Name: Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo w trybie poklatkowym do kwantyfikacji dynamiki gałęzi dendrytycznych w rozwijających się neuronach Drosophila. Technika ta umożliwia badanie morfogenezy dendrytów regulowanej przez rozwój i aktywność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Intramural Research Program of National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. Numer projektu: 1ZIANS003137.

UWAGA: Ten protokół obejmuje użycie laserów klasy IV i będzie wymagał odpowiedniego szkolenia oraz wytycznych bezpieczeństwa, które należy przestrzegać. Unikaj ekspozycji oczu lub skóry na bezpośrednie lub rozproszone światło laserowe. 
nuta: Protokół składa się z sześciu kroków. Przepływ pracy jest pokazany w Rysunek 1A.
1. Oznaczanie pojedynczych neuronów za pomocą techniki flip-out
UWAGA: Pojedyncze etykietowanie LNvs osiąga się poprzez wyrażenie mCD8::GFP w pojedynczych LNvs za pomocą stochastycznego etykietowania za pośrednictwem flippazy. Genotyp żyłki muchowej to: hs-flp; Plik PDF-Gal4; UAS-FRT-CD2-stop-FRT-mCD8::GFP11,12,13. Częstość otrzymywania pojedynczego znakowanego LNv wynosi około 10%. Stado much utrzymuje się w standardowym podłożu w inkubatorach o temperaturze 25 °C z kontrolowaną temperaturą okołodobową i wilgotnością.
<ol>
	<li>Zbierz 100-200 jaj w ciągu 2 godzin po zapłodnieniu na talerzu z sokiem winogronowym z dodatkiem drożdży. Inkubować zarodki w temperaturze 25 °C przez 24 godziny i zebrać nowo wyklute larwy pierwszego stadium rozwojowego do następnego etapu.</li>
	<li>Szok cieplny nowo wyklutych larw pierwszego stadium rozwojowego w temperaturze 37,5 °C przez 40 minut dwa razy, z 40-minutowym okresem rekonwalescencji pomiędzy nimi.</li>
	<li>Hodowla larw w temperaturze 25 °C z kontrolą okołodobową i wilgotnością do pożądanego stadium lub etapów rozwojowych.</li>
</ol>
2. Sekcja i montaż eksplantatów mózgów larw
<ol>
	<li>Wypreparuj mózgi larw w fizjologicznym roztworze soli zewnętrznej (120 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 3 mM KCl, 10 mM NaHCO3, 10 mM glukozy, 10 mM sacharozy, 5 mM TES, 10 mM HEPES, 2 mM Ca2+, PH 7,2) pod mikroskopem preparacyjnym (4,5x powiększenie) z dwiema parami standardowych kleszczy preparacyjnych #5 (11 cm). Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać ciało larwy na miejscu, a drugiej, aby ostrożnie wyciąć mózg. Zachowaj dyski oczne, płaty mózgowe i brzuszny rdzeń nerwowy. Usuń przyczepione mięśnie, aby zminimalizować ruchy próbki podczas obrazowania.</li>
	<li>Przygotuj szkiełko podstawowe (25 x 75 x 1,0 mm3) i za pomocą strzykawki narysuj kwadratową komorę z tłuszczem próżniowym.</li>
	<li>Dodać 20 μl zewnętrznego roztworu soli fizjologicznej do kwadratowej komory z barierami przeciwtłuszczowymi.</li>
	<li>Wypreparowane mózgi larwalne przenieść do komory na szkiełku za pomocą kleszczy. Dostosuj położenie mózgów pod lunetą preparacyjną, aby upewnić się, że strona grzbietowa jest skierowana do góry.</li>
	<li>Przykryj komorę szklanym szkiełkiem nakrywkowym (22 x 22 x 0,15 mm3). Mózg larwy jest teraz zamontowany na szkiełku w komorze wypełnionej zewnętrznym roztworem soli fizjologicznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	nuta: Delikatne naciskanie na szkiełko nakrywkowe ogranicza mózg i zmniejsza dryfowanie próbki podczas kolejnej sesji obrazowania.</li>
</ol>
3. Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym
UWAGA: Przeprowadzamy eksperymenty z obrazowaniem poklatkowym za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser wielofotonowy. Parametry akwizycji należy dostosować do innych konfiguracji obrazowania.
<ol>
	<li>Zidentyfikuj eksplantaty mózgu zawierające indywidualnie znakowane neurony za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzenia w wodzie (NA 1.3) i epifluorescencyjnego źródła światła. Do zbierania obrazów należy użyć lasera dwufotonowego dostrojonego do długości fali 920 nm i detektora non-descanned (NDD).</li>
	<li>Zbieraj obrazy w rozdzielczości 512 x 512 pikseli na klatkę i 1 minutę na stos Z przez 10 minut. Dostosuj zoom optyczny i cyfrowy, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość x-y-z, zapewniając jednocześnie pokrycie całej altany dendrytycznej w ciągu 1 minuty (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2, Dodatkowe wideo 1). Ustawienia generują obrazy o typowej rozdzielczości x-y-z 0,11 x 0,11 x 0,25 μm3.</li>
	<li>Zbierz serię zdjęć poklatkowych w ciągu 30 minut od sekcji mózgu. Dane z nadmiernym dryftem lub wyraźnym pogorszeniem morfologicznym powinny być wyłączone z przetwarzania końcowego i kwantyfikacji.</li>
</ol>
4. Korekcja dryfu i dekonwolucja
UWAGA: W zależności od jakości obrazu, oba kroki są opcjonalne, ale zdecydowanie zalecane.
<ol>
	<li>Otwórz pobrany plik obrazu za pomocą oprogramowania do korekcji dryfu. Edytuj parametry mikroskopowe, aby dopasować je do parametrów użytych w eksperymencie. W przypadku oprogramowania (patrz Spis materiałów) kliknij Edytuj | Edytuj parametry mikroskopowe. Ustaw typ mikroskopu jako szerokokątny dla obrazów dwufotonowych, jeśli nie ma opcji dwóch fotonów i postępuj zgodnie z przepływem pracy zdefiniowanym przez oprogramowanie. Na przykład otwórz kartę Dekonwolucja | Stabilizator obiektu i wybierz opcję Stabilizuj ramy czasowe.</li>
	<li>Otwórz obraz z korekcją dryfu w oprogramowaniu do dekonwolucji i postępuj zgodnie z jego przepływem pracy. W przypadku oprogramowania (patrz Spis materiałów) wybierz ustabilizowany obraz, a następnie kliknij przycisk Dekonwolucja | Dekonwolucja ekspresowa. Aby uzyskać lepszy wynik, dostosuj parametry za pomocą Kreatora dekonwolucji.</li>
	<li>Zapisz zdekonwoluowany obraz w typie pliku, który jest obsługiwany przez późniejsze oprogramowanie do adnotacji obrazu, które może analizować dane 4D i raportować współrzędne przestrzenne zdefiniowanych punktów na obrazie (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
5. Adnotacja obrazu
<ol>
	<li>Otwórz zdekonwoluowany obraz w oprogramowaniu do adnotacji obrazu. Badaj i oznaczaj końcówki gałęzi we wszystkich punktach czasowych w 3D. Oprogramowanie do adnotacji obrazów raportuje i przechowuje współrzędne przestrzenne i czasowe zaznaczonych końcówek gałęzi. Eksportuj informacje o współrzędnych jako plik .csv do kolejnych obliczeń. 
	nuta: Poniższe dwa kroki są specyficzne dla używanego przez nas oprogramowania do adnotacji (patrz Spis materiałów). Przepływ pracy może być inny w przypadku innych programów.</li>
	<li>W module Spoty kliknij "Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie" i zaznacz dolne pole wyboru "Automatycznie połącz z wybranym Spotem" (Rysunek 3A). Przejrzyj ramki w szeregach czasowych i wybierz gałąź do adnotacji. Przytrzymaj Shift i kliknij końcówkę terminala rozgałęzienia, aby dodać miejsce. Kliknij wszystkie punkty czasowe. 
	nuta: Oprogramowanie do adnotacji obrazu łączy punkty między klatkami i automatycznie generuje trajektorię. Informacje przestrzenne i czasowe końcówek gałęzi są teraz powiązane z zaznaczonymi miejscami. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie końcówki gałęzi zostaną opatrzone adnotacjami (Rysunek 3B).</li>
	<li>W module Spoty kliknij zakładkę Statystyki, wybierz Szczegółowe i wybierz Określone wartości | Pozycja. Zarejestrowane informacje o współrzędnych przestrzennych i czasowych zostaną wyświetlone. Kliknij przycisk Zapisz na dole, aby wyeksportować te informacje jako plik .csv (Rysunek 3C).</li>
</ol>
6. Obliczanie dynamiki gałęzi dendrytycznych
UWAGA: Korzystając z informacji o współrzędnych, można łatwo obliczyć przemieszczenie końcówek gałęzi w 3D. W naszym badaniu wszystkie ruchy gałęzi dendrytycznych są klasyfikowane jako Wydłużenie lub Wycofanie. Poniższe kroki opisują sposób przetwarzania plików .csv przy użyciu niestandardowych skryptów języka R (plik uzupełniający) i dodawania informacji kierunkowych za pomocą edycji ręcznej.
<ol>
	<li>Otwórz plik .csv jako arkusz kalkulacyjny. Wybierz kolumnę Identyfikator ścieżki, kliknij opcję Sortuj od najmniejszej do największej i zaakceptuj opcję Rozwiń wybór. Po posortowaniu identyfikator ścieżki identyfikuje każdą unikalną gałąź dendrytyczną, a miejsca z tej samej gałęzi mają ten sam identyfikator ścieżki. Kolumna Czas przechowuje informacje z różnych przedziałów czasowych.</li>
	<li>W arkuszu kalkulacyjnym dodaj kolumnę Odległość. Oblicz odległość wszystkich dwóch czasowo sąsiadujących ze sobą punktów, korzystając z ich współrzędnych i umieść wartości w kolumnie Odległość (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	<li>Drobne ruchy na poziomie pojedynczego woksela. W oparciu o ustawienia obrazowania, 0,3 μm to zwykle artefakty wynikające z nieskorygowanego dryftu lub niedoskonałej adnotacji obrazu. Odfiltruj te ruchy, resetując wszystkie wartości odległości mniejsze niż 0,3 μm do 0. Przetwarzaj wiele plików .csv ręcznie lub skorzystaj z naszego filtrowania kolumn wsadowych skryptu języka R. r (plik uzupełniający).</li>
	<li>Ręcznie wygeneruj nową kolumnę o nazwie Przemieszczenie w arkuszu kalkulacyjnym. Skopiuj wartości z kolumny Odległość do kolumny Przemieszczenie. Ręcznie przypisz zdarzenia przedłużania i wciągania dla każdej końcówki gałęzi. Jeśli jest to przedłużenie, pozostaw wartość Przemieszczenie bez zmian, która jest wartością dodatnią. Jeśli jest to wycofanie, zmień odpowiednią wartość Przemieszczenia na wartość ujemną (np. 0,35 do -0,35) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Wygeneruj nową kolumnę o nazwie Zdarzenie. W tej kolumnie ręcznie zsumuj wartości Przemieszczenia dla poszczególnych zdarzeń wysuwania i cofania (Rysunek 4B).</li>
	<li>Przetwórz zmodyfikowany arkusz kalkulacyjny i określ ilościowo zdarzenia wydłużania i wycofywania na podstawie ich wartości przemieszczenia przy użyciu sumy kolumn wsadowych skryptu języka R. r (plik uzupełniający). Parametry wyjściowe obejmują liczbę zdarzeń przedłużenia, liczbę zdarzeń wycofania, długość skumulowaną wydłużoną, długość skumulowaną wycofaną, zmienioną długość netto i przebytą długość całkowitą.</li>
</ol>

<ol><li>Wong, W. T., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+specificity+of+neurotransmitter+regulation+of+rapid+dendritic+remodeling+during+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changing specificity of neurotransmitter regulation of rapid dendritic remodeling during synaptogenesis.</a> Nature Neuroscience. 4 (4), 351-352 (2001).</li>
<li>Wu, G. Y., Zou, D. J., Rajan, I., Cline, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Dynamics+In+Vivo+Change+during+Neuronal+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic Dynamics In Vivo Change during Neuronal Maturation.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (11), 4472-4483 (1999).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 316(2010).</li>
<li>Cline, H., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+dendritic+arbor+development+and+plasticity+by+glutamatergic+synaptic+input%3A+a+review+of+the+synaptotrophic+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.</a> The Journal of Physiology. 586 (6), 1509-1517 (2008).</li>
<li>Helfrich-Forster, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+morphology+of+the+clock-gene-expressing+lateral+neurons+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development and morphology of the clock-gene-expressing lateral neurons of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Comparative Neurology. 500 (1), 47-70 (2007).</li>
<li>Sprecher, S. G., Cardona, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+larval+visual+system%3A+High-resolution+analysis+of+a+simple+visual+neuropil%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila larval visual system: High-resolution analysis of a simple visual neuropil.</a> Developmental Biology. 358 (1), 33-43 (2011).</li>
<li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Induced+Structural+and+Functional+Plasticity+in+Drosophila+Larval+Visual+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light-Induced Structural and Functional Plasticity in Drosophila Larval Visual System.</a> Science. 333 (6048), 1458-1462 (2011).</li>
<li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+targets+dynamic+filopodia+in+regulating+dendrite+maturation+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity targets dynamic filopodia in regulating dendrite maturation and synaptogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 3362(2018).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+of+Lipophorin+Receptors+Supports+Neuronal+Adaptation+to+Chronic+Elevations+of+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation of Lipophorin Receptors Supports Neuronal Adaptation to Chronic Elevations of Activity.</a> Cell Reports. 25 (5), 1181-1192 (2018).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li>
<li>Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+generation+of+marked+clones+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient generation of marked clones in Drosophila.</a> Current Biology. 3 (7), 424-433 (1993).</li>
<li>del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nature Methods. 9, 47(2011).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Niell, C. M., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+optical+imaging+of+nervous+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live optical imaging of nervous system development.</a> Annual Review of Physiology. 66, 771-798 (2004).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-dynamics%3A+Automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">F-dynamics: Automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 148-156 (2014).</li>
<li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FiloQuant+reveals+increased+filopodia+density+during+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FiloQuant reveals increased filopodia density during breast cancer progression.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3387(2017).</li>
<li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FiloDetect%3A+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Systems Biology. 7 (1), 66(2013).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Urbančič, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodyan%3A+An+open-source+pipeline+for+the+analysis+of+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Filopodyan: An open-source pipeline for the analysis of filopodia.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (10), 3405-3422 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół, który opracowaliśmy w celu rejestrowania i ilościowego określania dynamicznego zachowania gałęzi dendrytycznych w indywidualnie znakowanych neuronach w mózgach larw Drosophila . Warto zauważyć, że nasz protokół obrazowania na żywo zawiera określone parametry, które pozwalają nam uchwycić całą dendrytyczną altanę larwy LNv i zapewnić globalny wgląd w stan dynamiczny jej gałęzi dendrytowych. Ponieważ jednak nasze metody kwantyfikacji w dużym stopniu opierają się na adnotacji zakoń...

Dendryty to wyspecjalizowane przedziały neuronalne, które odbierają i przetwarzają bodźce sensoryczne i synaptyczne. Złożona i stereotypowa struktura altan dendrytycznych jest przedmiotem intensywnych badań od czasu ich odkrycia. Stworzono szereg systemów modelowych, w tym neurony tektalne optyczne Xenopus, komórki zwojowe siatkówki kurcząt i neurony arboryzacji dendrytycznej (da) w systemie Drosophila, w celu zbadania rozwoju, przebudowy i plastyczności dendrytów neuronalnych1,2,3,4. Brzuszne neurony boczne Drosophila (LNvs) to grupa neuronów projekcji wzrokowej, początkowo zidentyfikowanych ze względu na ich ważne funkcje w dobowej regulacji zachowań much5. Badania wykazały również rolę larwalnych LNv jako bezpośredniego celu postsynaptycznego fotoreceptorów larwalnych (PR)6,7. Co ważne, hodowla rozwijających się larw w różnych reżimach oświetleniowych silnie wpływa na wielkość dendrytycznych altan LNvs, co dowodzi przydatności LNvs jako nowego modelu do badania plastyczności dendrytycznej7. Ostatnie prace naszej grupy wskazują ponadto, że zarówno rozmiar dendrytu LNv, jak i dynamiczne zachowanie gałęzi dendrytycznych wykazują plastyczność zależną od doświadczenia8,9. W ramach tych prac opracowaliśmy nowy protokół obrazowania na żywo i kwantyfikacji w celu przeprowadzenia analizy dynamiki dendrytów w LNv od larw w 2. lub 3. stadium rozwojowym.
Przezroczysta natura mózgu larwy Drosophila sprawia, że jest on idealny do obrazowania na żywo. Jednak dendrytyczne altany LNv znajdują się w gęsto unerwionym larwalnym neuropilu wzrokowym (LON) w centrum larwalnego płata mózgu6. Aby uchwycić obrazy drobnych gałęzi dendrytów i filopodiów w nienaruszonej tkance mózgowej, używamy mikroskopii dwufotonowej, która zwiększa głębokość penetracji światła i zmniejsza fototoksyczność podczas eksperymentów z obrazowaniem na żywo10. Korzystając z tej konfiguracji, z powodzeniem przeprowadziliśmy eksperymenty obrazowania na żywo na LNv przez ponad 30 minut, nie obserwując oczywistego pogorszenia morfologicznego neuronu. Ponadto manipulacje genetyczne z wykorzystaniem techniki Flip-out umożliwiły nam oznaczenie poszczególnych LNv za pomocą membrany oznaczonej jako GFP, co jest również kluczowe dla monitorowania ruchów poszczególnych gałęzi11,12,13.
Aby uchwycić dynamiczne zachowanie wszystkich gałęzi na altance dendrytycznej LNv z optymalną rozdzielczością optyczną, przeprowadziliśmy poklatkowe obrazowanie 3D na świeżo wypreparowanych eksplantatach mózgów larw z wysoką rozdzielczością przestrzenną na poziomie 1 minuty na klatkę przez 10 do 30 minut. Rozwijające się dendryty LNv są bardzo dynamiczne, z dużym procentem gałęzi wykazujących obserwowalne zmiany w ciągu 10 minut. Prowadzi to do jednego z głównych wyzwań technicznych w badaniu dynamiki dendrytów, jakim jest ilościowe określenie zachowania gałęzi na podstawie zestawów danych obrazu 4D. Wcześniej ustalone metody mają różne ograniczenia, w tym brak dokładności i nadmierny wymóg czasowy. W związku z tym opracowaliśmy metodę półautomatyczną, która łączy w sobie obróbkę obrazu, ręczne znakowanie terminali rozgałęzionych oraz automatyczne śledzenie punktowe 4D za pomocą oprogramowania do adnotacji obrazu. Obliczamy ruchy terminali rozgałęzionych w różnych punktach czasowych na podstawie współrzędnych 3D miejsc. Dane są następnie eksportowane i analizowane w celu uzyskania ilościowych pomiarów dynamiki gałęzi. Metoda ta dokładnie ocenia czas trwania i zakres zdarzeń wydłużania i retrakcji istniejących gałęzi, a także powstawania nowych gałęzi, co pozwala nam monitorować dynamikę dendrytów w dużej liczbie neuronów.

<table><tbody><tr><td>Laser wielofotonowy Chameleon Vision II</td><td>Koherentny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>smar wysokopróżniowy</td><td>Dow Corning</td><td>79751-30</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 dwufotonowy laserowy skaningowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss</td><td>konfiguracja pionowa</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>do przetwarzania plików .csv</td></tr><tr><td>Huygens Professional</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>do korekcji dryfu i dekonwolucji</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>do wizualizacji 3D i adnotacji obrazów</td></tr><tr><td>< silny>Odczynniki</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów drosophila

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Bardzo ruchliwe filopodia dendrytyczne są powszechnie obecne w neuronach we wczesnych stadiach rozwoju. Te dynamiczne gałęzie eksploracyjne pobierają próbki otaczającego środowiska i inicjują kontakty z potencjalnymi partnerami synaptycznymi. Chociaż związek między dynamiką gałęzi dendrytycznych a synaptogenezą jest dobrze znany, sposób, w jaki procesy rozwojowe i zależne od aktywności regulują dynamikę gałęzi dendrytycznych, nie jest dobrze poznany. Wynika to częściowo z trudności technicznych związanych z obrazowaniem na żywo i analizami ilościowymi tych drobnych struktur przy użyciu systemu in vivo. Opracowaliśmy metodę badania dynamiki dendrytów przy użyciu larw brzusznych neuronów bocznych (LNvs) larw Drosophila, które mogą być indywidualnie znakowane przy użyciu podejść genetycznych i są dostępne do obrazowania na żywo. Korzystając z tego systemu, opracowaliśmy protokoły do uchwycenia dynamiki gałęzi całego trzpienia dendrytycznego pojedynczego znakowanego LNv za pomocą poklatkowego obrazowania na żywo. Następnie przeprowadziliśmy przetwarzanie końcowe w celu poprawy jakości obrazu poprzez korekcję dryfu i dekonwolucję, a następnie przeanalizowaliśmy dynamikę gałęzi na poziomie pojedynczej gałęzi poprzez adnotacje dotyczące pozycji przestrzennych wszystkich terminali rozgałęzionych. Na koniec opracowaliśmy skrypty języka R (plik uzupełniający) i określone parametry do ilościowego określania dynamiki gałęzi przy użyciu informacji o współrzędnych generowanych przez śledzenie terminala. Podsumowując, protokół ten pozwala nam uzyskać szczegółowy ilościowy opis dynamiki rozgałęzień neuronalnej trzpienia dendrytycznego z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną. Opracowane przez nas metody mają ogólne zastosowanie do słabo znakowanych neuronów zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo.

Korzystając z opisanego powyżej protokołu obrazowania na żywo, rejestrujemy stosy obrazów o wysokiej rozdzielczości do późniejszych analiz i kwantyfikacji. Supplementary Video 1 przedstawia serię obrazów z maksymalną projekcją intensywności (MIP), pobraną z reprezentatywnego, pojedynczo znakowanego LNv. Rysunek 2B przedstawia odpowiadający temu montaż ośmiu klatek z serii obrazów. Na obu panelach groty strzałek zaznaczają zda...

Tutaj opisujemy metodę, którą zastosowaliśmy do zobrazowania wysoce ruchliwych filopodiów dendrytycznych w żywym przygotowaniu mózgu larwy Drosophila, oraz opracowany przez nas protokół do ilościowego oznaczania zestawów danych obrazowania 3D w celu ilościowej oceny dynamiki dendrytów w rozwijających się neuronach.

Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Protokół ten zapewnia nowe podejście do ilościowego określania dynamiki gałęzi trzpienia dendrytycznego i rozwoju neuronów przy użyciu obrazowania poklatkowego na żywo i oprogramowania do adnotacji obrazów 3D. Technika ta obrazuje i śledzi terminale rozgałęzione, zapewniając szybką i wydajną metodę pomiaru dynamicznych zachowań filopodiów dendrytycznych. Badania z wykorzystaniem tej metody pozwalają zrozumieć, w jaki sposób rozwój i aktywność regulują morfogenezę dendrytów.Nasze metody mają zastosowanie do słabo znakowanych neuronów zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Wykonując ten zabieg należy pamiętać, że parametry obrazowania muszą być starannie dostosowane, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość czasową i przestrzenną. Aby pobrać mózg z larw Drosophila, pod mikroskopem preparacyjnym użyj jednej pary standardowych kleszczy preparacyjnych z końcówką numer pięć, aby przytrzymać próbkę larwy na miejscu, podczas gdy drugiej używasz do ostrożnego wypreparowania mózgu, zachowując dyski oczu, płaty mózgowe i brzuszny rdzeń nerwowy.Następnie usuń przyczepione mięśnie, aby zminimalizować ruch próbki podczas obrazowania. Kiedy wszystkie mózgi zostaną pobrane, użyj smaru próżniowego, aby narysować kwadratową komorę na szklanym szkiełku i dodaj 20 mikrolitrów zewnętrznego roztworu soli fizjologicznej do komory. Użyj kleszczy, aby przenieść mózgi do komory i dostosuj pozycje mózgów pod mikroskopem z grzbietowymi stronami skierowanymi do góry.Przykryj komorę szklanym szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby zmniejszyć dryf próbki podczas procedury obrazowania. Aby zidentyfikować eksplantaty mózgu zawierające indywidualnie znakowane neurony, w ciągu 30 minut od sekcji wybierz 40-krotny obiektyw zanurzenia w wodzie i źródło światła epifluorescencji. Wybierz laser dwufotonowy dostrojony do 920 nanometrów i detektor bez Dscan i ustaw parametry obrazowania, aby zbierać obrazy w rozdzielczości 512 na 512 pikseli na klatkę i jedną minutę na stos Z przez 10 minut.Następnie dostosuj zoom optyczny i cyfrowy, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość X, Y, Z, zapewniając jednocześnie pokrycie całej altany dendrytycznej w ciągu jednej minuty. Ustawienia wygenerują obrazy o typowej rozdzielczości X, Y, Z 0,11 na 0,11 na 0,25 mikrometra. Aby uzyskać korekcję dryftu, otwórz interesujący Cię plik w odpowiednim oprogramowaniu do korekcji dryftu i kliknij Edytuj i Edytuj parametry mikroskopowe.Ustaw typ mikroskopu na Szerokie pole dla dwóch obrazów fotonów, jeśli dostępna jest opcja dwóch fotonów, i postępuj zgodnie z przepływem pracy zdefiniowanym przez oprogramowanie. Aby uzyskać dekonwolucję, otwórz obraz z korekcją dryfu w oprogramowaniu do dekonwolucji i postępuj zgodnie z przepływem pracy. Następnie zapisz zdekonwoluowany obraz w typie pliku, który jest obsługiwany przez późniejsze oprogramowanie do adnotacji obrazu, które może analizować dane 4D i raportować współrzędne przestrzenne zdefiniowanych punktów na obrazie.Aby dodać adnotację do obrazu, otwórz zdekonwoluowany obraz w oprogramowaniu do adnotacji obrazu, a następnie sprawdź i zaznacz końcówki gałęzi we wszystkich punktach czasu w 3D. Oprogramowanie do adnotacji obrazów będzie raportować i przechowywać współrzędne przestrzenne i czasowe zaznaczonych końcówek gałęzi. Eksportuj informacje o współrzędnych jako plik CSV do kolejnych obliczeń.W module Spoty kliknij Pomiń automatyczne tworzenie, Edytuj ręcznie i zaznacz pole wyboru Automatycznie łącz z wybranym miejscem. Przejrzyj ramki w szeregach czasowych i wybierz gałąź do adnotacji. Przytrzymując Shift, kliknij końcówkę terminalu rozgałęzienia, aby dodać miejsce.Następnie kliknij kartę Statystyki, wybierz opcję Szczegółowe, Określone wartości i Pozycja. Zostaną wyświetlone zarejestrowane informacje o współrzędnych przestrzennych i czasowych. Kliknij przycisk Zapisz, aby wyeksportować dane jako plik CSV.Aby obliczyć położenie końcówki gałęzi w 3D, otwórz plik CSV jako arkusz kalkulacyjny i wybierz kolumnę Identyfikator ścieżki. Kliknij przycisk Sortuj od najmniejszego do największego i zaakceptuj Rozwiń zaznaczenie. Po posortowaniu identyfikator ścieżki zidentyfikuje każdą unikalną gałąź dendrytyczną, a miejsca z tej samej gałęzi mają ten sam identyfikator ścieżki. Kolumna Czas będzie przechowywać informacje z różnych przedziałów czasowych.W arkuszu kalkulacyjnym dodaj kolumnę Odległość i użyj współrzędnych, aby obliczyć odległość każdych dwóch czasowo sąsiadujących miejsc. Aby zmierzyć drobne ruchy na poziomie pojedynczego woksela, zresetuj wszystkie wartości odległości mniejsze niż 0,3 mikrometra, aby odfiltrować wszelkie nieskorygowane dryfowanie lub niedoskonałe adnotacje obrazu. Następnie utwórz kolumnę Przemieszczenie i skopiuj wartości z kolumny Odległość do kolumny Przemieszczenie.Ręcznie przypisz zdarzenia przedłużania i wciągania dla każdej końcówki gałęzi. Jeśli jest to przedłużenie, pozostaw wartość przemieszczenia dodatniego bez zmian. Jeśli jest to wycofanie, zmień odpowiednią wartość przemieszczenia na wartość ujemną.Następnie w nowej kolumnie Zdarzenie zsumuj wartości przemieszczenia dla poszczególnych zdarzeń wydłużenia i wycofania. W tym filmie można zaobserwować serię obrazów o maksymalnej intensywności pobranych z reprezentatywnego, indywidualnie oznakowanego brzusznego neuronu bocznego. Obrazy z pojedynczą klatką umożliwiają ocenę zdarzeń wycofania i wydłużenia.Półautomatyczne śledzenie 4D końcówek rozgałęzień umożliwia adnotację dynamicznych końców rozgałęzień indywidualnie znakowanych neuronów brzusznych bocznych, jak pokazano. Obliczanie kierunku i odległości ruchów gałęzi w każdym punkcie czasowym pozwala na porównanie dynamiki gałęzi dendrytycznych dla indywidualnie znakowanych brzusznych neuronów bocznych na różnych etapach rozwoju. Najważniejszym krokiem jest zachowanie integralności tkanki mózgowej i morfoloi dendrytów podczas preparacji i montażu.Jakość surowych serii obrazów ma również kluczowe znaczenie dla pomyślnego śledzenia i kwantyfikacji. Korzystając z tej techniki, uzyskaliśmy możliwość przeprowadzenia analizy ilościowej filopodiów dendrytowych w rozwoju neuronów centralnych Drosophila oraz zbadania maszynerii molekularnej związanej z dojrzewaniem dendrytów i synaptogenezą.

time-lapse-live-imaging-quantification-fast-dendritic-branch-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Źródło: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dynamiki dendrytycznej w żywych eksplantatach siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy stabilizacji siatkówki pod mikroskopem konfokalnym, wykonywania obrazowania epifluorescencyjnego w celu...

Poklatkowe obrazowanie konfokalne dynamiki dendrytycznej neuronów w eksplantatach siatkówki myszy

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia technikę obrazowania na żywo z wykorzystaniem mikroskopii różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) do obserwacji rozgałęzień aksonalnych w czasie rzeczywistym w neuronach korowych. Filmy poklatkowe ukazują efekty leczenia netryną-1, cząsteczką sygnałową, która indukuje...

Obrazowanie in vitro w czasie rzeczywistym rozgałęzień aksonalnych w neuronach korowych myszy

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Poznaj metodę obrazowania na żywo w trybie poklatkowym do kwantyfikacji dynamiki gałęzi dendrytycznych w rozwijających się neuronach Drosophila. Technika ta umożliwia badanie morfogenezy dendrytów regulowanej przez rozwój i aktywność.

Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila

Przeglądaj więcej filmów