Transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja Ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala naukowcom przeprowadzić prostą analizę genetyczną bakteryjnej choroby więdnięcia pomidorów. Główną zaletą tej techniki jest to, że manipulacja ekspresją genów i późniejsze testy mogą być wykonywane w krótkim czasie i przy niewielkich wymaganiach dotyczących sprzętu i przestrzeni do wzrostu roślin. Jest to metoda bardzo wszechstronna i może być stosowana do innych roślin uprawnych w celu przeprowadzenia zarówno inokulacji patogenów, jak i innych testów fizjologicznych.

Aby zachować sterylność podczas manipulacji sadzonkami in vitro, ważne jest, aby płytki były zamknięte, gdy znajdują się poza okapem przepływowym. Jest to łatwa technika, ale wymaga wielu kroków do manipulacji. Wizualizacja tej metody pomoże dostrzec drobne sztuczki, które są trudne do wyjaśnienia w manuskrypcie, pomagając innym badaczom wdrożyć metodę w swoich laboratoriach.

W zademonstrowaniu tej procedury pomoże Achen Zhao, doktorant. Po wysterylizowaniu i umyciu nasion pomidora przenieś je na podłoże o połowie mocy Murashige i Skoog bez sacharozy. Trzymaj nasiona w ciemności w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza przez trzy dni.

Umieść autoklawowane filtry o średnicy 8,5 centymetra kwadratowego w dziewięciocentymetrowych szalkach Petriego zawierających pożywkę Murashige i Skoog o połowie mocy, a na każdej talerzu umieść sześć kiełkujących nasion pomidorów. Uszczelnij płytkę taśmą Micropore i inkubuj kiełkujące nasiona w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Hoduj Agrobacterium rhizogenes MSU440 w stałym podłożu LB z odpowiednimi antybiotykami przez dwa dni w temperaturze 28 stopni Celsjusza przed przemianą rośliny.

Za pomocą sterylnego skalpela odetnij korzonek i spód hipokotylu sadzonek pomidorów. Użyj plastikowych końcówek lub ostrza skalpela, aby zebrać biomasę A.rhizogenes z powierzchni podłoża LB i ostrożnie zanurz pokrojone sadzonki pomidorów w biomasie bakteryjnej. Następnie przykryj sadzonki pomidorów półokrągłą bibułą filtracyjną o wymiarach dwa na cztery centymetry, aby utrzymać wysoką wilgotność i ułatwić przetrwanie oraz rozwój nowych korzeni.

Ważne jest, aby trzymać sadzonki w wysokiej wilgotności w środowisku umożliwiającym transpirację. Aby to zrobić, przykryj sadzonki bibułą filtracyjną i zamknij płytkę taśmą Micropore. Przetworzone sadzonki pomidorów przechowuj przez sześć do siedmiu dni w komorze wzrostowej w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza.

Następnie użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć nowo pojawiające się owłosione korzenie i pozwól sadzonkom wytworzyć nowe owłosione korzenie. Gdy pojawi się druga generacja nowych owłosionych korzeni, usuń bibułę filtracyjną z wierzchu sadzonek i ponownie uszczelnij płytkę taśmą Micropore. Aby uwidocznić fluorescencję DsRed lub jakikolwiek inny sprzęt do obrazowania roślin in vivo, zaznacz dodatnio przekształcone korzenie, które można zidentyfikować za pomocą czerwonej fluorescencji.

Użyj skalpela, aby usunąć ujemne, nieprzekształcone korzenie, które można rozpoznać po braku czerwonej fluorescencji. Przenieś siewki, które wykazują czerwoną fluorescencję, na nową płytkę zawierającą pożywkę o połowie mocy Murashige i Skoog, aby ułatwić rozwój przekształconego korzenia jako głównego korzenia. Trzymaj sadzonki, które nie wykazują czerwonej fluorescencji, na tej samej płytce, aby sprawdzić pojawienie się fluorescencyjnych korzeni w późniejszych punktach czasowych.

Przykryj sadzonki półokrągłą bibułą filtracyjną o wymiarach dwa na cztery centymetry, uszczelnij płytkę i inkubuj sadzonki, aby mogły rozwinąć nowe, owłosione korzenie. Przygotuj doniczki do zaszczepiania, w których powierzchnia korzeni będzie wystawiona na działanie inokulum bakteryjnego, najpierw namocz doniczki do zaszczepiania wodą, wylewając nadmiar wody, a następnie umieszczając je w plastikowej tacy do sadzenia. Za pomocą pęsety przenieś wybrane sadzonki z przekształconymi korzeniami do doniczek do zaszczepiania.

Przykryj tackę folią spożywczą lub przezroczystą pokrywką i utrzymuj je w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza przy wilgotności 65%. Zdejmij pokrywę po pięciu lub sześciu dniach. Hoduj Ralstonia w płynnym podłożu o masie pięciu funtów w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 28 stopni Celsjusza, z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min, aż do fazy stacjonarnej.

Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach, aby określić liczbę bakterii. Rozcieńczyć kulturę bakteryjną wodą do OD600 1. Umieść od 16 do 20 doniczek do zaszczepiania, które zawierają przekształcone rośliny pomidora, na tacy do zaszczepiania.

Następnie wlej 300 mililitrów rozcieńczonego inokulum bakteryjnego do tacy i pozwól roślinom zanurzyć się w inokulum przez 20 minut. Następnie przygotuj nową tacę z warstwą ziemi doniczkowej. Przenieś zaszczepione doniczki do nowej tacki i umieść tace w komorze wzrostu o wilgotności 75%, temperaturze od 26 do 28 stopni Celsjusza i fotoperiodzie 12 godzin światła i 12 godzinach ciemności.

Tutaj korzenie pomidora są przekształcane i zaszczepiane Ralstonią w celu przeprowadzenia prostej analizy genetycznej w celu zbadania bakteryjnej choroby więdnięcia. Rozwój objawów chorobowych śledzi się u roślin pomidora z korzeniami przekształconymi pustym wektorem oraz u tych przekształconych za pomocą konstruktu RAI ukierunkowanego na pomidora CESA6. Dane dotyczące indeksu choroby są zbierane z tej samej jednostki doświadczalnej w czasie zgodnie z dowolną skalą od zera do czterech i nie są zgodne z rozkładem Gaussa, co wyklucza stosowanie standardowych testów dla danych parametrycznych.

Jako standardowe podejście stosuje się dwustronny, nieparametryczny test U Manna-Whitneya do porównania zarówno krzywej kontrolnej, jak i krzywej infekcji. Zgodnie z tą analizą różnica między medianami obu krzywych wydaje się nieistotna. Możliwe jest również ilościowe określenie obszaru pod krzywą postępu choroby, co pozwala na połączenie wielu obserwacji postępu choroby w jedną wartość.

Obszar pod krzywą postępu choroby wykazuje wyższą wartość dla roślin kontrolnych w porównaniu z roślinami CESA6 RNAi pomidora pod koniec procesu infekcji, co wskazuje, że rośliny pomidora wyciszone CESA6 są bardziej odporne na infekcję Ralstonia niż rośliny kontrolne. Przedziały ufności umożliwiają oszacowanie, z dużym prawdopodobieństwem, zakresu wartości, w którym znajduje się wartość populacji danej zmiennej. Jak widać tutaj, obszar 95% przedziału ufności dla krzywych kontroli i infekcji szacuje większe prawdopodobieństwo oporności, gdy CESA6 jest wyciszony.

Wartości indeksu choroby można przekształcić w dane binarne, biorąc pod uwagę, że indeks choroby niższy niż dwa odpowiada zero, a indeks choroby równy lub wyższy niż dwa odpowiada jedynce. Pozwala to na przedstawienie krzywej przeżycia po zaszczepieniu Ralstonia. Różnice we wskaźniku przeżywalności między roślinami kontrolnymi a zakażonymi nie są statystycznie istotne zgodnie z testem statystycznym Gehana-Breslowa-Wilcoxona.

Ekspresja CESA6 jest następnie analizowana w dwóch losowo wybranych przekształconych korzeniach przed etapem inokulacji, wykazując, że zwiększona odporność na Ralstonia koreluje ze zmniejszoną ekspresją CESA6. Po dwóch rundach selekcji można uzyskać współczynnik przemiany od 35 do 40%, a wartość tę można zwiększyć, wykonując dodatkowe rundy selekcji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby sadzonki były przykryte kawałkiem bibuły filtracyjnej, aby utrzymać wysoką wilgotność i uszczelnić płytki za pomocą Micropore, aby zapewnić wymianę gazową.

Po transformacji korzeni wiele zabiegów można zastosować do badania reakcji roślin poprzez obserwację fizjologii korzeni lub wykorzystanie biologii molekularnej, biologii komórki lub biochemii. Przede wszystkim technika ta pozwoli naukowcom dysponującym ograniczonymi zasobami na przeprowadzenie analizy genetycznej infekcji bakteryjnej korzeni pomidora.