Name: Transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja Ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę transformacji korzenia pomidora i inokulacji Ralstonia solanacearum. Technika umożliwia szybką analizę genetyczną bakteryjnej choroby więdnięcia z minimalnymi wymaganiami sprzętowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Macho za pomocne dyskusje, Alvaro López-García za porady statystyczne oraz Xinyu Jian za pomoc techniczną i administracyjną podczas tej pracy. Dziękujemy głównej placówce PSC Cell Biology za pomoc w obrazowaniu fluorescencyjnym Prace te były wspierane przez Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (grant XDB27040204), Szanghajskie Centrum Biologii Stresu Roślinnego (Chińska Akademia Nauk) oraz chiński program 1000 talentów.

UWAGA: Ważne części tej metody obejmują przetwarzanie materiałów roślinnych in vitro, dlatego ważne jest utrzymanie sterylnych warunków podczas wszystkich tych procedur, w tym wizualizacji fluorescencji DsRed. Podczas całego procesu przemiany siewki pomidorów rosną w temperaturze 25−28 °C i 16 h/8 h światła/ciemności (130 μmol fotonów m-2 s-1 światło). Płytki są uszczelnione taśmą mikroporową w celu ułatwienia wymiany gazowej i transpiracji.
1. Przygotowanie pomidorów i Agrobacterium rhizogenes
<ol>
	<li>Nasiona pomidora (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC) sterylizować 5% (v/v) podchlorynem sodu przez 5 minut. Umyj 4-5 razy destylowaną sterylną wodą i utrzymuj nasiona powoli potrząsające w sterylnej wodzie przez noc, aby ułatwić kiełkowanie.</li>
	<li>Przenieś nasiona pomidora na pożywkę o połowie mocy Murashige i Skoog (1/2 MS) bez sacharozy (2,21 g/L MS, 8% w/v agar). Trzymaj nasiona w ciemności w temperaturze 25−28 °C przez trzy dni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Do każdego konstruktu potrzeba zwykle około 40 nasion.</li>
	<li>Autoklaw 8,5 cm2 kwadratowe bibuły filtracyjne. Umieść kwadratowe bibuły filtracyjne w 9 cm2 kwadratowych szalkach Petriego zawierających 1/2 MS podłoża (umieść papier na wierzchu agaru) i umieść sześć kiełkujących nasion pomidora na każdej płytce (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). Uszczelnij płytkę taśmą z mikroporami i inkubuj kiełkujące nasiona w temperaturze 25−28 °C przez 3−4 dni.</li>
	<li>Uprawiać Agrobacterium rhizogenes MSU440 w stałym podłożu LB (z odpowiednimi antybiotykami) w temperaturze 28 °C dwa dni przed przemianą rośliny. 
	UWAGA: A. rhizogenes jest dostarczany przez Dr. Juan Antonio López Ráez, EEZ-CSIC, Grenada, Hiszpania. W eksperymencie opisanym w tym artykule użyto A. rhizogenes zawierającego pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6 lub pusty wektor, jako kontrolę. pK7GWIWG2_II-RedRoot zawiera gen reporterowy, DsRed, napędzany przez promotor ubikwityny Arabidopsis thaliana (pAtUBQ10) i nadaje oporność na spektynomycynę (50 μg/ml). Możliwe jest użycie innych wektorów do nadekspresji genów, jak opisano wcześniej5. W niniejszej pracy amplifikację specyficznego fragmentu do wyciszania SlCESA6 uzyskano za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją (RT) przy użyciu RNA wyizolowanego z pomidora (S. lycopersicum cv. Moneymaker) i podligowanego do wektora p-ENTR/D-TOPO (Tabela 1). Następnie fragment SlCESA6-RNAi został sklonowany do wektora binarnego pK7GWIWG2_II-RedRoot.</li>
</ol>
2. Transformacja i selekcja roślin
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnego skalpela odetnij korzonek i spód hipokotylu sadzonek pomidorów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C,D).</li>
	<li>Zbierz biomasę A. rhizogenes z powierzchni podłoża LB za pomocą plastikowych końcówek lub ostrza skalpela i ostrożnie zanurz pokrojone sadzonki pomidorów w biomasie bakteryjnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Po zaszczepieniu A. rhizogenes przykryj sadzonki pomidorów półokrągłą bibułą filtracyjną o wymiarach 2 cm x 4 cm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F), aby utrzymać wysoką wilgotność i ułatwić przetrwanie oraz rozwój nowych korzeni.</li>
	<li>Przechowuj przekształcone sadzonki pomidorów przez 6-7 dni. Następnie użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć nowo pojawiające się owłosione korzenie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G,H; na tym etapie korzenie nie są jeszcze przekształcone) i pozwól siewkom wytworzyć nowe, owłosione korzenie.</li>
	<li>Gdy pojawi się druga generacja nowych owłosionych korzeni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I), usuń bibułę filtracyjną z wierzchu sadzonek i ponownie uszczelnij płytkę taśmą mikroporową. 
	UWAGA: W tym momencie obecność markera fluorescencyjnego DsRed w wektorze transformacji pozwala na wizualizację efektywności przemiany w nowych korzeniach.</li>
	<li>Aby zobrazować fluorescencję DsRed, użyj mikroskopu stereoskopowego lub innego sprzętu do obrazowania in vivo roślin (<silna klasa="xfig">Rysunek 1J). Zaznacz korzenie przekształcone w dodatnią (czerwona fluorescencja) i usuń ujemne nieprzekształcone korzenie (bez czerwonej fluorescencji) za pomocą sterylnego skalpela.</li>
	<li>Przenieś siewki wykazujące czerwoną fluorescencję na nową płytkę zawierającą 1/2 MS pożywki, aby ułatwić rozwój przekształconego korzenia jako głównego korzenia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1K). Trzymaj sadzonki, które nie wykazują czerwonej fluorescencji, na tej samej płytce, aby sprawdzić pojawienie się fluorescencyjnych korzeni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1L) w późniejszych punktach czasowych.</li>
	<li>Alternatywna metoda oparta na doborze antybiotyków
	<ol>
		<li>Alternatywą dla kroku 2.5 jest przygotowanie do połowy napełnionych 9 cm2 kwadratowych talerzy zawierających 1/2 MS pożywki z odpowiednim antybiotykiem. Nachyl płytki o około 5° podczas procesu przygotowania, aby wytworzyć pustą przestrzeń bez podłoża (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A), umożliwiając wzrost pędów unikając kontaktu z antybiotykiem.</li>
		<li>Alternatywnie do kroku 2.6, po przecięciu pierwszych nieprzekształconych owłosionych korzeni, które się pojawiły (krok 2.4), przenieś siewki bez korzeni na częściowo wypełnione płytki za pomocą bibuł filtracyjnych o odpowiednim rozmiarze (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
		UWAGA: Jako kontrolę pozytywną zaleca się przekształcenie kilku sadzonek w plazmid zawierający tę samą oporność na antybiotyki i gen reporterowy (w tym protokole pK7GWIWG2_II-RedRoot; kanamycyna 50 μg/ml).</li>
		<li>Alternatywnie do kroku 2.7, pozwól siewkom rozwinąć nowe owłosione korzenie i odetnij te korzenie, które nie mają bezpośredniego kontaktu z powierzchnią bibuły warstwowej filtracyjnej, ponieważ korzenie te mogą uniknąć selekcji antybiotyków. 
		UWAGA: Ze względu na działanie antybiotykowe rozwój korzeni może być wolniejszy niż w płytkach bez antybiotyków. Nowe przekształcone owłosione korzenie pojawiają się w ciągu 14−18 dni po przeniesieniu siewek bez korzeni na częściowo wypełnione płytki (krok 2.8.2) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C-E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryj sadzonki półokrągłą bibułą filtracyjną o wymiarach 2 cm x 4 cm, uszczelnij płytkę i inkubuj sadzonki, aby mogły rozwinąć nowe owłosione korzenie. 
	UWAGA: Nie jest konieczne eliminowanie A. rhizogenes za pomocą antybiotyków. Bibuła filtracyjna na wierzchu pożywki MS i brak sacharozy hamują rozprzestrzenianie się A. rhizogenes na talerzu5.</li>
	<li>Pięć do siedmiu dni po pierwszej selekcji korzeni powtórz proces selekcji, aby wybrać nowe przekształcone korzenie i usunąć nieprzekształcone korzenie. Przenieś sadzonki zawierające przekształcone korzenie na nową płytkę zawierającą 1/2 MS podłoża.</li>
</ol>
3. Przeniesienie do doniczek do inokulacji
<ol>
	<li>Przygotuj doniczki do zaszczepiania, w których powierzchnia korzeni będzie wystawiona na działanie inokulum bakteryjnego: namocz doniczki do zaszczepiania wodą, odlej nadmiar wody i umieść je w plastikowej tacy do sadzenia. Przenieś wybrane sadzonki z przekształconymi korzeniami do doniczek do zaszczepiania za pomocą pęsety (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Przykryj tacę folią spożywczą lub przezroczystą pokrywką i utrzymuj je w temperaturze 25−28 °C i wilgotności 65% (16 h/8 h jasno/ciemno; 130 μmol fotonów m-2 s-1 światło), aby utrzymać wysoki poziom wilgotności <silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Zdejmij pokrywę po pięciu lub sześciu dniach. 
	UWAGA: Przekształcone rośliny pomidora są gotowe do zaszczepienia dwa do trzech tygodni po przeniesieniu ich do gleby (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Podczas wzrostu na glebie rośliny pomidora mogą wytwarzać nowe korzenie, które nie są przekształcane. Aby określić zakres tego zjawiska, zaobserwowano czerwoną fluorescencję w korzeniach 3-tygodniowych przekształconych roślin pomidora. Większość korzeni (80%-100%) wykazywała czerwoną fluorescencję, co wskazuje, że rzeczywiście uległy transformacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D,E).</li>
</ol>
4. Inokulacja zraszająca glebę
<ol>
	<li>Hoduj R. solancearum (szczep GMI1000 w tym protokole) w płynnym podłożu phi (Tabela 211) w wytrząsarce orbitalnej (200 obr./min) w temperaturze 28 °C do fazy stacjonarnej.</li>
	<li>Określ liczbę bakterii, mierząc gęstość optyczną kultury bakteryjnej przy 600 nm (OD600). Rozcieńczyć kulturę bakteryjną wodą do OD600 0,1 (w stosowanych tutaj warunkach odpowiada to około 108 jednostkom tworzącym kolonie [CFU]/ml).</li>
	<li>Umieść 16−20 doniczek do zaszczepiania zawierających przekształcone pomidory na tacy do zaszczepiania (29 cm x 20 cm; <silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	<li>Wlej 300 ml (~ 15 ml na roślinę) inokulum bakteryjnego (OD600 0,1) do tacki zawierającej doniczki do inokulacji. Pozwól im moczyć się w inokulum przez 20 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Przygotuj nową tacę z warstwą ziemi doniczkowej. Przenieś zaszczepione doniczki do nowej tacki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4C) i umieść tace w komorze wzrostu o wilgotności 75%, temperaturze 26−28 °C i fotoperiodzie 12 godzin światła i 12 godzin ciemności (130 μmol fotonów m-2 s-1 światła).</li>
</ol>
5. Określenie parametrów infekcji i analiza statystyczna
<ol>
	<li>Oceń objawy choroby zgodnie z wcześniejszym opisem12,13, używając skali od 0 (brak objawów) do 4 (całkowite więdnięcie) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D-H), każdego dnia po inokulacji Ralstonia przez dwa tygodnie. 
	UWAGA: Dane dotyczące indeksu chorób są zbierane z tej samej jednostki doświadczalnej (każdej rośliny) w czasie.</li>
</ol>
6. Analiza ekspresji genów
UWAGA: Ekspresję transgenu lub wyciszenie genu docelowego można określić za pomocą RT-PCR lub ilościowego RT-PCR (qRT-PCR).
<ol>
	<li>Pobrać próbki i wyekstrahować RNA z reprezentatywnej części przekształconego systemu korzeniowego (w celu oceny wpływu na gen docelowy) i liści (w ramach kontroli wewnętrznej).</li>
	<li>Zsyntetyzuj cDNA przy użyciu 1 μg całkowitego RNA poddanego działaniu DNazy.</li>
	<li>Analizuj ekspresję genów docelowych za pomocą qRT-PCR. Oblicz względne poziomy transkrypcji za pomocą metody 2-ΔΔCT14, używając SlEFα-1 jako genów porządkowych15. 
	UWAGA: Sekwencje starterów są wymienione w Tabeli 1.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Wilt+in+China%3A+History%2C+Current+Status%2C+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+plant+pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Elphinstone, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElphinstone%2C+JG+%22The+current+bacterial+wilt+situation%3A+a+global+overview.+In%3A+Bacterial+Wilt+Disease+and+the+Ralstonia+solanacearum+Species+Complex%22">The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex</a>. Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. , American Phytopathological Society Press. St Paul, MN. 9-28 (2005).</li>
<li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+JB+%22Compendium+of+Tomato+1094+Diseases%22">Compendium of Tomato 1094 Diseases</a>. , APS Press. St Paul, MN. (1991).</li>
<li>Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34(2018).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+of+homogalacturonan%2C+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li>
<li>Hernández-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li>
<li>Denancé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+wat1+%28walls+are+thin1%29-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen%2C+Ralstonia+solanacearum%2C+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li>
<li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction%3A+focus+at+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li>
<li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li>
<li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li>
<li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retire+statistical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ralstonia solanacearum stanowi poważne zagrożenie dla rolnictwa; Jednak jego interakcja z naturalnymi żywicielami o znaczeniu rolniczym jest nadal słabo poznana w porównaniu z innymi patogenami bakteryjnymi, zwłaszcza w przypadku gatunków roślin uprawnych. W większości przypadków analiza genetyczna jest utrudniona ze względu na czas i koszty wymagane do genetycznej modyfikacji roślin żywicielskich. Aby rozwiązać ten problem i ułatwić analizę genetyczną zakażenia R. solanacearum w pomidorach, opracowaliś...

Ralstonia solanacearum, czynnik wywołujący bakteryjną chorobę więdnięcia, jest niszczycielskim patogenem naczyniowym przenoszonym przez glebę o światowym zasięgu, który może infekować wiele gatunków roślin, w tym między innymi ziemniaki, pomidory, tytoń, banany, papryki i bakłażan1,2. Straty w plonach spowodowane przez Ralstonia mogą sięgać 80-90% produkcji pomidorów, ziemniaków lub bananów, w zależności od odmiany, klimatu, gleby i innych czynników3. Model Ralstonia jest jednak znacznie słabo zbadany w porównaniu z innymi modelami obejmującymi bakteryjne patogeny roślin, takimi jak Pseudomonas syringae czy Xanthomonas spp. Ponadto większość badań nad interakcjami między roślinami a mikroorganizmami koncentruje się na roślinie modelowej Arabidopsis thaliana. Chociaż badania z wykorzystaniem tych modeli w dużej mierze przyczyniły się do naszego zrozumienia interakcji między roślinami a bakteriami, nie rozwiązują one obecnej potrzeby zrozumienia tych interakcji w roślinach uprawnych. Badania mające na celu zrozumienie interakcji między Ralstonią a roślinami uprawnymi są niezbędne do opracowania zrównoważonych rozwiązań w walce z bakteryjną chorobą więdnięcia, ale obecnie są utrudnione przez brak prostych testów eksperymentalnych charakteryzujących różne składniki interakcji. W szczególności pomidor, naturalny żywiciel Ralstonia, jest drugą najważniejszą uprawą warzyw na świecie i jest dotknięty mnóstwem chorób4, w tym bakteryjną chorobą więdnięcia. W niniejszej pracy opracowaliśmy łatwą metodę przeprowadzania analizy genetycznej zakażenia pomidora Ralstonia. Metoda ta opiera się na transformacji korzeni pomidora za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes, przy użyciu fluorescencji DsRed jako markera selekcji5, a następnie inokulacji Ralstonia glebowo powstałych roślin, zawierających przekształcone korzenie wyrażające interesujący nas konstrukt. Wszechstronność testu transformacji korzeniowej pozwala na przeprowadzenie nadekspresji genów lub wyciszenia genów za pośrednictwem RNAi.
Potencjalne ograniczenie tej metody polega na szczątkowym wzroście nieprzekształconych korzeni. Jest to szczególnie ważne w przypadkach, gdy zastosowany plazmid nie ma genu reporterowego, który umożliwia selekcję przekształconych korzeni. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy alternatywną metodę opartą na selekcji antybiotyków, która hamuje wzrost nieprzekształconych korzeni, umożliwiając jednocześnie wzrost zdrowych, odpornych na antybiotyki przekształconych korzeni. Ponieważ A. rhizogenes nie indukuje przemiany pędów, są one wrażliwe na antybiotyk i dlatego powinny być trzymane oddzielnie od pożywki zawierającej antybiotyk.
Chociaż odporność roślin na Ralstonia nie jest dobrze poznana, kilka raportów wiąże zmiany w ścianie komórkowej ze zwiększoną odpornością na więdnięcie bakterii6,7,8,9. Zasugerowano, że te zmiany w ścianie komórkowej wpływają na rozwój naczyń krwionośnych, co jest istotnym aspektem stylu życia Ralstonia wewnątrz rośliny10. Wykazano, że mutacje w genach kodujących syntazy celulozy CESA4, CESA7 i CESA8 u Arabidopsis thaliana upośledzają wtórną integralność ściany komórkowej, powodując zwiększoną oporność na Ralstonia, co wydaje się być związane z sygnalizacją ABA8. Dlatego, jako dowód słuszności koncepcji naszej metody, przeprowadziliśmy wyciszanie genu SlCESA6 (Solyc02g072240), wtórnej syntazy celulozy ściany komórkowej za pośrednictwem RNAi, oraz ortologa AtCESA8 (At4g18780). Późniejsze nasiąkanie gleby preparatem Ralstonia wykazało, że wyciszenie SlCESA6 zwiększyło odporność na objawy więdnięcia bakterii, co sugeruje, że oporność na Ralstonia za pośrednictwem ściany komórkowej jest prawdopodobnie zachowana w pomidorze i potwierdza naszą metodę przeprowadzania analizy genetycznej odporności bakterii na więdnięcie w korzeniach pomidora. W tym miejscu szczegółowo opisujemy tę metodę, umożliwiającą podejście genetyczne do zrozumienia bakteryjnej choroby więdnięcia w stosunkowo krótkim czasie i przy niewielkich wymaganiach dotyczących sprzętu i przestrzeni do wzrostu roślin.

<table><tbody><tr><td>90 mm kwadratowe szalki</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>Agar w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto pepton</td><td>BD (Becton i Dickinson)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Casamino kwasy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibuła</td><td></td><td></td><td></td>filtracyjna</tr><tr><td>System obrazowania roślin In Vivo NightShade LB 985</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Garnki</td><td>Jiffy Jiffy Products International A.S.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taśma mikroporowa</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog medium (M519)</td><td>Phytotechlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podłoże Pindstrup</td><td>Pindstrup Mosebrug A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpel i ostrze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna czysta ławka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier Wahtman</td><td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>OXOID</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Ralstonia solanacearum to niszczący patogen naczyniowy przenoszony przez glebę, który może infekować wiele gatunków roślin, stanowiąc poważne zagrożenie dla rolnictwa. Jednak model Ralstonia jest znacznie słabo zbadany w porównaniu z innymi modelami obejmującymi bakteryjne patogeny roślin, takie jak Pseudomonas syringae u rzodkiewnika. Badania mające na celu zrozumienie interakcji między Ralstonią a roślinami uprawnymi są niezbędne do opracowania zrównoważonych rozwiązań w walce z bakteryjną chorobą więdnięcia, ale obecnie są utrudnione przez brak prostych testów eksperymentalnych charakteryzujących różne składniki interakcji w rodzimych roślinach żywicielskich. W tym scenariuszu opracowaliśmy metodę przeprowadzania analizy genetycznej zakażenia Ralstonia pomidora, naturalnego żywiciela Ralstonia. Metoda ta opiera się na transformacji korzeni pomidora za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes, a następnie na nasiąkaniu glebą otrzymanych roślin za pomocą Ralstonia, zawierających przekształcone korzenie wyrażające interesujący nas konstrukt. Wszechstronność testu transformacji korzeniowej pozwala na przeprowadzenie nadekspresji genów lub wyciszenia genów za pośrednictwem RNAi. Jako dowód słuszności koncepcji zastosowaliśmy tę metodę, aby wykazać, że wyciszanie SlCESA6 w korzeniach pomidora za pośrednictwem RNAi nadało odporność na Ralstonia. W tym miejscu szczegółowo opisujemy tę metodę, umożliwiającą podejście genetyczne do zrozumienia bakteryjnej choroby więdnięcia w stosunkowo krótkim czasie i przy niewielkich wymaganiach dotyczących sprzętu i przestrzeni do wzrostu roślin.

Rysunek 5 przedstawia rozwój objawów choroby u roślin pomidora z korzeniami przekształconymi za pomocą pustego wektora (EV) oraz u roślin z korzeniami przekształconymi konstruktem RNAi celującym w SlCESA6 (Solyc02g07240). Dane indeksu choroby (Rysunek 5A) zostały zebrane z tej samej jednostki eksperymentalnej (każda roślina) w czasie według arbitralnej skali od 0 do 4 i nie wykazują rozkładu Gau...

Tutaj prezentujemy wszechstronną metodę transformacji korzenia pomidora, a następnie inokulacji Ralstonia solanacearum, aby przeprowadzić prostą analizę genetyczną do badania bakteryjnej choroby więdnięcia.

Transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja Ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala naukowcom przeprowadzić prostą analizę genetyczną bakteryjnej choroby więdnięcia pomidorów. Główną zaletą tej techniki jest to, że manipulacja ekspresją genów i późniejsze testy mogą być wykonywane w krótkim czasie i przy niewielkich wymaganiach dotyczących sprzętu i przestrzeni do wzrostu roślin. Jest to metoda bardzo wszechstronna i może być stosowana do innych roślin uprawnych w celu przeprowadzenia zarówno inokulacji patogenów, jak i innych testów fizjologicznych.Aby zachować sterylność podczas manipulacji sadzonkami in vitro, ważne jest, aby płytki były zamknięte, gdy znajdują się poza okapem przepływowym. Jest to łatwa technika, ale wymaga wielu kroków do manipulacji. Wizualizacja tej metody pomoże dostrzec drobne sztuczki, które są trudne do wyjaśnienia w manuskrypcie, pomagając innym badaczom wdrożyć metodę w swoich laboratoriach.W zademonstrowaniu tej procedury pomoże Achen Zhao, doktorant. Po wysterylizowaniu i umyciu nasion pomidora przenieś je na podłoże o połowie mocy Murashige i Skoog bez sacharozy. Trzymaj nasiona w ciemności w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza przez trzy dni.Umieść autoklawowane filtry o średnicy 8,5 centymetra kwadratowego w dziewięciocentymetrowych szalkach Petriego zawierających pożywkę Murashige i Skoog o połowie mocy, a na każdej talerzu umieść sześć kiełkujących nasion pomidorów. Uszczelnij płytkę taśmą Micropore i inkubuj kiełkujące nasiona w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Hoduj Agrobacterium rhizogenes MSU440 w stałym podłożu LB z odpowiednimi antybiotykami przez dwa dni w temperaturze 28 stopni Celsjusza przed przemianą rośliny.Za pomocą sterylnego skalpela odetnij korzonek i spód hipokotylu sadzonek pomidorów. Użyj plastikowych końcówek lub ostrza skalpela, aby zebrać biomasę A.rhizogenes z powierzchni podłoża LB i ostrożnie zanurz pokrojone sadzonki pomidorów w biomasie bakteryjnej. Następnie przykryj sadzonki pomidorów półokrągłą bibułą filtracyjną o wymiarach dwa na cztery centymetry, aby utrzymać wysoką wilgotność i ułatwić przetrwanie oraz rozwój nowych korzeni.Ważne jest, aby trzymać sadzonki w wysokiej wilgotności w środowisku umożliwiającym transpirację. Aby to zrobić, przykryj sadzonki bibułą filtracyjną i zamknij płytkę taśmą Micropore. Przetworzone sadzonki pomidorów przechowuj przez sześć do siedmiu dni w komorze wzrostowej w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza.Następnie użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć nowo pojawiające się owłosione korzenie i pozwól sadzonkom wytworzyć nowe owłosione korzenie. Gdy pojawi się druga generacja nowych owłosionych korzeni, usuń bibułę filtracyjną z wierzchu sadzonek i ponownie uszczelnij płytkę taśmą Micropore. Aby uwidocznić fluorescencję DsRed lub jakikolwiek inny sprzęt do obrazowania roślin in vivo, zaznacz dodatnio przekształcone korzenie, które można zidentyfikować za pomocą czerwonej fluorescencji.Użyj skalpela, aby usunąć ujemne, nieprzekształcone korzenie, które można rozpoznać po braku czerwonej fluorescencji. Przenieś siewki, które wykazują czerwoną fluorescencję, na nową płytkę zawierającą pożywkę o połowie mocy Murashige i Skoog, aby ułatwić rozwój przekształconego korzenia jako głównego korzenia. Trzymaj sadzonki, które nie wykazują czerwonej fluorescencji, na tej samej płytce, aby sprawdzić pojawienie się fluorescencyjnych korzeni w późniejszych punktach czasowych.Przykryj sadzonki półokrągłą bibułą filtracyjną o wymiarach dwa na cztery centymetry, uszczelnij płytkę i inkubuj sadzonki, aby mogły rozwinąć nowe, owłosione korzenie. Przygotuj doniczki do zaszczepiania, w których powierzchnia korzeni będzie wystawiona na działanie inokulum bakteryjnego, najpierw namocz doniczki do zaszczepiania wodą, wylewając nadmiar wody, a następnie umieszczając je w plastikowej tacy do sadzenia. Za pomocą pęsety przenieś wybrane sadzonki z przekształconymi korzeniami do doniczek do zaszczepiania.Przykryj tackę folią spożywczą lub przezroczystą pokrywką i utrzymuj je w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza przy wilgotności 65%. Zdejmij pokrywę po pięciu lub sześciu dniach. Hoduj Ralstonia w płynnym podłożu o masie pięciu funtów w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 28 stopni Celsjusza, z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min, aż do fazy stacjonarnej.Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach, aby określić liczbę bakterii. Rozcieńczyć kulturę bakteryjną wodą do OD600 1. Umieść od 16 do 20 doniczek do zaszczepiania, które zawierają przekształcone rośliny pomidora, na tacy do zaszczepiania.Następnie wlej 300 mililitrów rozcieńczonego inokulum bakteryjnego do tacy i pozwól roślinom zanurzyć się w inokulum przez 20 minut. Następnie przygotuj nową tacę z warstwą ziemi doniczkowej. Przenieś zaszczepione doniczki do nowej tacki i umieść tace w komorze wzrostu o wilgotności 75%, temperaturze od 26 do 28 stopni Celsjusza i fotoperiodzie 12 godzin światła i 12 godzinach ciemności.Tutaj korzenie pomidora są przekształcane i zaszczepiane Ralstonią w celu przeprowadzenia prostej analizy genetycznej w celu zbadania bakteryjnej choroby więdnięcia. Rozwój objawów chorobowych śledzi się u roślin pomidora z korzeniami przekształconymi pustym wektorem oraz u tych przekształconych za pomocą konstruktu RAI ukierunkowanego na pomidora CESA6. Dane dotyczące indeksu choroby są zbierane z tej samej jednostki doświadczalnej w czasie zgodnie z dowolną skalą od zera do czterech i nie są zgodne z rozkładem Gaussa, co wyklucza stosowanie standardowych testów dla danych parametrycznych.Jako standardowe podejście stosuje się dwustronny, nieparametryczny test U Manna-Whitneya do porównania zarówno krzywej kontrolnej, jak i krzywej infekcji. Zgodnie z tą analizą różnica między medianami obu krzywych wydaje się nieistotna. Możliwe jest również ilościowe określenie obszaru pod krzywą postępu choroby, co pozwala na połączenie wielu obserwacji postępu choroby w jedną wartość.Obszar pod krzywą postępu choroby wykazuje wyższą wartość dla roślin kontrolnych w porównaniu z roślinami CESA6 RNAi pomidora pod koniec procesu infekcji, co wskazuje, że rośliny pomidora wyciszone CESA6 są bardziej odporne na infekcję Ralstonia niż rośliny kontrolne. Przedziały ufności umożliwiają oszacowanie, z dużym prawdopodobieństwem, zakresu wartości, w którym znajduje się wartość populacji danej zmiennej. Jak widać tutaj, obszar 95% przedziału ufności dla krzywych kontroli i infekcji szacuje większe prawdopodobieństwo oporności, gdy CESA6 jest wyciszony.Wartości indeksu choroby można przekształcić w dane binarne, biorąc pod uwagę, że indeks choroby niższy niż dwa odpowiada zero, a indeks choroby równy lub wyższy niż dwa odpowiada jedynce. Pozwala to na przedstawienie krzywej przeżycia po zaszczepieniu Ralstonia. Różnice we wskaźniku przeżywalności między roślinami kontrolnymi a zakażonymi nie są statystycznie istotne zgodnie z testem statystycznym Gehana-Breslowa-Wilcoxona.Ekspresja CESA6 jest następnie analizowana w dwóch losowo wybranych przekształconych korzeniach przed etapem inokulacji, wykazując, że zwiększona odporność na Ralstonia koreluje ze zmniejszoną ekspresją CESA6. Po dwóch rundach selekcji można uzyskać współczynnik przemiany od 35 do 40%, a wartość tę można zwiększyć, wykonując dodatkowe rundy selekcji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby sadzonki były przykryte kawałkiem bibuły filtracyjnej, aby utrzymać wysoką wilgotność i uszczelnić płytki za pomocą Micropore, aby zapewnić wymianę gazową.Po transformacji korzeni wiele zabiegów można zastosować do badania reakcji roślin poprzez obserwację fizjologii korzeni lub wykorzystanie biologii molekularnej, biologii komórki lub biochemii. Przede wszystkim technika ta pozwoli naukowcom dysponującym ograniczonymi zasobami na przeprowadzenie analizy genetycznej infekcji bakteryjnej korzeni pomidora.

tomato-root-transformation-followed-inoculation-with-ralstonia

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Źródło: Hassan, J. A., et al. Wysokoprzepustowa identyfikacja oporności na Pseudomonas syringae pv. Pomidor w pomidorze za pomocą testu powodziowego sadzonek. J. Vis. Exp. (2020).Ten film przedstawia metodę badań przesiewowych pod kątem oporności bakteryjnej w różnych odmianach pomidorów przy użyciu dziesięciodniowych sadzonek zaszczepionych zawiesiną bakteryjną. Wyjaśnia, w jaki sposób bakterie atakują aparaty szparkowe, dostarczają białka efektorowe w celu stłumienia odporności roślin oraz...

Test zalewania sadzonek w celu badania przesiewowego odporności bakteryjnej pomidorów

Źródło: Matthysse, A. G. Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium. J. Vis. Exp., (2018)Ten film pokazuje protokół pomiaru kolonizacji korzeni siewek pomidora przez bakterie patogenne typu dzikiego i niedoborowego celulozy. Liczebne ilości gęsto przylegających bakterii wykazują większą przyczepność i tworzenie mikrokolonii przez szczep typu dzikiego, co podkreśla rolę celulozy w stabilnej kolonizacji korzeni.

Ocena kolonizacji korzeni siewek pomidorów przez patogenną bakterię na podstawie liczenia komórek żywotnych

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest zbadanie transkryptomicznej odpowiedzi izolowanych endosferą Bacillus mycoides na wysięki z korzenia ziemniaka. Metoda ta ułatwia identyfikację ważnych genów bakteryjnych zaangażowanych w interakcje roślina-mikroorganizm i zasadniczo ma zastosowanie do innych endofitów i roślin, z niewielkimi dostosowaniami.

Interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Test zalewania sadzonek ułatwia szybkie badanie odmian dzikich pomidorów pod kątem odporności na bakterię Pseudomonas syringae. Ten test, stosowany w połączeniu z testem wzrostu bakterii siewek, może pomóc w dalszym charakteryzowaniu podstawowej odporności na bakterię i może być wykorzystany do mapowania populacji w celu określenia genetycznych podstaw odporności.

Wysokoprzepustowa identyfikacja oporności na Pseudomonas syringae pv. Pomidor w pomidorze za pomocą testu powodziowego sadzonek

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.

Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Protokół opisuje zakażenie korzeni Solanum tuberosum pasożytniczymi nicieniami w warunkach szklarniowych in vivo oraz transgeniczne korzenie ziemniaka in vitro do analizy histochemicznej struktury korzenia za pomocą mikroskopii optycznej.

Zakażenie in vivo i in vitro korzeni ziemniaka nicieniami pasożytniczymi roślin w celu oceny indukowanych zmian strukturalnych

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Poznaj metodę transformacji korzenia pomidora i inokulacji Ralstonia solanacearum. Technika umożliwia szybką analizę genetyczną bakteryjnej choroby więdnięcia z minimalnymi wymaganiami sprzętowymi.

Transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja Ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia (Wideo) | JoVE Journal

Transformacja korzenia pomidora, a następnie inokulacja Ralstonia solanacearum w celu prostej analizy genetycznej bakteryjnej choroby więdnięcia

Przeglądaj więcej filmów