Niezawodna izolacja mikronaczyń ośrodkowego układu nerwowego w pięciu grupach kręgowców
12 stycznia 2020
Celem tego protokołu jest odizolowanie mikronaczyń z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego kręgowców lizencefalicznych i gyrencefalicznych.
Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na porównanie mikrokrążenia między różnymi obszarami ośrodkowego układu nerwowego, a także między różnymi osobami. Ta technika izolacji mikronaczyń może być wykonana w ciągu jednego dnia i eliminuje potrzebę ultrawirowania i dysocjacji enzymatycznej. Usunięcie opon mózgowych i splotu naczyniówkowego może być trudne.
Pamiętaj, aby pracować powoli i ostrożnie, aby zapewnić całkowite usunięcie każdej tkanki. W celu wypreparowania tkanki OUN z małego próbki kręgowców lizencefalicznych, należy umieścić pobrany mózg w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej roztwór MV-1 na lodzie i użyć kleszczy, aby pobrać przysadkę mózgową z siodła tureckiego czaszki. Umieść przysadkę mózgową w 1,7 mililitrowej probówce mikrowirówkowej z roztworem MV-1 na lodzie i usuń skórę i mięśnie, aby odsłonić kręgosłup.
Po usunięciu kończyn, klatki piersiowej i narządów wewnętrznych, użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 18, aby przepłukać kręgosłup świeżym roztworem MV-1, w kierunku ogonowo-rostralnym w całym otworze kręgowym lędźwiowym. Następnie umieść rdzeń kręgowy w 5-mililitrowej rurce zawierającej świeży roztwór MV-1. Następnie umieść mózg na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym i usuń opony mózgowe za pomocą dwuzębnego nakłucia.
Pamiętaj, aby sprawdzić rdzeń kręgowy, aby upewnić się, że nie pozostały żadne kawałki opon mózgowych. Użyj kleszczy, aby oddzielić podwzgórze, móżdżek, pień mózgu i korę. W razie potrzeby użyj kleszczy i tęczówki oraz nożyczek sprężynowych, aby wyciąć opuszki węchowe i wzgórze, a następnie użyj dwuzębnego nakłucia, aby usunąć cały splot naczyniówkowy ze wszystkich komór mózgu.
Do wycięcia tkanki OUN z dużego okazu kręgowców gyrencefalicznych należy użyć mikroskopu preparacyjnego i dwuzębnego nakłucia, kleszczy oraz nożyczek do tęczówki i sprężyny, aby usunąć opony mózgowe z każdej tkanki OUN, uważając, aby usunąć wszelkie kawałki splotu naczyniówkowego z komór mózgu. W celu homogenizacji pobranych tkanek OUN, zmielić każdy obszar OUN na jedno- lub dwumilimetrowe kawałki na poszczególnych szalkach Petriego. Aby homogenizować tkanki OUN z małych próbek kręgowców, użyj pipety transferowej, aby dodać jeden mililitr roztworu MV-1 w celu zawieszenia zmielonej tkanki.
Następnie użyj tej samej pipety transferowej, aby dozować korę, móżdżek, pień mózgu, płat wzrokowy i kawałki rdzenia kręgowego do pojedynczych 10-mililitrowych młynków do tkanek szklanych i użyj tłuczka PTFE i pięciu mililitrów roztworu MV-1, aby zmielić każdy zestaw tkanek przez około 10 uderzeń. Przenieś każdą zawiesinę tkanki do pojedynczych 15-mililitrowych stożkowych probówek na lodzie i użyj kleszczy, aby umieścić podwzgórze i przysadkę w 100 mikrolitrach roztworu MV-1, w pojedynczych probówkach o pojemności 1,7 mililitra. Następnie ostrożnie zhomogenizuj każdą tkankę za pomocą szklanego mikrotłuczka.
Aby homogenizować dużą próbkę kręgowców, użyj pipety transferowej ze skośnym cięciem, aby przenieść zmieloną tkankę do 55-mililitrowego młynka do tkanek szklanych i przymocuj młynek do mieszadła nad głową. Dodać połowę zalecanej objętości roztworu MV-1 zgodnie z konkretną homogenizowaną porcją OUN, jak wskazano w tabeli, i włączyć mieszadło górne na około 150 obrotów na minutę. Ostrożnie przesuwaj szklaną rurkę w górę iw dół przez około 30 sekund przed wyłączeniem mieszadła górnego, aby dodać więcej roztworu MV-1 w celu dodatkowej homogenizacji, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny.
Następnie przenieś homogenizowaną tkankę do 50-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie. W celu oczyszczenia mikronaczyń należy otoczkować homogenaty tkanek OUN przez odwirowanie i wyrzucić supernatanty. W celu izolacji mikronaczyń małego kręgowca należy pipetować korę, móżdżek, pień mózgu, płat wzrokowy i granulki rdzenia kręgowego w pięciu mililitrach świeżego, lodowatego roztworu MV-2 na próbkę, około 10 razy, przed dodaniem kolejnych pięciu mililitrów lodowatego roztworu MV-2 do każdej probówki.
Ostrożnie odwróć probówki, aby wymieszać i ponownie zawiesić podwzgórze i przysadkę mózgową w jednym mililitrze roztworu MV-2. W celu izolacji mikronaczyń próbek dużych kręgowców dodaj 20 mililitrów lodowatego roztworu MV-2 do kory, móżdżku, pnia mózgu i granulek mikronaczyń rdzenia kręgowego i ponownie zawiesić granulki w rewolwerze rurowym z prędkością 40 obrotów na minutę przez około 5 minut. Pod koniec ponownego zawieszania oddzielić likaty tkankowe OUN przez odwirowanie i powoli obracać każdą probówkę, aby umożliwić supernatantowi przejście wzdłuż ściany, aby ostrożnie oderwać grubą i gęstą warstwę mieliny na granicy cieczy od ścianek probówki.
Wyrzuć mielinę i ciecz i osusz wewnętrzną ściankę każdej probówki szpatułką owiniętą papierową chusteczką o niskiej zawartości włókien. Następnie użyj skręconej, niestrzępiącej się chusteczki papierowej, aby wchłonąć nadmiar płynu, i użyj słabo wiążących końcówek, aby ponownie zawiesić każdą granulkę w jednym mililitrze roztworu MV-3. W celu wymywania i filtracji mikronaczyń wymieszaj kilka mililitrów świeżego roztworu MV-3 z każdą zawiesiną mikronaczyń tkankowych OUN i mieszając, aby uniknąć agregatów, przecedź każdą zawiesinę przez sitko Pruitt do pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówek.
Umieść jeden filtr z siatki nylonowej o grubości 20 mikrometrów na jednym zmodyfikowanym uchwycie filtra na region CNS. Przenieś uchwyt filtra na stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów i zwilż filtr pięcioma mililitrami lodowatego roztworu MV-3, upewniając się, że bufor spływa w dół uchwytu filtra do stożkowej rurki. Przenieś wymyte mikronaczynia na każdy filtr z siatki nylonowej o grubości 20 mikrometrów i przepłucz mikronaczynia pięcioma do 10 mililitrami lodowatego roztworu MV-3.
Za pomocą kleszczy przenieś każdy filtr do pojedynczych zlewek zawierających lodowaty roztwór MV-3 i delikatnie potrząsaj każdym filtrem przez około 30 sekund, aby odłączyć mikronaczynia. Po przeniesieniu do 15-mililitrowej stożkowej probówki, zbierz mikronaczynia przez odwirowanie i użyj pipety o niskiej wiązalności, aby ponownie zawiesić każdą osadkę w jednym mililitrze lodowatego roztworu MV-3. Następnie przenieś zawiesiny mikronaczyń z małych próbek kręgowców do 1,7-mililitrowej probówki mikrowirówkowej w celu wirowania przez pięć minut w temperaturze 20 000 razy G, w czterech stopniach Celsjusza.
W przypadku dużych próbek kręgowców przenieś zawiesinę do pojedynczych pięciomililitrowych probówek wirówkowych i dodaj cztery mililitry roztworu MV-3 do wirowania przez pięć minut w temperaturze 2000 razy G w czterech stopniach Celsjusza. Wewnętrzne składniki jednostki nerwowo-naczyniowej można wykryć w mikronaczyniach, wyizolowanych, jak pokazano, przez znakowanie immunologiczne dla CD31, PDGFR-beta i akwaporyny cztery, w tym mikronaczynia korowe, móżdżkowe, przysadkowe, podwzgórze, pień mózgu i rdzeniowy. Podobnie można uwidocznić ekspresję białka adherens-junction VE-kadheryny, białek ścisłego połączenia CLDN5 i Zonula Occludens-1, trójkomórkowego białka połączeniowego anguliny-1 oraz podstawowego liganda chemokiny CXCL motywu 12 i gamma-glutamylotransferazy-1.
Co więcej, większość mikronaczyń jest pozbawiona ekspresji aktyny alfa mięśni gładkich, co wskazuje, że ten protokół izolacji selektywnie celuje w mikronaczynia małego kalibru. Mikronaczynia uzyskane od innych małych kręgowców lizopenfalicznych, takich jak ptaki, liardy, żaby i ryby, mają pewne cechy morfologiczne, co sugeruje, że metoda ta jest przydatna do dalszej charakterystyki różnic w jednostkach nerwowo-naczyniowych między gatunkami. Kwantyfikacja zmian w ekspresji białek ujawnia wzrost cząsteczki adhezji komórek naczyniowych 1 i cząsteczki adhezji złącznej B wzdłuż mikronaczyń rdzenia kręgowego, podczas szczytu eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia
kręgowego.Jednak cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych jest również znacznie zwiększona w mikronaczyniach przysadki mózgowej i zmniejszona w mikronaczyniach podwzgórza i pnia mózgu. Ponadto obserwuje się zmiany w ekspresji jednej cząsteczki adhezyjnej komórek naczyniowych podczas przewlekłego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia we wszystkich tkankach OUN oraz w ekspresji cząsteczki B adhezji złączowej w mikronaczyniach podwzgórza i przysadki. Analizy ilościowe, takie jak western blot, PCR i immunohistochemia, mogą być przeprowadzane zgodnie z tą procedurą, aby uzyskać wgląd w wzorce ekspresji genów i białek w barierze krew-mózg.
Paraformaldehyd jest silnie toksycznym odczynnikiem i zawsze powinien być obsługiwany pod wyciągiem podczas noszenia odpowiednich środków ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji mikro naczyń z różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u kręgowców lissencefalicznych oraz gyrencefalicznych. Dzięki możliwości porównania mikro naczyniowości pomiędzy różnymi obszarami OUN i osobnikami, technika ta pozwala na głębsze zrozumienie struktur naczyniowych. Protokół można zrealizować w ciągu jednego dnia, bez konieczności przeprowadzania ultrawirowania lub dysocjacji enzymatycznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania mikrokrążenia
- Badania nad ośrodkowym układem nerwowym
Wprowadzenie
- Izolacja mikronaczyń OUN jest kluczowa dla zrozumienia regionalnych różnic w unaczynieniu.
- Badania mikronaczyniowe mogą dostarczyć wiedzy na temat zaburzeń neurologicznych oraz stanu naczyń krwionośnych.
- Badanie odnosi się do wyzwań związanych z usuwaniem złożonych tkanek przy jednoczesnym zapewnieniu czystości preparatu do analizy.
- Analiza porównawcza między gatunkami może pogłębić naszą wiedzę na temat struktur OUN kręgowców.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji mikronaczyń z różnych obszarów OUN.
- Porównanie mikrokrążenia u kręgowców lissencefalicznych i gyrencefalicznych.
- Uproszczenie procesu izolacji poprzez uniknięcie tradycyjnych technik, takich jak ultrawirowanie.
Zastosowane metody
- Metoda obejmuje sekcję i homogenizację tkanki OUN, a następnie wirowanie w celu puryfikacji mikonaczyniów.
- Wykorzystuje się zarówno małe, jak i duże okazy kręgowców, stosując specyficzne protokoły dla każdego z rozmiarów.
- Kładzie się nacisk na techniki manualne, takie jak ostrożne usuwanie tkanki i homogenizacja, aby uniknąć uszkodzenia mikonaczyniów.
- Świeże roztwory MV-1 i MV-2 są kluczowe dla zachowania żywotności tkanki podczas całego procesu.
- Filtracja przez nylonowe filtry siatkowe wspomaga puryfikację wyizolowanych mikonaczyniów.
Główne wyniki
- Opisany proces skutecznie izoluje mikronaczynia, zapewniając solidną platformę do przyszłych badań porównawczych.
- Trudności w usuwaniu tkanek, w szczególności opon mózgowych i splotu naczyniówkowego, są rozwiązane dzięki konkretnym zaleceniom.
- Metoda ta jest wszechstronna i pozwala na izolację z gatunków kręgowców zarówno małych, jak i dużych.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia wydajną technikę izolacji mikronaczyń, która może usprawnić badania nad sieciami naczyniowymi OUN.
- Możliwość porównywania mikrokrążenia u różnych kręgowców otwiera nowe perspektywy w rozumieniu adaptacji naczyniowych.
- Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten przyczynia się do poszerzenia wiedzy na temat morfologii i funkcjonalności OUN, w szczególności w odniesieniu do stanu zdrowia mikronaczyniowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia bezpośrednie porównanie jednostek naczyniowo-nerwowych w różnych obszarach ośrodkowego układu nerwowego oraz u różnych osobników, rozwiązując kluczowy problem w badaniach nad barierą krew-mózg. Dzięki wsparciu analiz międzygatunkowych i międzytkankowych, metoda ta usprawnia walidację celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego w modelach chorób neurozapalnych. Kompatybilność tej metody z dalszymi aplikacjami, takimi jak qPCR, RNA-seq i Western blot, sprawia, że jest ona skalowalnym narzędziem do przedklinicznej oceny biomarkerów oraz analizy szlaków sygnałowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez porównanie składu NVU w korze mózgu, móżdżku, podwzgórzu, pniu mózgu, rdzeniu kręgowym i przysadce.
- Wartość operacyjna: Wspiera porównania na poziomie indywidualnym, co zmniejsza zmienność wynikającą z próbek połączonych i zwiększa moc statystyczną w badaniach nad zaangażowaniem celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie oczyszczonych mikro naczyń krwionośnych odpowiednich do ilościowej analizy ekspresji białek poprzez immunoznakowanie CD31, PDGFR-beta, akwaporyny-4, VE-kadheryny, CLDN5, ZO-1 oraz anguliny-1.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność stosowania ultrawirowania i dysocjacji enzymatycznej, co usprawnia proces i pozwala zachować natywne kompleksy białkowe dla wiarygodnych wyników analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazana użyteczność w modelu EAE, wykazująca mierzalne zmiany w ekspresji VCAM-1 i JAM-B w mikro naczyniach rdzenia kręgowego, przysadki, podwzgórza i pnia mózgu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne monitorowanie biomarkerów naczyniowych w przebiegu choroby, wspierając decyzje dotyczące rozwoju programów neurozapalnych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy obejmujący etap od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, w szczególności w przypadku celów naczyniowo-nerwowych i neurozapalnych, gdzie integralność BBB jest krytycznym czynnikiem determinującym skuteczność i bezpieczeństwo leku.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez dotyczących składu NVU w konkretnych regionach oraz zmian w białkach adhezyjnych i białkach złączy indukowanych przez zastosowane leczenie.
- Przesiewanie: Pozwala na przygotowanie zstandaryzowanych i powtarzalnych preparatów mikro naczyń, odpowiednich do obrazowania wysokoprzepustowego i multipleksowego profilowania białek.
- Analityka: Umożliwia ilościową analizę za pomocą Western blot, qPCR i RNA-seq w celu porównania ekspresji białek i genów pomiędzy osobnikami, regionami i grupami traktowanymi.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, umożliwiając bezpośrednie porównanie zmian w NVU w modelach chorób, takich jak EAE.
- Ponowne wykorzystanie w instytucji: Protokół jest możliwy do adaptacji dla różnych gatunków kręgowców i regionów OUN, co sprzyja standaryzacji międzyprojektowej i ogranicza redundancję w opracowywaniu metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez powiązanie zmian naczyniowych z mechanizmami neurozapalnymi za pomocą mierzalnych biomarkerów, takich jak VCAM-1 i JAM-B.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzowanym etapom sekcji, homogenizacji i filtracji, które minimalizują zmienność zależną od operatora.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wczesnych danych dotyczących odpowiedzi naczyniowej istotnych dla ludzi w modelach przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków skierowanych na OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o potencjał modulacji BBB oraz sygnały dotyczące bezpieczeństwa naczyniowo-nerwowego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu neuroanatomii i sekcji mikrosurgicalnej, aby zapewnić całkowite usunięcie opon mózgowo-rdzeniowych oraz splotów naczyniowych.
- Zależy od dostępu do rozdrabniaczy do tkanek, wirówek zdolnych do osiągnięcia 2,000–20,000 × G oraz probówek o niskim stopniu wiązania, aby zapobiec utracie mikronaczyń.
- Wymaga standaryzacji preparatów buforów MV-1, MV-2 i MV-3 pomiędzy laboratoriami w celu uzyskania spójnej wydajności i czystości mikronaczyń.
- Adaptacja metody dla różnych gatunków wymaga dostosowania objętości i czasu homogenizacji w zależności od gęstości i wielkości tkanki, zgodnie z opisem w protokole.
- Etap usuwania mieliny zwiększa złożoność techniczną; niepełne usunięcie może zanieczyścić preparaty i zakłócić późniejszą analizę białek.
