Name: Niezawodna izolacja mikronaczyń ośrodkowego układu nerwowego w pięciu grupach kręgowców (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj niezawodną metodę izolacji mikronaczyń OUN u pięciu grup kręgowców bez ultrawirówki i enzymów. Technika umożliwia porównanie mikrokrążenia między regionami mózgu i gatunkami w ciągu jednego dnia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr Cruz-Orengo był wspierany przez Uniwersytet Kalifornijski w Davis, Szkołę Medycyny Weterynaryjnej (University of California, Davis, School of Veterinary Medicine).

Wszystkie procedury niniejszego badania są zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Uniwersytet Kalifornijski (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Opieka nad zwierzętami na UC Davis jest regulowana przez kilka niezależnych źródeł i jest w pełni akredytowana przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) od 1966 roku. Tkanki OUN świń uzyskano z Zakładu Nauk o Zwierzętach UCD, Laboratorium Nauk o Mięsie. Tkanki OUN makaków rezusów uzyskano z California National Primate Research Center Patology Department (NIH P51OD011107). Personel laboratoryjny nie przeprowadził znieczulenia, eutanazji ani sekcji zwłok świń i makaków. W związku z tym nie ma szczególnych zaleceń dotyczących tych kwestii.
UWAGA: Ta metoda została zatwierdzona dla wielu gatunków, ale dostarczony protokół odpowiada bardziej bezpośrednio tkankom myszy i świń. Szczegóły dotyczące płata wzrokowego nie mają zastosowania w przypadku korzystania z okazów ssaków. Wszystkie materiały niebezpieczne biologicznie muszą być obsługiwane w obiekcie o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL). Wszystkie materiały silnie toksyczne muszą być przenoszone pod wyciągiem. Wszystkie odpady medyczne niebezpieczne biologicznie i odpady ostro toksyczne muszą być odpowiednio utylizowane.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Roztwory (Tabela 1) należy przygotować co najmniej jeden dzień wcześniej. 
	UWAGA: Bardzo trudno jest rozpuścić dekstran o masie cząsteczkowej 70 kDa (MW). Bardziej efektywne jest pozostawienie roztworu na wymieszanie przez noc przykrytego folią parafinową lub folią. Protokół wymaga użycia dwóch różnych roztworów MV-2 w zależności od badanej próbki. 18% dekstran skutecznie oddziela mielinę od osadu mikronaczynia podczas wykonywania protokołu na małych próbkach lizencefalicznych. Jednak rozwija rozmaz mieliny w obrębie granicy tkanek OUN z dużych próbek gyrencefalicznych, a także podwzgórza i przysadki mózgowej z małych próbek. Temu rozmazowi zapobiega się, stosując 20% dekstranu.</li>
	<li>Przygotować szkiełka podstawowe, ładując 50 μl poli-D-lizyny na studzienkę i pozostawić do wyschnięcia na 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT), najlepiej w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2 (BSC-2). Nie przesuszać. Spłucz dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i przechowuj w lodówce do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Wycięcie tkanki CNS z małego próbki kręgowców Lissencephalicz
UWAGA: Artykuł demonstruje zastosowanie protokołu na myszy męskiej C57BL6/J, 10 tygodniowej, ~25 g.
<ol>
	<li>Przygotować dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml i probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,7 ml z odpowiednio 5 ml i 1 ml roztworu MV-1 na próbkę. Trzymaj probówki na lodzie.</li>
	<li>Znieczulenie
	<ol>
		<li>Znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy, ksylazyny i acepromazyny koktajlu znieczulającego w dawce 100/10/3 mg na kg masy ciała i spryskać 70% etanolem. Potwierdź znieczulenie, oceniając brak odruchów powiekowych i odruchów pedałowania, odpowiednio dotykając oka i szczypiąc stopę.</li>
		<li>Znieczulenie gołębi poprzez inhalację 5% izofluranu za pomocą indukcyjnego pudełka do znieczulenia.</li>
		<li>Znieczulenie ryb i żab w 1% trikainy w zbiorniku wodnym dla ryb lub roztworze Ringera (tabela materiałów).</li>
		<li>Znieczulenie jaszczurek należy schłodzić w temperaturze 4 °C przed eutanazją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odetnij głowę zwierzęcia nożyczkami chirurgicznymi, oderwij skórę kleszczami, aby odsłonić czaszkę, i przetnij nożyczkami LaGrange otwór wielki (<silna klasa="xfig">Ryc. 1 A).</li>
	<li>Wyciąć mózg szpatułką i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z roztworem MV-1. Trzymaj probówkę na lodzie.</li>
	<li>Pobrać przysadkę mózgową z siodła tureckiego czaszki za pomocą kleszczy i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml z roztworem MV-1. Trzymaj probówkę na lodzie.</li>
	<li>Usuń skórę i mięśnie, aby odsłonić kręgosłup. Wytnij kończyny, klatkę piersiową i narządy wewnętrzne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Wypreparuj rdzeń kręgowy jedną z dwóch metod opisanych poniżej. Następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 5 ml z roztworem MV-1. Trzymaj probówkę na lodzie.
	<ol>
		<li>Wykonaj laminektomię, przecinając nożyczkami LaGrange w kierunku rostralnym do ogonowego, zaczynając od otworu kręgowego szyjnego, aż do rdzenia lędźwiowego.</li>
		<li>Wykonaj płukanie w kierunku doogonowym do rostralnego w całym otworze kręgowym lędźwiowym za pomocą igły 18 G i strzykawki 10 ml załadowanej roztworem MV-1 (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1C,D). 
		UWAGA: Ta metoda działa tylko w przypadku bardzo małych okazów, głównie gryzoni (<100 g).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą lunety preparacyjnej odetnij worek oponowy od rdzenia kręgowego nożyczkami sprężynowymi i usuń pozostałe opony mózgowe za pomocą dwuzębnego kilofa (<silna klasa="xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Przenieś mózg na szalkę Petriego i za pomocą lunety preparacyjnej usuń opony mózgowe za pomocą dwuzębnego kilofa (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2 A–C).</li>
	<li>Wytnij opuszki węchowe i wzgórze za pomocą kleszczy, nożyczek do tęczówki i nożyczek sprężynowych. Za pomocą dwuzębnego kilofa usuń splot naczyniówkowy ze wszystkich komór mózgu. Upewnij się, że usunąłeś cały splot naczyniówkowy. 
	UWAGA: Splot naczyniówkowy i opuszki węchowe są ogromnym źródłem zanieczyszczenia. W przeciwieństwie do BBB, naczynia te są wysoce fenestrowane, a wyniki kolejnych eksperymentów będą zagrożone, jeśli nie zostaną usunięte.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy oddziel różne obszary OUN: korę, móżdżek, pień mózgu, płat wzrokowy (nie u osobników ssaków) i podwzgórze.</li>
</ol>
3. Wycięcie tkanki CNS z dużego okazu kręgowca gyrencefalicznego
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje tkanki OUN świń uzyskane z rzeźni. Dlatego nie jest tu opisane ani pokazane żadne znieczulenie, eutanazja ani sekcja zwłok.
<ol>
	<li>Transportuj tkanki OUN świń w pojemniku histologicznym o pojemności 0,946 l (32 uncje) załadowanym roztworem MV-1 w skrzyni / wiadrze z lodem.</li>
	<li>Za pomocą lunety preparacyjnej usuń opony mózgowe za pomocą dwuzębnego kilofa, kleszczy, nożyczek do tęczówki i nożyczek sprężynowych z każdej tkanki OUN. Upewnij się, że usunąłeś wszelkie kawałki splotu naczyniówkowego z komór mózgu.</li>
</ol>
4. Homogenizacja tkanek OUN
UWAGA: Jest to bardziej efektywne, gdy dwóch badaczy angażuje się w proces homogenizacji: jeden preparuje opony mózgowe pod stereoskopem, a drugi homogenizuje zmielone tkanki. W ten sposób chusteczki są szybko wkładane z powrotem do pojemnika na lód i utrzymywane w niskiej temperaturze.
<ol>
	<li>Umieść każdy obszar OUN na szalce Petriego z ~1 ml roztworu MV-1. Za pomocą ostrza o pojedynczej krawędzi zmiel tkankę, aby uzyskać kawałki o średnicy 1–2 mm.
	<ol>
		<li>W przypadku małego okazu kręgowca należy użyć szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm.</li>
		<li>W przypadku dużego okazu kręgowca należy użyć szalki Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizacja próbki małego kręgowca (tabela 2 i tabela 3)
	<ol>
		<li>Przenieś korę, móżdżek, pień mózgu, płat wzrokowy i rdzeń kręgowy do ~1 ml roztworu MV-1 w indywidualnym młynku do tkanek szklanych Potter-Elvehjem o pojemności 10 ml za pomocą tłuczka PTFE za pomocą pipety transferowej. Dodaj 5 ml roztworu MV-1 i homogenizuj każdą tkankę (~10 uderzeń). Przenieść do pojedynczych probówek stożkowych o pojemności 15 ml. Utrzymuj probówki na lodzie. 
		UWAGA: W przypadku małych kręgowców, odpowiednio 5 lub 4, z płatem optycznym lub bez, potrzebne są młynki Potter-Elvehjem o pojemności 10 ml i probówki stożkowe o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Przenieś podwzgórze i przysadkę za pomocą kleszczy do ~100 μl roztworu MV-1 w pojedynczej probówce o pojemności 1,7 ml i ostrożnie homogenizuj szklanym mikrotłuczkiem. Opłucz każdy mikrotłuczek ~1 ml roztworu MV-1. Trzymaj rurkę na lodzie. 
		UWAGA: W przypadku małego kręgowca potrzebne są 2 szklane mikrotłuczki i probówki o pojemności 1,7 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizacja dużego okazu kręgowca (tabela 4 i tabela 5)
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety transferowej przenieś zmieloną tkankę do szklanego młynka do tkanek Potter-Elvehjem o pojemności 55 ml za pomocą tłuczka z PTFE i przymocuj do mieszadła nad głową. Dodać połowę zalecanej objętości roztworu MV-1, zgodnie z konkretną homogenizowaną porcją OUN (Tabela 5).</li>
		<li>Włącz mieszadło górne na bardzo niskich obrotach (~150 obr./min) i ostrożnie przesuwaj szklaną rurkę w górę iw dół przez około 30 s.</li>
		<li>Wyłączyć mieszadło górne, dodać więcej roztworu MV-1 i powtarzać krok 4.3.2 aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny.</li>
		<li>Przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Trzymaj probówkę na lodzie.</li>
		<li>Umyj młynek wodą dejonizowaną między każdą homogenizacją tkanek OUN. 
		UWAGA: W przypadku dużych kręgowców 5 lub 4, odpowiednio z istotą białą lub bez, potrzebne są stożkowe probówki o pojemności 50 ml. Podobnie, potrzebne są dwie (2) stożkowe rurki o pojemności 15 ml dla podwzgórza i przysadki mózgowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Oczyszczanie mikronaczyń
<ol>
	<li>Odwirować homogenaty tkanek wynikające z etapów 4.2.1, 4.2.2 lub 4.3.4 przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Duży biały interfejs mieliny utworzy się na wierzchu czerwonawych granulek mikronaczyń. Odrzucić supernatanty.
	<ol>
		<li>Okaz małego kręgowca (tabela 2 i tabela 3)
		<ol>
			<li>Zawiesić korę, móżdżek, pień mózgu, płat wzrokowy i rdzeń kręgowy w 5 ml lodowatego roztworu MV-2 za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml (~10 rzutów). Dodaj 5 ml lodowatego roztworu MV-2 do każdej zawiesiny i ostrożnie wymieszaj, obracając probówki.</li>
			<li>Zawiesić podwzgórze i przysadkę mózgową w 1 ml roztworu MV-2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Okaz dużych kręgowców (tabela 4 i tabela 5)
		<ol>
			<li>Dodaj 20 ml lodowatego roztworu MV-2 do kory mózgowej, móżdżku, pnia mózgu i granulek mikronaczyń rdzenia kręgowego. Ponownie zawiesić granulki, mieszając na rurowym wytrząsarce rewolwerowej, mieszając z prędkością 40 obr./min przez ~5 min. Zrównoważyć objętość stożkowych rurek korowych, móżdżku, pnia mózgu i zawiesin rdzenia kręgowego, dodając więcej roztworu MV-2.</li>
			<li>Zawiesić granulki mikronaczyń podwzgórza i przysadki mózgowej w 5 ml roztworu MV-2 za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml (~10 płukań). Dodaj 5 ml lodowatego roztworu MV-2 do zawiesiny i ostrożnie wymieszaj, obracając probówkę.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować przy 4 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij grubą i gęstą warstwę mieliny na granicy faz cieczy od ścianek każdej probówki, powoli obracając rurki i pozwalając supernatantowi przejść wzdłuż ścianek.</li>
	<li>Wyrzuć granicę mieliny i cieczy i osusz wewnętrzną ściankę każdej probówki szpatułką owiniętą papierową chusteczką o niskiej zawartości włókien. W przypadku małych próbek kręgowców należy usunąć warstwę mieliny z każdego podwzgórza i rurki przysadki mózgowej, ostrożnie odsysając pipetą transferową.</li>
	<li>Zetrzyj nadmiar płynu skręconą, niestrzępiącą się papierową chusteczką. Zawiesić każdą osadkę z 1 ml roztworu MV-3 za pomocą końcówek o niskim stopniu wiązania. Trzymaj probówki na lodzie.</li>
</ol>
6. Elucja i filtracja mikronaczyń
<ol>
	<li>Wlać lodowaty roztwór MV-3 do indywidualnych zlewek dla każdego regionu OUN. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>W przypadku małych okazów kręgowców należy użyć 10 ml roztworu MV-3 na 50 ml zlewki. W sumie potrzeba 6–7 zlewek, w zależności od tego, czy uwzględniony jest płat wzrokowy, czy nie.</li>
		<li>W przypadku dużych okazów kręgowców należy użyć 30 ml roztworu MV-3 na 100 ml zlewki. W sumie potrzeba 6-7 zlewek, w zależności od tego, czy zawiera się istotę białą, czy nie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść sitko do komórek na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Użyj jednego na region CNS. Użyj sitka 100 μm do kory, pnia mózgu, płata wzrokowego, rdzenia kręgowego i przysadki mózgowej. Użyj sitka komórkowego o wielkości 70 μm do móżdżku i podwzgórza.</li>
	<li>Zwilż każde sitko 1 ml lodowatego roztworu MV-3.</li>
	<li>Dodać więcej roztworu MV-3 do zawiesin przygotowanych w kroku 5.5 za pomocą pipety serologicznej podczas mieszania, aby uniknąć tworzenia się agregatów. Ostrożnie załaduj mikronaczynia na sitko. Spłucz lodowatym roztworem MV-3.
	<ol>
		<li>W przypadku próbek małych kręgowców (Tabela 2 i Tabela 3) dodać 10–15 ml roztworu MV-3 za pomocą pipety serologicznej i przepłukać 5 ml roztworu MV-3.</li>
		<li>W przypadku dużych próbek kręgowców dodać 20 ml roztworu MV-3 za pomocą pipety serologicznej i przepłukać 10 ml roztworu MV-3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmontuj jednostkę filtrującą, umieszczając nylonowy filtr siatkowy o grubości 20 μm na zmodyfikowanym uchwycie filtra (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D), po jednym na region CNS.
	<ol>
		<li>W przypadku małych okazów kręgowców (Tabela 2 i Tabela 3) należy użyć zmodyfikowanych uchwytów filtrów 25 mm do kory mózgowej, móżdżku, pnia mózgu, płata wzrokowego i rdzenia kręgowego. Użyj zmodyfikowanych uchwytów filtrów 13 mm do podwzgórza i przysadki mózgowej.</li>
		<li>W przypadku dużych okazów kręgowców (Tabela 4 i Tabela 5) należy użyć zmodyfikowanych uchwytów filtrów 47 mm dla kory, móżdżku, pnia mózgu i rdzenia kręgowego. Użyj 25 mm na podwzgórze i przysadkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść filtr na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zwilż filtr 5 ml lodowatego roztworu MV-3, upewniając się, że bufor wylewa się z uchwytu filtra do stożkowej rurki.</li>
	<li>Przenieś eluowane mikronaczynia (z kroku 6.4) na wierzch nylonowego filtra siatkowego o grubości 20 μm i przepłucz mikronaczynia 5–10 ml lodowatego roztworu MV-3.</li>
	<li>Odzyskać filtr za pomocą czystych kleszczyków i zanurzyć go w zlewce zawierającej lodowaty roztwór MV-3 przygotowany w kroku 6.1.</li>
	<li>Odłącz mikronaczynia od filtra, delikatnie nim potrząsając przez około 30 sekund. W przypadku małych okazów kręgowców zawartość zlewki wlać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. W przypadku dużych okazów kręgowców zawartość zlewki należy wlać do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego roztworu MV-3 za pomocą końcówki pipety o niskiej wiązce.
	<ol>
		<li>W przypadku próbek małych kręgowców przenieść zawiesinę (z kroku 6.10) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml i wirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: To wirowanie jest wykonywane na wirówce stołowej z maksymalną prędkością (~20 000 x g), aby zapewnić solidną wydajność.</li>
		<li>W przypadku dużych próbek kręgowców przenieść zawiesinę z etapu 6.10 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 5,0 ml, dodać 4 ml roztworu MV-3 i odwirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Barwienie immunologiczne
UWAGA: Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) zostało przeprowadzone na próbkach, i ryb jako dowód wykonalności protokołu. Dlatego nie ma zaleceń dotyczących znakowania immunologicznego dla tych próbek.
<ol>
	<li>Usunąć supernatant z probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1x sterylnym PBS za pomocą słabo wiążącej końcówki pipety (tabela materiałów). Nie dopuścić do tworzenia się agregatów w mikronaczyniach poprzez wielokrotne pipetowanie. W przypadku małych okazów kręgowców (tabela 3) należy użyć ~100 μL–2,000 μL w zależności od wielkości osadu. W przypadku dużych okazów kręgowców (Tabela 5) należy użyć ~1,000 μL–4,000 μL w zależności od wielkości osadu.</li>
	<li>Używając słabo wiążącej końcówki pipety, przenieś mikronaczynia do szkiełek studzienkowych, uważając, aby dodać je do środka każdej studzienki, unikając ścianek bocznych.</li>
	<li>Umieść szkiełka studzienne bez przykrycia w BSC-2 i pozostaw do wyschnięcia na 20 do 30 minut w RT. 
	UWAGA: Aby uniknąć tworzenia się kruszywa, stosuje się stosunkowo dużą objętość 1x PBS. Z tego powodu konieczne jest pozostawienie szkiełek do wyschnięcia przed utrwaleniem, aby upewnić się, że mikronaczynia są utrzymywane przez powłokę poli-D-lizyny.</li>
	<li>Usunąć resztki 1x PBS przez pipetowanie pipetą transferową, dodać 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odpipetować roztwór utrwalający i przemyć 3x 200 μl 1x PBS przez 5 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: W tym momencie przeprowadzono barwienie H&E na mikronaczyniach ośrodkowego układu nerwowego ryb, i.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu blokującego do szkiełka studzienkowego i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć bufor blokujący za pomocą pipety transferowej i dodać 200 μl pierwszorzędowego koktajlu przeciwciał do rozcieńczalnika przeciwciał (tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Odpipetować koktajl przeciwciał pierwotnych i przemyć 3x 200 μl 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Załadować drugorzędowy koktajl przeciwciał (tabela materiałów) rozcieńczony w 1x PBS i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Odpipetować wtórny koktajl przeciwciał i przemyć 3x 200 μl 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po ostatnim praniu odczep ramę szkiełka i osusz nadmiar 1x PBS za pomocą papierowej chusteczki o niskiej ilości kłaczków.</li>
	<li>Dodaj szkiełko nakrywkowe, płynne podłoże mocujące zapobiegające blaknięciu i 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do barwienia jądrowego. Pozostaw do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Po wyschnięciu przechowywać chronić przed światłem na szkiełku w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do mikroskopii konfokalnej i akwizycji danych.</li>
</ol>

<ol><li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).</li>
<li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li>
<li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+Physiology+to+Disease+and+Back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li>
<li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).</li>
<li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+barriers%3A+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes & Development. 32, 466-478 (2018).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li>
<li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li>
<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers%3A+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li>
<li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSR%2Fangulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li>
<li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li>
<li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li>
<li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li>
<li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li>
<li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li>
<li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).</li>
<li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex%3A+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li>
<li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bariera krew-mózg obejmuje unikalne właściwości komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu w połączeniu z wyrafinowaną architekturą połączeń ścisłych, przylegających, "kołkowo-gniazdowych" i blaszek adhezyjnych krytycznych dla homeostazy OUN 2,3,19. Właściwości komórek śródbłonka są indukowane i utrzymywane przez perycyty i otaczające je procesy astrogleju i końca stopy 2,3,19</su...

Nasz mózg jest najważniejszym organem w naszym ciele. Z tego powodu priorytetem jest utrzymanie homeostazy mózgu pomimo czynników zewnętrznych, które mogą wywołać odchylenie od normalności. Według niektórych badaczy, około 400–500 milionów lat temu1, kręgowce rozwinęły to, co obecnie znamy jako barierę krew-mózg (BBB)2,3. To ochronne "ogrodzenie" wywiera największy wpływ na homeostazę i funkcjonowanie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) poprzez ścisłą regulację transportu jonów, cząsteczek i komórek między krwią a miąższem OUN. Kiedy bariera krew-mózg zostaje zakłócona, mózg staje się podatny na ekspozycję na toksyny, infekcje i stany zapalne. Dlatego dysfunkcja BBB jest związana z wieloma, jeśli nie wszystkimi, zaburzeniami neurologicznymi i neurorozwojowymi4,5,6.
Wyrafinowana funkcja BBB jest przypisywana unikalnemu mikrokrążeniu OUN zgodnemu z jednostką nerwowo-naczyniową (NVU)2,3. Wysoce wyspecjalizowane komórki śródbłonka, perycyty i astrocytarne stopy końcowe są składnikami komórkowymi klasy NVU2,< klasy sup = "xref">3. Macierz zewnątrzkomórkowa generowana przez te komórki jest również niezbędna dla fizjologii NVU i BBB2,3. Chociaż podstawowe składniki komórkowe i molekularne NVU są zachowane wśród kręgowców, niejednorodność jest zgłaszana między rzędami i gatunkami7,8. Jednak ograniczenia techniczne utrudniają nam pełne uwzględnienie tych różnic w badaniach neurobiologicznych, biomedycznych lub translacyjnych.
Z tego powodu rozszerzyliśmy metodę izolacji mikronaczyń dla regionu CNS, aby można ją było zastosować do wielu gatunków ze wszystkich pięciu grup kręgowców: ryb,,, ptaków i ssaków. Protokół jest opisany do stosowania w odniesieniu do kręgowców z małą i dużą zakrętoczaszką, w tym gatunków o znaczeniu translacyjnym9. Dodatkowo uwzględniamy inne regiony OUN, które nie były wcześniej badane w tym kontekście, ale są istotne dla neurofizjologii i mają ogromne implikacje kliniczne: podwzgórze, przysadka mózgowa i istota biała. Na koniec przetestowaliśmy zdolność tej metody izolacji jako niezawodnego narzędzia do identyfikacji zmian w ekspresji białek wzdłuż NVU i/lub BBB9,10,11. Jako dowód słuszności koncepcji pokazaliśmy, jak określić zmiany w ekspresji VCAM-1 i JAM-B podczas EAE przy użyciu metody izolacji, a następnie immunofluorescencji.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>Służy do blokowania i rozcieńczalnika przeciwciał.</td></tr><tr><td>20%</td><td>Mikroskopia elektronowa</td> PFA Nauki <td>15713-S</td><td>Używany jako utrwalacz (4% PFA)</td></tr> <tr><td>70 000 MW Dextran</td><td>Millipore Sigma</td><td>9004-54-0</td><td>Używany do roztworu MV-2</td></tr><tr><td>Kleszcze Adsona</td><td>Narzędzia do nauki (FST)</td><td>11006-12</td><td>Używany do usuwania mięśni i skóry</td></tr><tr><td>Kleszcze Adson, jakość studencka</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td>Taki sam jak powyżej, ale tańszy</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca albumina (BSA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Stosowany do roztworu MV-3, bloku i rozcieńczalnika przeciwciał</td></tr><tr><td>Corning 100 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning Deskwork końcówki o niskim wiązaniu</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS4151</td><td>Taki sam jak poniżej, ale tańszy.</td></tr><tr><td>Cultrex Poli-D-lizyna</td><td>R& D</td><td>3439-100-01</td><td>Używany do powlekania ślizgowego</td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21432</td><td>Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Osioł anty-Rabbit IgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Osioł anty-Rat IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10029</td><td>Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Dwuzębny pick</td><td>do tkanek FST</td><td>18067-11</td><td>Służy do usuwania opon mózgowych i splotu naczyniówkowego</td></tr><tr><td>Dumont #3c Kleszcze</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>Używany do delikatniejszego i/lub małego transportu tkanek OUN (takich jak przysadka)</td></tr><tr><td>Dumont #7 Kleszcze</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Używany do rozwarstwiania i obsługi CNS Kleszcze Dumont</td></tr><tr><td>#7, student</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>Tak samo jak powyżej, ale tańsze</td></tr><tr><td>ep Dualfilter T.I.P.S. Końcówki LoRetention</td><td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>Lepsza jakość niż powyższe końcówki (droższe).</td></tr><tr><td>Bardzo drobne kleszczyki Graefe, ząbkowane</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>Używane do usuwania kości</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki, ostre</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>Używane do usuwania worka oponowego świń i makaków</td></tr><tr><td>Szklany tłuczek 1,5 ml Probówka do mikrowirówek Homogenizator do mielenia tkanek, opakowanie 10 sztuk</td><td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td><td>GP1.5_10</td><td>Używany do małych podwzgórz i przysadki weterynaryjnej.</td></tr><tr><td>Kozioł anty-CXCL12, biotynylowany</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane rozcieńczenie: 1:20.</td></tr><tr><td>Kozioł anty-JAM-B</td><td>R& D</td><td>AF1074</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do oceny zapalenia nerwów. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysi IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysi IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Koza anty-PDGFR&beta;</td><td>R& D</td><td>AF1042</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>Stosowana jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>Stosowana jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Kozioł anty-Rat IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>Stosowany jako przeciwciało wtórne. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze, zakrzywiona końcówka, 1X2 zęby</td><td>FST</td><td>11054-10</td><td>Służy do nylonowej siatki filtracyjnej przytrzymującej i wytrząsającej</td></tr><tr><td>HBSS, 1X bufor z wapniem i magnezem</td><td>Corning</td><td>21-022-CM</td><td>Używany do roztworu MV-1</td></tr><tr><td>HEPES, 1M bufor płynny</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td>Używany do roztworu MV-1</td></tr><tr><td>Izolektyna GS-IB4-Biotyna-XX</td><td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td><td>I21414</td><td>Glikoproteina wyizolowana z rośliny strączkowej Griffonia simplicifolia, która wiąże reszty D-galaktozylu glikokalizylu komórek śródbłonka. Stosowany do mikronaczyń ośrodkowego układu nerwowego ptaków i świń. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Nożyczki LaGrange, ząbkowane</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>Używane do preparowania czaszki i laminektomii (z wyjątkiem świń i makaków)</td></tr><tr><td>Millicell EZ slide 8-dołkowa jednostka Millipore</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anty-CLDN5</td><td>Thermo</td><td>35-2500</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Mysi anty-GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka CD31</td><td>R& D</td><td>BBA7</td><td>Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało na mikronaczyniach OUN naczelnych. Zalecane stężenie: 16,5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Mysi anty-NFM</td><td>Thermo</td><td>RMO-270</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Mysi anty-&alfa;SMA</td><td>Thermo</td><td>MA5-11547</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Nylonowa siatka filtracyjna, rolka</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY6000010</td><td>Wycinane laserowo tarcze z siatki filtracyjnej o średnicy 13 mm. Stosowany do małych wetebrów, podwzgórza i przysadki mózgowej.</td></tr><tr><td>Nylonowe siatki filtracyjne, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2002500</td><td>Stosowany na większości tkanek OUN małych kręgowców, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej. Stosowany do podwzgórza makaków i świń oraz przysadki mózgowej.</td></tr><tr><td>Nylonowe siatki filtracyjne, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2004700</td><td>Stosowany do tkanek OUN makaków i świń, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej.</td></tr><tr><td>Odczynnik zapobiegający blaknięciu ProLong Gold z DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>Służy do szkiełek nakrywkowych.</td></tr><tr><td>Królik anty-AQP4</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5971</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Królik anty-LSR</td><td>Millipore Sigma SAB2107967</td><td></td><td>Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Królik anty-NG2</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5320</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Królik anty-OSP</td><td>Abcam</td><td>ab53041</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 1 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Królicza anty-VE-Kadheryna</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>Stosowana jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Królik anty-ZO-1</td><td>Thermo</td><td>61-7300</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-CD31</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 550274</td><td>Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało dla mysich mikronaczyń OUN. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-GFAP</td><td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe na mikronaczyniach OUN ze wszystkich próbek. Zalecane rozcieńczenie 1:200.</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-VCAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 553329</td><td>Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do oceny zapalenia nerwów. Zalecane stężenie: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór Ringera, Frog</td><td>Aldon Corporation</td><td>IS5066</td><td>Stosowany do znieczulenia amfibiowego</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>S32355</td><td>Stosowany jako przeciwciało wtórne do znakowania biotynylowanych przeciwciał pierwotnych. Zalecane rozcieńczenie 1:500.</td></tr><tr><td>Streptawidyna-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>S32357</td><td>Stosowana jako przeciwciało drugorzędowe do znakowania biotynylowanych przeciwciał pierwszorzędowych. Zalecane rozcieńczenie 1:500.</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne, ostre</td><td>FST</td><td>14002-12</td><td>Używane do usuwania mięśni i skóry</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne, ostro-</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Używane do dekapitacji (z wyjątkiem świń i makaków)</td></tr> <tr><td>Uchwyt filtra Swinnex, 13 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0001300</td><td>Zmodyfikowane przez cięcie laserowe. Stosowany do małych wetebrów, podwzgórza i przysadki mózgowej.</td></tr><tr><td>Uchwyt filtra Swinnex, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0002500</td><td>modyfikowany przez cięcie laserowe. Stosowany na większości tkanek OUN małych kręgowców, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej. Stosowany do podwzgórza makaków i świń oraz przysadki mózgowej.</td></tr><tr><td>Uchwyt filtra Swinnex, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0004700</td><td>Zmodyfikowany przez cięcie laserowe. Stosowany do tkanek OUN makaków i świń, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>50-165-7277</td><td>Służy do blokowania i rozcieńczalnika przeciwciał.</td></tr><tr><td>Mieszadło napowietrzne Wheaton 120 Vac</td><td>VWR (Dostawca DWK Life Sciences)</td><td>62400-904 (DWK #903475)</td><td>Służy do tkanek OUN makaków i świń za pomocą młynka do tkanek o pojemności 55 ml, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej.</td></tr><tr><td>Młynek do tkanek Wheaton Potter-Elvehjem z tłuczkiem PTFE, 10 ml</td><td>VWR (dostawca DWK Life Sciences)</td><td>14231-384 (DWK #357979)</td><td>Stosowany na większości tkanek OUN małych kręgowców, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej. Stosowany do podwzgórza makaków i świń oraz przysadki mózgowej.</td></tr><tr><td>Młynek do tkanek Wheaton Potter-Elvehjem z tłuczkiem PTFE, 55 ml</td><td>VWR (Dostawca DWK Life Sciences)</td><td>14231-372 (DWK #357994)</td><td>Stosowany do tkanek OUN makaków i świń, z wyjątkiem podwzgórza i przysadki mózgowej.</td></tr></tbody></table>

niezawodna izolacja mikronaczyń ośrodkowego układu nerwowego w pięciu grupach kręgowców

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Izolacja mikronaczyń z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest zwykle wykonywana poprzez połączenie tkanki korowej wielu zwierząt, najczęściej gryzoni. Takie podejście ogranicza badanie właściwości bariery krew-mózg (BBB) do kory mózgowej i nie pozwala na indywidualne porównanie. Projekt ten koncentruje się na opracowaniu metody izolacji, która pozwala na porównanie jednostki nerwowo-naczyniowej (NVU) z wielu obszarów OUN: kory, móżdżku, płata wzrokowego, podwzgórza, przysadki mózgowej, pnia mózgu i rdzenia kręgowego. Co więcej, protokół ten, pierwotnie opracowany dla próbek mysich, został z powodzeniem zaadaptowany do stosowania na tkankach OUN małych i dużych gatunków kręgowców, z których jesteśmy również w stanie wyizolować mikronaczynia z istoty białej półkuli mózgowej. Ta metoda, w połączeniu z immunoznakowaniem, pozwala na ilościowe określenie ekspresji białek i statystyczne porównanie między osobami, typem tkanki lub leczeniem. Udowodniliśmy tę przydatność, oceniając zmiany w ekspresji białek podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), mysiego modelu choroby neurozapalnej, stwardnienia rozsianego. Ponadto mikronaczynia wyizolowane tą metodą mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak między innymi qPCR, sekwencjonowanie RNA i Western blot. Mimo że nie jest to pierwsza próba wyizolowania mikronaczyń OUN bez użycia ultrawirowania lub dysocjacji enzymatycznej, jest wyjątkowa pod względem biegłości w porównywaniu pojedynczych osób i wielu regionów OUN. W związku z tym pozwala na badanie szeregu różnic, które w przeciwnym razie mogłyby pozostać niejasne: części OUN (kora, móżdżek, płat wzrokowy, pień mózgu, podwzgórze, przysadka mózgowa i rdzeń kręgowy), typ tkanki OUN (istota szara lub biała), osoby, eksperymentalne grupy leczenia i gatunki.

Mikronaczynia wyizolowane z mysiego OUN pokazały wszystkie wewnętrzne składniki komórkowe jednostki nerwowo-naczyniowej2,3. Za pomocą cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka płytek krwi-1 (PECAM, znanej również jako CD31) lub izolektyny IB4 (glikoproteiny wiążącej glikokaliks komórek śródbłonka) dla komórek śródbłonka, płytkowego czynnika wzrostu-β (PDGFRβ) lub antygenu glejowego neuronu 2 (NG2) dla perycytów i akwaporyny-4 (AQP4...

Celem tego protokołu jest odizolowanie mikronaczyń z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego kręgowców lizencefalicznych i gyrencefalicznych.

Niezawodna izolacja mikronaczyń ośrodkowego układu nerwowego w pięciu grupach kręgowców

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na porównanie mikrokrążenia między różnymi obszarami ośrodkowego układu nerwowego, a także między różnymi osobami. Ta technika izolacji mikronaczyń może być wykonana w ciągu jednego dnia i eliminuje potrzebę ultrawirowania i dysocjacji enzymatycznej. Usunięcie opon mózgowych i splotu naczyniówkowego może być trudne.Pamiętaj, aby pracować powoli i ostrożnie, aby zapewnić całkowite usunięcie każdej tkanki. W celu wypreparowania tkanki OUN z małego próbki kręgowców lizencefalicznych, należy umieścić pobrany mózg w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej roztwór MV-1 na lodzie i użyć kleszczy, aby pobrać przysadkę mózgową z siodła tureckiego czaszki. Umieść przysadkę mózgową w 1,7 mililitrowej probówce mikrowirówkowej z roztworem MV-1 na lodzie i usuń skórę i mięśnie, aby odsłonić kręgosłup.Po usunięciu kończyn, klatki piersiowej i narządów wewnętrznych, użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 18, aby przepłukać kręgosłup świeżym roztworem MV-1, w kierunku ogonowo-rostralnym w całym otworze kręgowym lędźwiowym. Następnie umieść rdzeń kręgowy w 5-mililitrowej rurce zawierającej świeży roztwór MV-1. Następnie umieść mózg na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym i usuń opony mózgowe za pomocą dwuzębnego nakłucia.Pamiętaj, aby sprawdzić rdzeń kręgowy, aby upewnić się, że nie pozostały żadne kawałki opon mózgowych. Użyj kleszczy, aby oddzielić podwzgórze, móżdżek, pień mózgu i korę. W razie potrzeby użyj kleszczy i tęczówki oraz nożyczek sprężynowych, aby wyciąć opuszki węchowe i wzgórze, a następnie użyj dwuzębnego nakłucia, aby usunąć cały splot naczyniówkowy ze wszystkich komór mózgu.Do wycięcia tkanki OUN z dużego okazu kręgowców gyrencefalicznych należy użyć mikroskopu preparacyjnego i dwuzębnego nakłucia, kleszczy oraz nożyczek do tęczówki i sprężyny, aby usunąć opony mózgowe z każdej tkanki OUN, uważając, aby usunąć wszelkie kawałki splotu naczyniówkowego z komór mózgu. W celu homogenizacji pobranych tkanek OUN, zmielić każdy obszar OUN na jedno- lub dwumilimetrowe kawałki na poszczególnych szalkach Petriego. Aby homogenizować tkanki OUN z małych próbek kręgowców, użyj pipety transferowej, aby dodać jeden mililitr roztworu MV-1 w celu zawieszenia zmielonej tkanki.Następnie użyj tej samej pipety transferowej, aby dozować korę, móżdżek, pień mózgu, płat wzrokowy i kawałki rdzenia kręgowego do pojedynczych 10-mililitrowych młynków do tkanek szklanych i użyj tłuczka PTFE i pięciu mililitrów roztworu MV-1, aby zmielić każdy zestaw tkanek przez około 10 uderzeń. Przenieś każdą zawiesinę tkanki do pojedynczych 15-mililitrowych stożkowych probówek na lodzie i użyj kleszczy, aby umieścić podwzgórze i przysadkę w 100 mikrolitrach roztworu MV-1, w pojedynczych probówkach o pojemności 1,7 mililitra. Następnie ostrożnie zhomogenizuj każdą tkankę za pomocą szklanego mikrotłuczka.Aby homogenizować dużą próbkę kręgowców, użyj pipety transferowej ze skośnym cięciem, aby przenieść zmieloną tkankę do 55-mililitrowego młynka do tkanek szklanych i przymocuj młynek do mieszadła nad głową. Dodać połowę zalecanej objętości roztworu MV-1 zgodnie z konkretną homogenizowaną porcją OUN, jak wskazano w tabeli, i włączyć mieszadło górne na około 150 obrotów na minutę. Ostrożnie przesuwaj szklaną rurkę w górę iw dół przez około 30 sekund przed wyłączeniem mieszadła górnego, aby dodać więcej roztworu MV-1 w celu dodatkowej homogenizacji, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny.Następnie przenieś homogenizowaną tkankę do 50-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie. W celu oczyszczenia mikronaczyń należy otoczkować homogenaty tkanek OUN przez odwirowanie i wyrzucić supernatanty. W celu izolacji mikronaczyń małego kręgowca należy pipetować korę, móżdżek, pień mózgu, płat wzrokowy i granulki rdzenia kręgowego w pięciu mililitrach świeżego, lodowatego roztworu MV-2 na próbkę, około 10 razy, przed dodaniem kolejnych pięciu mililitrów lodowatego roztworu MV-2 do każdej probówki.Ostrożnie odwróć probówki, aby wymieszać i ponownie zawiesić podwzgórze i przysadkę mózgową w jednym mililitrze roztworu MV-2. W celu izolacji mikronaczyń próbek dużych kręgowców dodaj 20 mililitrów lodowatego roztworu MV-2 do kory, móżdżku, pnia mózgu i granulek mikronaczyń rdzenia kręgowego i ponownie zawiesić granulki w rewolwerze rurowym z prędkością 40 obrotów na minutę przez około 5 minut. Pod koniec ponownego zawieszania oddzielić likaty tkankowe OUN przez odwirowanie i powoli obracać każdą probówkę, aby umożliwić supernatantowi przejście wzdłuż ściany, aby ostrożnie oderwać grubą i gęstą warstwę mieliny na granicy cieczy od ścianek probówki.Wyrzuć mielinę i ciecz i osusz wewnętrzną ściankę każdej probówki szpatułką owiniętą papierową chusteczką o niskiej zawartości włókien. Następnie użyj skręconej, niestrzępiącej się chusteczki papierowej, aby wchłonąć nadmiar płynu, i użyj słabo wiążących końcówek, aby ponownie zawiesić każdą granulkę w jednym mililitrze roztworu MV-3. W celu wymywania i filtracji mikronaczyń wymieszaj kilka mililitrów świeżego roztworu MV-3 z każdą zawiesiną mikronaczyń tkankowych OUN i mieszając, aby uniknąć agregatów, przecedź każdą zawiesinę przez sitko Pruitt do pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówek.Umieść jeden filtr z siatki nylonowej o grubości 20 mikrometrów na jednym zmodyfikowanym uchwycie filtra na region CNS. Przenieś uchwyt filtra na stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów i zwilż filtr pięcioma mililitrami lodowatego roztworu MV-3, upewniając się, że bufor spływa w dół uchwytu filtra do stożkowej rurki. Przenieś wymyte mikronaczynia na każdy filtr z siatki nylonowej o grubości 20 mikrometrów i przepłucz mikronaczynia pięcioma do 10 mililitrami lodowatego roztworu MV-3.Za pomocą kleszczy przenieś każdy filtr do pojedynczych zlewek zawierających lodowaty roztwór MV-3 i delikatnie potrząsaj każdym filtrem przez około 30 sekund, aby odłączyć mikronaczynia. Po przeniesieniu do 15-mililitrowej stożkowej probówki, zbierz mikronaczynia przez odwirowanie i użyj pipety o niskiej wiązalności, aby ponownie zawiesić każdą osadkę w jednym mililitrze lodowatego roztworu MV-3. Następnie przenieś zawiesiny mikronaczyń z małych próbek kręgowców do 1,7-mililitrowej probówki mikrowirówkowej w celu wirowania przez pięć minut w temperaturze 20 000 razy G, w czterech stopniach Celsjusza.W przypadku dużych próbek kręgowców przenieś zawiesinę do pojedynczych pięciomililitrowych probówek wirówkowych i dodaj cztery mililitry roztworu MV-3 do wirowania przez pięć minut w temperaturze 2000 razy G w czterech stopniach Celsjusza. Wewnętrzne składniki jednostki nerwowo-naczyniowej można wykryć w mikronaczyniach, wyizolowanych, jak pokazano, przez znakowanie immunologiczne dla CD31, PDGFR-beta i akwaporyny cztery, w tym mikronaczynia korowe, móżdżkowe, przysadkowe, podwzgórze, pień mózgu i rdzeniowy. Podobnie można uwidocznić ekspresję białka adherens-junction VE-kadheryny, białek ścisłego połączenia CLDN5 i Zonula Occludens-1, trójkomórkowego białka połączeniowego anguliny-1 oraz podstawowego liganda chemokiny CXCL motywu 12 i gamma-glutamylotransferazy-1.Co więcej, większość mikronaczyń jest pozbawiona ekspresji aktyny alfa mięśni gładkich, co wskazuje, że ten protokół izolacji selektywnie celuje w mikronaczynia małego kalibru. Mikronaczynia uzyskane od innych małych kręgowców lizopenfalicznych, takich jak ptaki, liardy, żaby i ryby, mają pewne cechy morfologiczne, co sugeruje, że metoda ta jest przydatna do dalszej charakterystyki różnic w jednostkach nerwowo-naczyniowych między gatunkami. Kwantyfikacja zmian w ekspresji białek ujawnia wzrost cząsteczki adhezji komórek naczyniowych 1 i cząsteczki adhezji złącznej B wzdłuż mikronaczyń rdzenia kręgowego, podczas szczytu eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego.Jednak cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych jest również znacznie zwiększona w mikronaczyniach przysadki mózgowej i zmniejszona w mikronaczyniach podwzgórza i pnia mózgu. Ponadto obserwuje się zmiany w ekspresji jednej cząsteczki adhezyjnej komórek naczyniowych podczas przewlekłego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia we wszystkich tkankach OUN oraz w ekspresji cząsteczki B adhezji złączowej w mikronaczyniach podwzgórza i przysadki. Analizy ilościowe, takie jak western blot, PCR i immunohistochemia, mogą być przeprowadzane zgodnie z tą procedurą, aby uzyskać wgląd w wzorce ekspresji genów i białek w barierze krew-mózg.Paraformaldehyd jest silnie toksycznym odczynnikiem i zawsze powinien być obsługiwany pod wyciągiem podczas noszenia odpowiednich środków ochrony osobistej.

reliable-isolation-central-nervous-system-microvessels-across-five

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje izolację nienaruszonych naczyń z mózgu myszy, które tworzą barierę krew-mózg (BBB) wraz z neuronami i komórkami glejowymi. Wyizolowane naczynia mogą być wykorzystane jako model in vitro do zbadania ich roli w utrzymaniu homeostazy mózgu.

Izolowanie naczyń mózgowych myszy: protokół izolowania nienaruszonych naczyń z próbki mózgu myszy

Ten film pokazuje proces izolowania mikronaczyń mózgowych od szczurów poddanych eutanazji. Obejmuje preparację mózgu, oczyszczanie tkanki i trawienie mechaniczne, a następnie wielokrotne wirowanie w celu wyizolowania czystej frakcji mikronaczyń.

Metoda izolacji jednostek nerwowo-naczyniowych z mózgu szczura

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Ten protokół opisuje powtarzające się wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, czyli krótkie ekspozycje na niedotlenienie ogólnoustrojowe, które zmniejszają objętość zawału i zaburzenie bariery krew-mózg po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy. Szczegółowo opisano również podwójną kwantyfikację objętości zawału i przerwania bariery krew-mózg po udarze, aby ocenić skuteczność ochrony nerwowo-naczyniowej.

Kwantyfikacja ochrony nerwowo-naczyniowej po powtarzającym się kondycjonowaniu wstępnym hipoksyjnym i przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy

Opisujemy protokół pozwalający na oczyszczenie przedziału naczyniowego mózgu myszy. Izolowane naczynia mózgowe obejmują komórki śródbłonka połączone ścisłymi połączeniami i otoczone ciągłą blaszką podstawną, perycyty, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, a także okołonaczyniowe błony astroglejowe.

Oczyszczanie naczyń mózgowych myszy

Ten manuskrypt opisuje prosty i powtarzalny protokół izolacji tętniczek śródmózgowych (grupa naczyń krwionośnych obejmujących tętniczki miąższowe, tętniczki penetrujące i tętniczki przedkapilarne) od myszy, do wykorzystania w miografii ciśnieniowej, immunofluorescencji, biochemii i badaniach molekularnych.

Izolacja i kaniulacja tętniczek miąższowych mózgu

Izolowane naczynia włosowate mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej mogą być użyte jako model przedkliniczny do badania funkcji bariery w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Tutaj opisana jest metoda izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Protokół ten ma wyraźną zaletę polegającą na wytwarzaniu wzbogaconych próbek mikronaczyń o akceptowalnej wydajności białka od poszczególnych zwierząt. Próbki można następnie wykorzystać do solidnych analiz białek w śródbłonku mikronaczyniowym mózgu.

Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Poznaj niezawodną metodę izolacji mikronaczyń OUN u pięciu grup kręgowców bez ultrawirówki i enzymów. Technika umożliwia porównanie mikrokrążenia między regionami mózgu i gatunkami w ciągu jednego dnia.

Niezawodna izolacja mikronaczyń ośrodkowego układu nerwowego w pięciu grupach kręgowców

Przeglądaj więcej filmów