Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila
September 25th, 2019
Tutaj opisujemy metodę, którą zastosowaliśmy do zobrazowania wysoce ruchliwych filopodiów dendrytycznych w żywym przygotowaniu mózgu larwy Drosophila, oraz opracowany przez nas protokół do ilościowego oznaczania zestawów danych obrazowania 3D w celu ilościowej oceny dynamiki dendrytów w rozwijających się neuronach.
Protokół ten zapewnia nowe podejście do ilościowego określania dynamiki gałęzi trzpienia dendrytycznego i rozwoju neuronów przy użyciu obrazowania poklatkowego na żywo i oprogramowania do adnotacji obrazów 3D. Technika ta obrazuje i śledzi terminale rozgałęzione, zapewniając szybką i wydajną metodę pomiaru dynamicznych zachowań filopodiów dendrytycznych. Badania z wykorzystaniem tej metody pozwalają zrozumieć, w jaki sposób rozwój i aktywność regulują morfogenezę dendrytów.
Nasze metody mają zastosowanie do słabo znakowanych neuronów zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Wykonując ten zabieg należy pamiętać, że parametry obrazowania muszą być starannie dostosowane, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość czasową i przestrzenną. Aby pobrać mózg z larw Drosophila, pod mikroskopem preparacyjnym użyj jednej pary standardowych kleszczy preparacyjnych z końcówką numer pięć, aby przytrzymać próbkę larwy na miejscu, podczas gdy drugiej używasz do ostrożnego wypreparowania mózgu, zachowując dyski oczu, płaty mózgowe i brzuszny rdzeń nerwowy.
Następnie usuń przyczepione mięśnie, aby zminimalizować ruch próbki podczas obrazowania. Kiedy wszystkie mózgi zostaną pobrane, użyj smaru próżniowego, aby narysować kwadratową komorę na szklanym szkiełku i dodaj 20 mikrolitrów zewnętrznego roztworu soli fizjologicznej do komory. Użyj kleszczy, aby przenieść mózgi do komory i dostosuj pozycje mózgów pod mikroskopem z grzbietowymi stronami skierowanymi do góry.
Przykryj komorę szklanym szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby zmniejszyć dryf próbki podczas procedury obrazowania. Aby zidentyfikować eksplantaty mózgu zawierające indywidualnie znakowane neurony, w ciągu 30 minut od sekcji wybierz 40-krotny obiektyw zanurzenia w wodzie i źródło światła epifluorescencji. Wybierz laser dwufotonowy dostrojony do 920 nanometrów i detektor bez Dscan i ustaw parametry obrazowania, aby zbierać obrazy w rozdzielczości 512 na 512 pikseli na klatkę i jedną minutę na stos Z przez 10 minut.
Następnie dostosuj zoom optyczny i cyfrowy, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość X, Y, Z, zapewniając jednocześnie pokrycie całej altany dendrytycznej w ciągu jednej minuty. Ustawienia wygenerują obrazy o typowej rozdzielczości X, Y, Z 0,11 na 0,11 na 0,25 mikrometra. Aby uzyskać korekcję dryftu, otwórz interesujący Cię plik w odpowiednim oprogramowaniu do korekcji dryftu i kliknij Edytuj i Edytuj parametry mikroskopowe.
Ustaw typ mikroskopu na Szerokie pole dla dwóch obrazów fotonów, jeśli dostępna jest opcja dwóch fotonów, i postępuj zgodnie z przepływem pracy zdefiniowanym przez oprogramowanie. Aby uzyskać dekonwolucję, otwórz obraz z korekcją dryfu w oprogramowaniu do dekonwolucji i postępuj zgodnie z przepływem pracy. Następnie zapisz zdekonwoluowany obraz w typie pliku, który jest obsługiwany przez późniejsze oprogramowanie do adnotacji obrazu, które może analizować dane 4D i raportować współrzędne przestrzenne zdefiniowanych punktów na obrazie.
Aby dodać adnotację do obrazu, otwórz zdekonwoluowany obraz w oprogramowaniu do adnotacji obrazu, a następnie sprawdź i zaznacz końcówki gałęzi we wszystkich punktach czasu w 3D. Oprogramowanie do adnotacji obrazów będzie raportować i przechowywać współrzędne przestrzenne i czasowe zaznaczonych końcówek gałęzi. Eksportuj informacje o współrzędnych jako plik CSV do kolejnych obliczeń.
W module Spoty kliknij Pomiń automatyczne tworzenie, Edytuj ręcznie i zaznacz pole wyboru Automatycznie łącz z wybranym miejscem. Przejrzyj ramki w szeregach czasowych i wybierz gałąź do adnotacji. Przytrzymując Shift, kliknij końcówkę terminalu rozgałęzienia, aby dodać miejsce.
Następnie kliknij kartę Statystyki, wybierz opcję Szczegółowe, Określone wartości i Pozycja. Zostaną wyświetlone zarejestrowane informacje o współrzędnych przestrzennych i czasowych. Kliknij przycisk Zapisz, aby wyeksportować dane jako plik CSV.
Aby obliczyć położenie końcówki gałęzi w 3D, otwórz plik CSV jako arkusz kalkulacyjny i wybierz kolumnę Identyfikator ścieżki. Kliknij przycisk Sortuj od najmniejszego do największego i zaakceptuj Rozwiń zaznaczenie. Po posortowaniu identyfikator ścieżki zidentyfikuje każdą unikalną gałąź dendrytyczną, a miejsca z tej samej gałęzi mają ten sam identyfikator ścieżki. Kolumna Czas będzie przechowywać informacje z różnych przedziałów czasowych.
W arkuszu kalkulacyjnym dodaj kolumnę Odległość i użyj współrzędnych, aby obliczyć odległość każdych dwóch czasowo sąsiadujących miejsc. Aby zmierzyć drobne ruchy na poziomie pojedynczego woksela, zresetuj wszystkie wartości odległości mniejsze niż 0,3 mikrometra, aby odfiltrować wszelkie nieskorygowane dryfowanie lub niedoskonałe adnotacje obrazu. Następnie utwórz kolumnę Przemieszczenie i skopiuj wartości z kolumny Odległość do kolumny Przemieszczenie.
Ręcznie przypisz zdarzenia przedłużania i wciągania dla każdej końcówki gałęzi. Jeśli jest to przedłużenie, pozostaw wartość przemieszczenia dodatniego bez zmian. Jeśli jest to wycofanie, zmień odpowiednią wartość przemieszczenia na wartość ujemną.
Następnie w nowej kolumnie Zdarzenie zsumuj wartości przemieszczenia dla poszczególnych zdarzeń wydłużenia i wycofania. W tym filmie można zaobserwować serię obrazów o maksymalnej intensywności pobranych z reprezentatywnego, indywidualnie oznakowanego brzusznego neuronu bocznego. Obrazy z pojedynczą klatką umożliwiają ocenę zdarzeń wycofania i wydłużenia.
Półautomatyczne śledzenie 4D końcówek rozgałęzień umożliwia adnotację dynamicznych końców rozgałęzień indywidualnie znakowanych neuronów brzusznych bocznych, jak pokazano. Obliczanie kierunku i odległości ruchów gałęzi w każdym punkcie czasowym pozwala na porównanie dynamiki gałęzi dendrytycznych dla indywidualnie znakowanych brzusznych neuronów bocznych na różnych etapach rozwoju. Najważniejszym krokiem jest zachowanie integralności tkanki mózgowej i morfoloi dendrytów podczas preparacji i montażu.
Jakość surowych serii obrazów ma również kluczowe znaczenie dla pomyślnego śledzenia i kwantyfikacji. Korzystając z tej techniki, uzyskaliśmy możliwość przeprowadzenia analizy ilościowej filopodiów dendrytowych w rozwoju neuronów centralnych Drosophila oraz zbadania maszynerii molekularnej związanej z dojrzewaniem dendrytów i synaptogenezą.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę obrazowania wysoce ruchliwych filopodi dendrytycznych w żywych mózgach larw Drosophila. Wykorzystując 3D time-lapse imaging, protokół ilustruje dynamikę gałęzi dendrytów w rozwijających się neuronach, dostarczając wglądu w morfogenezę dendrytów regulowaną rozwojem i aktywnością.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwojowa
- Techniki obrazowania
Tło
- Filopodia dendrytyczne odgrywają krytyczną rolę w synaptogenezie i rozwoju obwodów neuronowych.
- Rozumienie dynamiki dendrytów jest niezbędne dla wglądu w plastyczność i funkcjonowanie neuronów.
- Techniki obrazowania na żywo umożliwiają obserwację zmian neuronowych w czasie rzeczywistym podczas rozwoju.
- Dokładne ilościowe określenie dynamiki dendrytów może zapewnić lepsze zrozumienie mechanizmów regulacyjnych.
Cel badania
- Rozwój solidnej metody śledzenia filopodi dendrytycznych in vivo.
- Ocena dynamiki rozgałęziania się w rozwijających się neuronach.
- Ułatwienie wglądu w to, jak aktywność i rozwój neuronów wpływają na morfologię dendrytów.
Stosowane metody
- Live time-lapse imaging mózgów larw Drosophila.
- Wykorzystano oprogramowanie do adnotacji obrazów 3D w celu śledzenia końcówek gałęzi.
- Parametry obrazowania zostały zoptymalizowane pod kątem rozdzielczości czasowej i przestrzennej podczas dysekcji.
- Analiza po obrazowaniu obejmowała korekcję dryfu, dekonwolucję i ręczne adnotowanie końcówek gałęzi.
- Analiza ilościowa obejmowała obliczanie odległości i ruchów końcówek gałęzi dendrytycznych.
Główne wyniki
- Metoda z powodzeniem śledziła dynamiczne zachowania filopodi dendrytycznych w rozwijających się neuronach.
- Zdarzenia wydłużania i kurczenia każdej gałęzi dendrytycznej zostały ilościowo ocenione.
- Jakość obrazu i integralność tkanki były krytyczne dla dokładnego śledzenia i ilościowego określenia.
- To podejście umożliwia analizy porównawcze na różnych etapach rozwoju.
Wnioski
- Niniejsze badanie zapewnia nowy protokół ilościowej analizy dynamiki filopodi dendrytycznych.
- Metoda zwiększa zrozumienie, w jaki sposób rozwój i aktywność neuronowa regulują morfologię dendrytów.
- Zdobyte wglądy mogą wpłynąć na badania nad formowaniem synaps i łącznością neuronową.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying dendritic branch dynamics enables mechanistic de-risking in neurodevelopmental target validation by linking structural plasticity to functional outcomes. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative readouts of neurite morphogenesis relevant to synaptic formation pathways. The method’s applicability to sparsely labeled neurons in vitro and in vivo enhances translational continuity across model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to neurite outgrowth and synaptic partner engagement through direct measurement of filopodial dynamics.
- Operational Value: Provides a standardized framework for assessing target engagement effects on dendritic complexity in phenotypic screening assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved data on branch tip movements that can serve as phenotypic readouts for compound-induced neurodevelopmental effects.
- Operational Value: Supports assay standardization through drift correction, deconvolution, and coordinate-based tracking, improving reproducibility across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by enabling comparison of dendritic dynamics across developmental stages or genetic perturbations linked to neurodevelopmental disorders.
- Operational Value: Produces translatable metrics (extension/retraction events, displacement) that bridge in vitro findings to in vivo validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by converting live imaging data into quantifiable dynamics that inform lead identification and preclinical risk assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of targets regulating cytoskeletal remodeling and activity-dependent neurite stabilization.
- Screening: Enables assay readiness through standardized imaging protocols and post-processing pipelines that ensure data consistency.
- Analytics: Delivers quantitative outputs (distance, displacement, event summation) that allow objective comparison of dendritic behavior across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing measurable neurite dynamics that correlate with synaptic maturation and circuit formation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform applicable to diverse neuronal models and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental target validation by linking molecular perturbations to dynamic structural phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized drift correction, deconvolution, and manual annotation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, quantitative neurite morphology data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on dendritic complexity and synaptic readiness.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live imaging, neuronal dissection, and 4D image annotation software for accurate terminal tracking.
- Depends on high-resolution microscopy systems capable of 3D time-lapse acquisition with sufficient temporal resolution to capture fast filopodial dynamics.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters, drift correction protocols, and annotation criteria to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to different neuronal types or model systems with varying arbor complexity.
- Dependent on preserving tissue integrity during dissection and mounting, as physical disruption directly impacts data quality and tracking accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
Larval Brain Explant Dissection and Mounting
2:04
Live Time-Lapse Imaging
3:02
Drift Correction and Deconvolution
3:54
Image Annotation
5:06
Dynamic Dendritic Branch Calculation
6:43
Results: Representative Dynamic Dendritic Branch Terminal Tracking
7:34
Conclusion
