub odpowiedzi immunologicznych gospodarza. Technika ta pozwoliła nam scharakteryzować związek między morfologią komórek grzybów mutantów Candida albicans a przeżywalnością w organizmie gospodarza, pogłębiając naszą wiedzę na temat biologii Candida albicans, którą można wykorzystać przy opracowywaniu terapii.