Name: Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj wizualizację Candida albicans w przewodzie pokarmowym myszy za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Ta metoda pozwala badać lokalizację i morfologię grzyba w jego naturalnym środowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Carolinie Tropini, Katharine Ng, Justinowi Sonnenburgowi i KC Huangowi za wskazówki w rozwijaniu techniki FISH. Teresa O'Meara udzieliła pomocnych komentarzy na temat rękopisu, a Miriam Levy pomogła w fotografii. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01AI108992, R01DK113788 oraz Burroughs Welcome Award w dziedzinie patogenezy chorób zakaźnych.

<ol><li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Bacher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Anti-fungal+Th17+Immunity+and+Pathology+Rely+on+Cross-Reactivity+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans.</a> Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).</li>
<li>Shao, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Candida+albicans+Positively+Calibrates+Systemic+Th17+Immunological+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).</li>
<li>Jiang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Fungi+Recapitulate+the+Protective+Benefits+of+Intestinal+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).</li>
<li>Iliev, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+Between+Commensal+Fungi+and+the+C-Type+Lectin+Receptor+Dectin-1+Influence+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis.</a> Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).</li>
<li>Fan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIF-1+alpha+and+LL-37+by+Commensal+Bacteria+Inhibits+Candida+Albicans+Colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization.</a> Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).</li>
<li>Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Damage+and+Neutropenia+Are+Required+for+Candida+Albicans+Dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination.</a> PLoS Pathogens. 4 (2), e35(2008).</li>
<li>Yamaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Colonization+of+Candida+Albicans+Differs+in+Mice+Fed+Commercial+and+Purified+Diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets.</a> Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).</li>
<li>Kadosh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Antifungal+Treatment+in+a+Diet-Based+Murine+Model+of+Disseminated+Candidiasis+Acquired+via+the+Gastrointestinal+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).</li>
<li>Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Fungal+Infections%3A+Epidemiology%2C+Diagnosis%2C+and+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment.</a> Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).</li>
<li>Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+Through+the+Mammalian+Gut+Triggers+a+Phenotypic+Switch+That+Promotes+Candida+Albicans+Commensalism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism.</a> Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).</li>
<li>Witchley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Morphogenesis+Programs+Control+the+Balance+between+Gut+Commensalism+and+Invasive+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).</li>
<li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+Cell-Mediated+Immunity+in+Candida+Albicans-Colonized+Gnotobiotic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice.</a> Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).</li>
<li>Guarner, J., Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+Diagnosis+of+Fungal+Infections+in+the+21st+Century%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).</li>
<li>Johansson, M. E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+Mucus+in+Histological+Sections%2C+Immunostaining+of+Mucins+in+Fixed+Tissue%2C+and+Localization+of+Bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+and+Composition+of+the+Mucosal+Flora+in+Patients+with+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Amino+Acid+Liquid+Synthetic+Medium+for+the+Development+of+Mycelial+and+Yeast+Forms+of+Candida+Albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Sabouraudia%22%5BJournal%5D)">An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans.</a> Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).</li>
<li>Banerjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UME6%2C+a+Novel+Filament-Specific+Regulator+of+Candida+Albicans+Hyphal+Extension+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).</li>
<li>Earle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Gut+Microbiota+Spatial+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).</li>
<li>Sokol, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+Microbiota+Dysbiosis+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD.</a> Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda pozwala na wizualizację drożdży i strzępek C. albicans w przewodzie pokarmowym komensywnie skolonizowanych myszy dowolnej płci i szczepu. Sonda FISH hybrydyzuje z 23S rRNA, które jest rozprowadzane w cytoplazmie grzyba. Nasza metoda została zaadaptowana z wcześniej opisanego protokołu wizualizacji bakterii jelitowych20. Ponieważ C. albicans zmienia swoją morfologię w organizmie gospodarza, metoda ta jest przydatna do monitorowania kształtu komórek grzyba, a także ich lokalizacji. Na przykład użyliśmy tej metody, aby obalić hipotezę, że drożdże dominują w całym przewodzie pokarmowym i ujawnić rozbieżności między fenotypami in vivo i in vitro niektórych mutantów z "wadliwym filamentem"12.
Istnieje kilka modeli myszy dla kolonizacji komensalnej C. albicans . Mikrobiota myszy laboratoryjnych i ludzi jest odrębna, a u myszy do ustanowienia stabilnej kolonizacji wymagane jest stosowanie antybiotyków lub specjalistycznej diety. Leczenie antybiotykami zwiększa również kolonizację C. albicans u ludzi i jest głównym czynnikiem ryzyka choroby rozsianej10. Antybiotyki stosowane w tym badaniu są stosunkowo niedrogie i powodują wiarygodne zmniejszenie mikrobioty bakteryjnej. Należy pamiętać, że antybiotyki są stosowane w celu zmniejszenia obciążenia antagonistycznymi gatunkami bakterii, a nie w celu wyeliminowania wszystkich bakterii ze zwierząt. Jeśli naukowcy chcą badać interakcje C. albicans-gospodarz przy braku bakterii lub aby uniknąć stosowania antybiotyków lub specjalnej diety, zwierzęta wolne od zarazków mogą zostać zastąpione zwierzętami hodowanymi konwencjonalnie; Jednak myszy gnotobiotyczne wykazują pewne nieprawidłowości immunologiczne i anatomiczne, dlatego mogą nie być odpowiednie do wszystkich celów.
Dla udanego barwienia RYB ważne jest kilka kroków: Zalecana metoda utrwalania ma kluczowe znaczenie dla zachowania integralności strukturalnej tkanek przewodu pokarmowego, w szczególności delikatnej zawartości światła jelita, takiej jak warstwa śluzu i trójwymiarowa organizacja grzybów i bakterii16. Należy pamiętać, że wiele powszechnie stosowanych roztworów mocujących, które zawierają wodę, jest wysoce szkodliwych dla architektury światła. Utrwalacze i roztwory do mycia po utrwaleniu zalecane w niniejszym protokole nie zawierają wody i ważne jest, aby unikać zanieczyszczenia wodą. Kolejnym krytycznym etapem jest etap hybrydyzacji, w którym ważne jest, aby uniknąć odparowania roztworu hybrydyzacyjnego podczas inkubacji szkiełek w piecu do hybrydyzacji. Sugerujemy umieszczenie zjeżdżalni w wodoszczelnym pojemniku, aby uniknąć tego problemu. Alternatywnie można użyć wodoszczelnych komór hybrydyzacyjnych, takich jak te pierwotnie używane do hybrydyzacji mikromacierzy.
Sonda FISH specyficzna dla C. albicans jest opisana w tym protokole. Ponieważ jednak wiele myszy hodowanych w laboratorium nie zawiera C. albicans ani innych grzybów jako części swojej naturalnej mikroflory jelitowej, sonda pangrzybicza może specyficznie zabarwić C. albicans u eksperymentalnie skolonizowanych zwierząt. Zastąpienie sondy pangrzybiczej może być pożądane ze względu na jej lepsze właściwości hybrydyzacyjne i wyższy stosunek sygnału do szumu. Jeśli sonda pangrzybicza jest używana jako sonda pseudospecyficzna dla C. albicans, ważne jest, aby udokumentować brak barwienia u niezakażonych zwierząt (tj. leczonych antybiotykami, ale nie C. albicans). Barwienie nieskolonizowanego zwierzęcia kontrolnego jest również przydatne do oceny barwienia tła, które może wynikać z przylegania sond FISH do cząstek pokarmu. Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie sond FISH zapewnia lepszą specyficzność w porównaniu z większością innych metod barwienia grzybów, takich jak Calcofluor white (który barwi chitynę, składnik ściany komórkowej, który może się różnić w zależności od typu komórki), GMS lub dostępne na rynku przeciwciała przeciwgrzybicze. Co więcej, barwienie FISH pozwala na kobarwienie wielu organizmów za pomocą różnie znakowanych sond FISH do specyficznych dla gatunku rRNA.
Jednym z zastrzeżeń tej techniki jest to, że niektóre typy komórek drożdży C. albicans wydają się bardzo podobne do FISH (na przykład typy komórek nieprzezroczystych i GUT). Aby rozróżnić te typy komórek, przydatne byłoby opracowanie sond hybrydyzacyjnych do mRNA grzybów specyficznych dla typu komórki. Niemniej jednak, w swojej obecnej formie, technika FISH ujawniła już zaskakujące rozbieżności między zachowaniami in vivo i in vitro mutantów C. albicans ocenianych w obu warunkach12, wskazując na złożone interakcje w naturalnym środowisku komensalnym, które nie są odpowiednio naśladowane przez istniejące testy in vitro. Dalsze badania różnych barwników C. albicans u dodatkowych dzikich i zmutowanych gospodarzy prawdopodobnie dostarczą dodatkowych informacji na temat interakcji między grzybem a gospodarzem. W szczególności pouczające będzie profilowanie C. albicans w modelach nieswoistego zapalenia jelit, które jest związane z wysokimi mianami C. albicans u ludzi21, oraz innych modelach przerostu i choroby C. albicans . Technika FISH może być również połączona z immunohistochemią w celu barwienia określonych komórek gospodarza. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiona tutaj metoda zapewnia dość szybki i niezawodny sposób określania lokalizacji i morfologii C. albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Candida albicans jest grzybem komensalnym, a także oportunistycznym ludzkim patogenem. Drożdże te nie mają zdefiniowanej niszy środowiskowej, a zamiast tego rozmnażają się w przewodzie pokarmowym (GI), skórze i układzie moczowo-płciowym ludzi i innych ssaków1. Podczas gdy wczesne badania nad C. albicans koncentrowały się przede wszystkim na jego potencjale wirulencji, kilka ostatnich doniesień sugeruje, że organizmy rozmnażające się komensalnie w jelitach mogą odgrywać ważną rolę w prawidłowym zdrowiu, w tym w rozwoju immunologicznym gospodarza2,3,4. Aby ułatwić badania komensalizmu C. albicans w jelicie ssaków, opracowaliśmy mysi model stabilnej kolonizacji przewodu pokarmowego i metodę opartą na fluorescencji hybrydyzacji in situ (FISH) do wizualizacji komórek drożdży i strzępek grzybów w świetle jelita.
Z pewnymi wyjątkami5, myszy wyhodowane w laboratorium zazwyczaj wykazują odporność na kolonizację przewodu pokarmowego przez grzyby. Uważa się, że w oporności na kolonizację pośredniczą określone gatunki bakterii; Można jednak temu zaradzić, traktując zwierzęta antybiotykami6,7 lub stosując chemicznie zdefiniowaną dietę, która przypuszczalnie zmienia skład gatunkowy bakterii8,9. Podobnie, u ludzi, stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działania wiąże się z przerostem i rozprzestrzenianiem się C. albicans10. Nasz mysi model kolonizacji wykorzystuje antybiotyki o szerokim spektrum działania do ustanowienia kolonizacji C. albicans u immunokompetentnych, konwencjonalnie hodowanych myszy. Penicylina i streptomycyna są podawane zwierzętom w wodzie pitnej przez tydzień przed zgłębnikiem z 108 jednostkami tworzącymi kolonie (CFU) C. albicans. Tak długo, jak woda z antybiotykiem jest kontynuowana, C. albicans będzie się rozprzestrzeniać w przewodzie pokarmowym, osiągając miano kału 106-10 8 CFU/g. Pomimo wysokiego poziomu kolonizacji grzybów, zwierzęta pozostają zdrowe i przybierają na wadze w takim samym tempie jak niezakażone grupy kontrolne. Model ten został z powodzeniem wykorzystany do badania przesiewowego i scharakteryzowania wielu czynników komensalizmu C. albicans11,12.
Podobnie jak inni członkowie królestwa grzybów, C. albicans jest zdolny do ogromnej plastyczności morfologicznej13. W warunkach in vitro wykazano, że przechodzi między co najmniej sześcioma jednokomórkowymi typami komórek drożdży, a także wielokomórkowymi strzępkami i pseudostrzępkami. Przejście drożdży do strzępek jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych atrybutów wirulencji, a strzępki i pseudostrzępki dominują w większości modeli chorób ssaków, a także w zakażonych tkankach ludzkich. Aby określić lokalizację i morfologię komórek C. albicans w mysim przewodzie pokarmowym, opracowaliśmy technikę FISH do barwienia drożdży i strzępek w ustalonych skrawkach histologicznych. Sondy składają się z fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów DNA, które hybrydyzują z rybosomalnym RNA (rRNA) grzyba 23S, który jest rozprowadzany w cytoplazmie grzyba. Ponieważ tkanki gospodarza są utrwalone w sposób, który zachowuje trójwymiarową architekturę jelita, w tym błonę śluzową gospodarza, materiał trawienny, mikrobiotę bakteryjną i śluz w świetle jelita, technika ta umożliwia lokalizację komórek grzybów w odniesieniu do tych punktów orientacyjnych po zabarwieniu. Technika FISH wypada korzystnie w porównaniu z tradycyjnymi barwieniami histologicznymi grzybów, takimi jak Periodic Acid Schiff (PAS) lub Methenamino-Silver Gomoriego (GMS), a także dostępnymi na rynku przeciwciałami przeciwgrzybiczymi, ponieważ odczynniki te nie są specyficzne dla C. albicans. Co więcej, standardowe utrwalacze usuwają warstwę śluzu i zakłócają pozostałą zawartość lumenu jelitowego 14,15.
W tym artykule podajemy szczegółowe instrukcje dotyczące ustalenia wysokiej klasy kolonizacji przewodu pokarmowego myszy przez C. albicans, preparacji przewodu pokarmowego zwierząt poddanych eutanazji, utrwalenia tkanek w sposób zachowujący architekturę świetlną, oraz wykrywania C. albicans w tkankach gospodarza za pomocą FISH. Oprócz dzikich i zmutowanych szczepów C. albicans, technika gaveage może być stosowana do dostarczania innych mikroorganizmów. Technika fiksacji byłaby przydatna w każdym badaniu, w którym pożądane jest zachowanie treści jelitowej. Procedura FISH może zostać zakończona w ciągu jednego dnia i może być wykorzystana do lokalizacji wielu gatunków grzybów za pomocą wielu, różnie znakowanych sond.

<table><tbody><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td>może być zastąpiona od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td> z krwią BHI <td>można zastąpić od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>C. albicans Sonda FISH</td><td>IDT DNA Technologies</td><td>na zamówienie</td><td></td>niestandardowe</tr><tr><td>Komora do inkubacji</td><td></td><td></td> hybrydyzacji <td>wodoszczelna komora przeznaczona do redukcji parowania</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>>=99,5%</td></tr> <tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>można zastąpić od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Delikatne chusteczki do wycierania</td><td>Kimberley-Clark</td><td>34256CT</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021-5KG</td><td>można zastąpić u dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Igły do karmienia</td><td>Kadencja, Inc.</td><td>7910</td><td>metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; może być sterylizowany w autoklawie w celu sterylizacji</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>dostępne inne fluorofory</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>dostępne inne fluorofory</td></tr><tr><td>Podkładki piankowe</td><td>Fisher</td><td>22038221</td><td>Zamów podkładki piankowe, które zmieszczą się w kasetach</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>47671</td><td>klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MK881746</td><td>odczynnik ACS, >=99,5%</td></tr><tr><td>Szklany słoik z kopliny</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td>mieści do 10 szkiełek tyłem do siebie</td></tr><tr><td>Kasety histologiczne</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>Głębokie kasety, dzięki którym jelito ślepe nie jest zgniecione</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do hybrydyzacji</td><td>Sigma</td><td>GBL712222</td><td>bez RNaz</td></tr><tr><td>Piec</td> <td>do hybrydyzacji</td><td></td><td>może być zastąpiony od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>LB</td><td></td><td></td><td>może być zastąpiony od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> Lee <td>przygotowana zgodnie z opisem w Lee et al. 1975</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td>odczynnik ACS, >=99,8%</td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Charles River Laboratories</td><td>028</td><td>dorosły BALB/c; 18-21 gramów (8-10 tygodni)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>50-980-487</td><td>16% roztwór</td></tr><tr><td>Wosk parrafinowy</td><td>Sigma</td><td>P3558-1KG</td><td>Paraplast do zatapiania tkanek</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>UCSF Zakład Hodowli Komórkowych Jednostka Produkcji Pożywek</td><td>CCFAL003</td><td>wapń, magnez; można zastąpić od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Penicylina G</td><td>Sigma</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td> z dekstrozą Sabouraud <td>może być zastąpiony od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7123</td><td>sterylny, może być zastąpiony od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td></td> <td>Sigma S3014</td><td>może być zastąpiony od dowolnego dostawcy; utrzymywać</td></tr><tr><td>dodecylosiarczan sodu (SDS)</td> wolny od RNaz <td>Sigma</td><td>L3771</td><td>może być zastąpiony od dowolnego dostawcy; utrzymywać streptomycynę wolną od RNaz</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>S9137-100G</td><td></td></tr><tr><td>Długopis Super PAP</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td>można zastąpić od dowolnego dostawcy</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>można zastąpić u dowolnego dostawcy; utrzymywać wolne od RNaz</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>nie zawiera DAPI</td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Sigma</td><td>214736</td><td>odczynnik</td></tr><tr><td>klasy YEPD</td><td></td><td></td><td>może być podstawiony od dowolnego dostawcy</td></tr></tbody></table>

wizualizacja candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans jest grzybowym składnikiem mikrobioty jelitowej u ludzi i wielu innych ssaków. Chociaż C. albicans nie powoduje objawów u większości skolonizowanych żywicieli, rezerwuar komensalny służy jako repozytorium chorób zakaźnych, a obecność wysokich mian grzybów w jelitach jest związana z nieswoistym zapaleniem jelit. W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji morfologii i lokalizacji komórek C. albicans w mysim modelu stabilnej kolonizacji przewodu pokarmowego. Kolonizację ustala się przy użyciu pojedynczej dawki C. albicans u zwierząt, które były leczone doustnymi antybiotykami. Segmenty tkanki jelitowej są utrwalone w sposób, który zachowuje architekturę zawartości światła (mikroorganizmy i śluz), a także błonę śluzową gospodarza. Wreszcie, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest przeprowadzana przy użyciu sond przeciwko rRNA grzyba w celu barwienia C. albicans i strzępek. Kluczową zaletą tego protokołu jest to, że pozwala on na jednoczesną obserwację morfologii komórek C. albicans i jej przestrzennego powiązania ze strukturami gospodarza podczas kolonizacji przewodu pokarmowego.

Postępując zgodnie z podanymi instrukcjami, wynikiem tej techniki będzie fluorescencyjne znakowanie jąder komórkowych w nabłonku gospodarza, śluzie oraz C. albicans w przekrojach tkanek przewodu pokarmowego. Komórki Candida albicans typu dzikiego powinny występować jako okrągłe, jednokomórkowe komórki drożdżakowe lub silnie wydłużone, niekiedy rozgałęzione, wielokomórkowe strzępki (podziały komórkowe w strzępkach nie będą widoczne). Mutanty C. albicans mogą dodatkowo występować jako mniejsze, lekko wydłużone drożdżaki „szare” lub jako większe, lekko wydłużone drożdżaki „GUT” (przejście indukowane przez przewód pokarmowy) lub „nieprzezroczyste”.
Rysunek 1 przedstawia igłę do karmienia używaną do zgłębnika doustnego, a także kluczowe pozycje igły podczas procedury podawania treści. Rysunek 2 przedstawia typową konfigurację stosowaną do sekcji organów oraz wygląd odcinków przewodu pokarmowego myszy.
Rysunek 3 przedstawia barwienie FISH różnych typów komórek C. albicans po propagacji in vitro oraz w modelu mysim. Rysunek 3A pokazuje obrazy fluorescencyjne i fazowe utrwalonych, permeabilizowanych strzępek propagowanych in vitro. Tworzenie strzępek indukowano przy użyciu płynnego podłoża Lee18 z 2% N-acetyloglukozaminą, pH 6,8 w temperaturze 37 °C. Rysunek 3B przedstawia obrazy fluorescencyjne i fazowe utrwalonych, permeabilizowanych komórek drożdżowych propagowanych in vitro. Rysunek 3C,D pokazuje odpowiednio utrwalone, permeabilizowane komórki GUT i komórki opaque propagowane in vitro. Typy komórek GUT i opaque są morfologicznie nieodróżnialne, chyba że są obrazowane za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Należy pamiętać, że barwienie FISH komórek propagowanych in vitro będzie suboptimalne, jeśli komórki nie zostaną odpowiednio permeabilizowane. Przykład słabego i rozproszonego barwienia pokazano na Rysunku 3C. Aby uzyskać najlepsze wyniki, warunki utrwalania i permeabilizacji komórek powinny zostać określone empirycznie dla każdego badanego typu komórek i gatunku. Na szczęście zalecany protokół wizualizacji C. albicans w przekrojach tkanek zapewnia bardziej spójną permeabilizację.
Rysunek 3E-G przedstawiają C. albicans w jelitach grubych myszy, barwione sondą specyficzną dla C. albicans (Rysunek 3E) lub sondą pan-grzybiczą (Rysunek 3F,G). C. albicans widoczne są na tych obrazach na czerwono, jądra komórek gospodarza na niebiesko, a warstwa śluzu na zielono. W jelitach grubych występują zarówno okrągłe drożdżaki, jak i silnie wydłużone strzępki (białe groty strzałek). Należy zauważyć, że barwienie sondą pan-grzybiczą jest jaśniejsze. Rysunek 3G przedstawia mutant ume6 w tym samym odcinku, barwiony sondą pan-grzybiczą. Ume6 koduje czynnik transkrypcyjny niezbędny do tworzenia strzępek w warunkach in vitro19. Co ciekawe, fenotyp zablokowany w formie drożdżakowej, wykazywany przez tego mutanta w warunkach in vitro, nie powtarza się w jelitach, co sugeruje, że w organizmie gospodarza musi zostać aktywowany redundantny czynnik12. Rysunek 4 przedstawia wygląd typu dzikiego C. albicans w różnych odcinkach przewodu pokarmowego myszy, w tym w obszarach bezpośrednio przylegających do błony śluzowej gospodarza oraz w bardziej centralnych obszarach światła jelita.
<img alt="Układ do gavage u gryzoni; wprowadzanie strzykawki i proces podawania, wspomagający doustną aplikację substancji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Kluczowe pozycje kaniuli do karmienia podczas gavage. (A) Kaniula do karmienia. (B) Kula kaniuli do karmienia wprowadzona z boku języka. (C) Kaniula do karmienia w pozycji pionowej z wprowadzeniem do przełyku. (D) Kaniula do karmienia wprowadzona do żołądka, z widocznymi kilkoma milimetrami powyżej nosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do sekcji z methacarnem, etanolem i kasetkami do analizy przewodu pokarmowego z podziałem na segmenty." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przykład układu sekcyjnego. (A) Podkładka do sekcji i narzędzia. (B) Wycięty przewód pokarmowy. Odcinek proksymalny (przełyk) do dystalnego (odbyt): I. Żołądek. II. Proksymalne jelita cienkie. III. Środkowe jelita cienkie. IV. Dystalne jelita cienkie. V. Ślepa kiszka. VI. Jelito grube. Różowe przerywane ramki wskazują tkanki przeznaczone do utrwalenia. (C) Tkanki umieszczone w kasetkach. Cyfry rzymskie odpowiadają tym z panelu B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej struktur bakteryjnych i komórkowych, przedstawiający lokalizację białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy po barwieniu metodą FISH C. albicans. (A) FISH w zakresie C. albicans strzępki hodowane w płynnym podłożu Lee’s18 z 2% N-acetyloglukozaminą, pH 6,8. (B) FISH w obrębie C. albicans okrągłe komórki drożdży hodowane na płytkach z agarem YEPD + 2%. (C) FISH w obrębie C. albicans Komórki GUT (ySN1045) hodowane na płytkach z agarem YEPD + 2%. (D) FISH w obrębie C. albicans komórki typu opaque hodowane na płytkach z agarem YEPD + 2%. (E) Typ dziki C. albicans (ySN250) w jelitach grubych, wybarwionych za pomocą C. albicans-specyficzna sonda. (F) Typ dziki C. albicans w jelitach grubych, zabarwionych sondą panfungalną. (G) Ume6 mutant (ySN1479) w jelicie grubym, zabarwiony sondą panfungalną: kolor czerwony oznacza C. albicans, kolor niebieski oznacza jądra komórkowe nabłonka gospodarza, a zielony mucynę. Groty strzałek wskazują strzępki. Strzałki wskazują drożdżaki. Paski skali = 20 µmObrazy F i G zostały opracowane na podstawie pracy Witchley i wsp.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Statyczna fluorescencja in situ mikrobioty jelitowej; schemat; regiony nabłonka i światła w przewodzie pokarmowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4: Wygląd preparatów barwionych metodą FISH C. albicans w różnych przedziałach przewodu pokarmowego. Typ dziki C. albicans przedstawiono we wskazanych odcinkach przewodu pokarmowego myszy. W każdym z tych odcinków obrazy przedstawiają obszar sąsiadujący ze śluzówką gospodarza oraz centralną część światła jelita. Barwienie wykonano za pomocą sondy panfungalnej. Pasek skali = 20 µmRyciny zostały opracowane na podstawie pracy Witchley i wsp.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Roztwory stokowe antybiotyków (200x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina G</td>
			<td>181 mg/ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycyna</td>
			<td>400 mg/µL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Methacarn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór zapasowy</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
			<td>Objętość</td>
			<td>Jednostki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metanol</td>
			<td>60%</td>
			<td>300</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>30%</td>
			<td>150</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas octowy lodowaty</td>
			<td>10%</td>
			<td>50</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Roztwór do hybrydyzacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór zapasowy</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
			<td>Objętość</td>
			<td>Jednostki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7,4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>20</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>180</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% formamid</td>
			<td>1.00%</td>
			<td>10</td>
			<td>µL (przechowywane w małych alikwotach w temperaturze -20 °C między użyciami)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda wolna od RNaz</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">roztwór do płukania w technice FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 7,4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>1</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>9</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda wolna od RNaz</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Roztwór do barwienia mucyn i jąder komórkowych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, 10 µg/mL</td>
			<td>20 ng/ml</td>
			<td>2</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lektyna, 40 µg/mL</td>
			<td>1.6 µg/mL</td>
			<td>40</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7,4</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Typowe objętości i stężenia roztworów stosowanych w tym protokole.

Celem tego protokołu jest wizualizacja kształtu i lokalizacji komórek Candida albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Protokół ten przyniósł jedne z najlepszych wglądów, jakie do tej pory posiadaliśmy na temat tego, w jaki sposób Candida albicans zamieszkuje przewód pokarmowy ssaków. Na przykład do niedawna tak naprawdę nie wiedzieliśmy, gdzie Candida jest zlokalizowana w jelitach ani którą z wielu form morfologicznych przyjmuje w tej niszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wizualizację Candidy w jej naturalnym środowisku bez zakłócania trójwymiarowych interakcji, jakie grzyb ma ze strukturami gospodarza lub z bakteriami w mikrobiocie.Ponieważ jelita są złożonym środowiskiem, bardzo trudno jest je modelować w laboratorium, dlatego znalezienie sposobu na zbadanie biologii Candida bezpośrednio w modelu gospodarza było bardzo satysfakcjonujące. Podejrzewa się, że niektóre składniki mikrobioty jelitowej, w tym Candida albicans, odgrywają rolę w chorobach, takich jak nieswoiste zapalenie jelit. Technika ta może być potencjalnie wykorzystana do diagnozowania obecności określonych mikroorganizmów w próbkach biopsyjnych pobranych od pacjentów.Opanowanie techniki gavage i umiejętność preparowania segmentów przewodu pokarmowego bez rozrywania narządów jest ważne dla uzyskania optymalnych wyników. Na początek należy podać każdemu zwierzęciu obliczoną objętość danego inokulum. Podłącz autoklawowaną igłę do karmienia zwierząt do jednomililitrowej strzykawki i napełnij strzykawkę jedną objętością zgłębnika, upewniając się, że usunąłeś wszystkie pęcherzyki.Umieścić strzykawkę na sterylnej powierzchni. Aby zabezpieczyć zwierzę, przytrzymaj je u nasady ogona dominującą ręką i przesuń niedominującą rękę w górę grzbietu zwierzęcia do luźnej skóry tuż za uszami. Zbierz mocno kark kciukiem i palcem wskazującym.Podnieś zwierzę za kark, odwróć je i owiń mały palec tej samej ręki wokół ogona, aby unieruchomić zwierzę na dłoni. Delikatnie wysuń głowę zwierzęcia tak, aby znajdowała się w linii prostej z ciałem. Następnie podnieś strzykawkę dominującą ręką i trzymaj ją prostopadle do zwierzęcia z zakrzywioną igłą skierowaną w dół.Użyj kulki igły, aby delikatnie zaczepić wewnętrzny kącik ust i przesuń igłę wzdłuż boku jamy ustnej do tylnej części gardła, a następnie przesuń igłę do środka. Gdy kulka igły znajdzie się z tyłu gardła zwierzęcia, przechyl igłę do góry, tak aby była równoległa do linii ciała zwierzęcia i pozwól jej płynnie przesunąć się w dół gardła. Jeśli igła nie przesuwa się płynnie w dół gardła, może to oznaczać, że igła nie jest prawidłowo umieszczona i należy ją wycofać w celu zmiany położenia i ponownej próby.Płynnie przesuwaj igłę, pozwalając zwierzęciu połknąć igłę, aż pozostanie widocznych tylko kilka milimetrów. Sprawdzić, czy kulka igły znajduje się w żołądku, delikatnie przesuwając tłok i jeśli nie ma oporu, kontynuować podawanie inokulum. Po podaniu inokulum powoli wyjąć igłę i umieścić zwierzę w klatce.Kontynuuj monitorowanie zwierzęcia przez pięć do 10 minut pod kątem oznak trudności w oddychaniu lub niepokoju i sprawdź, czy wznawia normalną aktywność wkrótce po zgłębniku. Jeśli ten sam inokulum zostanie użyty dla następnego zwierzęcia, wyczyść igłę chusteczką nasączoną alkoholem. Jeśli zostanie użyte inne inokulum, wymień igłę.Użyj tępo zakończonych kleszczy, aby uszczypnąć fragment skóry brzucha i naciąć skórę i leżącą pod nią powięź w pobliżu podstawy miednicy za pomocą nożyczek. Przedłuż nacięcie w kształcie litery U wzdłuż każdej strony jamy otrzewnej i aż do klatki piersiowej, a następnie unieś skórę z drogi. Użyj tępo zakończonych kleszczy, aby delikatnie usunąć jelito ślepe z jamy otrzewnej, używając nożyczek, aby przeciąć połączenia między jelitem ślepym a jelitem cienkim i grubym.Umieść całe jelito ślepe w kasecie histologicznej tak, aby było odkręcone i leżało płasko. Umieść drugą podkładkę piankową na górze i zamknij kasetę. Następnie umieść kasetę w zakręcanym słoiku zawierającym metakarnę.Wyciąć odcinek jelita grubego, który zawiera od jednego do dwóch granulek kału i ma długość mniejszą niż długość kasety. Umieść chusteczkę w kasecie, trzymając ją płasko i nieskręconą. Przykryj go drugą podkładką piankową, zamknij kasetę i umieść ją w metakarnie.Dla każdego odcinka jelita cienkiego, z którego ma zostać pobrana próbka, należy wyciąć od jednego do dwóch centymetrów odcinka, który zawiera pewną ilość materiału trawiennego. Umieść chusteczkę w kasecie, pokryj drugą podkładką piankową, zamknij kasetę i włóż ją do metakarnu. Podczas wycinania żołądka przerwij połączenia z przełykiem i jelitem cienkim.Umieść tkankę w kasecie i umieść kasetę w metakarnie. Pozostawić kasety w roztworze metakarny w temperaturze pokojowej na co najmniej trzy godziny, ale krócej niż dwa tygodnie. Po utrwaleniu usuń piankowe podkładki i włóż każdy nienaruszony fragment tkanki do kasety.Następnie myj chusteczki dwa razy przez 35 minut w 100% metanolu, dwa razy przez 25 minut w 100% etanolu i dwa razy przez 20 minut w ksylenie. Osusz kasety na ręczniku papierowym i umieść je we wstępnie stopionym wosku parafinowym na dwie godziny w temperaturze 70 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji. Następnie wyjmij kasety z wosku, pozwól nadmiarowi wosku spłynąć i przechowuj je w temperaturze pokojowej, aż zostaną osadzone w blokach wosku.Odwoskuj skrawki histologiczne zatopione w parafinie, wkładając szkiełka do wstępnie podgrzanego słoika wypełnionego ksylenem. Pozostaw słoik w temperaturze 60 stopni Celsjusza na 10 minut, a następnie wyrzuć mycie z ksylenu. Wlej świeży ksylen o temperaturze pokojowej do słoika i powtórz inkubację.Następnie napełnij słoik 100% etanolem i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji wyjmij szkiełka ze słoika i wysusz je na powietrzu. Aby zabarwić C.albicans za pomocą sondy do ryb, zacznij od narysowania okręgu wokół sekcji tkanki za pomocą Pat Pen.Odpipetować 50 mikrolitrów sondy zawierającej roztwór hybrydyzacyjny na utrwaloną tkankę i delikatnie rozprowadzić końcówką pipety. Pokryj płyn szkiełkiem nakrywkowym do hybrydyzacji, upewniając się, że zapobiegasz powstawaniu pęcherzyków. Następnie uszczelnij szkiełka w wodoszczelnej komorze hybrydyzacyjnej i inkubuj sekcje przez trzy godziny w temperaturze 50 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji w ciemności.Po inkubacji dodaj roztwór myjący do słoika Coplin. Ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe z szkiełka za pomocą kleszczy i umieść szkiełko w roztworze myjącym. Przykryj słoik folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 20 minut.Następnie umyj szkiełka, wylewając roztwór myjący i ponownie napełniając słoik PBS. Natychmiast odlej i ponownie napełnij świeżym PBS, powtarzając proces, w sumie dwa prania. Odetnij PBS delikatną chusteczką zadaniową i okrąż odcinek tkanki jelitowej za pomocą Pat Pen.Umieść szkiełka w nieprzezroczystym plastikowym pojemniku i dodaj 50 mikrolitrów roztworu do barwienia jąder mucyny do sekcji tkanki. Przykryj pojemnik folią aluminiową i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 45 minut. Po inkubacji włóż szkiełka do słoika Coplin i umyj je dwukrotnie PBS.Stuknij nadmiar PBS na ręcznik papierowy, a następnie odchować ostatnie krople chusteczką. Umieść jedną kroplę podłoża montażowego na każdej sekcji i przykryj ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym, upewniając się, że nie ma pęcherzyków. Pozwól, aby podłoże montażowe rozprowadziło się pod całym szkiełkiem nakrywkowym.Zakotwicz szkiełko nakrywkowe w miejscu z lakierem do paznokci w rogach i zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Protokół ten może być stosowany do fluorescencyjnego znakowania C.albicans in vitro i w tkankach gospodarza. Strzępki rozmnażane in vitro, okrągłe komórki drożdży, komórki jelitowe i komórki nieprzezroczyste utrwalono, przepuszczalno i rozróżniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i kontrastu fazowego.Okrągłe drożdże i bardzo wydłużone strzępki zostały zobrazowane w jelicie grubym myszy. Tkanki gospodarza barwiono za pomocą specyficznej sondy C.albicans lub sondy pangrzybiczej. C. albicans oznaczono na czerwono, jądra komórek gospodarza na niebiesko, a warstwę śluzu na zielono.C. albicans wykryto w różnych segmentach mysiego przewodu pokarmowego, w tym w regionach bezpośrednio przylegających do błony śluzowej gospodarza i bardziej centralnych obszarach światła jelita. Dla naukowców, którzy wcześniej nie stosowali techniki gaveage, ważne jest, aby przed wypróbowaniem tej metody przejść specjalistyczne szkolenie. Po barwieniu ryb można zastosować techniki immunofluorescencyjne do barwienia dodatkowych cech błony śluzowej gospodarza.Może to pozwolić na scharakteryzowanie uszkodzeń tkanek lub odpowiedzi immunologicznych gospodarza. Technika ta pozwoliła nam scharakteryzować związek między morfologią komórek grzybów mutantów Candida albicans a przeżywalnością w organizmie gospodarza, pogłębiając naszą wiedzę na temat biologii Candida albicans, którą można wykorzystać przy opracowywaniu terapii.

visualization-candida-albicans-murine-gastrointestinal-tract-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Źródło: Ng, K. M., Tropini, C. Wizualizacja interakcji mikrobioty jelitowej z gospodarzem za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ , barwienia lektynowego oraz obrazowania. J. Vis. Exp. (2021).Ten film demonstruje procedurę hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) w celu barwienia mikrobioty jelitowej w tkance jelitowej myszy poprzez hybrydyzację fluorescencyjnych sond do bakteryjnego rRNA (rybosomalnego kwasu rybonukleinowego) oraz przeciwbarwienie struktur gospodarza do analizy...

Fluorescencja in situ Hybrydyzacja bakterii jelitowych w przekrojach jelit myszy

Ten film demonstruje rozwój mysiego modelu in vivo do badania tworzenia biofilmu Candida albicans w tkance podskórnej. Eksperyment polega na wszczepieniu urządzeń zakażonych Candida w okolicy pleców zwierzęcia w celu rozwoju biofilmu.

Candida albicans (Candida albicans) Tworzenie biofilmu w mysim modelu in vivo

Przedstawiamy eksperymentalną procedurę rozwoju biofilmu Candida albicans w mysim modelu podskórnym. Biofilmy grzybów określono ilościowo, określając liczbę jednostek tworzących kolonie oraz nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne, w którym ilość wytwarzanego światła odpowiada liczbie żywotnych komórek.

Candida albicans (Candida albicans) Rozwój biofilmu na istotnych z medycznego punktu widzenia ciałach obcych w mysim modelu podskórnym, a następnie obrazowanie bioluminescencyjne

Tutaj opisujemy technikę opartą na mikroskopie, aby wizualizować i kwantyfikować wczesne kaskady zdarzeń podczas fagocytozy patogenów, takich jak grzyby Candida albicans i cząstki większe niż 0,5 μm, w tym kulki pokryte zymozanem i IgG.

Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

Aby zobaczyć i określić ilościowo wewnętrzne cechy biofilmów Candida albicans, przygotowujemy nienaruszone próbki stałe, które są klarowane przez dopasowanie współczynnika załamania. Następnie można wykorzystać optyczną mikroskopię przekrojową do uzyskania trójwymiarowych danych obrazowych na całej grubości biofilmu.

Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans

Test ex vivo opisany w tym badaniu z wykorzystaniem ekstraktów homogenatu jelitowego i barwienia immunofluorescencyjnego stanowi nowatorską metodę badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym. Metoda ta może być wykorzystana do badania sygnałów środowiskowych regulujących przemianę morfogenetyczną w jelitach.

Test ex vivo do badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Ten manuskrypt opisuje metodę badania przesiewowego bibliotek mutantów Candida albicans średniej wielkości pod kątem fenotypów morfogenezy podczas aktywnej infekcji u ssaków za pomocą nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej.

Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Tworzymy mysi model infekcji związanej z cewnikiem (CRI) związanej z C.albicans, w której na cewniku tworzy się biofilm, a interakcja między C.albicans a gospodarzem dobrze koreluje z klinicznym CRI. Model ten pomaga w badaniach przesiewowych w kierunku CRI związanego z biofilmem C. albicans, kładąc podwaliny pod transformację kliniczną.

Model zakażenia Candida albicans związany z cewnikiem u myszy

Poznaj wizualizację Candida albicans w przewodzie pokarmowym myszy za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Ta metoda pozwala badać lokalizację i morfologię grzyba w jego naturalnym środowisku.

Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Przeglądaj więcej filmów