Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów
3 czerwca 2020
Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program dawstwa mózgu i właściwą charakterystykę mózgów. Dawcy mózgu biorą udział w długoterminowym badaniu podłużnym, w tym w seryjnych ocenach wielowymiarowych. Protokół zawiera szczegółowy opis przetwarzania przez mózg i dokładną metodologię diagnostyczną.
Ponieważ częstość występowania zaburzeń neurokognitywnych stale rośnie, naszym celem jest uzyskanie, scharakteryzowanie i przechowywanie wysokiej jakości próbek tkanki mózgowej, aby uzyskać dokładną diagnozę i rzucić światło na mechanizmy neurodegeneracyjne. Biorąc pod uwagę asymetrię mózgu, nasza metodologia próbkowania pozwala na przeprowadzenie wszystkich metabadań na dobrze zdefiniowanych histologicznie tkankach z obu półkul, a wiele danych można zebrać i skorelować za pomocą głębokiego uczenia. Często obserwuje się addytywny wpływ na uszkodzenie mózgu przez wiele patologii.
Ostateczne rozpoznanie wymaga połączenia zespołu klinicznego z objawami neuropatologicznymi w celu poznania patogenezy choroby i możliwych terapii. Świeże procedury cięcia, a także zarządzanie sekcjami makro są trudne, ale są również niezbędne do osiągnięcia dobrych wyników. Wyszkolony i zgrany zespół jest niezbędny do pokonania tych trudności.
Nasz protokół zawiera szereg kroków, które są wymagane od ssaków, dlatego demonstracja wizualna może być bardziej przydatna niż teksty opisowe dla badacza chcącego opanować te techniki. Po potwierdzeniu tanatografii za pomocą ostrego skalpela wykonaj nacięcie skóry głowy przez skórę włosa i tkankę podskórną na płytce czołowej od czubka wyrostka sutkowatego po jednej stronie do drugiej, przechodząc przez wierzchołek. Ostrożnie oddziel dwa fałdy skóry głowy od czaszki i kontynuuj nacięcie, aż żółty tłuszcz super oczodołowy stanie się widoczny.
Odbij skórę głowy do przodu i pociągnij drugą część tkanki do tyłu. Za pomocą skalpela i kleszczy zbierz małą próbkę mięśnia skroniowego po każdej stronie czaszki, umieszczając jedną próbkę w 4% formaldehydzie, a drugą próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą piły elektrycznej przeciąć czaszkę w kształcie litery V po przedniej stronie i usunąć jarmułkę.
Po przecięciu opon mózgowych zbierz jeden kawałek opony twardej do utrwalenia, a drugi do zamrożenia. Włóż igłę o rozmiarze 20 i rozmiarze 3,5 cala przymocowaną do 10-mililitrowej strzykawki przez ciało modzelowate, aby dotrzeć do trzeciej komory i cofnąć tłok, aby uzyskać około 10 mililitrów płynu mózgowo-rdzeniowego. Oceń wygląd, kolor i zmętnienie płynu oraz zmierz pH.
Delikatnie pociągnij za oba płaty czołowe, aby podnieść mózg i przeciąć oba nerwy wzrokowe, tętnice szyjne wewnętrzne oraz trzeci, czwarty, piąty i szósty nerw czaszkowy. Przeciąć tentorium, aby dotrzeć do tylnego dołu i przeciąć tętnice kręgowe i dolne nerwy czaszkowe. Następnie wbij skalpel jak najgłębiej w otwór wielki, aby przeciąć najbardziej ogonową część meduli i ostrożnie usunąć cały mózg.
Użyj skalpela, aby ukazać się do kości nad jaskinią Meckla i zbierz ganglion Gassera z każdej strony w celu utrwalenia i zamrożenia. Użyj młotka chirurgicznego i dłuta, aby złamać kostny sella turcica i usunąć przysadkę mózgową w celu utrwalenia w 4% formaldehydzie. Sprawdź czaszkę i cały mózg pod kątem zmian makroskopowych i zmian naczyniowych.
Użyj taśmy mierniczej, aby zmierzyć średnicę poprzecznej i przedniej postawy mózgu i zważyć mózg na wadze. Ostrożnie odzyskaj krąg Willisa w celu makroskopowej oceny pod kątem obecności wariantów anatomicznych, zmian chorobowych lub zwężenia naczynia. Oddziel i sprawdź mózg, móżdżek i pień mózgu przed indywidualnym zważeniem tkanek.
Usunąć jeden do dwóch, dwóch do czterech centymetrów kwadratowych kawałków opon mózgowo-rdzeniowych z wypukłości i zachować próbki w kompletnej pożywce hodowlanej DMEM o wysokiej zawartości glukozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz szyszynkę do utrwalenia w 4% formaldehydzie i usuń opuszki węchowe i nerwy wzrokowe w celu utrwalenia i zamrożenia jednej z każdej pary. Umieść mózg, móżdżek i pień mózgu na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Kiedy wszystkie interesujące nas tkanki zostaną pobrane, użyj super adhezyjnego kleju, aby ponownie przymocować kość i użyj igły chirurgicznej oraz niewchłanialnych szwów, aby zszyć skórę głowy. Do wypreparowania banku mózgu użyj noża preparacyjnego, aby przeciąć pień mózgu osiowo i wykonaj pierwsze cięcie na poziomie śródmózgowia rostralnego przez wzgórek górny, aby uzyskać dwa plasterki, aby odsłonić istotę czarną. Pokrój pień mózgu na 10, ośmiomilimetrowe plasterki, uważając, aby uwzględnić nacięcia przechodzące przez most rostralny w pobliżu górnych brzegów czwartej komory, aby obserwować miejsce sinawe i przez rdzeń przedłużony poniżej prążka akustycznego, tuż nad dolnym wierzchołkiem czwartej komory, aby uzyskać plasterki zawierające grzbietowe jądro ruchowe błędnika.
Oznacz wszystkie plasterki w sposób rostralny ogonowy jako BS dla pnia mózgu, a następnie cyfry arabskie. Po ostatnim wycięciu pnia mózgu użyj oznaczenia SC dla rdzenia kręgowego, a następnie cyfr arabskich. Przetnij móżdżek na płaszczyźnie strzałkowej, aby oddzielić dwie półkule móżdżku na poziomie robaka i wykonaj cięcie strzałkowe, aby uzyskać pięć plasterków z każdej półkuli.
Nazwij wszystkie plasterki z robaka jako CBR lub CBL odpowiednio dla prawego i lewego móżdżku i użyj cyfr arabskich do identyfikacji każdej sekcji. Następnie oddziel dwie półkule mózgu przez ciało modzelowate na płaszczyźnie strzałkowej, a następnie przetnij półkulę pojedynczo wzdłuż płaszczyzny koronalnej przechodzącej między skrzyżowaniem wzrokowym a ciałami sutkowymi przez płat czołowy, biegun skroniowy, przedni zakręt obręczy, spoidło przednie, jądro mniejsze i zwoje podstawy. Wykonaj drugie cięcie około jednego centymetra z tyłu, przechodząc przez ciała sutkowe i odsłaniając zwoje podstawy, przednie wzgórze, podwzgórze i ciało migdałowate.
Kontynuuj krojenie, aby wyciąć przednie i tylne obszary, aż uzyskasz od 15 do 21 centymetrowych plasterków na każdą półkulę. Umieść plasterek na płaskiej powierzchni, tak jak są osiągane zgodnie z ich pierwotnym położeniem w przednim lub tylnym kierunku od bieguna czołowego do potylicznego, z częścią ciągłą z poprzednimi slajdami skierowanymi do góry. Po umieszczeniu wszystkich plastrów należy wybrać główne sekcje, które mają zostać utrwalone do badania histopatologicznego, w tym wcześniej nabyte skrawki oraz skrawki hipokampa, ciemieniowego i potylicznego, i oznaczyć je jako L lub R, a następnie cyframi arabskimi, w tym etykietą wskazującą, czy plaster ma być utrwalony, czy zamrożony.
Po podziale i oznaczeniu wszystkich tkanek należy uzyskać obraz dla każdej serii odcinków przed ich utrwaleniem lub zamrożeniem. Aby zamrozić próbki, umieść zarezerwowane alternatywne skrawki tkanek na wstępnie zamrożonej aluminiowej tacce i przykryj skrawki blokującą płytką aluminiową, aby utrzymać je płasko. Następnie zamroź plastry w ciekłym azocie przez trzy minuty przed umieszczeniem zamrożonych próbek w plastikowej torbie oznaczonej odpowiednimi kodami identyfikacyjnymi i numerami plastrów do przechowywania w odpowiednim pudełku kriogenicznym w temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Aby utrwalić próbki, umieść zarezerwowane alternatywne skrawki tkanek w pojedynczych kawałkach gazy i umieść plastry w 10% buforowanym roztworze formaliny fosforanowej na pięć dni w chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza. 24 z 27 pobranych mózgów otrzymało pełną charakterystykę neuropatologiczną z określoną kliniczną diagnozą patologiczną. Wstępna ilościowa analiza elektroencefalogramu serii 36 dawców mózgu wskazuje, że główny odsetek rytmu alfa jest znacznie niższy w głównych zaburzeniach neuropoznawczych niż w normalnych łagodnych zaburzeniach neuropoznawczych w podeszłym wieku.
Tutaj pokazano przykład patologii asymetrycznej z atrofią prawej strony widoczną makroskopowo z ciężkimi poszerzeniami komór obserwowanymi w prawym odcinku koronalnym w porównaniu z lewym. W innym przypadku widoczny jest zawał prawej półkuli, podczas gdy w innym egzemplarzu widoczny jest wyraźny zanik prawego ciała sutkowego. Makroskrawki można barwić w celu zidentyfikowania utraty mieliny lub rozkładu immunoreaktywności w półkulach.
Próbki te pochodzą od bliźniąt, u których choroba Alzheimera wystąpiła klinicznie w różnych ramach czasowych ze względu na czynniki epigenetyczne i środowiskowe. Niemniej jednak analiza mikroskopowa ujawniła bardzo podobny obraz neuropatologiczny wskazujący na wysoki poziom patologii choroby Alzheimera i angiopatii amyloidowej. Jednak u tych dwóch pacjentów to samo rozpoznanie kliniczne choroby Alzheimera nie odpowiadało dokładnie cechom neuropatologicznym, które ujawniły duet otępienia o różnej etiologii.
Rzeczywiście, pierwszy przypadek przedstawiał ciała Lewy'ego w zakręcie pojedyncze kłamstwo i istotę czarną. Drugi przypadek pokazał ciała Lewy'ego związane z neurytami Lewy'ego w ciele migdałowatym i w jądrze mniejszym. Fotografia plastrów jest starannie wykonana w celu dokładnej identyfikacji obszarów anatomicznych podczas analizy mikroskopowej.
Utrwalanie i zamrażanie pojedynczych plastrów jest również ważne dla zachowania mikrostruktury tkanki, omiki, topografii aktywacji genów i dystrybucji białek oraz korelacji tych danych z histopatologią. Hodowle komórkowe z dobrze scharakteryzowanych tkanek, a także badanie patogenezy choroby. Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej, ponieważ nabyta tkanka mózgowa jest uważana za potencjalnie zakaźną, a także dlatego, że wymagane jest użycie niebezpiecznych narzędzi, takich jak ostre narzędzia i ciekły azot.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu w ramach programu donacji mózgów, koncentrując się na prawidłowej charakterystyce tkanki mózgowej. Opisano w nim kompleksową metodologię przetwarzania i diagnostyki w celu uzyskania wysokiej jakości próbek tkankowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mechanizmy neurodegeneracyjne
- Starzenie się mózgu
Wprowadzenie
- Rosnąca rozpowszechnienie zaburzeń neur poznawczych sprawia, że wysokiej jakości tkanka mózgowa jest niezbędna do postawienia dokładnej diagnozy.
- Badania podłużne wykorzystują wielowymiarowe oceny w celu uzyskania kompleksowego zrozumienia zjawisk.
- Metodyka pobierania próbek uwzględnia asymetrię mózgu, co jest kluczowe dla efektywności metaanaliz.
- Wykwalifikowany zespół jest niezbędny do przeprowadzenia złożonych procesów sekcji mózgu.
Cel badania
- Charakteryzacja i przechowywanie tkanki mózgowej w celu diagnozowania chorób neurodegeneracyjnych.
- Badanie patogenezy chorób oraz potencjalnych terapii poprzez kompleksową analizę.
- Ustanowienie solidnej metodologii pobierania i konserwacji tkanki mózgowej.
Zastosowane metody
- Protokół obejmuje szczegółowe techniki obróbki i konserwacji mózgu.
- Obejmuje on staranną dyssekcję różnych obszarów mózgu oraz pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego.
- Metodyka kładzie nacisk na wykorzystanie przeszkolonego zespołu w celu zapewnienia precyzji wymaganej przy zadaniach związanych z obróbką mózgu.
- Sugeruje się wykorzystanie demonstracji wizualnych w celu usprawnienia opanowania technik przez badaczy.
Główne wyniki
- Szczegółowa metodologia umożliwia spójne i wysokojakościowe pobieranie próbek mózgu w przypadku różnych patologii.
- Protokół ułatwia lepsze zrozumienie zmian anatomicznych i patologicznych w mózgu.
- Podkreślono znaczenie integracji zespołów klinicznych i znalezisk neuropatologicznych dla postawienia ostatecznej diagnozy.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia efektywny protokół charakterystyki tkanki mózgowej, który może usprawnić diagnostykę oraz badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Podkreśla ono znaczenie precyzyjnych technik pobierania próbek dla przyszłych badań nad starzeniem się mózgu.
- Wyniki te mają istotne znaczenie dla zrozumienia zdrowia mózgu oraz potencjalnych interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół wspiera walidację celów terapeutycznych w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi, umożliwiając pobieranie histologicznie dobrze zdefiniowanych próbek tkanek z obu półkul, co ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez korelację danych omicznych i patomorfologicznych. Zwiększa on pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, dostarczając zweryfikowanych neuropatologicznie próbek ludzkiego mózgu powiązanych z podłużnymi danymi klinicznymi i dotyczącymi stylu życia. Podejście to wzmacnia ciągłość translacyjną poprzez integrację fenotypowania przedśmiertnego z neuropatologią pośmiertną, co redukuje niepewność biologiczną przy wyborze celów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośrednie porównanie tkanki mrożonej i utrwalonej z przeciwległych półkul w celu dopasowania danych omicznych i histologicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez dostarczenie tkanki potwierdzonej neuropatologicznie w celu walidacji zaangażowania celu i modulacji szlaków.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez powiązanie zespołu klinicznego z ostateczną diagnozą neuropatologiczną, co redukuje liczbę błędnych założeń dotyczących celów terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie dobrze scharakteryzowanej tkanki mózgowej do opracowania testów biomarkerów z wykorzystaniem obszarów zdefiniowanych histologicznie z obu półkul.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie standaryzacji testów poprzez powtarzalne przetwarzanie tkanek oraz parowanie próbek utrwalonych i mrożonych w celu walidacji międzyplatformowej.
- Wartość strategiczna: Zwiększenie gotowości do badań przesiewowych poprzez dostarczenie zakwalifikowanej ludzkiej tkanki do kaskad przesiewowych opartych na celach molekularnych i fenotypowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia modelowanie systemów istotnych dla przebiegu choroby poprzez dostarczenie ludzkich tkanek z dopasowanymi profilami klinicznymi i neuropatologicznymi do walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Wspiera ciągłość badań przedklinicznych, umożliwiając prowadzenie badań omicznych na tkankach zwalidowanych histologicznie, co poprawia translacyjność biomarkerów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju projektów z uwzględnieniem ryzyka dzięki redukcji ryzyka mechanistycznego w oparciu o patologiczne i molekularne dane pochodzące od ludzi.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, dostarczając zwalidowaną tkankę ludzkiego mózgu do etapów identyfikacji celu, opracowywania testów oraz walidacji przedklinicznej, szczególnie w programach dotyczących chorób neurodegeneracyjnych wymagających potwierdzenia patologicznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy molekularnej histologicznie zdefiniowanych obszarów mózgu powiązanych z fenotypami klinicznymi.
- Przesiewanie: Zwiększa gotowość do przeprowadzania testów dzięki standaryzowanej konserwacji tkanek oraz podłużnym danym dawców, co zapewnia odtwarzalność pomiarów biomarkerów.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty neuropatologiczne i omiczne, które umożliwiają porównania między różnymi stanami chorobowymi oraz priorytetyzację celów terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez dostarczanie ludzkich tkanek z potwierdzoną patologią, co poprawia modelowanie predykcyjne modulacji celów.
- Wykorzystanie przedsiębiorstwa: Ustanawia wielokrotnego użytku potok charakteryzacji tkanek do podłużnych badań nad procesami neurodegeneracyjnymi w ramach wielu programów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki zastosowaniu weryfikowanej neuropatologicznie tkanki ludzkiej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność poprzez sparowane przetwarzanie utrwalone/zamrożone oraz szczegółowe protokoły etykietowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając potwierdzenia patologicznego w celu zmniejszenia ryzyka związanego z celami terapeutycznymi przed inwestycjami przedklinicznymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez integrację danych klinicznych, dotyczących stylu życia oraz neuropatologicznych w celu walidacji celów.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga wiedzy z zakresu neuroanatomii, neuropatologii oraz aseptycznego obchodzenia się z tkankami w celu prawidłowej dyssekcji i konserwacji.
- Zależność od instrumentarium, w tym skalpeli, pił, pęset, przechowywania kriogenicznego i systemów utrwalania w formalinie.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej między koordynatorami klinicznymi, neuropatologami a biologami molekularnymi w celu spójnego gromadzenia danych.
- Uwzględnienie konieczności adaptacji do różnych obszarów mózgu i patologii ze względu na asymetryczny rozkład choroby.
- Ograniczenia wynikające z geograficznej dostępności dawców oraz dużego zapotrzebowania na zasoby w przypadku podłużnej oceny klinicznej i opracowania neuropatologicznego.
