Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03^YEMK opartego na FRET

Opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego czujnika opartego na FRET ATeam1.03^YEMK w organotypowych kulturach warstwowych przodomózgowia myszy. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać ten czujnik do dynamicznego obrazowania komórkowych poziomów ATP w neuronach i astrocytach.

Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać czuły na ATP czujnik FRET ATeam 1.03 YEMK do dynamicznych pomiarów zmian neuronalnych i astrocytarnych poziomów ATP w organotypowo hodowanych wycinkach hipokampa myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że można badać metabolizm energetyczny w żywej tkance mózgowej w kontrolowanych warunkach, środowisku o wysokim poziomie ekspresji czujnika. Technika ta może pomóc w uzyskaniu wglądu w patomechanizmy, choroby leżące u podstaw lub uszkodzenia mózgu, na przykład spowodowane brakiem energii, takim jak udar niedokrwienny.

W zasadzie może być stosowany do badania poziomu ATP, nie tylko w tkance mózgowej, ale także w innych narządach. Aby pomyślnie przeprowadzić ten eksperyment, konieczne jest bardzo ostrożne wykonanie wszystkich etapów związanych z hodowlą tkanki i utrzymanie sterylności. Ponadto wymagana jest pewna wiedza na temat obrazowania fluorescencyjnego komórkowego.

Obchodzenie się z tkankami w najbardziej wyrafinowanym podejściu i wizualizacja są niezbędne do zrozumienia właściwych procedur. To samo dotyczy eksperymentów obrazowych. Procedurę zademonstrują Rodrigo Lerchundi, doktor habilitowany, oraz Na Huang, student studiów magisterskich z laboratorium.

Na lodowatej szalce Petriego wypełnionej ACSF umieść mózg na membranie filtrującej. Oddziel półkule i wykonaj cięcie przystrzałkowe pod kątem 45 stopni. Przymocuj jedną półkulę na etapie tkanki Vibratome za pomocą superglue i natychmiast przenieś blok tkankowy do kąpieli Vibratome zawierającej lodowaty ACSF z bąbelkami 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu.

Wyrównaj tkankę w kąpieli Vibratome. Trzymaj drugą półkulę w lodowatym ACSF do czasu pokrojenia. Dostosuj Vibratome, aby kroić plastry o grubości od 250 do 400 mikrometrów.

Po przecięciu plastra zidentyfikuj formację hipokampa na podstawie jej typowego wyglądu morfologicznego i wyizoluj ją za pomocą igieł podskórnych, utrzymując część kory mózgowej przylegającą do hipokampa. Umieść plasterek na siatce w ACSF, podgrzanej do 34 stopni Celsjusza i bąbelkującej 5% dwutlenkiem węgla i 95% tlenem, aż wszystkie plastry zostaną zebrane. Przenieś plastry do komory z przepływem laminarnym, aby kontynuować w sterylnych warunkach.

Za pomocą odwróconej, sterylnej, szklanej pipety Pasteura delikatnie przenieś plastry z ACSF na jedną z wstępnie podgrzanych szalek Petriego wypełnionych sterylnym roztworem soli Hanksa. Zmień pipetę i przenieś plastry do drugiej płytki hodowlanej. Powtórz ten proces pięć razy.

Przenieś jak najmniej HBSS na następujące płytki hodowlane. Za pomocą pipety delikatnie umieszczaj po jednym plasterku na wierzchu wkładki hodowlanej. Unikaj turbulencji w pipecie i poczekaj, aż plasterek opadnie na końcówkę pipety Pasteura.

Powtórz ten proces dla każdego plasterka. Umieść dwa plasterki na błonie. Ostrożnie usuń nadmiar roztworu Hank z górnej części wkładki za pomocą cienkiej końcówki.

Trzymaj kultury w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza do dnia eksperymentu. Wymieniaj pożywkę co dwa do trzech dni. Nie dotykając tkanki, nałóż 0,5 mikrolitra rozcieńczonego wektora bezpośrednio na wierzch każdego plasterka.

Na koniec umieść plastry z powrotem w inkubatorze i trzymaj je tam przez co najmniej sześć dni. Tuż przed rozpoczęciem eksperymentu przenieś wkładkę zawierającą plastry z kulturami bakterii do sterylnego kaptura i umieść ją w 30-milimetrowym naczyniu zawierającym jeden mililitr organotypowej pożywki do hodowli plastrów lub minimalnej pożywki niezbędnej. Umieść naczynie pod stereoskopem i skup się na powierzchni plasterka.

Użyj dwóch sterylnych igieł podskórnych, aby wykonać krótkie cięcie poprzeczne bezpośrednio na wąskich krawędziach wybranego plastra oraz w górnej warstwie, nie uszkadzając tkanki pod spodem. Aby wyjąć przygotowany plasterek z wkładki, przytrzymaj krawędzie membrany pęsetą i za pomocą sterylnego skalpela wykonaj proste, równoległe nacięcia na membranie, tworząc kwadrat lub trójkąt z plastrem pośrodku. Jeśli we wkładce znajdują się dodatkowe plastry, przenieś ją z powrotem na oryginalną płytkę i do inkubatora.

Napięcie powierzchniowe medium zapobiegnie jego wyciekaniu na powierzchnię membrany. Przygotować eksperymentalny ACSF i uzyskać pH 7,4 poprzez bulgotanie go 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla przez włożony rurkę podłączoną do źródła karbogenu przez co najmniej trzydzieści minut. Utrzymuj sól fizjologiczną w stanie bąbelkowym przez cały eksperyment.

Następnie włącz fluorescencyjne źródło światła monochromatycznego. Przenieść organotypową kulturę plastrów do komory doświadczalnej. Umieść siatkę na wierzchu organotypowej kultury plastrów ramką do dołu, nie dotykając kultury, a nitkami do góry, dotykając membrany.

Umieść komorę na stoliku mikroskopu i podłącz ją do systemu perfuzyjnego. Włącz pompę perystaltyczną przy natężeniu przepływu od 1,5 do 2,5 mililitra na minutę. Upewnij się, że system perfuzyjny nie jest nieszczelny.

Używając światła transmisyjnego, ustaw ostrość wyhodowany wycinek i zidentyfikuj obszar, w którym należy przeprowadzić eksperymenty. Przed rozpoczęciem eksperymentów obrazowych odczekaj co najmniej 15 minut, aby plastry przystosowały się do warunków zasolenia, a następnie włącz aparat i oprogramowanie do obrazowania. Wzbudz białko fluorescencyjne donora przy 435 nanometrach.

Ustaw czas ekspozycji w zakresie od 40 do 90 milisekund. Następnie włóż zwierciadło dichroiczne i filtry do rozdzielacza wiązki. Podziel emisję fluorescencji na 500 nanometrów za pomocą rozdzielacza obrazu emisyjnego i zastosuj filtry pasmowo-przepustowe przy 482 plus minus 16 i 542 plus lub minus 13,5 nanometra, aby dalej wyizolować fluorescencję donorową i akceptorową.

Wybierz obszar zainteresowania pozornie pozbawiony fluorescencji komórkowej do odejmowania tła. Zakreśl pojedyncze struktury oznakowanej tkanki na obrazie na ekranie, aby utworzyć ROI. Ustaw częstotliwość przechwytywania obrazu i całkowity czas nagrywania.

W przypadku eksperymentów trwających dłużej niż 30 minut zaleca się częstotliwość akwizycji od 0,2 do 0,5 Hz, aby zapobiec fototoksyczności. Następnie rozpocznij nagrywanie. Aby wywołać zmiany w wewnątrzkomórkowym ATP, należy przełączyć rurkę perfuzyjną ze standardowego ACSF na sól fizjologiczną zawierającą inhibitory przemiany materii, na przykład roztwór niedokrwienia chemicznego.

Alternatywnie użyj soli fizjologicznej o podwyższonym stężeniu potasu na poziomie ośmiu milimolowców, aby naśladować uwalnianie jonów potasu z aktywnych neuronów. Bezpośrednio po nagraniach należy wymienić eksperymentalny ACSF na ACSF buforowany hałdą. Następnie przenieść komorę rejestracyjną zawierającą kulturę plastrową do konfokalnego laserowego mikroskopu skanowego.

Wykonaj obrazy stosu Z w najwyższej możliwej rozdzielczości Z przy danej konfiguracji optycznej. W tym protokole, dziesięć dni po transdukcji, neurony wyrażające ATeam 1.03 YEMK znaleziono w dużej gęstości w korze nowej hodowanych wycinków tkanek na głębokości do 50 mikrometrów poniżej powierzchni warstwy. Porównywalne wyniki uzyskano w hipokampie.

W przypadku astrocytów ATeam 1.03 YEMK ulegał ekspresji pod kontrolą ludzkiego promotora fibrolowego białka fibrolowego gleju, a warstwki organotypowe wyrażające ATeam 1.03 YEMK w neuronach hipokampa wybrane ROI reprezentują somaty komórek piramidowych. Po wystawieniu wycinka na działanie 5-milimolowego azydku sodu przy braku zewnątrzkomórkowej glukozy przez jedną minutę, wywołano przeciwne zmiany w intensywności emisji pary FRET. Zaobserwowano również odwracalny spadek współczynnika ATeam FRET.

Długoterminowy stosunek ATeam FRET w 14 różnych komórkach w warunkach wyjściowych w neuronach i astrocytach pokazuje, że ATeam jest niezawodnym i stabilnym czujnikiem. Należy pamiętać, że niedokrwienie chemiczne spowodowało oczekiwany silny spadek współczynnika ATeam w obu typach komórek pod koniec tego eksperymentu. Wzrost zewnątrzkomórkowego stężenia potasu z trzech do ośmiu milimolów przez trzy minuty nie spowodował wykrywalnej zmiany w neuronach wyrażających ATeam 1,03 YEMK.

Natomiast astrocyty zareagowały na wzrost zewnątrzkomórkowego potasu odwracalnym wzrostem stosunku ATeam FRET, co wskazuje na wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu ATP. Ponownie, niedokrwienie chemiczne spowodowało natychmiastowy spadek współczynnika ATeam, co pokazuje, że czujnik może wykrywać zmiany w ATP. Próbując obrazować komórkowo na podstawie FRET, jak opisano tutaj, należy pamiętać, że produkcja wysokiej jakości plastrów w kulturach organotypowych jest kluczowym krokiem.

Ponadto wymagane jest staranne usunięcie blizny glejowej i obrazowanie na poziomie eksperckim. Zgodnie z tą procedurą, powinno być również możliwe przeprowadzenie eksperymentu z wykorzystaniem różnych innych nanoczujników opartych na FRET dla metabolitów komórkowych. Na przykład te dotyczące glukozy lub mleczanu.

Na koniec należy podkreślić, że zawsze należy przestrzegać odpowiednich aktów prawnych dotyczących ochrony zwierząt. Odnosi się to również do obowiązujących praw regulujących postępowanie z organizmami modyfikowanymi genetycznie.