Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji

Protokół ten jest istotny dla tworzenia i określania pożądanych mutacji umysł-ciało w genomie Pseudomonas aeruginosa, a także dla testowania wpływu mutacji na zmniejszenie wirulencji w odtwarzalnym modelu mysim. Kluczową zaletą tej techniki jest walidacja chromem i odtwarzalność modelu infekcji myszy. Bakterie nieustannie pracują, ciągle się zmieniają.

Aby spowolnić ten proces, używamy zamrożonych ograniczników, pakujemy je, zawieszamy na wielu szczeblach podczas modyfikacji, a następnie testujemy je w modelu myszy. Ktoś, kto nie jest zaznajomiony z tymi metodami, najprawdopodobniej będzie miał problemy z opracowaniem i wyborem możliwej rekombinantu krzyżowego do testowania. Co więcej, postępowanie z myszami w przypadku infekcji będzie trudne dla kogoś niezaznajomionego z pracą ze zwierzętami.

Metoda ta może być stosowana do badania innych patogenów i ich mutantów, a także wirusa wirulencji u myszy. W porównaniu z obecnymi modelami, procedury z odtwarzalnością oraz walidacją klonów przed i po zakażeniu mogą przynieść korzyści innym badaczom w tej dziedzinie. Wizualna demonstracja tego protokołu zapewnia wgląd w obszerne procedury, które mogą być trudne do zrozumienia lub zrozumienia za pomocą samego czytania.

Zacznij od wyhodowania pojedynczych, rekombinowanych kolonii w Pseudomonas Isolation Broth lub PIB. Zaszczepić i rozsypać 10 mikrolitrów każdej kultury na wstępnie podgrzanych płytkach PIA, uzupełnionych 10% sacharozą. Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia wyjmij płytki z inkubatora i sprawdź je pod kątem wzrostu. Kolonia odporna na sacharozę powinna być rekombinantami podwójnie krzyżującymi. Użyj sterylnych wykałaczek, aby załatać co najmniej 20 kolonii na wstępnie podgrzanych płytkach PIA, PIA uzupełnionego 10% sacharozą i PIA uzupełnionego karbenicyliną.

Inkubuj płytki przez noc i zbadaj je pod kątem wzrostu następnego dnia. Prawdziwe rekombinanty z podwójnym krzyżowaniem będą wrażliwe na karbenicylinę i sacharozę. Przebadaj od 10 do 20 kolonii w celu usunięcia, używając PCR kolonii.

Podnieś wzrost podejrzanego rekombinantu podwójnie krzyżowego za pomocą sterylnej wykałaczki i zawieś go w 50 mikrolitrach PBS. Gotować zawiesinę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Odwiruj go przez trzy minuty w temperaturze 13 000 razy G i umieść na lodzie.

Następnie wykonaj PCR zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Po zakończeniu PCR wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym na produktach. Mniejsze produkty amplifikacji wskazują kolonie, w których obszar zainteresowania został usunięty.

Rano w dniu wstrzyknięcia rozmrażaj kriowia komórek bakteryjnych w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy do czterech godzin. Po rozmrożeniu należy przechowywać fiolki na lodzie i wstrzyknąć myszom w ciągu dwóch godzin. Przenieść zawartość każdego kriowialu do nowej dwumililitrowej probówki i odwirować ją w temperaturze 4 500 razy G przez 10 minut.

Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze PBS. Powtórz wirowanie i ponownie zawiesić komórki w PBS do końcowego stężenia 2,5 razy 10 do dziewiątej jednostki tworzącej kolonię na mililitr. Pobrać trzy próbki z końcowej zawiesiny każdego szczepu, aby potwierdzić stężenie, genotyp i fenotyp.

Dla każdego szczepu należy podać 1,5 mililitra zawiesiny komórek do dwumililitrowej probówki i przygotować PBS do wstrzyknięć kontrolnych. Zbierz myszy i materiały potrzebne do wstrzyknięć w sterylnej sali operacyjnej dla zwierząt i wytrzyj wszystkie powierzchnie chusteczkami odkażającymi przed rozpoczęciem. Noś dwie pary rękawiczek lateksowych, aby ograniczyć ryzyko przebicia w przypadku ugryzienia, a także fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i maskę na twarz.

Wyjmij mysz z klatki i zważ ją, oznaczając ogon trwałym markerem do śledzenia po wstrzyknięciu. Otwórz nową strzykawkę o pojemności jednego mililitra z igłą o rozmiarze 27 i pobrać 200 mikrolitrów sterylnego PBS. Chwyć mysz za uszami, używając kciuka i palca wskazującego, i uszczypnij, aby utworzyć fałd skórny na karku.

Następnie przymocuj ogon do dłoni za pomocą małego palca, aby utrzymać mysz płasko i nieruchomo. Wbić igłę pod kątem 30 stopni do jamy otrzewnej po lewej lub prawej stronie linii środkowej. Lekko unieść igłę, aby upewnić się, że nie została wprowadzona do narządów.

Następnie powoli wstrzyknąć PBS i wyjąć igłę. Typowy jest bolus w miejscu wstrzyknięcia. Umieść igłę w wyznaczonym pojemniku na ostre przedmioty i przenieś mysz do osobnej klatki.

Powtórz procedurę z następną myszą i po wstrzyknięciu wszystkim myszom z jednej klatki przenieś je z powrotem do pierwotnej klatki. Po wstrzyknięciu grupy kontrolnej wstrzyknąć grupy testowe, stosując tę samą procedurę. Po zakończeniu wszystkich wstrzyknięć zwróć myszy do pomieszczenia mieszkalnego i wyczyść miejsce pracy chusteczkami odkażającymi.

Aby zobrazować zwierzęta, przygotuj system obrazowania, ustawiając parametry kamery i podgrzewając scenę. Ustaw przepływ tlenu na 1,5 litra na minutę i izofluran na 3,5% i przenieś mysz do komory anestezjologicznej, a następnie do etapu stabilizacji temperatury, po znieczuleniu. Ułóż mysz na plecach z wyciągniętymi ramionami i dopasuj stożek do nosa w celu podania 2,5% izofluranu podczas obrazowania.

Zamknij drzwi i wykonaj bioluminescencyjne zdjęcia i zdjęcia rentgenowskie myszy. Po zakończeniu obrazowania umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj ją. Powinien odzyskać przytomność w ciągu trzech do pięciu minut.

Docelowe delecje genomowe zostały potwierdzone przez PCR kolonii ze specyficznymi starterami, które amplifikowały obszar zainteresowania. Kolonie z delecją genomową dają krótszy prążek PCR w porównaniu z koloniami typu dzikiego. Dootrzewnowe wstrzyknięcie atenuowanego szczepu P aeruginosa, PGN 5, spowodowało 0% śmiertelność, co odpowiada śmiertelności obserwowanej w przypadku E. coli BL 21.

Wstrzyknięcie szczepu rodzicielskiego było jednak śmiertelne dla 80% myszy. Postęp infekcji śledzono za pomocą szczepów macierzystych i atenuowanych znakowanych bioluminescencyjnie. Osłabiony szczep pozostał zlokalizowany w miejscu wstrzyknięcia do momentu zaniku bioluminescencji, co prawdopodobnie zbiegło się z ustąpieniem infekcji.

W przedstawionej metodzie zbadano jedynie śmiertelność wytwarzaną przez szczep. Bardziej szczegółowe aspekty immunologiczne i toksykologiczne można wykorzystać do określenia dynamiki infekcji i efektu końcowego infekcji, który nie prowadzi do śmierci. Najważniejszą rzeczą w procedurze jest przeprowadzenie szeroko zakrojonej walidacji, obejmującej różne etapy, od wstępnej identyfikacji po testy na zwierzętach.

Pominięcie niektórych etapów walidacji może potencjalnie prowadzić do błędnego wyniku, ponieważ testowane szczepy mogą ulec mutacji i selekcji lub zostać skażone. Sądzimy, że wraz z rozwojem tych dwóch technik pozwoli to naszym naukowcom w dziedzinie immunologii zakażeń skuteczniej badać, w jaki sposób potężna interakcja pakietów prowadzi do ekstremalnego fenotypu, sepsy i śmiertelności. Wpływ różnych składników odżywczych na warianty można porównać poprzez dozowanie wielkości bakterii.