Name: Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metodę obrazowania ATP w żywych wycinkach mózgu myszy przy użyciu czujnika FRET ATeam1.03 YEMK. Technika umożliwia dynamiczne pomiary poziomów ATP w neuronach i astrocytach, dostarczając wgląd w metabolizm energetyczny komórek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Claudii Roderigo i Simone Durry za fachową pomoc techniczną. Dziękujemy dr Niklasowi J. Gerkau i M.Sc. Joelowi Nelsonowi za pomoc w przygotowaniu organtypowych kultur plastrowych. Badania w laboratorium autora zostały sfinansowane przez Niemieckie Stowarzyszenie Badawcze (DFG; DLA 2795: Ro 2327/13-1 i SPP 1757: Ro 2327/8-2 do CRR; oraz SPP 1757: Finansowanie start-upu Young Glia dla RL).

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów. Autorzy otrzymali wsparcie finansowe umożliwiające publikację w otwartym dostępie od firmy Nikon Microscope Solutions z Düsseldorfu w Niemczech, która produkuje instrumenty wykorzystane w artykule wideo. Firma nie była zaangażowana ani w projektowanie prezentowanych tu eksperymentów, ani w ich wykonywanie, ani w przetwarzanie danych, ani w pisanie manuskryptów.

Tutaj demonstrujemy procedurę specyficznej dla typu komórki ekspresji ATeam1.03YEMK, opartego na FRET, genetycznie kodowanego nanoczujnika14, do pomiaru zmian poziomów ATP w astrocytach lub neuronach w organotypowych kulturach warstw tkanki mózgu myszy15. W przykładowych nagraniach pokazujemy, że wzrost stężenia potasu w zewnątrzkomórkach nie powoduje zmiany stężeń ATP w neuronach, podczas gdy poziomy astrocytarnego ATP rosną w odpowiedzi na tę manipulację. Co więcej, nasze wyniki pokazują, że po zahamowaniu metabolizmu komórkowego stosunek ATeam1.03YEMK FRET gwałtownie spada w obu typach komórek, co wskazuje na szybki spadek wewnątrzkomórkowego ATP.
Ekspresja ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach plastrów wymaga utrzymania tkanki w kulturze w kontrolowanych warunkach przez co najmniej 7-10 dni. Alternatywnie, ATeam1.03YEMK może być również stosowany do pomiaru ATP w ostro izolowanych wycinkach tkanki mózgowej oraz w nerwach wzrokowych myszy13,15. Pomiary w ostro izolowanej tkance wymagają jednak generacji transgenicznych zwierząt lub stereotaktycznego zastosowania wektorów wirusowych do mózgu, co wiąże się z eksperymentami na zwierzętach i ścisłymi protokołami opieki nad zwierzętami. W związku z tym ekspresja ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych tkanek stanowi użyteczną i cenną alternatywę 22,23. Od wielu lat organotypowe kultury warstwowe tkanek służą jako uznany system modelowy do badania właściwości neuronalnych, łączności i rozwoju 24,25,26. Nie tylko utrzymują one ogólną architekturę tkanek i laminację (ryc. 1), ale także posiadają preferencyjne właściwości kultur komórkowych, takie jak doskonała dostępność i bezpośrednia kontrola warunków eksperymentalnych. Organotypowe kultury warstw tkanek są również rutynowo wykorzystywane do ekspresji obcych genów za pomocą wektorów wirusowych27. Doniesiono, że kilka typów wektorów wirusowych dostarcza transgeny do tkanki mózgowej16,28. Wektory adenowirusowe indukują wysoką ekspresję w komórkach glejowych, ale nie w neuronach hipokampa16 i mogą generować reaktywność glejową17. Wektory wirusowe związane z adenowirusami, takie jak stosowane w tym artykule, pojawiają się jako dobra alternatywa15, a ich skuteczność wykazano również in vivo29.
Chociaż są one wykorzystywane głównie do badania właściwości neuronalnych, ostatnie badania wykazały, że organotypowe kultury warstw tkanek mogą być również wykorzystywane do analizy astrocytów. Wyhodowane wycinki są zwykle pokryte warstwą reaktywnych astrocytów19,30 (ryc. 5), ale astrocyty wykazują bardziej natywną, niereaktywną morfologię i cytoarchitekturę w głębszych warstwach19,30 (ryc. 5). W niniejszej pracy opisano procedurę mechanicznego usuwania zewnętrznej blizny glejowej, która skutkuje lepszą dostępnością doświadczalną i optyczną astrocytów natywnych w obrębie właściwych organotypowych warstw tkankowych. Co więcej, jego usunięcie poprawia skuteczność ekspresji w głębszych warstwach plastrów organotypowych; jeśli blizna glejowa nie zostanie usunięta, transdukcja przez AAV może być ograniczona do powierzchownych warstw komórek.
Podczas przeprowadzania eksperymentów na wycinkach tkanek należy wziąć pod uwagę kilka zewnętrznych czynników mechanicznych. Zmiana prędkości perfuzji w kąpieli może indukować ruchy całego preparatu i/lub wywoływać zmiany ostrości, powodując sztuczne przejściowe zmiany sygnału czujnika. Co więcej, doniesiono, że zarówno astrocyty, jak i neurony reagują na deformacje mechaniczne, takie jak narzucone przez wysokie szybkości perfuzji32,33. W naszych rękach zastosowanie niezawodnej pompy perystaltycznej wraz z utrzymywaniem małych i stabilnych objętości soli fizjologicznej między tkanką a obiektywem (łąkotką) skutkuje stabilnym sygnałem FRET w warunkach wyjściowych przy zastosowanej tutaj prędkości perfuzji (1,5-2,5 ml/min; Rysunek 8).
W niniejszym badaniu wykazaliśmy również, że obrazowanie oparte na FRET za pomocą ATeam1.03YEMK może być stosowane do monitorowania poziomów ATP w neuronach i astrocytach. Alternatywnym sposobem wprowadzonym wcześniej do pomiaru komórkowego ATP jest tzw. test lucyferyna-lucyferazy 34,35,36,37. Podejście to opiera się jednak na obrazowaniu bioluminescencji i zapewnia jedynie raczej niską rozdzielczość czasową i przestrzenną, częściowo ze względu na wysoki poziom szumów tła. Inną metodą rutynowo stosowaną w ostatnich latach było obrazowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia magnezu za pomocą wrażliwego na jony fluoroforu magnezu 38,39,40. Podejście to odnosi się do obserwacji, że spożycie ATP powoduje uwolnienie jego kofaktora magnezu. Obrazowanie z użyciem zieleni magnezowej zapewnia zatem jedynie wtórne oszacowanie zmian poziomów ATP. Co więcej, zieleń magnezowa jest również wrażliwa na zmiany wewnątrzkomórkowego wapnia, co wprowadza kolejną trudność przy interpretacji wyników uzyskanych tą metodą.
Niedawny rozwój genetycznie kodowanych nanoczujników do bezpośredniego obrazowania metabolitów komórkowych stanowił zatem duży krok naprzód11,12. Wygenerowano kilka różnych czujników, które można wykorzystać do pomiaru wewnątrzkomórkowego ATP 36,41,42,43. Należą do nich ratiometryczny fluorescencyjny wskaźnik ATP "QUEEN"41, a także PercevalHR, który wykrywa stosunek ATP:ADP42. O ile ta ostatnia sonda jest cennym narzędziem do badania stanu energetycznego komórek, o tyle wymaga jednoczesnego pomiaru zmian pH42.
ATeam to nanosensor, w którym istnieje kilka wariantów, które – między innymi – różnią się powinowactwem do wiązania ATP14. In vitro ATeam1.03YEMK wykazuje Kd 1,2 mM w temperaturze 37 °C, co jest zbliżone do komórkowych poziomów ATP określonych w różnych typach komórek neuronalnych, od podwzgórza i móżdżku34 do hipokampa 37,44,45. W pomiarach kuwetowych obniżenie temperatury o 10 °C spowodowało znaczny spadek powinowactwa wiązania ATeam1.03YEMK do ATP, co sugeruje, że może nie być idealny do obrazowania komórkowego w temperaturze pokojowej14. Nasze wcześniejsze badaniewykazało jednak, że zachowanie i odpowiedź ATeam1.03YEMK wyrażanego w neuronach i astrocytach na różne manipulacje jest podobna w temperaturze zbliżonej do fizjologicznej i pokojowej, co wskazuje, że czujnik umożliwia wiarygodne określenie wewnątrzkomórkowych poziomów ATP w obu warunkach. Ponadto nasze poprzednie eksperymenty dotyczyły wrażliwości na pH ATeam1.03YEMK wyrażanego w komórkach15, wykazując, że jest on niewrażliwy na zmiany wewnątrzkomórkowego pH o około 0,1-0,2 jednostki pH. Jeśli Kd w niskim zakresie mM jest problemem, można zastosować alternatywne warianty ATeam14, w tym warianty ATeam z przesunięciem ku czerwieni ("GO-ATeam")43.
Nasze eksperymenty z użyciem ATeam1.03YEMK pokazują, że wzrost zewnątrzkomórkowego stężenia potasu tylko o kilka mM (od 3 do 8 mM) powoduje przejściowy wzrost stosunku ATeam1,03YEMK w astrocytach w organotypowej kulturze warstwowej. Obserwacja ta potwierdza wcześniejsze badania15,46 i jednoznacznie wskazuje, że astrocyty reagują na uwalnianie potasu przez aktywne neurony wzrostem ich produkcji ATP, najprawdopodobniej w wyniku stymulacji odpowiednio Na+/K+-ATPazy i kotransportera Na+/HCO 3-47,48. W przeciwieństwie do tego, neurony nie wykazały odpowiedzi, co jest zgodne z wcześniejszymi pracami15. Oba typy komórek jednak szybko i silnie zareagowały na hamowanie glikolizy komórkowej i oddychanie mitochondrialne, jak wykazano powyżej15. W warunkach niedokrwienia chemicznego współczynniki ATeam FRET spadły do nowego stabilnego poziomu, co wskazuje na nominalne wyczerpanie komórkowego ATP. Ten ostatni wynik sugeruje, że zarówno neurony, jak i astrocyty wykazują odpowiednie zużycie ATP również w warunkach stanu stacjonarnego, bez dodatkowej stymulacji przez aktywację synaps lub zastosowanie neuroprzekaźników. Podsumowując, dochodzimy do wniosku, że obrazowanie oparte na fret za pomocą genetycznie kodowanych nanoczujników, w tym ATeam1.03YEMK, zapewni cenne podejście do wyjaśnienia procesów komórkowych, które są odpowiedzialne za zmiany wewnątrzkomórkowych poziomów ATP i komórkowego zużycia ATP w różnych warunkach.

Pobudzająca aktywność elektryczna neuronów opiera się głównie na przepływie kationów, takich jak sód (Na+) i potas (K+) przez ich błony plazmatyczne. Utrzymanie gradientów elektrochemicznych tych dwóch jonów jest zatem wymagane do sygnalizacji. Osiąga się to za pomocą komórkowej ATPazy Na+/K+ (NKA), wszechobecnej elektrogenicznej pompy transbłonowej, która wytłacza 3 Na+ z komórki w zamian za 2 K+ z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, wymagając zużycia jednej cząsteczki ATP na cykl transportowy1. Oprócz NKA istnieje kilka innych transporterów jonów zużywających ATP, w tym błona plazmatyczna Ca2 + -ATPaza, która jest niezbędna do wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca2 + i jej eksportu po napływie wywołanym aktywnością2. W pęcherzykach presynaptycznych wakuolarna H+-ATPaza (v-ATPaza) tworzy gradient protonów niezbędny do wychwytu neuroprzekaźnika do tego przedziału3.
Chociaż aktywność neuronów wymaga znacznej ilości ATP4, nie wykazują one znaczącej zdolności do magazynowania energii. Zamiast tego wydają się polegać na interakcjach metabolicznych z sąsiednimi astrocytami, głównymi magazynami glikogenu w mózgu5. Sugeruje się, że glikogen astrocytarny rzeczywiście odgrywa ważną rolę we wspieraniu potrzeb energetycznych neuronów; a kluczowym zjawiskiem w proponowanym sprzężeniu neurometabolicznym między tymi dwoma typami komórek jest zdolność astrocytów do zwiększania produkcji ATP w odpowiedzi na aktywność neuronalną6,7,8. Hipoteza ta, znana jako astrocyte-neuron lactatate shuttle (ANLS), jest nadal przedmiotem dyskusji, ponieważ inne prace dostarczyły dowodów na to, że neurony mogą również zwiększać swoje własne tempo glikolizy w odpowiedzi na stymulację9,10, co odzwierciedla konieczność dalszych metod i podejść do badania interakcji neuro-gleju.
Badanie metabolizmu energii komórkowej i poziomów ATP w neuronach i astrocytach w celu wyjaśnienia interakcji metabolicznych neuro-gleju było od dawna utrudnione przez brak odpowiednich sond do wykrywania zmian w stężeniach metabolitów w żywych komórkach w tkance mózgowej. Ostatnia dekada przyniosła jednak gwałtowny rozwój nowych narzędzi i nowych genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych dla różnych metabolitów, w tym czujników ATP, mleczanu, pirogronianu i innych11,12. Korzystając z tych narzędzi, możliwe jest teraz bezpośrednie odniesienie się do pytań związanych z konsumpcją ATP w komórkach i zmianami w poziomach energii komórkowej na poziomie pojedynczej komórki oraz w sposób specyficzny dla typu komórki w nienaruszonej tkance mózgowej13.
W niniejszej pracy opisujemy procedurę wizualizacji cytozolowej dynamiki ATP na neuronach i astrocytach hodowanych organotypowych wycinków mózgu. Pokazujemy, jak wykorzystać wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV) do specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego nanoczujnika ATP ATeam1.03YEMK (14) w neuronach i astrocytach wycinków mózgu myszy, które mogą być utrzymywane w hodowli komórkowej przez kilka tygodni15. Opisano procedurę usuwania blizny glejowej pokrywającej wycinki tkanki hodowlanej, która poprawia dostępność optyczną i obrazowanie komórek w warstwach tkanki organotypowej pod spodem. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób ATeam1.03YEMK może być wykorzystany do wykonywania obrazowania zmian w komórkowych poziomach ATP w tym preparacie na podstawie FRET. Główną zaletą tej metody jest to, że nie wymaga chirurgicznych zabiegów na mózgu, zapewnia wysoki poziom ekspresji czujnika i specyficzności typu komórki w hodowanych wycinkach mózgu, zmniejszając inwazyjność lub stres w komórkach w porównaniu z innymi metodami, takimi jak transfekcja przez elektroporację lub transdukcja z innymi wektorami wirusowymi10,16,17. Ponadto protokół ten może być stosowany do innych nanoczujników opartych na FRET, w tym wariantów ATeam1.03, które zapewniają niższe powinowactwo wiązania do ATP14.

<table><tbody><tr><td>2-deoksyglukoza</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07338</td><td>Niemetabolizowany analog glukozy</td></tr><tr><td>36-IMA-410-019 Laser argonowy</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>488 nm długość fali</td></tr><tr><td>argon Kwas askorbinowy</td><td>Carl Roth</td><td>3525.1</td><td>Przeciwutleniacz, witamina C</td></tr> filtry <tr><td>pasmowe 483/32</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>Filtry pasmowe kompatybilne z rozdzielaczem</td></tr><tr><td> 542/27</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>Filtr emmisyjny kompatybilny z rozdzielaczem</td></tr><tr><td>Beamsplitter T 455 LP</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>Wzbudzenie zwierciadło dichroiczne</td></tr><tr><td>Beamsplitter T 505 LPXR</td><td>AHF Analysentechnik AG</td><td></td><td>Splitter dichroiczny</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy C1</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Modułowy system mikroskopu konfokalnego C1</td></tr><tr><td>Przetwarzanie danych Origin Pro 9.0.0 (64-bit)</td><td>OriginLab corporation</td><td></td><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy danych</td></tr><tr><td>Monohydrat D-glukozy</td><td>Caelo</td><td>2580-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO/Life</td><td>14190250</td><td>Buforowany fosforanem sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>Eclipse E 600FN</td> firmy <td>Dulbecco Mikroskop pionowy Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse FN1 pionowy mikroskop</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora eksperymentalna</td> o <td>niestandardowej konstrukcji</td><td></td><td>Komora perfuzyjna do obrazowania żywych komórek</td></tr><tr><td>EZ-C1 Srebrna wersja 3.91</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania do mikroskopu konfokalnego</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td>z czerwienią fenolową do monitorowania pH</td></tr><tr><td>HERAcell 150</td><td>Inkubator</td><td>CO2 firmy Thermo Scientific HERAcell &reg; 150 z procedurą dekontaminacji</td>HERAsafe KS/KSP Szafa bezpieczeństwa Thermo Scientific Surowica dla koni GIBCO/Life 26050088 Inaktywowane termicznie oprogramowanie Huygens Professional SVI Imaging Deconvolution Obraz J 1.52i Wayne'a Rasbana <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Narodowy Instytut Zdrowia</td><td></td><td>Przetwarzanie obrazów Oprogramowanie dostępne w domenie publicznej</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>Insulina z trzustki bydlęcej</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna serii IP</td><td>Ismatec</td><td></td><td>Precyzyjna pompa wielokanałowa</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do układu, Illustrator CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>Edytor grafiki wektorowej</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO/Life</td><td></td><td></td>25030024</tr><tr><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Mikrotom wibracyjny. W międzyczasie firma Thermo scientific zaprzestała produkcji urządzenia. Każda inna krajalnica lub rozdrabniacz do tkanek, który można nadawać do krojenia żywej tkanki, również jest w porządku.</td></tr><tr><td>Niestandardowa konstrukcja</td><td></td><td></td> <td>stolika mikroskopu</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 16</td><td>Arkusz</td> kalkulacyjny Microsoft <td></td><td>do podstawowego przetwarzania danych</td></tr><tr><td>Wkładka do hodowli Millicell</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>Hydrofilizowany PTFE, wielkość porów 0,4 i mu; m</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7278</td><td>Syntetyczne podłoże do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Monochromator Polychrome V</td><td>Thermo Scientific/FEI</td><td></td><td>Ultra szybko przełączający monochromator</td></tr><tr><td>NaN3 (Azek sodu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>Inhibitor mitochondriów (inhibitor kompleksu IV). UWAGA: Azydek jest toksyczny. Należy pamiętać, aby przypadkowo go nie połknąć ani nie wdychać i zapobiec jego wchłanianiu przez skórę.</td></tr><tr><td>Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M &infin;/0 WD 2.0</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Mikroskop zanurzeniowy w wodzie Obiektyw</td></tr><tr><td>NIS Elements 4.50 zaawansowane badania</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania. Ulepszona wersja do obrazowania FRET</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>Cyfrowa kamera CMOS</td>Rurka <td></td></tr><tr><td>perfuzyjna</td><td>Pro Liquid GmbH</td><td></td><td>Rurka Tygon, 1,52 x 322 mm (szer.: 0,85)</td></tr><tr><td>Photoshop CS 6 wersja 13.0</td><td>Adobe</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>L-mleczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>ssAAV-2/2- hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)</td><td>ETH Z&uuml; bogaty</td><td>v244</td><td>Jednoniciowy wektor AAV, który indukuje ekspresję ATeam1.03YEMK pod kontrolą ludzkiego fragmentu promotora synapsyny 1 hSyn1.</td></tr><tr><td>ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)</td><td>ETH Z&uuml; bogaty</td><td>v307</td><td>Jednoniciowy wektor AAV, który indukuje ekspresję ATeam1.03YEMK pod kontrolą ludzkiego fragmentu promotora fibrylarnego białka glejowego ABC1D.</td></tr><tr><td>WVIEW System optyczny GEMINI</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Emission Image Splitter</td></tr></tbody></table>

obrazowanie wewnątrzkomórkowego atp w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ateam1.03yemk opartego na fret

Imaging of Intracellular ATP in Organotypic Tissue Slices of the Mouse Brain using the FRET-based Sensor ATeam1.03YEMK

Aktywność neuronalna w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) wywołuje wysokie zapotrzebowanie na energię komórkową dostarczaną przez rozkład adenozynotrójfosforanu (ATP). Duża część ATP jest potrzebna do reinstalacji gradientów jonów na błonach plazmatycznych zdegradowanych przez sygnalizację elektryczną neuronów. Istnieją dowody na to, że astrocyty - choć same nie generują szybkich sygnałów elektrycznych - ulegają zwiększonej produkcji ATP w odpowiedzi na aktywność neuronalną i wspierają aktywne neurony, dostarczając im metabolity energetyczne. Niedawny rozwój genetycznie kodowanych czujników dla różnych metabolitów umożliwia teraz badanie takich interakcji metabolicznych między neuronami a astrocytami. W tym miejscu opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji wrażliwego na ATP czujnika transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET-) ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych tkanki hipokampa i kory myszy przy użyciu wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (AAV). Ponadto pokazujemy, w jaki sposób ten czujnik może być wykorzystany do dynamicznego pomiaru zmian w komórkowych poziomach ATP w neuronach i astrocytach po wzroście zewnątrzkomórkowego potasu i po indukcji niedokrwienia chemicznego (tj. Zahamowaniu metabolizmu energii komórkowej).

Wektory AAV stanowią niezawodne narzędzie do selektywnej ekspresji obcych genów w komórkach w obrębie żywej tkanki16. Bezpośrednie zastosowanie AAV zawierających kasetę sekwencyjną ATeam1.03YEMK oraz specyficznego promotora prowadzi do wysokiej ekspresji sensora w wybranym typie komórek. W 14. dobie in vitro (DIV 14, ok. 10 dni po transdukcji), neurony wykazujące ekspresję ATeam pod kontrolą ludzkiego promotora synapsyny występują z wysoką gęstością w neokorze hodowanych skrawków tkanki na głębokości do 50 µm poniżej powierzchni skrawka (Rysunek 5A). Porównywalne wyniki można uzyskać w hipokampie (Rysunek 5B).
<img alt="Kultury neuronów korowych i hipokampalnych, mikroskopia fluorescencyjna, wizualizacja 3D rozmieszczenia komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig5a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wizualizacja neuronów wykazujących ekspresję ATeam1.03YEMK w hodowlach organotypowych skrawków mózgu w płaszczyźnie parasagitalnej. Obrazy po lewej stronie odpowiadają projekcjom o rozszerzonym obszarze ostrości z 43 przekrojów optycznych (1.05 µm każda) tkanki korowej (A) i (B) 70 przekrojów optycznych (0.6 µm (każdy) tkanki hipokampa. Obrazy po prawej stronie przedstawiają widok wolumetryczny tej samej projekcji. Komórki są oznaczone kolorami zgodnie z ich głębokością względem powierzchni skrawka, zgodnie ze skalą kolorów po prawej stronie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W celu pomiaru poziomów ATP w astrocytach, ATeam1.03YEMK jest ekspresowany pod kontrolą ludzkiego promotora kwaśnego białka włókienstwa glia (GFAP). Skutkuje to wydajną transdukcją komórek zarówno w neocortex, jak i w hipokampie hodowanych skrawków tkankowych (Rysunek 6). Warto zauważyć, że można wyróżnić dwa różne fenotypy morfologiczne, w zależności od głębokości względem powierzchni preparatów skrawków. W pierwszej, powierzchownej warstwie, komórki charakteryzują się grubymi wypustkami pierwotnymi, które są rozmieszczone głównie równolegle do powierzchni. Komórki te wykazują silnie nakładające się domeny, tworząc gęstą sieć pozornie reaktywnych astrocytów (Rysunek 6). W głębszych warstwach (30-60 µm od powierzchni), transdukowane astrocyty wykazują cienkie wypustki komórkowe tworzące w dużej mierze sferyczne domeny, a ich morfologia przypomina morfologię astrocytów in situ, jak opisano wcześniej19,20,21 (Rysunek 6). Aby uzyskać lepszą transdukcję astrocytów z głębszych warstw oraz lepszy dostęp optyczny do tych obszarów, można usunąć tkankę blizny glejowej zgodnie z opisem w Kroku 4.
<img alt="Warstwy astrocytów hipokampa w hodowli; mikroskopia fluorescencyjna; profilowanie głębokości z-stack." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig6a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wizualizacja astrocytów wykazujących ekspresję ATeam1.03YEMK w hodowanych organotypowych skrawkach mózgu w płaszczyźnie parasagitalnej. Obraz po lewej stronie odpowiada projekcji z rozszerzoną głębią ostrości, obejmującej 191 przekrojów optycznych (0.45 µm (każdy). W celach ilustracyjnych blizna glejowa została wykluczona z projekcji astrocytów. Obrazy po prawej stronie przedstawiają widok objętościowy tej samej projekcji przed i po usunięciu blizny glejowej. Komórki są oznaczone kolorami zgodnie z ich głębokością względem powierzchni skrawka, zgodnie ze skalami kolorów po prawej stronie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
Pomyślna ekspresja ATeam1.03YEMK umożliwia dynamiczny pomiar zmian poziomów ATP w neuronach lub astrocytach, w zależności od zastosowanego promotora (patrz wyżej). Eksperymenty przeprowadzono w kąpieli eksperymentalnej stale perfundowanej E-ACSF (napowietrzanym mieszanką 95% O2/5% CO2). W organotypowych skrawkach wykazujących ekspresję ATeam1.03YEMK w neuronach hipokampa, przed rozpoczęciem rejestracji wybrano obszary zainteresowania (ROIs), reprezentujące somata komórek piramidalnych (Ryc. 7A). Ponadto wybrano obszar do odejmowania tła (Ryc. 7A). Następnie rejestrowano emisję fluorescencji Venus oraz eCFP oddzielnie dla każdego z tych ROI, przedstawiając ją jako poziom emisji fluorescencji w czasie (Ryc. 7B). Po rejestracji fluorescencji w warunkach kontrolnych przez kilka minut w celu zapewnienia stabilnej linii bazowej, metabolizm komórkowy zahamowano poprzez wystawienie preparatu skrawka na sól fizjologiczną bez glukozy, do której dodano 5 mM azotku sodu (NaN3) na jedną minutę (Ryc. 7B). Manipulacja ta wywoła przeciwstawne zmiany w intensywności emisji pary FRET (Ryc. 7B, panele lewe), polegające na spadku emisji Venus (527 nm) i wzroście emisji eCFP (475 nm). Obliczenie stosunku FRET poprzez podzielenie emisji fluorescencji Venus przez emisję eCFP (FVenus/FeCFP) pozwoliło uzyskać sygnały odzwierciedlające względne zmiany wewnątrzkomórkowych poziomach ATP, tzw. „stosunek FRET ATeam” (Ryc. 7B, panel prawy). we wszystkich rejestrowanych neuronach (n = 70 komórek w N = 5 skrawkach) NaN3 spowodował odwracalny spadek stosunku FRET ATeam, co wskazuje na odwracalny spadek wewnątrzkomórkowych poziomów ATP po zahamowaniu metabolizmu komórkowego.
<img alt="Obrazowanie stosunku fluorescencji; analiza FRET neuronów hipokampa obszaru CA1; wykres odpowiedzi fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig7a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rycina 7: Demonstracja obrazowania czasu rzeczywistego stosunku FRET dla ATeam. (A) Górny lewy róg: obraz fluorescencyjny w szerokim polu warstwy piramidowej i stratum radiatum obszaru CA1 hodowanej organotypowej skrawka hipokampa wykazującego ekspresję ATeam1.03YEMK w neuronach. Górny prawy róg: Powiększony widok zaznaczonego ramką obszaru wskazanego po lewej stronie. Białe linie wyznaczają obszary zainteresowania (ROI) 1-3 reprezentujące ciała komórek neuronów piramidowych obszaru CA1 wybranych do analizy w (B). BG oznacza obszar zainteresowania (ROI) wybrany do korekcji tła. Na dole: obrazy w pseudokolorach przedstawiające emisję fluorescencji Venus (zielony), eCFP (fioletowy) oraz stosunek Venus/eCFP. (B) Rejestracja time-lapse w obszarach ROI 1-3, reprezentujących ciała neuronów (patrz A). Ślady po lewej stronie przedstawiają znormalizowaną emisję fluorescencji Venus (zielona) i eCFP (magenta). Ślady po prawej stronie przedstawiają odpowiadający im stosunek FRET dla ATeam. Należy zauważyć, że perfuzja 5 mM NaN3 brak glukozy poza komórką przez 1 minutę (szary słupek) indukuje odwracalny spadek stosunku FRET dla ATeam, co wskazuje na obniżenie wewnątrzkomórkowej koncentracji ATP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig7alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Aby zapewnić stabilność preparatu i czujnika w długoterminowych warunkach eksperymentalnych, skrawki z ekspresją ATeam w neuronach lub astrocytach były poddawane ciągłej perfuzji ACSF przez dłuższe okresy (&gt;50 min; n = 12 komórek na próbę, N = 3 OTC z 3 mózgów). W tych warunkach stosunek FRET dla ATeam nie uległ zmianie (Rysunek 8). Poddanie preparatów działaniu CIS zawierającego inhibitory metaboliczne („ Niedokrwienie chemiczne”, patrz Tabela 1), z kolei, ponownie doprowadziły do oczekiwanego spadku stosunku FRET dla ATeam, co zaobserwowano powyżej.
<img alt="Odpowiedź neuronalna i astrocytarna na niedokrwienie chemiczne na wykresie stosunku FRET; analiza czasu względem stosunku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig8a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Eksperymenty bazowe z wykorzystaniem ATeam. Obrazowanie stosunku FRET dla ATeam w długim okresie w 14 różnych komórkach w warunkach bazowych w neuronach (góra) i astrocytach (dół). Dane zostały zebrane w warunkach porównywalnych z innymi danymi eksperymentalnymi. Pod koniec każdego pomiaru wywołano niedokrwienie chemiczne poprzez perfuzję CIS, co zaznaczono strzałką. UWAGA: Bazowe stosunki FRET ATeam są stabilne w czasie w warunkach bazowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Następnie przeanalizowano reakcje neuronów i astrocytów wykazujących ekspresję ATeam1.03YEMK na wzrost stężenia potasu pozakomórkowego. Po ustaleniu stabilnej linii bazowej neurony przepłukiwano roztworem soli fizjologicznej, w którym stężenie potasu zwiększono z 3 do 8 mM przez 3 minuty (Rysunek 9A). Manipulacja ta nie doprowadziła jednak do wykrywalnej zmiany stosunku FRET ATeam (n = 56 komórek w N = 5 skrawkach). Aby upewnić się, że czujnik reaguje na zmianę poziomu ATP, skrawki poddano ponownie długotrwałej niedokrwienności chemicznej wywołanej poprzez zastąpienie E-ACSF przez CIS. Niedokrwienność chemiczna spowodowała szybki spadek stosunku FRET ATeam do nowego, stabilnego poziomu, co wskazywało na nominalne wyczerpanie ATP po 2-3 min (Rysunek 9A).
<img alt="Analiza FRET w neuronach i astrocytach; stosunki i odpowiedź na niedokrwienie chemiczne, mikroskopia, wyniki graficzne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60294/60294fig9a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 9"> 
Rysunek 9: Reprezentatywne eksperymenty ilustrujące zmiany poziomu ATP w neuronach i astrocytach. (A,B): Obrazy po lewej stronie przedstawiają fluorescencję ATeam z neuronów i astrocytów zlokalizowanych w obszarze CA1 hipokampa w skrawkach organotypowych. Wykresy po prawej stronie przedstawiają zapisy czasowe stosunku FRET ATeam uzyskane z ROI (obszaru zainteresowania) umieszczonego nad pojedynczym ciałem komórki. W obu eksperymentach skrawki poddano najpierw zwiększeniu stężenia potasu pozakomórkowego przez 3 minuty (patrz. pasek), a następnie końcowej ekspozycji na niedokrwienie chemiczne. Należy zauważyć, że podczas gdy neurony nie reagują na podwyższenie poziomu potasu pozakomórkowego (A), astrocyty reagują zwiększeniem poziomu ATP (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60294/60294fig9large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Ten sam protokół eksperymentalny przeprowadzono na skrawkach, w których w astrocytach wykazano ekspresję ATeam1.03YEMK. W przeciwieństwie do obserwacji w neuronach, astrocyty zareagowały na wzrost stężenia potasu zewnątrzkomórkowego odwracalnym wzrostem stosunku FRET dla ATeam, co wskazuje na wzrost poziomu wewnątrzkomórkowego ATP (n = 70 komórek w N = 5 skrawkach) (Rysunek 9B). Następna ekspozycja na niedokrwienie chemiczne spowodowała, zgodnie z oczekiwaniami, znaczny spadek stosunku FRET dla ATeam, co świadczy o nominalnym wyczerpaniu wewnątrzkomórkowego ATP (Rysunek 9B).

Opisujemy protokół specyficznej dla typu komórki ekspresji genetycznie kodowanego czujnika opartego na FRET ATeam1.03YEMK w organotypowych kulturach warstwowych przodomózgowia myszy. Ponadto pokazujemy, jak wykorzystać ten czujnik do dynamicznego obrazowania komórkowych poziomów ATP w neuronach i astrocytach.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET

Neuronal activity in the central nervous system (CNS) evokes a high demand on cellular energy provided by the breakdown of adenosine triphosphate (ATP). A ...

Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać czuły na ATP czujnik FRET ATeam 1.03 YEMK do dynamicznych pomiarów zmian neuronalnych i astrocytarnych poziomów ATP w organotypowo hodowanych wycinkach hipokampa myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że można badać metabolizm energetyczny w żywej tkance mózgowej w kontrolowanych warunkach, środowisku o wysokim poziomie ekspresji czujnika. Technika ta może pomóc w uzyskaniu wglądu w patomechanizmy, choroby leżące u podstaw lub uszkodzenia mózgu, na przykład spowodowane brakiem energii, takim jak udar niedokrwienny.W zasadzie może być stosowany do badania poziomu ATP, nie tylko w tkance mózgowej, ale także w innych narządach. Aby pomyślnie przeprowadzić ten eksperyment, konieczne jest bardzo ostrożne wykonanie wszystkich etapów związanych z hodowlą tkanki i utrzymanie sterylności. Ponadto wymagana jest pewna wiedza na temat obrazowania fluorescencyjnego komórkowego.Obchodzenie się z tkankami w najbardziej wyrafinowanym podejściu i wizualizacja są niezbędne do zrozumienia właściwych procedur. To samo dotyczy eksperymentów obrazowych. Procedurę zademonstrują Rodrigo Lerchundi, doktor habilitowany, oraz Na Huang, student studiów magisterskich z laboratorium.Na lodowatej szalce Petriego wypełnionej ACSF umieść mózg na membranie filtrującej. Oddziel półkule i wykonaj cięcie przystrzałkowe pod kątem 45 stopni. Przymocuj jedną półkulę na etapie tkanki Vibratome za pomocą superglue i natychmiast przenieś blok tkankowy do kąpieli Vibratome zawierającej lodowaty ACSF z bąbelkami 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu.Wyrównaj tkankę w kąpieli Vibratome. Trzymaj drugą półkulę w lodowatym ACSF do czasu pokrojenia. Dostosuj Vibratome, aby kroić plastry o grubości od 250 do 400 mikrometrów.Po przecięciu plastra zidentyfikuj formację hipokampa na podstawie jej typowego wyglądu morfologicznego i wyizoluj ją za pomocą igieł podskórnych, utrzymując część kory mózgowej przylegającą do hipokampa. Umieść plasterek na siatce w ACSF, podgrzanej do 34 stopni Celsjusza i bąbelkującej 5% dwutlenkiem węgla i 95% tlenem, aż wszystkie plastry zostaną zebrane. Przenieś plastry do komory z przepływem laminarnym, aby kontynuować w sterylnych warunkach.Za pomocą odwróconej, sterylnej, szklanej pipety Pasteura delikatnie przenieś plastry z ACSF na jedną z wstępnie podgrzanych szalek Petriego wypełnionych sterylnym roztworem soli Hanksa. Zmień pipetę i przenieś plastry do drugiej płytki hodowlanej. Powtórz ten proces pięć razy.Przenieś jak najmniej HBSS na następujące płytki hodowlane. Za pomocą pipety delikatnie umieszczaj po jednym plasterku na wierzchu wkładki hodowlanej. Unikaj turbulencji w pipecie i poczekaj, aż plasterek opadnie na końcówkę pipety Pasteura.Powtórz ten proces dla każdego plasterka. Umieść dwa plasterki na błonie. Ostrożnie usuń nadmiar roztworu Hank z górnej części wkładki za pomocą cienkiej końcówki.Trzymaj kultury w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza do dnia eksperymentu. Wymieniaj pożywkę co dwa do trzech dni. Nie dotykając tkanki, nałóż 0,5 mikrolitra rozcieńczonego wektora bezpośrednio na wierzch każdego plasterka.Na koniec umieść plastry z powrotem w inkubatorze i trzymaj je tam przez co najmniej sześć dni. Tuż przed rozpoczęciem eksperymentu przenieś wkładkę zawierającą plastry z kulturami bakterii do sterylnego kaptura i umieść ją w 30-milimetrowym naczyniu zawierającym jeden mililitr organotypowej pożywki do hodowli plastrów lub minimalnej pożywki niezbędnej. Umieść naczynie pod stereoskopem i skup się na powierzchni plasterka.Użyj dwóch sterylnych igieł podskórnych, aby wykonać krótkie cięcie poprzeczne bezpośrednio na wąskich krawędziach wybranego plastra oraz w górnej warstwie, nie uszkadzając tkanki pod spodem. Aby wyjąć przygotowany plasterek z wkładki, przytrzymaj krawędzie membrany pęsetą i za pomocą sterylnego skalpela wykonaj proste, równoległe nacięcia na membranie, tworząc kwadrat lub trójkąt z plastrem pośrodku. Jeśli we wkładce znajdują się dodatkowe plastry, przenieś ją z powrotem na oryginalną płytkę i do inkubatora.Napięcie powierzchniowe medium zapobiegnie jego wyciekaniu na powierzchnię membrany. Przygotować eksperymentalny ACSF i uzyskać pH 7,4 poprzez bulgotanie go 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla przez włożony rurkę podłączoną do źródła karbogenu przez co najmniej trzydzieści minut. Utrzymuj sól fizjologiczną w stanie bąbelkowym przez cały eksperyment.Następnie włącz fluorescencyjne źródło światła monochromatycznego. Przenieść organotypową kulturę plastrów do komory doświadczalnej. Umieść siatkę na wierzchu organotypowej kultury plastrów ramką do dołu, nie dotykając kultury, a nitkami do góry, dotykając membrany.Umieść komorę na stoliku mikroskopu i podłącz ją do systemu perfuzyjnego. Włącz pompę perystaltyczną przy natężeniu przepływu od 1,5 do 2,5 mililitra na minutę. Upewnij się, że system perfuzyjny nie jest nieszczelny.Używając światła transmisyjnego, ustaw ostrość wyhodowany wycinek i zidentyfikuj obszar, w którym należy przeprowadzić eksperymenty. Przed rozpoczęciem eksperymentów obrazowych odczekaj co najmniej 15 minut, aby plastry przystosowały się do warunków zasolenia, a następnie włącz aparat i oprogramowanie do obrazowania. Wzbudz białko fluorescencyjne donora przy 435 nanometrach.Ustaw czas ekspozycji w zakresie od 40 do 90 milisekund. Następnie włóż zwierciadło dichroiczne i filtry do rozdzielacza wiązki. Podziel emisję fluorescencji na 500 nanometrów za pomocą rozdzielacza obrazu emisyjnego i zastosuj filtry pasmowo-przepustowe przy 482 plus minus 16 i 542 plus lub minus 13,5 nanometra, aby dalej wyizolować fluorescencję donorową i akceptorową.Wybierz obszar zainteresowania pozornie pozbawiony fluorescencji komórkowej do odejmowania tła. Zakreśl pojedyncze struktury oznakowanej tkanki na obrazie na ekranie, aby utworzyć ROI. Ustaw częstotliwość przechwytywania obrazu i całkowity czas nagrywania.W przypadku eksperymentów trwających dłużej niż 30 minut zaleca się częstotliwość akwizycji od 0,2 do 0,5 Hz, aby zapobiec fototoksyczności. Następnie rozpocznij nagrywanie. Aby wywołać zmiany w wewnątrzkomórkowym ATP, należy przełączyć rurkę perfuzyjną ze standardowego ACSF na sól fizjologiczną zawierającą inhibitory przemiany materii, na przykład roztwór niedokrwienia chemicznego.Alternatywnie użyj soli fizjologicznej o podwyższonym stężeniu potasu na poziomie ośmiu milimolowców, aby naśladować uwalnianie jonów potasu z aktywnych neuronów. Bezpośrednio po nagraniach należy wymienić eksperymentalny ACSF na ACSF buforowany hałdą. Następnie przenieść komorę rejestracyjną zawierającą kulturę plastrową do konfokalnego laserowego mikroskopu skanowego.Wykonaj obrazy stosu Z w najwyższej możliwej rozdzielczości Z przy danej konfiguracji optycznej. W tym protokole, dziesięć dni po transdukcji, neurony wyrażające ATeam 1.03 YEMK znaleziono w dużej gęstości w korze nowej hodowanych wycinków tkanek na głębokości do 50 mikrometrów poniżej powierzchni warstwy. Porównywalne wyniki uzyskano w hipokampie.W przypadku astrocytów ATeam 1.03 YEMK ulegał ekspresji pod kontrolą ludzkiego promotora fibrolowego białka fibrolowego gleju, a warstwki organotypowe wyrażające ATeam 1.03 YEMK w neuronach hipokampa wybrane ROI reprezentują somaty komórek piramidowych. Po wystawieniu wycinka na działanie 5-milimolowego azydku sodu przy braku zewnątrzkomórkowej glukozy przez jedną minutę, wywołano przeciwne zmiany w intensywności emisji pary FRET. Zaobserwowano również odwracalny spadek współczynnika ATeam FRET.Długoterminowy stosunek ATeam FRET w 14 różnych komórkach w warunkach wyjściowych w neuronach i astrocytach pokazuje, że ATeam jest niezawodnym i stabilnym czujnikiem. Należy pamiętać, że niedokrwienie chemiczne spowodowało oczekiwany silny spadek współczynnika ATeam w obu typach komórek pod koniec tego eksperymentu. Wzrost zewnątrzkomórkowego stężenia potasu z trzech do ośmiu milimolów przez trzy minuty nie spowodował wykrywalnej zmiany w neuronach wyrażających ATeam 1,03 YEMK.Natomiast astrocyty zareagowały na wzrost zewnątrzkomórkowego potasu odwracalnym wzrostem stosunku ATeam FRET, co wskazuje na wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu ATP. Ponownie, niedokrwienie chemiczne spowodowało natychmiastowy spadek współczynnika ATeam, co pokazuje, że czujnik może wykrywać zmiany w ATP. Próbując obrazować komórkowo na podstawie FRET, jak opisano tutaj, należy pamiętać, że produkcja wysokiej jakości plastrów w kulturach organotypowych jest kluczowym krokiem.Ponadto wymagane jest staranne usunięcie blizny glejowej i obrazowanie na poziomie eksperckim. Zgodnie z tą procedurą, powinno być również możliwe przeprowadzenie eksperymentu z wykorzystaniem różnych innych nanoczujników opartych na FRET dla metabolitów komórkowych. Na przykład te dotyczące glukozy lub mleczanu.Na koniec należy podkreślić, że zawsze należy przestrzegać odpowiednich aktów prawnych dotyczących ochrony zwierząt. Odnosi się to również do obowiązujących praw regulujących postępowanie z organizmami modyfikowanymi genetycznie.

imaging-intracellular-atp-organotypic-tissue-slices-mouse-brain-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nowa metoda optycznego pomiaru neurotransmisji z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów dopaminy.

Wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą FFN

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

Źródło: Kennedy, L. H., et. al. Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu myszy. Plaster umieszcza się w komorze kąpielowej z ciągłą cyrkulacją płynu i kontrolowaną temperaturą. Po ustawieniu różnych parametrów mikroskopu konfokalnego wykonywane są obrazy...

Obrazowanie konfokalne ruchu mitochondriów w oligodendrocytach w organotypowych kulturach wycinków mózgu

Źródło: Lerchundi, R., et. al. Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje wykorzystanie czujników opartych na FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów ATP w organotypowych wycinkach hipokampa myszy, umożliwiając wizualizację dynamiki ATP w neuronach i astrocytach w czasie rzeczywistym w warunkach fizjologicznych i...

Obrazowanie wewnątrzkomórkowej dynamiki ATP za pomocą czujników opartych na FRET w organotypowym wycinku hipokampa myszy

Konfokalna mikroskopia skaningowa jest stosowana do obrazowania pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych w perfundowanych mięśniach serca lub szkieletowych u żywych zwierząt. Monitorowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych procesów mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego, umożliwia ocenę funkcji mitochondriów w fizjologicznie istotnym kontekście i podczas patologicznych perturbacji.

Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.

Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Poznaj metodę obrazowania ATP w żywych wycinkach mózgu myszy przy użyciu czujnika FRET ATeam1.03 YEMK. Technika umożliwia dynamiczne pomiary poziomów ATP w neuronach i astrocytach, dostarczając wgląd w metabolizm energetyczny komórek nerwowych.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03^YEMK opartego na FRET

Przeglądaj więcej filmów