Name: Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę generowania mutantów delecji genów u Pseudomonas aeruginosa i testowania tłumienia wirulencji w mysim modelu infekcji. Protokół zapewnia niezawodną reprodukowalność badań nad patogennością bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) R44GM113545 i P20GM103434.

<ol><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa%3A+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li>
<li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li>
<li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li>
<li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).</li>
<li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+%28sigmaE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li>
<li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli%3A+Current+Scenario+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li>
<li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58(2013).</li>
<li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17(2009).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li>
<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li>
<li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li>
<li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells%3A+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li>
<li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209(2010).</li>
<li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria%3A+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li>
<li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li>
<li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li>
<li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+and+prospects+of+microbial+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li>
</ol>

Autor Hongwei D. Yu jest dyrektorem naukowym i współzałożycielem Progenesis Technologies, LLC.

Plazmid pEX100T-Not1 jest skutecznym mediatorem sekwencyjnych delecji genomowych, które są wolne od markerów i znajdują się w ramce. Podczas inżynierii szczepów bakteryjnych w celu osłabienia zjadliwości, delecja całych sekwencji genów zamiast generowania mutacji punktowych zmniejsza prawdopodobieństwo powrotu do zjadliwego fenotypu. Dodatkowo, każda delecja genu chorobotwórczości dodatkowo osłabia patogen, wzmacniając stabilność atenuacji.
Metoda ta może być również stosowana do generowania m...

Pseudomonas aeruginosa to oportunistyczny patogen bakteryjny, który może powodować choroby zagrażające życiu u ludzi, zwłaszcza u osób z obniżoną odpornością. Chorobotwórczość P. aeruginosa wynika z ekspresji wielu czynników wirulencji, w tym proteaz i lipopolisacharydu, a także z jego zdolności do tworzenia ochronnego biofilmu1. Ze względu na jego zdolność do wytwarzania czynników wirulencji i wywoływania chorób u ludzi, stosowanie P. aeruginosa do wytwarzania produktów komercyjnych stwarza obawy dotyczące bezpieczeństwa. Niepatogenne szczepy E. coli są tradycyjnie wykorzystywane do bioinżynierii produktów medycznych i komercyjnych przeznaczonych do stosowania u ludzi. Jednak niektóre produkty są trudne do wytworzenia przez E. coli, a wiele z nich jest pakowanych w korpusy inkluzyjne, co sprawia, że ekstrakcja jest pracochłonna. Zmodyfikowane szczepy bakteryjne zdolne do wytwarzania i wydzielania określonych produktów są wysoce pożądane, ponieważ wydzielanie prawdopodobnie zwiększyłoby wydajność i ułatwiło procesy oczyszczania. Tak więc niepatogenne szczepy innych gatunków bakterii (np. Gatunki, które wykorzystują więcej ścieżek wydzielania) mogą stanowić użyteczną alternatywę dla E. coli. Niedawno informowaliśmy o rozwoju szczepu P. aeruginosa, PGN5, w którym patogenność i toksyczność organizmu jest wysoce osłabiona2. Co ważne, szczep ten nadal wytwarza duże ilości alginianu polisacharydów, interesującego z handlowego punktu widzenia składnika biofilmu P. aeruginosa.
Szczep PGN5 został wygenerowany przy użyciu dwuetapowej procedury wymiany allelicznej z plazmidem pEX100T-NotI w celu sekwencyjnego usunięcia pięciu genów (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA), o których wiadomo, że przyczyniają się do patogeniczności organizmu. pEX100T-NotI został wygenerowany przez zmianę SmaI na miejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego NotI w obrębie miejsca wielokrotnego klonowania plazmidu pEX100T, który został opracowany w lab3,4. Miejscem rozpoznania enzymu restrykcyjnego NotI jest rzadsza sekwencja DNA w porównaniu z SmaI i mniej prawdopodobne jest, że będzie obecna w klonowanych sekwencjach, dlatego jest wygodniejsza do celów klonowania. Plazmid zawiera geny, które pozwalają na selekcję, w tym gen bla, który koduje ß-laktamazę i nadaje odporność na karbenicylinę, oraz gen B. subtilissacB, który nadaje wrażliwość na sacharozę (ryc. 1A). Plazmid ma również początek replikacji (ori) zgodny z E. coli oraz początek transferu (oriT), który pozwala na transfer plazmidu z E. coli do gatunków Pseudomonas poprzez koniugację. Jednak plazmid nie ma początku replikacji zgodnego z Pseudomonas, a zatem nie może się replikować w obrębie gatunku Pseudomonas (tj. jest wektorem samobójczym Pseudomonas). Te cechy sprawiają, że pEX100T-NotI idealnie nadaje się do celowania w delecje genetyczne z chromosomu Pseudomonas. Etapy klonowania plazmidu przeprowadza się przy użyciu E. coli, a powstały plazmid jest przenoszony do Pseudomonas przez transformację lub koniugację. Następnie, poprzez homologiczne zdarzenia rekombinacji i selektywne etapy, generowana jest ukierunkowana delecja w ramce, wolna od markerów. Ta metoda sekwencyjnego usuwania regionów genomowych z chromosomu P. aeruginosa może być wykorzystana do generowania wysoce atenuowanych szczepów Pseudomonas, takich jak PGN5, lub do projektowania szczepów do innych specyficznych zastosowań (np. szczepów z niedoborem endonukleaz do namnażania plazmidu lub szczepów z niedoborem proteaz do produkcji białek będących przedmiotem zainteresowania).
Ogólna zjadliwość szczepów bakterii zależy od warunków i faz wzrostu, podczas których mutacje występują często. Dlatego pomiar bezpieczeństwa genetycznie modyfikowanych szczepów może być wyzwaniem. Aby ocenić izolaty bakteryjne pod kątem zjadliwości ogólnoustrojowej, dostosowaliśmy wcześniej opublikowany protokół infekcji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie myszy C57BL / 6 5. Zmodyfikowaliśmy tę procedurę, aby użyć zamrożonych wywarów bakteryjnych do wstrzykiwań, co pozwoliło na precyzyjne dozowanie i łatwą walidację użytych szczepów. W tym modelu szczep E. coli BL21, który został zatwierdzony przez FDA do produkcji biofarmaceutyków, został wykorzystany jako standard bezpieczeństwa kontroli do określenia względnej patogenezy szczepu6,7,8. Główną zaletą stosowania tej metody jest to, że jest ona powtarzalna i minimalizuje źródła zmienności, ponieważ infekujące szczepy są walidowane pod kątem liczby komórek bakteryjnych, fenotypu i markerów genetycznych zarówno przed, jak i po zakażeniu. Dzięki tym kontrolowanym krokom zmniejsza się liczba wymaganych zwierząt. W tym modelu szczepy P. aeruginosa, które powodują śmiertelność myszy C57BL/6 równą lub mniejszą niż E. coli BL21 po wstrzyknięciu dootrzewnowym, można uznać za atenuowane. Ten prosty mysi model infekcji może być również wykorzystany do oceny osłabionej patogenności genetycznie modyfikowanych szczepów innych gatunków, wykorzystując zatwierdzony przez FDA szczep E. coli jako punkt odniesienia. Kroki 1-7 szczegółowo opisują generowanie sekwencyjnych delecji genomowych u P. aeruginosa (ryc. 1), a kroki 8-12 szczegółowo opisują wykorzystanie modelu mysiego do badania patogenności szczepów P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Probówki 0,2 ml z płaskimi nakrętkami</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0620</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>22-253-260</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>1,5 ml jednorazowa kuweta polistyrenowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Fiolki kriogeniczne</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>przez</td></tr><tr><td>igłę Fisher Scientific 27G</td><td>BD</td><td>14-821-13B</td> przez probówki <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Blok akumulatorowy Cyfrowy</td><td>labnet</td> do suchej kąpieli <td>NC0205808</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>04-987-372</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Mikrowirówka stołowa</td><td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>za pośrednictwem</td></tr><tr><td>inkubatora gabinetowego</td> Fisher Scientific <td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa karbenicyliny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648250</td><td></td></tr><tr><td>probówka do hodowli, polistyren</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-6D</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Jednorazowe pętle do inokulacji</td><td>Fisher Scientific Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mikrobiologiczny Dneasy UltraClean (50)</td><td>Qiagen</td><td>12224-50</td><td>lub preferowana metoda/dostawca</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td><td>Omega bio-tek</td><td>D6493-01</td><td>lub preferowana metoda/dostawca</td></tr><tr><td>EcoRI-HF, endonukleaza restrykcyjna</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101L</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji</td><td>Bulldog Bio</td><td>NC0492929</td><td>przez Fisher Naukowy</td></tr><tr><td>zestaw do ligacji DNA FastLink II</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Bezbarwny Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7833</td><td>przez Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Isothesia Isofluran</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS Series III System obrazowania in vivo</td><td>Perkins i Elmer</td><td>CLS136340</td><td></td></tr><tr><td>Monosiarczan kanamycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LE agaroza</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>MicroPulser Elektroporator</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Agar szlachetny, ultraczysty</td><td>Affymetris/USB</td><td>AAJ10907A1</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>NotI-HF, endonukleaza restrykcyjna</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404052</td><td>za pośrednictwem Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Fosforan buforowany solą fizjologiczną w proszku</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a</td></tr><tr><td>>Pseudomonas agar izolacyjny</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas izolacja bulion</td><td>Alpha Biosciences</td><td>P16-115</td><td>Niestandardowy</td></tr><tr><td>zestaw do miniprzygotowania QIAprep Spin (250)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>lub preferowana metoda/dostawca</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4080</td><td>wstrząsnąć przy 200 obr./min</td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko</td><td>Difco</td><td>DF0032-17-3</td><td>przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Małe płytki (100 ø zewnętrzna x 10 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektrofotometr</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>lub preferowana metoda/dostawca</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Wykałaczki, okrągłe</td><td>diamentowe</td><td></td><td>Wykałaczki dowolnej marki, autoklawowane</td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania TOPO TA, do sekwencjonowania</td><td>Invitrogen</td><td>45-0030</td><td></td></tr><tr><td>XAF-8 Filtry systemu anestezjologicznego</td><td>Perkins and Elmer</td><td>118999</td><td></td></tr><tr><td>XGI 8 System anestezjologii gazowej</td><td>Suwmiarka Nauki Przyrodnicze/Xenogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie mutantów delecji genów w ramce u pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Mikroorganizmy są genetycznie wszechstronne i różnorodne, stały się głównym źródłem wielu produktów komercyjnych i biofarmaceutyków. Chociaż niektóre z tych produktów są naturalnie wytwarzane przez organizmy, inne produkty wymagają inżynierii genetycznej organizmu w celu zwiększenia wydajności produkcji. Szczepy awirulentowe Escherichia coli są tradycyjnie preferowanymi gatunkami bakterii do produkcji biofarmaceutyków; jednak niektóre produkty są trudne do wyprodukowania przez E. coli. W związku z tym awirulentne szczepy innych gatunków bakterii mogą stanowić użyteczną alternatywę dla produkcji niektórych produktów komercyjnych. Pseudomonas aeruginosa jest powszechną i dobrze przebadaną bakterią Gram-ujemną, która może stanowić odpowiednią alternatywę dla E. coli. Jednak P. aeruginosa jest oportunistycznym ludzkim patogenem. W tym miejscu szczegółowo opisujemy procedurę, którą można wykorzystać do generowania niepatogennych szczepów P. aeruginosa poprzez sekwencyjne delecje genomowe przy użyciu plazmidu pEX100T-NotI. Główną zaletą tej metody jest uzyskanie szczepu wolnego od markerów. Metoda ta może być stosowana do wytwarzania wysoce osłabionych szczepów P. aeruginosa do produkcji produktów komercyjnych lub do projektowania szczepów do innych specyficznych zastosowań. Opisujemy również prosty i powtarzalny mysi model bakteryjnej infekcji ogólnoustrojowej poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie zwalidowanych szczepów testowych w celu zbadania osłabienia genetycznie zmodyfikowanego szczepu w porównaniu z zatwierdzonym przez FDA szczepem BL21 E. coli.

Jak pokazano na Rysunku 2, celowaną delecję genomiczną można potwierdzić za pomocą kolonialnej reakcji PCR z zastosowaniem specyficznych starterów amplifikujących analizowany region. Kolonie z delecją genomiczną dadzą krótszy produkt PCR w porównaniu do kolonii typu dzikiego. Przesiew PCR 10–12 kolonii jest zazwyczaj wystarczający do wykrycia co najmniej jednej kolonii z celowaną delecją. Jeśli po kilku rundach przesiewu nie wykryto żadnych delecji, należy po...

Tutaj opisujemy prosty i powtarzalny protokół mysiego modelu infekcji do oceny osłabienia genetycznie zmodyfikowanych szczepów Pseudomonas aeruginosa w porównaniu z zatwierdzonymi przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) Escherichia coli do zastosowań komercyjnych.

Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Protokół ten jest istotny dla tworzenia i określania pożądanych mutacji umysł-ciało w genomie Pseudomonas aeruginosa, a także dla testowania wpływu mutacji na zmniejszenie wirulencji w odtwarzalnym modelu mysim. Kluczową zaletą tej techniki jest walidacja chromem i odtwarzalność modelu infekcji myszy. Bakterie nieustannie pracują, ciągle się zmieniają.Aby spowolnić ten proces, używamy zamrożonych ograniczników, pakujemy je, zawieszamy na wielu szczeblach podczas modyfikacji, a następnie testujemy je w modelu myszy. Ktoś, kto nie jest zaznajomiony z tymi metodami, najprawdopodobniej będzie miał problemy z opracowaniem i wyborem możliwej rekombinantu krzyżowego do testowania. Co więcej, postępowanie z myszami w przypadku infekcji będzie trudne dla kogoś niezaznajomionego z pracą ze zwierzętami.Metoda ta może być stosowana do badania innych patogenów i ich mutantów, a także wirusa wirulencji u myszy. W porównaniu z obecnymi modelami, procedury z odtwarzalnością oraz walidacją klonów przed i po zakażeniu mogą przynieść korzyści innym badaczom w tej dziedzinie. Wizualna demonstracja tego protokołu zapewnia wgląd w obszerne procedury, które mogą być trudne do zrozumienia lub zrozumienia za pomocą samego czytania.Zacznij od wyhodowania pojedynczych, rekombinowanych kolonii w Pseudomonas Isolation Broth lub PIB. Zaszczepić i rozsypać 10 mikrolitrów każdej kultury na wstępnie podgrzanych płytkach PIA, uzupełnionych 10% sacharozą. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź je pod kątem wzrostu. Kolonia odporna na sacharozę powinna być rekombinantami podwójnie krzyżującymi. Użyj sterylnych wykałaczek, aby załatać co najmniej 20 kolonii na wstępnie podgrzanych płytkach PIA, PIA uzupełnionego 10% sacharozą i PIA uzupełnionego karbenicyliną.Inkubuj płytki przez noc i zbadaj je pod kątem wzrostu następnego dnia. Prawdziwe rekombinanty z podwójnym krzyżowaniem będą wrażliwe na karbenicylinę i sacharozę. Przebadaj od 10 do 20 kolonii w celu usunięcia, używając PCR kolonii.Podnieś wzrost podejrzanego rekombinantu podwójnie krzyżowego za pomocą sterylnej wykałaczki i zawieś go w 50 mikrolitrach PBS. Gotować zawiesinę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Odwiruj go przez trzy minuty w temperaturze 13 000 razy G i umieść na lodzie.Następnie wykonaj PCR zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Po zakończeniu PCR wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym na produktach. Mniejsze produkty amplifikacji wskazują kolonie, w których obszar zainteresowania został usunięty.Rano w dniu wstrzyknięcia rozmrażaj kriowia komórek bakteryjnych w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy do czterech godzin. Po rozmrożeniu należy przechowywać fiolki na lodzie i wstrzyknąć myszom w ciągu dwóch godzin. Przenieść zawartość każdego kriowialu do nowej dwumililitrowej probówki i odwirować ją w temperaturze 4 500 razy G przez 10 minut.Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze PBS. Powtórz wirowanie i ponownie zawiesić komórki w PBS do końcowego stężenia 2,5 razy 10 do dziewiątej jednostki tworzącej kolonię na mililitr. Pobrać trzy próbki z końcowej zawiesiny każdego szczepu, aby potwierdzić stężenie, genotyp i fenotyp.Dla każdego szczepu należy podać 1,5 mililitra zawiesiny komórek do dwumililitrowej probówki i przygotować PBS do wstrzyknięć kontrolnych. Zbierz myszy i materiały potrzebne do wstrzyknięć w sterylnej sali operacyjnej dla zwierząt i wytrzyj wszystkie powierzchnie chusteczkami odkażającymi przed rozpoczęciem. Noś dwie pary rękawiczek lateksowych, aby ograniczyć ryzyko przebicia w przypadku ugryzienia, a także fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i maskę na twarz.Wyjmij mysz z klatki i zważ ją, oznaczając ogon trwałym markerem do śledzenia po wstrzyknięciu. Otwórz nową strzykawkę o pojemności jednego mililitra z igłą o rozmiarze 27 i pobrać 200 mikrolitrów sterylnego PBS. Chwyć mysz za uszami, używając kciuka i palca wskazującego, i uszczypnij, aby utworzyć fałd skórny na karku.Następnie przymocuj ogon do dłoni za pomocą małego palca, aby utrzymać mysz płasko i nieruchomo. Wbić igłę pod kątem 30 stopni do jamy otrzewnej po lewej lub prawej stronie linii środkowej. Lekko unieść igłę, aby upewnić się, że nie została wprowadzona do narządów.Następnie powoli wstrzyknąć PBS i wyjąć igłę. Typowy jest bolus w miejscu wstrzyknięcia. Umieść igłę w wyznaczonym pojemniku na ostre przedmioty i przenieś mysz do osobnej klatki.Powtórz procedurę z następną myszą i po wstrzyknięciu wszystkim myszom z jednej klatki przenieś je z powrotem do pierwotnej klatki. Po wstrzyknięciu grupy kontrolnej wstrzyknąć grupy testowe, stosując tę samą procedurę. Po zakończeniu wszystkich wstrzyknięć zwróć myszy do pomieszczenia mieszkalnego i wyczyść miejsce pracy chusteczkami odkażającymi.Aby zobrazować zwierzęta, przygotuj system obrazowania, ustawiając parametry kamery i podgrzewając scenę. Ustaw przepływ tlenu na 1,5 litra na minutę i izofluran na 3,5% i przenieś mysz do komory anestezjologicznej, a następnie do etapu stabilizacji temperatury, po znieczuleniu. Ułóż mysz na plecach z wyciągniętymi ramionami i dopasuj stożek do nosa w celu podania 2,5% izofluranu podczas obrazowania.Zamknij drzwi i wykonaj bioluminescencyjne zdjęcia i zdjęcia rentgenowskie myszy. Po zakończeniu obrazowania umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj ją. Powinien odzyskać przytomność w ciągu trzech do pięciu minut.Docelowe delecje genomowe zostały potwierdzone przez PCR kolonii ze specyficznymi starterami, które amplifikowały obszar zainteresowania. Kolonie z delecją genomową dają krótszy prążek PCR w porównaniu z koloniami typu dzikiego. Dootrzewnowe wstrzyknięcie atenuowanego szczepu P aeruginosa, PGN 5, spowodowało 0% śmiertelność, co odpowiada śmiertelności obserwowanej w przypadku E. coli BL 21.Wstrzyknięcie szczepu rodzicielskiego było jednak śmiertelne dla 80% myszy. Postęp infekcji śledzono za pomocą szczepów macierzystych i atenuowanych znakowanych bioluminescencyjnie. Osłabiony szczep pozostał zlokalizowany w miejscu wstrzyknięcia do momentu zaniku bioluminescencji, co prawdopodobnie zbiegło się z ustąpieniem infekcji.W przedstawionej metodzie zbadano jedynie śmiertelność wytwarzaną przez szczep. Bardziej szczegółowe aspekty immunologiczne i toksykologiczne można wykorzystać do określenia dynamiki infekcji i efektu końcowego infekcji, który nie prowadzi do śmierci. Najważniejszą rzeczą w procedurze jest przeprowadzenie szeroko zakrojonej walidacji, obejmującej różne etapy, od wstępnej identyfikacji po testy na zwierzętach.Pominięcie niektórych etapów walidacji może potencjalnie prowadzić do błędnego wyniku, ponieważ testowane szczepy mogą ulec mutacji i selekcji lub zostać skażone. Sądzimy, że wraz z rozwojem tych dwóch technik pozwoli to naszym naukowcom w dziedzinie immunologii zakażeń skuteczniej badać, w jaki sposób potężna interakcja pakietów prowadzi do ekstremalnego fenotypu, sepsy i śmiertelności. Wpływ różnych składników odżywczych na warianty można porównać poprzez dozowanie wielkości bakterii.

generation-frame-gene-deletion-mutants-pseudomonas-aeruginosa-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Valentine, M. E., et al. Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje zastosowanie bioluminescencji do wizualizacji i porównania zachowania in vivo zjadliwych i atenuowanych szczepów bakteryjnych u myszy. Przedstawiono w nim przygotowanie bioluminescencyjnych zawiesin bakteryjnych i ich dootrzewnowe wstrzyknięcie myszom. Zjadliwy szczep wykazuje...

Śledzenie dynamiki infekcji bakteryjnych u myszy za pomocą bioluminescencji

Źródło: Valentine, M. E., et al. Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji. J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje generowanie rekombinantów podwójnie krzyżowych w Pseudomonas aeruginosa przy użyciu strategii delecji genów opartej na plazmidzie. Proces ten polega na selekcji bakterii, które zawierają niereplikacyjny plazmid zintegrowany z genomem poprzez pojedyncze skrzyżowanie, a następnie wywołaniu...

Generowanie podwójnie krzyżowanych rekombinantów Pseudomonas aeruginosa w celu celowanej delecji genów

Źródło: Valentine, M. E. i in., Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa oraz testowanie tłumienia zjadliwości w prostym modelu infekcji myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje zastosowanie podejścia obrazowania opartego na bioluminescencji do monitorowania zakażenia bakteryjnego w modelu żywej myszy. Sekwencyjne obrazowanie bioluminescencyjne i rentgenowskie umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym oraz anatomiczną lokalizację infekcji rozprzestrzeniającej...

Obrazowanie w czasie rzeczywistym infekcji bakteryjnej w modelu myszy z użyciem bioluminescencji

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mutagenezę za pośrednictwem transpozonu mini-himar1 mariner do generowania biblioteki mutantów insercyjnych o wysokiej gęstości do badania, izolacji i identyfikacji nowych regulatorów alginianu w prototypowym szczepie Pseudomonas aeruginosa PAO1.

Identyfikacja nowych genów związanych z produkcją alginianów u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu mutagenezy za pośrednictwem transpozonu Mini-himar1 Mariner

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Tutaj przedstawiamy trzy różne eksperymenty do badania infekcji Aeromonas u C. elegans. Korzystając z tych wygodnych metod, łatwo jest ocenić toksyczność wśród i w obrębie gatunków Aeromonas.

Ocena zjadliwości i patogenezy zakażenia Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

System rekombinacji za pośrednictwem λ-czerwieni został użyty do stworzenia mutanta delecji małego niekodującego RNA micC.

Niekodujący mały RNA MicC przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w Salmonella enteritidis

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Poznaj metodę generowania mutantów delecji genów u Pseudomonas aeruginosa i testowania tłumienia wirulencji w mysim modelu infekcji. Protokół zapewnia niezawodną reprodukowalność badań nad patogennością bakterii.

Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji

Przeglądaj więcej filmów