Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Technika ta ułatwia obserwację w czasie rzeczywistym synaptycznej aktywności wapnia jako parametru fizjologicznego procesów komórkowych leżących u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci u Drosophila melanogaster. Porównując reakcje neuronów na zapachy przed i po treningu asocjacyjnym, możemy narysować bezpośrednie korelacje między aktywnością synaptyczną a powstawaniem śladu pamięciowego u poszczególnych muszek owocowych. Aby wyprodukować transgeniczne muszki owocowe, w których określone neurony wykazują ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, krzyżuj samice i samce much z dziewicami i samcami noszącymi pożądane konstrukty GAL4 i UAS i starzej potomstwo samic do trzech do sześciu dni po ekleksji.

Aby przygotować muchę do obrazowania, użyj cienkich kleszczy, aby umieścić znieczuloną lodem muchę w specjalnie przygotowanej komorze obrazowania. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ustawić klatkę piersiową i nogi w kontakcie z przewodami elektrycznymi na dnie komory oraz z głową leżącą płasko. Przymocuj muchę za pomocą przezroczystej taśmy klejącej i użyj ostrza skalpela chirurgicznego, aby wyciąć okienko w taśmie wokół głowy, pozostawiając antenę zakrytą i odsłoniętą tylko najbardziej przednią część klatki piersiowej.

Użyj szpilki do owadów trzymanej przez wklęsło-wypukłe szczęki, aby ostrożnie otoczyć boki i tył głowy klejem utwardzanym niebieskim światłem. I użyj lampy LED emitującej niebieskie światło, aby utrwalić klej. Gdy klej jest całkowicie związany, usuń resztki nieutwardzonego kleju z grzbietowej powierzchni głowy muchy i przykryj odsłonięty naskórek głowy kroplą roztworu Ringera.

Za pomocą noża o bardzo cienkim ostrzu przetnij naskórek w poprzek tylnej części głowy, zaczynając od oczek i przecinając każdą stronę przyśrodkowo do oczu, aby utworzyć płat naskórka, który można łatwo oderwać za pomocą kleszczy. Usuń nadmiar naskórka, który może blokować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania i użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie oczyścić powierzchnię grzbietową z tchawicy, uważając, aby nie uszkodzić samej tkanki mózgowej. W razie potrzeby usuń i odśwież roztwór Ringera, aby oczyścić obszar z resztek tkanki.

I umieść igłę do dostarczania zapachu podskórnego około jednego centymetra od głowy muchy, uważając, aby nic nie przeszkadzało w dostarczaniu zapachu do anteny. Następnie podłącz komorę obrazowania do systemu dostarczania zapachów za pomocą igły do dostarczania zapachów podskórnych. I pozwól muchy na 10 minut, aby doszła do siebie po znieczuleniu i operacji.

W celu wizualizacji wskaźników wapnia opartych na GFP należy dostroić laser mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień i obiektyw zanurzeniowy zainstalowany na stole z izolacją drgań do długości fali wzbudzenia 920 nanometrów i zainstalować filtr pasmowoprzepustowy GFP. Korzystając z pokrętła regulacji kursu Z, przeskanuj oś Z mózgu, aby zlokalizować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Użyj funkcji przycinania, aby ustawić ostrość skanowania tylko na obszarze zainteresowania, aby zminimalizować czas skanowania.

I obróć widok skanowania tak, aby przednia część głowy była skierowana w dół. Następnie dostosuj rozmiar klatki do 512 na 512 pikseli i wybierz region do skanowania. Biorąc pod uwagę obliczony czas skanowania dla każdej klatki, aby osiągnąć częstotliwość odświeżania co najmniej cztery herce.

W celu wizualizacji stanu przejściowego wapnia wywołanego zapachem, zainicjuj wstępnie zaprogramowany pakiet makr, który może połączyć oprogramowanie do akwizycji obrazu i program dostarczania zapachu, a następnie rozpocznij pomiar w oprogramowaniu mikroskopu na 6,25 sekundy, aby ustalić wartość bazową F0. W systemie dostarczania zapachów należy dostarczyć 2,5-sekundowy bodziec zapachowy wskazany tutaj przez podświetlenie diod LED wyzwalane otwieraniem i zamykaniem określonych zaworów kubków zapachowych. Następnie 12,5 sekundy nagrywania na końcu przesunięcia zapachu.

Następnie powtórz dostawę dla drugiego i trzeciego środka zapachowego w ten sam sposób. Aby przeprowadzić warunkowanie asocjacyjne w tej konfiguracji, użyj sterowanego komputerowo systemu dostarczania zapachów, aby przedstawić kondycjonowany bodziec plus zapach przez 60 sekund wraz z 12 90-woltowymi wstrząsami elektrycznymi. Po 60-sekundowej przerwie zaprezentuj sam kondycjonowany bodziec bez zapachu przez 60 sekund bez porażenia prądem.

Ponownie zmierz przejściowość wapnia wywołanego przez zapach po treningu, powtarzając protokół stymulacji zapachu przed treningiem trzy minuty po zakończeniu fazy treningowej. Następnie zapisz pliki obrazowania w odpowiednim formacie do późniejszej analizy obrazu. Tutaj można zaobserwować reprezentatywne obrazy neuronów wyjściowych ciała grzyba, uzyskane, jak pokazano.

Specyficzna ekspresja przedziałowa czujnika dHomer-GCaMP3, która nie jest wyrażana w przedziałach aksonalnych neuronu, demonstruje sygnał punktowy w przedziale dendrytycznym. Wyraźne, choć o mniejszej amplitudzie reakcje zapachowe można zaobserwować u muszek wyrażających dHomer-GCaMp3, w porównaniu z muchami wyrażającymi cytozolowy GCaMP6f. W tym przypadku reprezentatywne ślady wapnia od jednej pojedynczej muchy pokazują różnice w poziomie i amplitudzie hałasu, które można uzyskać między poszczególnymi preparatami.

Technika ta otworzyła możliwość wizualizacji na poziomie subkomórkowym, w jaki sposób reprezentacje węchowe są modulowane i jak fazy pamięci są tworzone przez warunkowanie. Takie eksperymenty będą miały kluczowe znaczenie dla poszerzenia naszego zrozumienia złożonych struktur mózgu, takich jak ciało grzyba, oraz do scharakteryzowania, w jaki sposób wspomnienia asocjacyjne są przechowywane w rozproszonych populacjach neuronów.