Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów
June 3rd, 2020
Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program dawstwa mózgu i właściwą charakterystykę mózgów. Dawcy mózgu biorą udział w długoterminowym badaniu podłużnym, w tym w seryjnych ocenach wielowymiarowych. Protokół zawiera szczegółowy opis przetwarzania przez mózg i dokładną metodologię diagnostyczną.
Ponieważ częstość występowania zaburzeń neurokognitywnych stale rośnie, naszym celem jest uzyskanie, scharakteryzowanie i przechowywanie wysokiej jakości próbek tkanki mózgowej, aby uzyskać dokładną diagnozę i rzucić światło na mechanizmy neurodegeneracyjne. Biorąc pod uwagę asymetrię mózgu, nasza metodologia próbkowania pozwala na przeprowadzenie wszystkich metabadań na dobrze zdefiniowanych histologicznie tkankach z obu półkul, a wiele danych można zebrać i skorelować za pomocą głębokiego uczenia. Często obserwuje się addytywny wpływ na uszkodzenie mózgu przez wiele patologii.
Ostateczne rozpoznanie wymaga połączenia zespołu klinicznego z objawami neuropatologicznymi w celu poznania patogenezy choroby i możliwych terapii. Świeże procedury cięcia, a także zarządzanie sekcjami makro są trudne, ale są również niezbędne do osiągnięcia dobrych wyników. Wyszkolony i zgrany zespół jest niezbędny do pokonania tych trudności.
Nasz protokół zawiera szereg kroków, które są wymagane od ssaków, dlatego demonstracja wizualna może być bardziej przydatna niż teksty opisowe dla badacza chcącego opanować te techniki. Po potwierdzeniu tanatografii za pomocą ostrego skalpela wykonaj nacięcie skóry głowy przez skórę włosa i tkankę podskórną na płytce czołowej od czubka wyrostka sutkowatego po jednej stronie do drugiej, przechodząc przez wierzchołek. Ostrożnie oddziel dwa fałdy skóry głowy od czaszki i kontynuuj nacięcie, aż żółty tłuszcz super oczodołowy stanie się widoczny.
Odbij skórę głowy do przodu i pociągnij drugą część tkanki do tyłu. Za pomocą skalpela i kleszczy zbierz małą próbkę mięśnia skroniowego po każdej stronie czaszki, umieszczając jedną próbkę w 4% formaldehydzie, a drugą próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą piły elektrycznej przeciąć czaszkę w kształcie litery V po przedniej stronie i usunąć jarmułkę.
Po przecięciu opon mózgowych zbierz jeden kawałek opony twardej do utrwalenia, a drugi do zamrożenia. Włóż igłę o rozmiarze 20 i rozmiarze 3,5 cala przymocowaną do 10-mililitrowej strzykawki przez ciało modzelowate, aby dotrzeć do trzeciej komory i cofnąć tłok, aby uzyskać około 10 mililitrów płynu mózgowo-rdzeniowego. Oceń wygląd, kolor i zmętnienie płynu oraz zmierz pH.
Delikatnie pociągnij za oba płaty czołowe, aby podnieść mózg i przeciąć oba nerwy wzrokowe, tętnice szyjne wewnętrzne oraz trzeci, czwarty, piąty i szósty nerw czaszkowy. Przeciąć tentorium, aby dotrzeć do tylnego dołu i przeciąć tętnice kręgowe i dolne nerwy czaszkowe. Następnie wbij skalpel jak najgłębiej w otwór wielki, aby przeciąć najbardziej ogonową część meduli i ostrożnie usunąć cały mózg.
Użyj skalpela, aby ukazać się do kości nad jaskinią Meckla i zbierz ganglion Gassera z każdej strony w celu utrwalenia i zamrożenia. Użyj młotka chirurgicznego i dłuta, aby złamać kostny sella turcica i usunąć przysadkę mózgową w celu utrwalenia w 4% formaldehydzie. Sprawdź czaszkę i cały mózg pod kątem zmian makroskopowych i zmian naczyniowych.
Użyj taśmy mierniczej, aby zmierzyć średnicę poprzecznej i przedniej postawy mózgu i zważyć mózg na wadze. Ostrożnie odzyskaj krąg Willisa w celu makroskopowej oceny pod kątem obecności wariantów anatomicznych, zmian chorobowych lub zwężenia naczynia. Oddziel i sprawdź mózg, móżdżek i pień mózgu przed indywidualnym zważeniem tkanek.
Usunąć jeden do dwóch, dwóch do czterech centymetrów kwadratowych kawałków opon mózgowo-rdzeniowych z wypukłości i zachować próbki w kompletnej pożywce hodowlanej DMEM o wysokiej zawartości glukozy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz szyszynkę do utrwalenia w 4% formaldehydzie i usuń opuszki węchowe i nerwy wzrokowe w celu utrwalenia i zamrożenia jednej z każdej pary. Umieść mózg, móżdżek i pień mózgu na lodzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Kiedy wszystkie interesujące nas tkanki zostaną pobrane, użyj super adhezyjnego kleju, aby ponownie przymocować kość i użyj igły chirurgicznej oraz niewchłanialnych szwów, aby zszyć skórę głowy. Do wypreparowania banku mózgu użyj noża preparacyjnego, aby przeciąć pień mózgu osiowo i wykonaj pierwsze cięcie na poziomie śródmózgowia rostralnego przez wzgórek górny, aby uzyskać dwa plasterki, aby odsłonić istotę czarną. Pokrój pień mózgu na 10, ośmiomilimetrowe plasterki, uważając, aby uwzględnić nacięcia przechodzące przez most rostralny w pobliżu górnych brzegów czwartej komory, aby obserwować miejsce sinawe i przez rdzeń przedłużony poniżej prążka akustycznego, tuż nad dolnym wierzchołkiem czwartej komory, aby uzyskać plasterki zawierające grzbietowe jądro ruchowe błędnika.
Oznacz wszystkie plasterki w sposób rostralny ogonowy jako BS dla pnia mózgu, a następnie cyfry arabskie. Po ostatnim wycięciu pnia mózgu użyj oznaczenia SC dla rdzenia kręgowego, a następnie cyfr arabskich. Przetnij móżdżek na płaszczyźnie strzałkowej, aby oddzielić dwie półkule móżdżku na poziomie robaka i wykonaj cięcie strzałkowe, aby uzyskać pięć plasterków z każdej półkuli.
Nazwij wszystkie plasterki z robaka jako CBR lub CBL odpowiednio dla prawego i lewego móżdżku i użyj cyfr arabskich do identyfikacji każdej sekcji. Następnie oddziel dwie półkule mózgu przez ciało modzelowate na płaszczyźnie strzałkowej, a następnie przetnij półkulę pojedynczo wzdłuż płaszczyzny koronalnej przechodzącej między skrzyżowaniem wzrokowym a ciałami sutkowymi przez płat czołowy, biegun skroniowy, przedni zakręt obręczy, spoidło przednie, jądro mniejsze i zwoje podstawy. Wykonaj drugie cięcie około jednego centymetra z tyłu, przechodząc przez ciała sutkowe i odsłaniając zwoje podstawy, przednie wzgórze, podwzgórze i ciało migdałowate.
Kontynuuj krojenie, aby wyciąć przednie i tylne obszary, aż uzyskasz od 15 do 21 centymetrowych plasterków na każdą półkulę. Umieść plasterek na płaskiej powierzchni, tak jak są osiągane zgodnie z ich pierwotnym położeniem w przednim lub tylnym kierunku od bieguna czołowego do potylicznego, z częścią ciągłą z poprzednimi slajdami skierowanymi do góry. Po umieszczeniu wszystkich plastrów należy wybrać główne sekcje, które mają zostać utrwalone do badania histopatologicznego, w tym wcześniej nabyte skrawki oraz skrawki hipokampa, ciemieniowego i potylicznego, i oznaczyć je jako L lub R, a następnie cyframi arabskimi, w tym etykietą wskazującą, czy plaster ma być utrwalony, czy zamrożony.
Po podziale i oznaczeniu wszystkich tkanek należy uzyskać obraz dla każdej serii odcinków przed ich utrwaleniem lub zamrożeniem. Aby zamrozić próbki, umieść zarezerwowane alternatywne skrawki tkanek na wstępnie zamrożonej aluminiowej tacce i przykryj skrawki blokującą płytką aluminiową, aby utrzymać je płasko. Następnie zamroź plastry w ciekłym azocie przez trzy minuty przed umieszczeniem zamrożonych próbek w plastikowej torbie oznaczonej odpowiednimi kodami identyfikacyjnymi i numerami plastrów do przechowywania w odpowiednim pudełku kriogenicznym w temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Aby utrwalić próbki, umieść zarezerwowane alternatywne skrawki tkanek w pojedynczych kawałkach gazy i umieść plastry w 10% buforowanym roztworze formaliny fosforanowej na pięć dni w chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza. 24 z 27 pobranych mózgów otrzymało pełną charakterystykę neuropatologiczną z określoną kliniczną diagnozą patologiczną. Wstępna ilościowa analiza elektroencefalogramu serii 36 dawców mózgu wskazuje, że główny odsetek rytmu alfa jest znacznie niższy w głównych zaburzeniach neuropoznawczych niż w normalnych łagodnych zaburzeniach neuropoznawczych w podeszłym wieku.
Tutaj pokazano przykład patologii asymetrycznej z atrofią prawej strony widoczną makroskopowo z ciężkimi poszerzeniami komór obserwowanymi w prawym odcinku koronalnym w porównaniu z lewym. W innym przypadku widoczny jest zawał prawej półkuli, podczas gdy w innym egzemplarzu widoczny jest wyraźny zanik prawego ciała sutkowego. Makroskrawki można barwić w celu zidentyfikowania utraty mieliny lub rozkładu immunoreaktywności w półkulach.
Próbki te pochodzą od bliźniąt, u których choroba Alzheimera wystąpiła klinicznie w różnych ramach czasowych ze względu na czynniki epigenetyczne i środowiskowe. Niemniej jednak analiza mikroskopowa ujawniła bardzo podobny obraz neuropatologiczny wskazujący na wysoki poziom patologii choroby Alzheimera i angiopatii amyloidowej. Jednak u tych dwóch pacjentów to samo rozpoznanie kliniczne choroby Alzheimera nie odpowiadało dokładnie cechom neuropatologicznym, które ujawniły duet otępienia o różnej etiologii.
Rzeczywiście, pierwszy przypadek przedstawiał ciała Lewy'ego w zakręcie pojedyncze kłamstwo i istotę czarną. Drugi przypadek pokazał ciała Lewy'ego związane z neurytami Lewy'ego w ciele migdałowatym i w jądrze mniejszym. Fotografia plastrów jest starannie wykonana w celu dokładnej identyfikacji obszarów anatomicznych podczas analizy mikroskopowej.
Utrwalanie i zamrażanie pojedynczych plastrów jest również ważne dla zachowania mikrostruktury tkanki, omiki, topografii aktywacji genów i dystrybucji białek oraz korelacji tych danych z histopatologią. Hodowle komórkowe z dobrze scharakteryzowanych tkanek, a także badanie patogenezy choroby. Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej, ponieważ nabyta tkanka mózgowa jest uważana za potencjalnie zakaźną, a także dlatego, że wymagane jest użycie niebezpiecznych narzędzi, takich jak ostre narzędzia i ciekły azot.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program darowizn mózgu, koncentrując się na właściwym charakteryzowaniu tkanki mózgowej. Opisuje ono kompleksową metodykę przetwarzania i diagnostyki w celu uzyskania wysokiej jakości próbek tkanki.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Mechanizmy neurodegeneracji
- Starzenie się mózgu
Tło
- Wzrost zapadalności na zaburzenia neuropoznawcze wymaga wysokiej jakości tkanki mózgowej dla dokładnej diagnozy.
- Badania longitudinalne wykorzystują wielowymiarowe oceny dla kompleksowego zrozumienia.
- Metodologia pobierania próbek uwzględnia rozważania dotyczące asymetrii mózgu dla efektywnych meta-badań.
- Wyszkolony zespół jest niezbędny do zarządzania złożonymi procesami sekcjonowania mózgu.
Cel badania
- Charakteryzowanie i przechowywanie tkanki mózgowej dla diagnozowania chorób neurodegeneracyjnych.
- Zbadanie patogenezy chorób i potencjalnych terapii poprzez kompleksową analizę.
- Ustanowienie solidnej metodologii pobierania i przechowywania tkanki mózgowej.
Stosowane metody
- Protokół obejmuje szczegółowe techniki przetwarzania i przechowywania mózgu.
- Zawiera staranne sekcjonowanie różnych obszarów mózgu i pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego.
- Metodologia podkreśla znaczenie wyszkolonego zespołu dla precyzji wymaganej w zadaniach przetwarzania mózgu.
- Sugerowane są wizualne demonstracje, aby poprawić opanowanie techniki wśród badaczy.
Główne wyniki
- Szczegółowa metodologia umożliwia konsekwentne i wysokiej jakości pobieranie próbek mózgu w różnych patologiach.
- Protokół ułatwia lepsze zrozumienie anatomicznych i patologicznych zmian w mózgu.
- Podkreśla się integrację zespołów klinicznych i wyników neuropatologicznych dla ostatecznej diagnozy.
Wnioski
- To badanie pokazuje skuteczny protokół charakteryzacji tkanki mózgowej, który może poprawić diagnozę i badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Podkreśla znaczenie precyzyjnych technik pobierania dla przyszłych badań nad starzeniem się mózgu.
- Wyniki mają znaczące implikacje dla zrozumienia zdrowia mózgu i potencjalnych interwencji terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol supports target validation in neurodegenerative disease research by enabling histologically well-defined tissue collection from both hemispheres, facilitating mechanistic de-risking through correlated omics and pathology data. It enhances predictive confidence in preclinical models by providing neuropathologically verified human brain samples linked to longitudinal clinical and lifestyle data. The approach strengthens translational continuity by integrating ante-mortem phenotyping with post-mortem neuropathology, reducing biological uncertainty in target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct comparison of frozen and fixed tissue from contralateral hemispheres for omics and histology alignment.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing neuropathologically confirmed tissue to validate target engagement and pathway modulation.
- Strategic Value: Improves target confidence by linking clinical syndrome with definitive neuropathological diagnosis, reducing false-positive target assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares well-characterized brain tissue for biomarker assay development using histologically defined regions from both hemispheres.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible tissue processing and fixed/frozen pairing for cross-platform validation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by supplying qualified human tissue for target-based and phenotypic screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by providing human tissue with matched clinical and neuropathological profiles for target validation.
- Operational Value: Supports preclinical continuity by allowing omics studies on histologically validated tissue, improving biomarker translatability.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking using human-derived pathological and molecular data.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated human brain tissue for target identification, assay development, and preclinical validation stages, particularly in neurodegenerative programs requiring pathological confirmation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling molecular analysis of histologically defined brain regions linked to clinical phenotypes.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized tissue preservation and longitudinal donor data for reproducible biomarker measurement.
- Analytics: Generates quantitative neuropathological and omics readouts that enable cross-condition comparison and target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation by providing human tissue with verified pathology, improving predictive modeling of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue characterization pipeline for longitudinal neurodegenerative studies across multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through neuropathologically verified human tissue.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via paired fixed/frozen processing and detailed labeling protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing pathological confirmation to de-risk targets before preclinical investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by integrating clinical, lifestyle, and neuropathological data for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, neuropathology, and aseptic tissue handling for proper dissection and preservation.
- Depends on instrumentation including scalpels, saws, forceps, cryogenic storage, and formalin fixation systems.
- Necessitates cross-team standardization between clinical coordinators, neuropathologists, and molecular biologists for consistent data collection.
- Involves adaptation considerations for different brain regions and pathologies due to asymmetric disease distribution.
- Limited by geographic donor availability and resource intensity of longitudinal clinical assessment and neuropathological processing.
