Name: Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj metodę optycznego obrazowania wapnia in vivo w celu badania plastyczności synaptycznej związanej z uczeniem się u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia obserwację aktywności wapniowej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych poprzez Wspólne Centrum Badawcze SFB 889 "Mechanizmy przetwarzania sensorycznego" oraz Jednostkę Badawczą FOR 2705 "Rozwarstwienie obwodu mózgu: struktura, plastyczność i funkcja behawioralna ciała grzyba Drosophila".

1. Transgeniczne muszki owocowe, Drosophila melanogaster
<ol>
	<li>Krzyżuj samice dziewiczych i samców much (hodowanych w temperaturze 25 °C przy 60% wilgotności względnej w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność) niosących pożądane Gal4 i UAS konstruują odpowiednio klasę<="xref">25, aby uzyskać muchy, w których określone neurony wyrażają genetycznie kodowany wskaźnik wapnia.</li>
	<li>Żeńskie potomstwo powyższej krzyżówki należy postarzać do momentu, gdy znajdą się w przedziale 3-6 dni po eklozji. Samice much są preferowane ze względu na ich nieco większy rozmiar.</li>
</ol>
2. Przygotowanie muszki owocowej do obrazowania wapnia in vivo
<ol>
	<li>Wybierz pojedynczą samicę muchy i znieczulaj ją na lodzie nie dłużej niż 5 minut.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków umieść muchę w komorze obrazowania (pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1c). Upewnij się, że klatka piersiowa i nogi stykają się z przewodami elektrycznymi na dnie komory i że głowa leży płasko. Ustal pozycję rozporka za pomocą przezroczystej taśmy klejącej. 
	UWAGA: Ten protokół wymaga specjalnie zbudowanej komory, w której muchy są zamocowane, z kapsułą głowy dostępną do otwarcia, a muchy mogą odbierać zarówno stymulacje zapachowe do czułków, jak i wstrząsy elektryczne do klatki piersiowej i nóg (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela chirurgicznego przymocowanego do rękojeści skalpela (patrz Tabela materiałów), wytnij okienko w taśmie wokół głowy muchy, pozostawiając zakryte czułki i odsłoniętą tylko najbardziej wysuniętą do przodu część klatki piersiowej.</li>
	<li>Otocz boki i tył głowy klejem utwardzanym niebieskim światłem, ostrożnie manipulowanym za pomocą szpilki do owadów trzymanej przez wklęsło-wypukłe szczęki. Utrwal klej za pomocą lampy LED emitującej niebieskie światło.</li>
	<li>Sprawdź, czy klej jest całkowicie związany i usuń resztki nieutwardzonego kleju z grzbietowej powierzchni głowicy muchy.</li>
	<li>Nałóż kroplę roztworu Ringera24 (patrz Tabela Materiałów), aby pokryć odsłonięty naskórek głowy.</li>
	<li>Za pomocą noża o bardzo cienkim ostrzu przetnij naskórek. Aby jak najskuteczniej usunąć naskórek, najpierw przetnij tylną część głowy, używając oczek jako punktu wyjścia. Następnie przetnij każdą stronę, przyśrodkowo do oczu, aby utworzyć płat naskórka, który można łatwo oderwać za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Usuń nadmiar naskórka, który może blokować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Ostrożnie oczyść powierzchnię grzbietową tchawicy za pomocą cienkich kleszczy, unikając uszkodzenia samej tkanki mózgowej. Usuń i odśwież roztwór Ringera24 (patrz Tabela materiałów) zgodnie z wymaganiami, aby oczyścić obszar z resztek tkanki.</li>
	<li>Umieść igłę do dostarczania zapachu podskórnego w miejscu, około 1 cm od głowy muchy. Upewnij się, że nic nie utrudnia dostarczania zapachu do anten.</li>
	<li>Pod mikroskopem podłączyć komorę obrazowania do systemu dostarczania zapachów za pomocą igły do dostarczania zapachów podskórnych.</li>
	<li>Aby mucha mogła w pełni wyzdrowieć po znieczuleniu i operacji oraz dostosować się do przepływu powietrza, na tym etapie należy wprowadzić 10-minutowy okres odpoczynku.</li>
</ol>
3. Obrazowanie wapnia in vivo
<ol>
	<li>Użyć mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień i obiektyw zanurzeniowy w wodzie (patrz Tabela materiałów), zainstalowanego na stole z izolacją drgań. W celu wizualizacji wskaźników wapnia opartych na GFP należy dostroić laser do długości fali wzbudzenia 920 nm i zainstalować filtr pasmowo-przepustowy GFP.</li>
	<li>Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej Z przeskanuj oś Z mózgu i zlokalizuj interesujący Cię obszar mózgu. Użyj funkcji kadrowania, aby ustawić ostrość skanowania tylko na tym obszarze, aby zminimalizować czas skanowania, i obrócić widok skanowania tak, aby przednia część głowy była skierowana w dół.</li>
	<li>Dostosuj rozmiar klatki do 512 x 512 px, prędkość skanowania do > 4 Hz i obszar skanowania (w wymiarze Y) tak, aby interesujące Cię neurony były zakryte.</li>
</ol>
4. Wizualizacja stanów przejściowych wapnia wywołanych zapachem poprzez warunkowanie węchowe
<ol>
	<li>Użyj systemu dostarczania zapachów19,26, który może dostarczyć kilka bodźców zapachowych w czasowo precyzyjny sposób.
	<ol>
		<li>Użyj dodatkowego komputera do sterowania urządzeniem i do komunikacji z oprogramowaniem mikroskopu obrazowego, aby skoordynować stymulację zapachu z przechwytywaniem obrazu podczas eksperymentów.</li>
		<li>Zainicjuj wstępnie zaprogramowany pakiet makr zdolny do połączenia oprogramowania do akwizycji obrazu i programu dostarczania zapachu (np. pakiet makr VBA zainstalowany w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, patrz Tabela materiałów), który reaguje na zewnętrzny wyzwalacz wejściowy zapewniony przez zainicjowanie protokołu dostarczania zapachu w oddzielnym programie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij pomiar od monitorowania "przed treningiem"/naiwnych stanów przejściowych wapnia wywołanych zapachem w rozdzielczości 512 x 512 px i częstotliwości odświeżania 4 Hz. Dostarcz 2,5-sekundowy bodziec zapachowy otoczony dodatkową akwizycją obrazu przez 6,25 s poprzedzający początek zapachu (w celu ustalenia wartości bazowej F0) i 12,5 s po przesunięciu zapachu. Powtórz to z drugim środkiem zapachowym, a następnie z trzecim środkiem zapachowym.</li>
	<li>Kontynuuj 3 minuty po tym pomiarze z klasycznym kondycjonowaniem ("treningiem") muchy.
	<ol>
		<li>Wybierz jeden z zapachów prezentowanych w fazie "przedtreningowej", aby stać się zapachem CS+, a drugi, aby stać się zapachem CS-. Prezentuj zapach CS+ za pomocą sterowanego komputerowo systemu dostarczania zapachów przez 60 sekund wraz z dwunastoma wstrząsami elektrycznymi 90 V.</li>
		<li>Po 60 s przerwie prezentuj sam zapach CS przez 60 s. Stosować jako substancje zapachowe 4-metylocykloheksanol i 3-oktanol. Nie należy podawać trzeciego środka zapachowego (np. 1-octen-3-ol) podczas tego treningu, ponieważ jest on stosowany tylko jako kontrola przed (krok 4.2.) i po (krok 4.4) fazie treningu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zmierz stany przejściowe wapnia wywołane zapachem "po treningu", powtarzając protokół stymulacji zapachu "przed treningiem" (krok 4.2.) 3 minuty po zakończeniu fazy treningu (krok 4.3). 
	UWAGA: Czas wykonania tego kroku powinien odzwierciedlać interesujący czas po utworzeniu pamięci (np. wykonaj ten krok 3-4 minuty po etapie kondycjonowania, aby zbadać pamięć krótkotrwałą). Zazwyczaj muchy mogą przetrwać kilka godzin w tym preparacie.</li>
	<li>Zapisz pliki obrazów w odpowiednim formacie (np. Tiff) do późniejszej analizy obrazu.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Aby przeanalizować obrazy, otwórz pliki Tiff (lub podobne) w oprogramowaniu do analizy obrazów, takie jak Fiji27.</li>
	<li>Wyrównaj stosy za pomocą algorytmu korekcji ruchu, aby zapewnić minimalny ruch w kierunkach X i Y. Odrzuć wszystkie nagrania, które pokazują silny ruch w osi Z.</li>
	<li>Wybierz narzędzie w oprogramowaniu używanym do oznaczania obszaru zainteresowania (ROI) wokół obszaru, który ma być badany. Powinno to być tak precyzyjne, jak to tylko możliwe, aby ograniczyć wpływ fluorescencji tła.</li>
	<li>Użyj odpowiedniego narzędzia oprogramowania, aby wyodrębnić czasowe dane o intensywności fluorescencji jako pliki danych z wybranego ROI, tak aby wartość została wygenerowana dla każdej klatki nagrania.</li>
	<li>Otwórz dane za pomocą programu do analizy danych, aby obliczyć wartości ΔF/F0 dla każdego śladu zapachu. F0 = średnia fluorescencja w ciągu 2 s przed pojawieniem się zapachu. ΔF = różnica między surową fluorescencją w danej ramce a F0. Na podstawie tych wartości oblicz wartość ΔF/F0 dla każdej klatki, którą można wykreślić w funkcji czasu, aby odzwierciedlić względną fluorescencję przez cały okres bodźca zapachowego.</li>
</ol>

<ol><li>Poo, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+memory%3F+The+present+state+of+the+engram%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">What is memory? The present state of the engram.</a> BMC Biology. 14, 40(2016).</li>
<li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+plasticity+and+memory+hypothesis%3A+encoding%2C+storage+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).</li>
<li>Josselyn, S. A., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+Allocation%3A+Mechanisms+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Memory Allocation: Mechanisms and Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).</li>
<li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).</li>
<li>Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Conditioned behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).</li>
<li>Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+mutants+are+deficient+in+olfactory+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning.</a> Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).</li>
<li>de Belle, J. S., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+odor+learning+in+Drosophila+abolished+by+chemical+ablation+of+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies.</a> Science. 263 (5147), 692-695 (1994).</li>
<li>Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engram+found%3F+Evaluating+the+evidence+from+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).</li>
<li>Fiala, A., Riemensperger, T. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFiala%2C+A+%22In%3A+Learning+and+Memory%3A+A+Comprehensive+Reference%22">In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference</a>. editors, edition.,R. .M. enzelandJ. .H. .B. yrne, 1, Academic Press. Oxford. 475-482 (2017).</li>
<li>Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+the+right+thing%3A+neural+network+mechanisms+of+memory+formation%2C+expression+and+update+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).</li>
<li>Hige, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+tiny+mushrooms+in+fruit+flies+tell+us+about+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory.</a> Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).</li>
<li>Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mushroom+body+of+adult+Drosophila+characterized+by+GAL4+drivers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers.</a> Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).</li>
<li>Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+contacts+between+Kenyon+cells+and+aminergic+neurons+in+the+Drosophila+melanogaster+brain+using+SplitGFP+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution.</a> Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).</li>
<li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mushroom+body+output+neurons+encode+valence+and+guide+memory-based+action+selection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punishment+prediction+by+dopaminergic+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li>
<li>Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+calcium+imaging+in+the+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li>
<li>Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+dissection+of+experience-dependent+pre-+and+postsynaptic+plasticity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain.</a> Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noize+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+calcium+imaging+using+DNA-encoded+fluorescence+sensors+in+transgenic+fruit+flies%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+Plasticity+Underlies+Aversive+Olfactory+Learning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila.</a> Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).</li>
<li>Owald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+defined+mushroom+body+output+neurons+underlies+learned+olfactory+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila.</a> Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza obwodów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się i pamięci jest ważnym celem w dziedzinie neuronauki. Dostępność genetyczna Drosophila oraz zakres i łatwość testów behawioralnych sprawiają, że jest to idealne narzędzie do badania takich zjawisk. W tym miejscu przedstawiono metodę, za pomocą której można uwidocznić u poszczególnych muszek modulację, która zachodzi na poziomie subkomórkowym w wyniku warunkowania węchowego. Przeprowadzając zarówno przedtreningową, jak i potreningową wizualizację dynamiki...

Rozszyfrowanie, gdzie i jak informacje są zdobywane w mózgu poprzez uczenie się, a następnie przechowywane jako pamięć, stanowi jedno z najtrudniejszych zadań w neurobiologii1. Badania neuronaukowe doprowadziły do koncepcji zmiany w przekaźnictwie synaptycznym jako substracie neuronalnym, który leży u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci2,3. Przypuszcza się, że podczas uczenia się połączenia synaptyczne między zespołami neuronalnymi, które są aktywne podczas percepcji bodźca, ulegają modyfikacji w taki sposób, że ich połączony wzorzec aktywności może zostać odzyskany podczas przywoływania pamięci, instruując w ten sposób przyszłe działania behawioralne4. Te "komórki engramowe" i ich synapsy są często rozmieszczone w różnych regionach mózgu i poziomach przetwarzania, co utrudnia przypisanie obserwowanych zmian w transmisji synaptycznej do uczenia się zadania lub bodźca. Aby zlokalizować i zobrazować te zmiany synaptyczne, które są przyczynowo związane z konkretnym zadaniem uczenia się, potrzebny jest odpowiedni system modelowy, który pozwala na precyzyjne ograniczenie tych synaps.
Dla takiego przedsięwzięcia Drosophila melanogaster jest szczególnie odpowiednia, ponieważ łączy w sobie względną prostotę mózgu, bogactwo behawioralne i dostępność eksperymentalną. Wśród dobrze ugruntowanych organizmów modelowych Drosophila znajduje się pomiędzy nicieniem C. elegans a genetycznie podatnymi ssakami, takimi jak myszy, pod względem złożoności neuronalnej. Stereotypową liczbę neuronów (~300) i ograniczony repertuar behawioralny obserwuje się u C. elegans. Z drugiej strony ssaki mają miliony neuronów i oszałamiającą złożoność behawioralną. Mózg muszki owocowej jest, ze swoimi ~100 000, neuronami znacznie mniejszymi niż mózgi większości kręgowców, a wiele neuronów jest indywidualnie identyfikowalnych5. Jednak Drosophila wykazuje szerokie spektrum złożonych zachowań, w tym zdolność do wykazywania silnego asocjacyjnego uczenia się węchowego i tworzenia pamięci, po raz pierwszy opisaną ponad 40 lat temu6. W trakcie tej klasycznej procedury warunkowania, grupy much są poddawane działaniu zapachu jako bodźca warunkowego (CS+), podczas gdy otrzymują karzący wstrząs elektryczny jako bodziec bezwarunkowy (US). Drugi zapach (CS-) jest wtedy prezentowany bez żadnej kary. W ten sposób zwierzęta uczą się unikać zapachu związanego z karą, który można przetestować w późniejszej sytuacji wyboru między dwoma zapachami, CS+ i CS-. Prace nad analizą substratu neuronalnego leżącego u podstaw tego zachowania u Drosophila zidentyfikowały ciała grzybów (MB) jako główne miejsce "engramu"7,8,9,10 a zatem obwody tego obszaru mózgu były i są przedmiotem intensywnych badań w celu odkrycia logiki, za pomocą której engram pamięci jest pozyskiwany i przechowywany (ostatnio Sprawdzone w11,12).
MB Drosophila składa się z ~2,000 wewnętrznych neuronów (komórek Kenyona) na półkulę, zorganizowanych w równoległe projekcje aksonalne13. Aksony neuronów projekcyjnej węchu są przedłużone do bocznej protocerebry i do kielichów MB, głównego dendrytycznego miejsca wejściowego MB i otrzymują bodźce węchowe z płatów czułkowych. Długie, równoległe wiązki aksonów komórek Kenyona tworzą szypułkę i płaty. Większość komórek Kenyona rozwidla się, tworząc poziome płaty β/β', rozciągając jeden płat poboczny w kierunku linii środkowej mózgu, a pionowe płaty α/α', wydłużając drugie płaty poboczne wystające w kierunku grzbietowo-przednim. Druga grupa komórek Kenyona tworzy poziome γ-płaty 13 MB, gdzie proces uczenia się i następujące po nim tworzenie pamięci krótkotrwałej mogą być zlokalizowane10. Płaty MB odbierają aferentne dane wejściowe i zapewniają odprowadzające wyjście, z których oba są zwykle ograniczone do odrębnych podregionów przedziałowych wzdłuż aksonów komórek Kenyona14,15,16. W szczególności wykazano, że aferentne dopaminergiczne neurony wejściowe MB pośredniczą w efektach opartych na wartościach, np. karnych, wzmacniających w asocjacyjnym uczeniu węchowym15,17. Stereotypowe i indywidualnie identyfikowalne odprowadzające neurony wyjściowe MB z płatów ciała grzyba integrują informacje z dużej liczby komórek Kenyona, celują w różne obszary mózgu i zawierają informacje instruujące o zachowaniu lub awersyjne15. Ta architektura neuronalna doprowadziła do koncepcji organizacji engramu asocjacyjnego. Zapachy są stosunkowo precyzyjnie kodowane przez słabo aktywowane zespoły komórek Kenyona. Zbieżna aktywność tych zespołów komórek Kenyona i uwalnianie dopaminy - wywołane przez karzące bodźce - moduluje transmisję z presynaps komórek Kenyona do neuronów wyjściowych MB w taki sposób, że zwierzęta będą następnie unikać tego konkretnego zapachu10,12. Używamy tego dość precyzyjnie zdefiniowanego i zlokalizowanego engramu jako paradygmatycznego przypadku do zilustrowania, w jaki sposób te zależne od uczenia się zmiany w aktywności synaptycznej mogą być określane i monitorowane.
Wartość Drosophila jako systemu modelowego opiera się w dużej mierze na niezrównanym genetycznym zestawie narzędzi, który pozwala na ekspresję transgenów w celu identyfikacji, monitorowania i kontrolowania pojedynczych neuronów w złożonych obwodach18. Pojawienie się technik monitorowania aktywności neuronalnej - takich jak obrazowanie wapnia, omówione tutaj - pozwoliło na określenie wzorców aktywności neuronów w odpowiedzi na określony bodziec. Łącząc specyficzną ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) sterowaną przez Gal4 ze stymulacją węchową, można zobrazować dynamikę wapnia wywołaną zapachem w interesujących neuronach19. W tym protokole pokazano, że dzięki dalszemu sprzężeniu tej techniki z klasycznym paradygmatem warunkowania, możliwe jest zbadanie tych reakcji węchowych w kontekście uczenia się. Plastyczność wywołana uczeniem się może być dalej analizowana za pomocą GECI, które są nie tylko zlokalizowane w pojedynczym konkretnym neuronie, ale także w określonych podprzedziałach neuronu. Pech et al.20 stworzyli zestaw narzędzi, które pozwalają właśnie na to. Kierując GCaMP321 do pre- lub postsynapsy - poprzez połączenie z kręgowcami Synaptophysin lub dHomer, odpowiednio20 - można rozróżnić modulację różnicową tych miejsc. Ta lokalizacja daje w tym kontekście przewagę nad większością GECI, które są wszechobecne w cytozolu - np. GCaMP22, GCaMP321, lub GCaMP623 - ponieważ oznacza to, że stany przejściowe pre- i postsynaptyczne można odróżnić od ogólnego zintegrowanego napływu wapnia, który następuje w wyniku aktywacji neuronów. Może to dostarczyć wskazówek na temat lokalizacji i rodzajów plastyczności, które występują w wyniku lub powodują uczenie się i tworzenie pamięci. Jako przykład, przedstawiony tutaj protokół pokazuje wartość tego narzędzia w rozszyfrowywaniu modulacji neuronów wyjściowych MB podczas węchowego uczenia się asocjacyjnego poprzez ukierunkowanie ekspresji czujnika wapnia tylko na postsynapsę. Monitorując w obrębie pojedynczej muchy aktywność wywołaną zapachem przed i po kondycjonowaniu węchowym, można dokonać bezpośredniego porównania między naiwną reakcją na zapach a wyuczoną reakcją zapachową. Po umieszczeniu w tej samej komorze obrazowania muchy są narażone na działanie różnych zapachów. Następnie otrzymują protokół awersyjnego warunkowania asocjacyjnego, w którym jeden z tych zapachów jest połączony z porażeniem prądem (stając się CS+), a inny zapach jest prezentowany bez wzmocnienia (stając się CS-). Na koniec muchy są ponownie wystawione na te same zapachy, co w pierwszym kroku. Dynamikę wapnia obserwuje się za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

<table><tbody><tr><td>1-Octen-3-ol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>O5284</td><td>Substancja chemiczna stosowana jako środek nawaniający</td></tr><tr><td>3-Octanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>218405</td><td>Substancja chemiczna stosowana jako środek nawaniający</td></tr><tr><td>4-metylocykloheksanol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>153095</td><td>Substancja chemiczna stosowana jako nawaniacz</td></tr><tr><td>Filtr pasmowoprzepustowy do EGFP (525/50 nm)</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma samoprzylepna</td><td>Tesa SE, Norderstedt, Niemcy</td><td></td><td>Standardowa przezroczysta taśma samoprzylepna</td></tr><tr><td>Wklęsło-wypukłe szczęki</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada</td><td>10053-09</td><td>Uchwyty ostrzy z wklęsło-wypukłymi szczękami</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada</td><td>11412-11</td><td>Kleszcze z końcówką 0,1 x 0,06 mm</td></tr><tr><td>Igła</td> <td>podskórnaSterican - B. Braun, Melsungenk, Niemcy</td><td>4665120</td><td>1,20x40mm</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów Minutien</td><td>Fine Science Tools, North Vancouver, Kanada</td><td>26002-10</td><td>Średnica 0,1 mm, końcówka 0,0125 mm</td></tr><tr><td>Kentoflow</td><td>Kent Express Dental Supplies, Gillingham, Wielka Brytania</td><td>953683</td><td>Niebieski klej światłoutwardzalny</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Niemcy</td><td>0656.1</td><td>Obiektyw standardowy szkiełko 76 x 26 mm</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>M8410</td><td>Stosowany jako rozcieńczalnik do nawaniaczy</td></tr><tr><td>Laser Ti-Sapphire z blokadą trybu pracy Chameleon Vision 2</td><td>Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>Przestrajalny laser femtosekundowy na podczerwień</td></tr><tr><td>Mikroskop wielofotonowy LSM 7MP wyposażony w detektory BiG</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Niemcy</td><td></td><td>Mikroskop wielofotonowy, wiele firm dostarcza podobne urządzenia.</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20x (NA = 1,0) obiektyw zanurzeniowy</td><td>w wodzie Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Niemcy</td><td>421452-9900-000</td><td>Obiektyw W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm</td></tr><tr><td>Roztwór Ringera</td> n.a.n.a.5mM <td></td><td></td><td>KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sacharoza, pH = 7,4</td></tr><tr><td>Nóż kłuty</td><td>Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA</td><td>72-1551</td><td>5,0 mm Prosta ograniczona głębokość ostrza</td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne</td><td>Swann-Morton, Sheffield, Wielka Brytania</td><td>0303</td><td>Produkt nr 11</td></tr><tr><td>Rękojeść chirurgiczna</td><td>Swann-Morton, Sheffield, Wielka Brytania</td><td>0907</td><td>Nr produktu 7S/S</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Visual Basics of Applicatons (VBA) do odbierania wyzwalacza z urządzenia dostarczającego zapach oraz urządzenia aplikacyjnego (zasilacza) do porażenia prądem do interakcji z oprogramowaniem ZEN firmy Zeiss, które steruje mikroskopem.</td><td>Napisane na zamówienie i dostępne na życzenie</td>, <td>gdzie indziej</td> <td>niesklasyfikowane.</td></tr></tbody></table>

optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u drosophila melanogaster

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Dziesięciolecia badań nad wieloma organizmami modelowymi doprowadziły do obecnej koncepcji plastyczności synaptycznej leżącej u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci. Wywołane uczeniem się zmiany w transmisji synaptycznej są często rozmieszczone w wielu neuronach i poziomach przetwarzania w mózgu. Dlatego potrzebne są metody wizualizacji zależnej od uczenia się plastyczności synaptycznej w neuronach. Muszka owocowa Drosophila melanogaster stanowi szczególnie korzystny organizm modelowy do badania obwodów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się. Przedstawiony tu protokół demonstruje sposób, w jaki procesy leżące u podstaw powstawania asocjacyjnych wspomnień węchowych, czyli aktywność synaptyczna i jej zmiany, mogą być monitorowane in vivo. Korzystając z szerokiego wachlarza narzędzi genetycznych dostępnych u Drosophila, możliwa jest specyficzna ekspresja genetycznie kodowanych wskaźników wapnia w określonych populacjach komórek, a nawet w pojedynczych komórkach. Utrwalając muchę w miejscu i otwierając torebkę głowy, można zobrazować dynamikę wapnia w tych komórkach podczas dostarczania bodźców węchowych. Dodatkowo demonstrujemy konfigurację, w której mucha może być jednocześnie poddawana wstrząsom elektrycznym ciała. Zapewnia to system, w którym muchy mogą przechodzić klasyczne warunkowanie węchowe - dzięki któremu wcześniej naiwny zapach uczy się kojarzyć z karą porażenia prądem - w tym samym czasie, gdy reprezentacja tego zapachu (i innych niewyuczonych zapachów) jest obserwowana w mózgu za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Nasze laboratorium wcześniej informowało o generacji synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia, które umożliwiają ograniczenie fluorescencyjnych sygnałów wapniowych do przedziałów pre- lub postsynaptycznych. Mikroskopia dwufotonowa umożliwia przestrzenne rozdzielenie drobnych struktur. Ilustrujemy to, skupiając się na neuronach integrujących informacje z ciała grzyba, centrum wyższego rzędu w mózgu owada. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia metodę badania połączeń synaptycznych między neuronami, których aktywność jest modulowana w wyniku uczenia się węchowego.

Przykład obrazów uzyskanych zgodnie z powyższym protokołem przedstawiono na Ryc. 2. dHomer-GCaMP3 jest eksprymowany w neuronie wyjściowym ciała grzybowatego (MB), którego dendryty unerwiają kompartment 1 γ-ramienia ciała grzybowatego (neuron ten określa się jako MVP228,29) i który jest genetycznie docelowy za pomocą linii split-Gal4 MB112C16. Pokazano również różnicę w...

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Technika ta ułatwia obserwację w czasie rzeczywistym synaptycznej aktywności wapnia jako parametru fizjologicznego procesów komórkowych leżących u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci u Drosophila melanogaster. Porównując reakcje neuronów na zapachy przed i po treningu asocjacyjnym, możemy narysować bezpośrednie korelacje między aktywnością synaptyczną a powstawaniem śladu pamięciowego u poszczególnych muszek owocowych. Aby wyprodukować transgeniczne muszki owocowe, w których określone neurony wykazują ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, krzyżuj samice i samce much z dziewicami i samcami noszącymi pożądane konstrukty GAL4 i UAS i starzej potomstwo samic do trzech do sześciu dni po ekleksji.Aby przygotować muchę do obrazowania, użyj cienkich kleszczy, aby umieścić znieczuloną lodem muchę w specjalnie przygotowanej komorze obrazowania. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ustawić klatkę piersiową i nogi w kontakcie z przewodami elektrycznymi na dnie komory oraz z głową leżącą płasko. Przymocuj muchę za pomocą przezroczystej taśmy klejącej i użyj ostrza skalpela chirurgicznego, aby wyciąć okienko w taśmie wokół głowy, pozostawiając antenę zakrytą i odsłoniętą tylko najbardziej przednią część klatki piersiowej.Użyj szpilki do owadów trzymanej przez wklęsło-wypukłe szczęki, aby ostrożnie otoczyć boki i tył głowy klejem utwardzanym niebieskim światłem. I użyj lampy LED emitującej niebieskie światło, aby utrwalić klej. Gdy klej jest całkowicie związany, usuń resztki nieutwardzonego kleju z grzbietowej powierzchni głowy muchy i przykryj odsłonięty naskórek głowy kroplą roztworu Ringera.Za pomocą noża o bardzo cienkim ostrzu przetnij naskórek w poprzek tylnej części głowy, zaczynając od oczek i przecinając każdą stronę przyśrodkowo do oczu, aby utworzyć płat naskórka, który można łatwo oderwać za pomocą kleszczy. Usuń nadmiar naskórka, który może blokować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania i użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie oczyścić powierzchnię grzbietową z tchawicy, uważając, aby nie uszkodzić samej tkanki mózgowej. W razie potrzeby usuń i odśwież roztwór Ringera, aby oczyścić obszar z resztek tkanki.I umieść igłę do dostarczania zapachu podskórnego około jednego centymetra od głowy muchy, uważając, aby nic nie przeszkadzało w dostarczaniu zapachu do anteny. Następnie podłącz komorę obrazowania do systemu dostarczania zapachów za pomocą igły do dostarczania zapachów podskórnych. I pozwól muchy na 10 minut, aby doszła do siebie po znieczuleniu i operacji.W celu wizualizacji wskaźników wapnia opartych na GFP należy dostroić laser mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień i obiektyw zanurzeniowy zainstalowany na stole z izolacją drgań do długości fali wzbudzenia 920 nanometrów i zainstalować filtr pasmowoprzepustowy GFP. Korzystając z pokrętła regulacji kursu Z, przeskanuj oś Z mózgu, aby zlokalizować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Użyj funkcji przycinania, aby ustawić ostrość skanowania tylko na obszarze zainteresowania, aby zminimalizować czas skanowania.I obróć widok skanowania tak, aby przednia część głowy była skierowana w dół. Następnie dostosuj rozmiar klatki do 512 na 512 pikseli i wybierz region do skanowania. Biorąc pod uwagę obliczony czas skanowania dla każdej klatki, aby osiągnąć częstotliwość odświeżania co najmniej cztery herce.W celu wizualizacji stanu przejściowego wapnia wywołanego zapachem, zainicjuj wstępnie zaprogramowany pakiet makr, który może połączyć oprogramowanie do akwizycji obrazu i program dostarczania zapachu, a następnie rozpocznij pomiar w oprogramowaniu mikroskopu na 6,25 sekundy, aby ustalić wartość bazową F0. W systemie dostarczania zapachów należy dostarczyć 2,5-sekundowy bodziec zapachowy wskazany tutaj przez podświetlenie diod LED wyzwalane otwieraniem i zamykaniem określonych zaworów kubków zapachowych. Następnie 12,5 sekundy nagrywania na końcu przesunięcia zapachu.Następnie powtórz dostawę dla drugiego i trzeciego środka zapachowego w ten sam sposób. Aby przeprowadzić warunkowanie asocjacyjne w tej konfiguracji, użyj sterowanego komputerowo systemu dostarczania zapachów, aby przedstawić kondycjonowany bodziec plus zapach przez 60 sekund wraz z 12 90-woltowymi wstrząsami elektrycznymi. Po 60-sekundowej przerwie zaprezentuj sam kondycjonowany bodziec bez zapachu przez 60 sekund bez porażenia prądem.Ponownie zmierz przejściowość wapnia wywołanego przez zapach po treningu, powtarzając protokół stymulacji zapachu przed treningiem trzy minuty po zakończeniu fazy treningowej. Następnie zapisz pliki obrazowania w odpowiednim formacie do późniejszej analizy obrazu. Tutaj można zaobserwować reprezentatywne obrazy neuronów wyjściowych ciała grzyba, uzyskane, jak pokazano.Specyficzna ekspresja przedziałowa czujnika dHomer-GCaMP3, która nie jest wyrażana w przedziałach aksonalnych neuronu, demonstruje sygnał punktowy w przedziale dendrytycznym. Wyraźne, choć o mniejszej amplitudzie reakcje zapachowe można zaobserwować u muszek wyrażających dHomer-GCaMp3, w porównaniu z muchami wyrażającymi cytozolowy GCaMP6f. W tym przypadku reprezentatywne ślady wapnia od jednej pojedynczej muchy pokazują różnice w poziomie i amplitudzie hałasu, które można uzyskać między poszczególnymi preparatami.Technika ta otworzyła możliwość wizualizacji na poziomie subkomórkowym, w jaki sposób reprezentacje węchowe są modulowane i jak fazy pamięci są tworzone przez warunkowanie. Takie eksperymenty będą miały kluczowe znaczenie dla poszerzenia naszego zrozumienia złożonych struktur mózgu, takich jak ciało grzyba, oraz do scharakteryzowania, w jaki sposób wspomnienia asocjacyjne są przechowywane w rozproszonych populacjach neuronów.

in-vivo-optical-calcium-imaging-learning-induced-synaptic-plasticity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Ten film opisuje obrazowanie in vivo wapnia w neuronach Drosophila za pomocą GCaMP. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak rejestrować zmiany we fluorescencji GCaMP z neuronów ciała grzyba podczas eksperymentu kondycjonowania węchowego.

Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Źródło: Lark, A. R., et. al., Podejście do funkcjonalnego obrazowania mózgu in vivo oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin. J. Vis. exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą Greena bioluminescencja białka fluorescencyjnego i aequoryny w głębokich strukturach mózgu .

Obrazowanie bioluminescencyjne do badania stanów przejściowych wapnia w strukturach mózgu Drosophila

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca2+ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Podejście do obrazowania wapnia umożliwia rejestrowanie reakcji wywołanych smakiem w mózgach obudzonych muszek, podczas gdy roztwór jest nakładany na labellum. Jako przykład podano pierwotne reakcje smakowe u Drosophila melanogaster, ale protokół ten można dostosować do badania neuronów w dół rzeki lub innych gatunków.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia reakcji neuronalnych wywołanych smakiem u dorosłych Drosophila

Istotną przeszkodą w badaniu aktywności komórkowej podczas procesów poznawczych, takich jak uczenie się i pamięć, jest stosowanie środków znieczulających do przygotowania obrazowania in vivo. Znieczulenie upośledza pamięć krótkotrwałą i funkcje poznawcze w wielu modelach, w tym u Drosophila. W pracy przedstawiono unikalną metodę przygotowania dorosłej Drosophila do obrazowania in vivo bez znieczulenia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie aktywności neuronalnej u nieznieczulonych dorosłych much Drosophila

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Poznaj metodę optycznego obrazowania wapnia in vivo w celu badania plastyczności synaptycznej związanej z uczeniem się u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia obserwację aktywności wapniowej w czasie rzeczywistym.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów