Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster
8 października 2019
Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.
Technika ta ułatwia obserwację w czasie rzeczywistym synaptycznej aktywności wapnia jako parametru fizjologicznego procesów komórkowych leżących u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci u Drosophila melanogaster. Porównując reakcje neuronów na zapachy przed i po treningu asocjacyjnym, możemy narysować bezpośrednie korelacje między aktywnością synaptyczną a powstawaniem śladu pamięciowego u poszczególnych muszek owocowych. Aby wyprodukować transgeniczne muszki owocowe, w których określone neurony wykazują ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, krzyżuj samice i samce much z dziewicami i samcami noszącymi pożądane konstrukty GAL4 i UAS i starzej potomstwo samic do trzech do sześciu dni po ekleksji.
Aby przygotować muchę do obrazowania, użyj cienkich kleszczy, aby umieścić znieczuloną lodem muchę w specjalnie przygotowanej komorze obrazowania. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ustawić klatkę piersiową i nogi w kontakcie z przewodami elektrycznymi na dnie komory oraz z głową leżącą płasko. Przymocuj muchę za pomocą przezroczystej taśmy klejącej i użyj ostrza skalpela chirurgicznego, aby wyciąć okienko w taśmie wokół głowy, pozostawiając antenę zakrytą i odsłoniętą tylko najbardziej przednią część klatki piersiowej.
Użyj szpilki do owadów trzymanej przez wklęsło-wypukłe szczęki, aby ostrożnie otoczyć boki i tył głowy klejem utwardzanym niebieskim światłem. I użyj lampy LED emitującej niebieskie światło, aby utrwalić klej. Gdy klej jest całkowicie związany, usuń resztki nieutwardzonego kleju z grzbietowej powierzchni głowy muchy i przykryj odsłonięty naskórek głowy kroplą roztworu Ringera.
Za pomocą noża o bardzo cienkim ostrzu przetnij naskórek w poprzek tylnej części głowy, zaczynając od oczek i przecinając każdą stronę przyśrodkowo do oczu, aby utworzyć płat naskórka, który można łatwo oderwać za pomocą kleszczy. Usuń nadmiar naskórka, który może blokować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania i użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie oczyścić powierzchnię grzbietową z tchawicy, uważając, aby nie uszkodzić samej tkanki mózgowej. W razie potrzeby usuń i odśwież roztwór Ringera, aby oczyścić obszar z resztek tkanki.
I umieść igłę do dostarczania zapachu podskórnego około jednego centymetra od głowy muchy, uważając, aby nic nie przeszkadzało w dostarczaniu zapachu do anteny. Następnie podłącz komorę obrazowania do systemu dostarczania zapachów za pomocą igły do dostarczania zapachów podskórnych. I pozwól muchy na 10 minut, aby doszła do siebie po znieczuleniu i operacji.
W celu wizualizacji wskaźników wapnia opartych na GFP należy dostroić laser mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień i obiektyw zanurzeniowy zainstalowany na stole z izolacją drgań do długości fali wzbudzenia 920 nanometrów i zainstalować filtr pasmowoprzepustowy GFP. Korzystając z pokrętła regulacji kursu Z, przeskanuj oś Z mózgu, aby zlokalizować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Użyj funkcji przycinania, aby ustawić ostrość skanowania tylko na obszarze zainteresowania, aby zminimalizować czas skanowania.
I obróć widok skanowania tak, aby przednia część głowy była skierowana w dół. Następnie dostosuj rozmiar klatki do 512 na 512 pikseli i wybierz region do skanowania. Biorąc pod uwagę obliczony czas skanowania dla każdej klatki, aby osiągnąć częstotliwość odświeżania co najmniej cztery herce.
W celu wizualizacji stanu przejściowego wapnia wywołanego zapachem, zainicjuj wstępnie zaprogramowany pakiet makr, który może połączyć oprogramowanie do akwizycji obrazu i program dostarczania zapachu, a następnie rozpocznij pomiar w oprogramowaniu mikroskopu na 6,25 sekundy, aby ustalić wartość bazową F0. W systemie dostarczania zapachów należy dostarczyć 2,5-sekundowy bodziec zapachowy wskazany tutaj przez podświetlenie diod LED wyzwalane otwieraniem i zamykaniem określonych zaworów kubków zapachowych. Następnie 12,5 sekundy nagrywania na końcu przesunięcia zapachu.
Następnie powtórz dostawę dla drugiego i trzeciego środka zapachowego w ten sam sposób. Aby przeprowadzić warunkowanie asocjacyjne w tej konfiguracji, użyj sterowanego komputerowo systemu dostarczania zapachów, aby przedstawić kondycjonowany bodziec plus zapach przez 60 sekund wraz z 12 90-woltowymi wstrząsami elektrycznymi. Po 60-sekundowej przerwie zaprezentuj sam kondycjonowany bodziec bez zapachu przez 60 sekund bez porażenia prądem.
Ponownie zmierz przejściowość wapnia wywołanego przez zapach po treningu, powtarzając protokół stymulacji zapachu przed treningiem trzy minuty po zakończeniu fazy treningowej. Następnie zapisz pliki obrazowania w odpowiednim formacie do późniejszej analizy obrazu. Tutaj można zaobserwować reprezentatywne obrazy neuronów wyjściowych ciała grzyba, uzyskane, jak pokazano.
Specyficzna ekspresja przedziałowa czujnika dHomer-GCaMP3, która nie jest wyrażana w przedziałach aksonalnych neuronu, demonstruje sygnał punktowy w przedziale dendrytycznym. Wyraźne, choć o mniejszej amplitudzie reakcje zapachowe można zaobserwować u muszek wyrażających dHomer-GCaMp3, w porównaniu z muchami wyrażającymi cytozolowy GCaMP6f. W tym przypadku reprezentatywne ślady wapnia od jednej pojedynczej muchy pokazują różnice w poziomie i amplitudzie hałasu, które można uzyskać między poszczególnymi preparatami.
Technika ta otworzyła możliwość wizualizacji na poziomie subkomórkowym, w jaki sposób reprezentacje węchowe są modulowane i jak fazy pamięci są tworzone przez warunkowanie. Takie eksperymenty będą miały kluczowe znaczenie dla poszerzenia naszego zrozumienia złożonych struktur mózgu, takich jak ciało grzyba, oraz do scharakteryzowania, w jaki sposób wspomnienia asocjacyjne są przechowywane w rozproszonych populacjach neuronów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wizualizacji wapnia presynaptycznego i postsynaptycznego u Drosophila w celu zbadania procesów uczenia się i pamięci. Wykorzystując obrazowanie wapnia in vivo z pomocą sensorów zlokalizowanych synaptycznie, badanie to łączy tę metodę z klasycznym warunkowaniem węchowym, aby zbadać plastyczność synaptyczną związaną z uczeniem się asocjacyjnym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia behawioralna
- obrazowanie wapnia
Wstęp
- Drosophila melanogaster służy jako model do badania uczenia się i pamięci.
- Zrozumienie aktywności wapnia w synapsach może wyjaśnić procesy fizjologiczne leżące u podstaw tworzenia pamięci.
- Uczenie się asocjacyjne jest fundamentalne dla sposobu kodowania i przywoływania wspomnień.
- Ciało grzybowate u Drosophila ma kluczowe znaczenie dla funkcji uczenia się i pamięci.
Cel badania
- Aby zwizualizować aktywność wapniową w synapsach podczas procesów uczenia się.
- Aby skorelować aktywność synaptyczną z formowaniem śladu pamięciowego.
- Aby wykorzystać paradygmat warunkowania klasycznego do zbadania zmian synaptycznych.
Zastosowane metody
- Obrazowanie wapnia przeprowadza się z wykorzystaniem genetycznie kodowanych wskaźników wapnia w specjalnie zaprojektowanej komorze obrazującej.
- Muchówki z rodzaju Drosophila są przygotowywane do obrazowania poprzez zabiegi chirurgiczne mające na celu odsłonięcie interesującego regionu mózgu.
- Eksperyment obejmuje pomiar bazowy przed kondycjonowaniem, a następnie podanie bodźca zapachowego i pomiary po kondycjonowaniu.
- System obrazowania obejmuje mikroskop wielofotonowy nastrojony na określone długości fal wzbudzenia oraz protokoły skanowania.
- Gromadzenie danych polega na pomiarze przejściowych zmian stężenia wapnia powiązanych z bodźcami zapachowymi przed i po treningu asocjacyjnym.
Główne wyniki
- Badanie dostarcza wiedzy na temat zmian synaptycznych związanych z uczeniem się zapachowym.
- Zaobserwowano różnice w odpowiedziach wapniowych pomiędzy różnymi genetycznie zmodyfikowanymi muchami, co demonstruje wpływ konkretnych wskaźników na aktywność synaptyczną.
- Wizualizacje ujawniają, w jaki sposób pamięć zapachowa jest przechowywana i modulowana na poziomie komórkowym.
- Wyniki podkreślają użyteczność tej metody w zrozumieniu złożonych struktur mózgu.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia wizualizację dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym, co przyczynia się do zrozumienia mechanizmów neuronalnych w procesie formowania pamięci.
- Wiedza zdobyta dzięki tej metodzie może rzucić światło na zasady plastyczności synaptycznej i pogłębić nasze zrozumienie procesów uczenia się.
- Wyniki mają szerokie zastosowanie w neuronauce, szczególnie w kontekście przechowywania pamięci asocjacyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Niniejszy protokół umożliwia wizualizację dynamiki wapnia w synapsach Drosophila w czasie rzeczywistym, zapewniając mechanistyczny odczyt plastyczności indukowanej uczeniem się. Poprzez powiązanie aktywności neuronalnej wywołanej zapachami z wynikami warunkowania skojarzeniowego, metoda ta wspiera walidację celów w neurofarmakologii poprzez funkcjonalną analizę szlaków synaptycznych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć, minimalizując ryzyko związane z hipotezami dotyczącymi mechanizmów tworzenia pamięci przy użyciu modelu genetycznie podatnego na manipulacje.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację aktywności wapniowej synaps z tworzeniem śladu pamięciowego w określonych populacjach neuronów.
- Wartość operacyjna: Wspiera minimalizację ryzyka biologicznego dzięki bezpośredniej obserwacji przed- i postsynaptycznej sygnalizacji przedziałowej podczas uczenia się asocjacyjnego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie bazowych wartości przejściowych stężeń wapnia wywołanych zapachem przed i po warunkowaniu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki kontrolowanemu podawaniu bodźców oraz mierzalnym pomiarom odpowiedzi wapniowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omówienie znaczenia dla patologii poprzez powiązanie z konserwatywnymi mechanizmami plastyczności synaptycznej leżącymi u podstaw zaburzeń uczenia się i pamięci.
- Wartość operacyjna: Opis ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki umożliwieniu podłużnego śledzenia zmian w reprezentacji neuronalnej po treningu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania, dostarczając funkcjonalnych odczytów, które łączą manipulacje genetyczne z efektami behawioralnymi w obwodach neuronalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wizualizację sposobu, w jaki reprezentacje węchowe są modulowane podczas formowania fazy pamięciowej.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu dzięki zestandaryzowanemu dostarczaniu zapachów i kwantyfikacji przejściowych wzrostów poziomu wapnia w określonych punktach czasowych po warunkowaniu.
- Analityka: Podkreśla ilościowe pomiary zmian intensywności fluorescencji w przedziałach dendrytycznych w stosunku do aksonalnych w celu porównania stanów aktywności synaptycznej.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając charakteryzację sposobu przechowywania pamięci asocjacyjnej w rozproszonych populacjach neuronalnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako platformę wielokrotnego użytku do oceny zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych w zakresie plastyczności synaptycznej in vivo.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu poprzez bezpośrednią korelację aktywności synaptycznej z plastycznością indukowaną uczeniem się.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i skalowalność dzięki stałym protokołom przygotowania oraz powtarzalnym parametrom obrazowania dwufotonowego.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki redukcji niejednoznaczności mechanistycznej w angażowaniu celów neuropsychiatrycznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko, oparta na funkcjonalnych odczytach synaptycznych odzwierciedlających modulację procesów poznawczych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Do skutecznej implementacji wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu genetyki Drosophila, mikrochirurgii oraz mikroskopii dwufotonowej.
- Wymagane instrumentarium obejmuje mikroskop wielofotonowy z izolacją od wibracji, laserem podczerwonym, obiektywem immersyjnym z wodą oraz systemem podawania zapachów.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga zsynchronizowanych protokołów przygotowania much, czasu podawania bodźców oraz analizy przejściowych zmian poziomu wapnia.
- Kwestie adaptacyjne obejmują modyfikację linii sterujących GAL4/UAS w celu ukierunkowania na konkretne subpopulacje neuronów w różnych systemach modelowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność stosunku sygnału do szumu między poszczególnymi preparatami oraz potencjalną fototoksyczność podczas przedłużonych sesji obrazowania.
Często zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:26
In Vivo Calcium Imaging Preparation
2:44
In Vivo Calcium Imaging
3:39
Olfactory Conditioning and Odor-Evoked Calcium Transients Visualization
5:07
Results: Representative Postsynaptically-Localized Calcium and Learning-Induced Postsynaptic Plasticity Visualization
5:56
Conclusion
