Name: System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj metodę tworzenia matryc 3D pochodzących z fibroblastów do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka. Technika ta umożliwia badanie interakcji komórkowych w środowisku zbliżonym do in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rozwój tego protokołu był wspierany przez PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 i RD12/0036/0041 z Instituto de Salud Carlos III; przez Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); przez "CIBER de Cáncer", CB16/12/00273 i CB16/12/00446, przez Instituto de Salud Carlos III-FEDER; oraz przez Fundación Científica AECC (wieloaspektowe podejście do zwalczania raka trzustki). Cristina Peña jest laureatką kontraktu Miguela Serveta z Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude pomógł w przygotowaniu tekstu w języku angielskim. Dziękujemy członkom laboratorium za pomoc i rady podczas tych badań.

Próbki tkanek ludzkich uzyskano za zgodą Komisji Etyki Badań Szpitala Ramón y Cajal w Madrycie.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj 0,2% roztwór żelatyny: dodaj 1 g żelatyny do 500 ml PBS. Roztwór należy sterylizować w autoklawie i utrzymywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem przefiltrować go filtrem 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotuj 1% aldehydu glutarowego: Dodaj 1 ml 25% roztworu podstawowego aldehydu glutarowego do 24 ml PBS. Przed użyciem przefiltrować filtrem 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować 1 M etanoloaminę: przygotować roztwór etanoloaminy ze sterylnymH2O. Przed użyciem przefiltrować filtrem 0,22 μm. 
	UWAGA: Ponieważ etanoloamina jest dostarczana z nasadką zabezpieczającą, potrzebna będzie igła i strzykawka.</li>
	<li>Przygotować kwas askorbinowy: dodać 0,1 ml 50 mg/ml roztworu podstawowego kwasu askorbinowego (wrażliwego na światło) do 100 ml pożywki.</li>
	<li>Przygotuj bufor do lizy: przygotuj PBS 0,5% Triton 100X z 20 nM NH4OH. Dodaj NH4OH bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować PBS Pen/Strep: rozcieńczyć roztwór podstawowy Pen/Strep do 100 U/ml Pen i 100 μg/ml Strep.</li>
	<li>Przygotuj DMEM z 10% FBS: Dodaj 10% FBS do 500 ml DMEM. Suplement zawierający 100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,1 mg/ml normocyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B.</li>
	<li>Przygotuj 2% BSA denaturowanego na gorąco: dodaj 2 g BSA do 100 ml sterylnej wody. Podgrzewać we wrzącej wodzie przez 7 min.</li>
	<li>Przygotuj FBS z antybiotykami: uzupełnij FBS o 200 U/ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyny, 100 μg/ml gentamycyny i 2,5 g/ml amfoterycyny B.</li>
</ol>
2. Przygotowanie hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Unieśmiertelniona linia komórkowa fibroblastów
	<ol>
		<li>Hodowla rekombinowanej telomerazy transfekowanej unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów napletka (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) w DMEM z 10% FBS i utrzymywać w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki śródbłonka
	<ol>
		<li>Hodowla ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC, ATCC PCS-100-013) w pożywce EBM-2 zawierającej 2% FBS i utrzymywanie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pierwotna kultura fibroblastów 
	UWAGA: W przypadku ustanowienia i hodowli CAF, protokół opublikowany wcześniej przez naszą grupę był przestrzegany6.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, pokrój próbki tkanek na małe kawałki o wielkości około 2-3 mm3 i zasiej w FBS z wysokim stężeniem antybiotyków.</li>
		<li>Kiedy pojawią się pierwsze fibroblasty, zastąp pożywkę pożywką FBM do konserwacji komórek. 
		UWAGA: W zależności od pochodzenia tkanki, kultury komórkowe mogą być łatwo skażone. Umyj próbki w PBS uzupełnionym antybiotykami, z silnie zanieczyszczoną tkanką (np. okrężnica6) i wstrząsaj przez 30-45 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Matryce 3D pochodzące z fibroblastów (Na podstawie Castelló-Cros i Cukierman16)
<ol>
	<li>Dodać 2 ml 0,2% roztworu żelatyny do każdego dołka na płytce 6-dołkowej i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać żelatynę i umyć ją w 2 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 2 ml 1% aldehydu glutarowego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aldehyd glutarowy sieciuje żelatynę.</li>
	<li>Odessać aldehyd glutarowy i przemyć studzienki w 2 ml PBS przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.</li>
	<li>Dodać 2 ml 1 M etanoloaminy i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Etanoloamina będzie działać w celu zablokowania pozostałego aldehydu glutarowego.</li>
	<li>Odessać etanoloaminę i przemyć studzienki w 2 ml PBS przez 5 min. Powtórzyć 3 razy.</li>
	<li>Dodaj 1 ml DMEM z 10% FBS. Jeśli podłoże natychmiast zmieni kolor na różowy, usuń pożywkę, przemyj 2 ml PBS i ponownie dodaj 1 ml DMEM z 10% FBS.</li>
	<li>Wysiewaj 1 ml zawiesiny fibroblastów, z 5 x 105 komórek w każdym dołku. Całkowita objętość w każdym dołku wyniesie 2 ml.</li>
	<li>Hoduj komórki, aż do osiągnięcia 100% zbieżności. Następnie usuń pożywkę i zastąp DMEM 10% FBS z 50 μg/ml kwasu askorbinowego i dodatkową obróbką, jeśli jest stosowana.</li>
	<li>Zastąp pożywkę świeżym DMEM z 10% FBS i 50 μg/ml kwasu askorbinowego co 2 dni przez 6 dni. 
	UWAGA: Jeśli stosuje się dodatkową obróbkę (np. PDGF-BB, TGF-β i/lub inne czynniki wzrostu), dodaj je w tych samych dniach, w których dodawana jest obróbka kwasem askorbinowym.</li>
	<li>Dwa dni po ostatnim zabiegu kwasem askorbinowym usuń pożywkę i przemyj w 2 ml PBS.</li>
	<li>Powoli dodawać 1 ml buforu do lizy, wstępnie podgrzanego w temperaturze 37 °C, do każdego dołka. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej, aż fibroblasty zostaną poddane lizie (obserwowalnej pod mikroskopem).</li>
	<li>Ostrożnie i bez usuwania buforu do lizy dodać 2 ml PBS. Następnie odessać około 2,5 ml PBS. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania.</li>
	<li>Na koniec usuń 2,5 ml PBS i dodaj 2 ml PBS za pomocą Pen/Strep (odpowiednio 100 U/ml i 100 μg/ml). Uszczelnić folią i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. 
	UWAGA: W zależności od eksperymentu, długotrwałe przechowywanie wygenerowanych matryc może mieć wpływ na wyniki. Zalecamy jak najszybsze użycie matryc, a tym bardziej, jeśli eksperyment obejmuje wysiewanie komórek, ze względu na możliwą degradację białek. Jeśli matryce są używane do testów strukturalnych, takich jak obserwacja kolagenu, matryce mogą być utrwalane i przechowywane przez dłuższy czas. Protokół ten jest wskazany dla 6-dołkowej płytki hodowlanej. Można użyć innych płytek, ale objętości reaktywne i stężenie zawiesiny komórek należy ponownie obliczyć w zależności od powierzchni studzienki.</li>
</ol>
4. Test tworzenia probówek
<ol>
	<li>Hoduj komórki HUVEC w EBM-2 2% FBS aż do maksymalnej konfluencji.</li>
	<li>Wymień pożywkę na EBM-2 bez FBS na 8 godzin.</li>
	<li>Przygotuj matryce przed wysiewem komórek.
	<ol>
		<li>Wyjmij matryce z lodówki i umieść na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Blokuj matryce, dodając 2 ml denaturowanego termicznie 2% BSA. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odessać BSA i przemyć w 2 ml PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zasiać 2 x 105 komórek HUVEC w pożywce zubożonej w FBS na każdym dołku 6-dołkowej płytki uprzednio pokrytej matrycami pochodzącymi z fibroblastów 3D.</li>
	<li>Inkubować komórki śródbłonka w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Zbadaj tworzenie się struktury przypominającej rurkę pod standardowym mikroskopem jasnego pola przy powiększeniu 20-40x.</li>
</ol>

<ol><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li>
<li>Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+Structure%2C+composition%2C+age-related+differences%2C+tools+for+analysis+and+applications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li>
<li>Erdogan, B., Webb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+modulate+growth+factor+signaling+and+extracellular+matrix+remodeling+to+regulate+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kB-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).</li>
<li>Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+Cancer-associated+Fibroblast+Establishment+and+Culture+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth.</a> Bio-protocol. 6 (7), e1773(2016).</li>
<li>Herrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+activation+on+3D-matrices+derived+from+PDGF-BB-stimulated+fibroblasts+is+mediated+by+Snail1%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1.</a> Oncogenesis. 7 (9), 76(2018).</li>
<li>MacColl, E., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Metalloproteinases+as+Regulators+of+Vein+Structure+and+Function%3A+Implications+in+Chronic+Venous+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).</li>
<li>Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Invasion+and+Angiogenesis+by+Zinc-Chelating+Agent+Disulfiram%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram.</a> Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).</li>
<li>Neri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+invasion+driven+by+extracellular+matrix+remodeling+is+dependent+on+the+properties+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).</li>
<li>Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+morphogenesis+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+on+cell-derived+macromolecular+matrix+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment.</a> Tissue Engineering. (Part A), (2014).</li>
<li>Bignon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase-like+protein+2+regulates+sprouting+angiogenesis+and+type+IV+collagen+assembly+in+the+endothelial+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane.</a> Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).</li>
<li>Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+in+digestive+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).</li>
<li>Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+Snail1+in+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of Snail1 in the tumor stroma.</a> Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).</li>
<li>Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+Scaffolds+for+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).</li>
<li>Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCastell%C3%B3-Cros%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 522, 275-305 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Matryce mogą być generowane z unieśmiertelnionych fibroblastów lub pierwotnych kultur fibroblastów. Fibroblasty są łatwe w utrzymaniu w hodowli in vitro o wysokim tempie wzrostu i odporności na stres. Można je nawet wyizolować z tkanki pośmiertnej3, chociaż zanieczyszczenie może być ograniczeniem, w zależności od pochodzenia tkanki.
Model matrycowy 3D oferuje nowatorski i skuteczny system do skutecznego badania składu ECM i orientacji włókien. Nadaje się również do anal...

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest dynamiczną strukturą obecną we wszystkich typach tkanek. Składa się z białek i polisacharydów, które tworzą sieć włókien kluczowych dla adhezji komórek, migracji i komunikacji1. Skład ECM różni się w zależności od tkanki. Podczas gdy kolagen typu I jest najbardziej rozpowszechnionym białkiem strukturalnym, kolagen typu II, III, V i XI można również znaleźć w różnych tkankach2. Fibronektyna wytwarzana przez fibroblasty jest potrzebna do adhezji komórek2. Ponadto istnieją inne cząsteczki strukturalne, takie jak elastyna, laminina i receptory powierzchniowe zwane integrynami, które pośredniczą w składaniu włókien i są specyficzne dla różnych tkanek ECM2. ECM odgrywa ważną rolę jako rusztowanie komórkowe i może być również zaangażowany zarówno w procesy fizjologiczne, jak i patologiczne1. Nieprawidłowości w ECM obserwuje się w patologiach, takich jak rak, który zmienia skład ECM i/lub jego organizację. W nowotworach ECM reprezentuje niekomórkowy składnik mikrośrodowiska guza (TME), złożonego środowiska składników komórkowych, takich jak fibroblasty, komórki odpornościowe, komórki śródbłonka, perycyty i różne rozpuszczalne czynniki. Wiadomo, że TME sprzyja progresji raka i przerzutom; W procesie tym biorą udział fibroblasty związane z rakiem, jako dominujący typ komórek w zrębie guza3. W przeciwieństwie do normalnych fibroblastów, CAF są w stanie stałej aktywacji, wykazując zwiększone wydzielanie białek ECM i czynników wzrostu (np. Transforming Growth Factor-β, TGF-β), a także wyższą ekspresję niektórych markerów, takich jak aktyna α-mięśni gładkich (α-SMA) i białko aktywujące fibroblasty (FAP)4. Jednak CAF to niejednorodna populacja komórek, wykazująca różne poziomy aktywacji lub ekspresji markerów5. Można zatem założyć, że skład i struktura matryc pochodzących z fibroblastów będzie zależała od statusu i charakterystyki fibroblastów.
W tym kontekście, celem tej metodologii jest ustanowienie odpowiedniego modelu in vitro do generowania ECM przez fibroblasty, równoważnego ustawieniu ECM in vivo. Proponujemy to podejście jako metodologię translacyjną in vitro do dalszych badań funkcji komórek nowotworowych, takich jak chemooporność lub migracja, w których pośredniczy ECM. Jak nasza grupa opublikowała w innym miejscu, CAF można uzyskać ze świeżych próbek tkanek, ale należy zauważyć, że przeżywalność CAF w hodowli jest ograniczona, a liczba ich pasaży komórkowych jest zmniejszona6. Ponadto do generowania matrycy można wykorzystać pierwotne kultury CAF utworzone z próbek pobranych od pacjentów. Manipulowanie ekspresją genów w fibroblastach jest również interesującym sposobem wytwarzania zróżnicowanych matryc in vitro w celu oceny możliwego wpływu na skład matrycy, orientację włókien itp. W związku z tym nasza grupa niedawno poinformowała o roli fibroblastów wyrażających ślimaka w składzie i orientacji włókien różnych pochodnych matryc7.
Ponadto, CAFy i ECM są zaangażowane w układ naczyniowy, zarówno w generowaniu naczyń, jak i jako część zewnętrznej warstwy wazonu8. Przebudowa ECM indukuje angiogenezę; Metaloproteinazy macierzy (MMP) wydają się być najważniejszym typem enzymu przyczyniającym się do tego procesu9,10. Unaczynienie tkanek komórek pierwotnych, które generują ECM, makrocząsteczki ECM, resztkowe czynniki wzrostu zawarte w ECM, elastyczność matrycy i grubość matrycy są opisane jako czynniki zaangażowane w aktywację komórek śródbłonka11. W nowotworach niedotlenienie zwiększa sztywność ECM i generowanie kiełków śródbłonka12. Ponadto CAF wydzielają czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) i płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF), które stymulują angiogenezę w zrębie guza13. W tej dziedzinie generowanie matryc in vitro może być wykorzystywane do badania procesów angiogenezy lub działania MMP w różnych warunkach eksperymentalnych. W związku z tym reprodukcja in vitro najbardziej analogicznej matrycy in vivo może być cennym narzędziem do badania roli ECM w angiogenezie lub mikrośrodowiskowych interakcjach komórkowych.
Stymulacja hodowanych fibroblastów kwasem askorbinowym w celu zwiększenia osadzania matrycy i generowania ECM jest akceptowanym sposobem wytwarzania analogicznych matryc in vivo. Unieśmiertelnione linie komórkowe fibroblastów są łatwe do hodowli i są aktywowane przez różne czynniki wzrostu, takie jak PDGF-BB, Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) lub TGF-β14. W ramach TME CAF syntetyzują kolagen typu I i fibronektynę jako główne składniki ECM4. Podobnie, składniki te znajdują się jako główne składniki matryc pochodzących z fibroblastów generowanych in vitro (ryc. 1).
Istnieją różne metodologie symulacji in vivo ECM. Zastosowanie powlekanych szalek hodowlanych z mieszaninami włókien ECM zostało rozszerzone w poprzednich latach, ale to podejście 2D wymagało ulepszenia struktur 3D, takich jak usieciowane żele (np. Matrigel)1. Konfiguracja podobna do Matrigela stała się standardową metodą symulacji matrycy 3D. Fibryna jest również alternatywą przy generowaniu matryc, ale zawodzi pod względem wytrzymałości i trwałości klasy ECM<sup="xref">1. Kolagen stosowany w połączeniu z innymi składnikami ECM rozwiązuje niektóre z wyżej wymienionych problemów. Jednak te żele kolagenowe tworzą silną sieć z włóknami, które można zorientować, ale są bardzo niejednorodne, co może stanowić problem w powtórzeniach eksperymentów1. Niemniej jednak należy założyć, że w zależności od celu eksperymentów, bardziej odpowiednie jest stosowanie Matrigelu lub innych hydrożeli (np. w badaniach skurczu matrycowego, w których skurcz żelu można łatwo wykryć).
Potencjalna immunogenność wygenerowanych matryc może stanowić problem w eksperymentach z niektórymi typami komórek. Dlatego, aby zmniejszyć możliwość odpowiedzi immunologicznej spowodowanej komórkami generującymi ECM podczas korzystania z naszej metody, matryce są decellularizowane i myte, chociaż usunięcie fragmentów komórek nie może być całkowite15. Idealny ECM musi być kompatybilny z hodowlą komórkową i zdolny do komunikowania się i reagowania na sygnały komórkowe. Nasza procedura pozwala na bezproblemowe wprowadzenie zmian podczas produkcji ECM (np. dodanie czynników wzrostu stymulujących fibroblasty).

<table><tbody><tr><td>Wodorotlenek amonu (NH4OH)</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna-B</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-014-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Śródbłonkowe podłoże podstawowe (EBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3121</td><td>Dodaj suplementy przed użyciem</td></tr><tr><td>Śródbłonkowe podłoże Podstawowe suplementy (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma</td><td>411000-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>inaktywowana termicznie przed użyciem</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Basal Medium (FBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3131</td><td>dodaj suplementy przed użyciem</td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa fibroblastów Suplementy i czynniki wzrostu (FGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma</td><td>g5882</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A92902-100G</td><td>światłoczuła</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>3ANT-NR-2</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycyna (długopis/paciorkowiec)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana telomeraza transfekowana unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty napletka (BJ-hTERT)</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-4001</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka żyła pępowinowa komórki śródbłonka (HUVEC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-013</td><td></td></tr></tbody></table>

system matrycowy 3d pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Fibroblast-Derived 3D Matrix System Applicable to Endothelial Tube Formation Assay

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) to trójwymiarowe rusztowanie, które działa jako główne wsparcie dla komórek w tkankach. Oprócz swojej funkcji strukturalnej, ECM uczestniczy również w migracji, proliferacji i różnicowaniu komórek. Fibroblasty są głównym typem komórek modyfikujących ułożenie i produkcję włókien ECM. W przypadku raka CAF (fibroblasty związane z rakiem) są w stanie trwałej aktywacji, uczestnicząc w przebudowie ECM, ułatwiając migrację komórek nowotworowych i stymulując angiogenezę związaną z nowotworem, a także pełniąc inne role pronowotworowe. Celem tej metody jest stworzenie trójwymiarowej matrycy o składzie włókien zbliżonym do matryc in vivo, przy użyciu unieśmiertelnionych fibroblastów lub ludzkich pierwotnych CAF. Fibroblasty są hodowane na wstępnie poddanych działaniu preparatów do hodowli komórkowych i hodowane pod wpływem stymulacji kwasem askorbinowym. Następnie fibroblasty są usuwane, a matryce blokowane do dalszego wysiewu komórek. W tym modelu ECM fibroblasty mogą być aktywowane lub modyfikowane w celu wytworzenia różnych rodzajów macierzy, których działanie można badać w hodowli komórkowej. Matryce 3D są również kształtowane przez sygnały komórkowe, takie jak enzymy degradacji lub sieciowania, które mogą modyfikować rozkład włókien. W tym kontekście można badać angiogenezę wraz z innymi typami komórek, takimi jak nabłonkowe komórki nowotworowe.

Fibroblasty stymulowane PDGF-BB tworzą grubszą macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Herrera i wsp. wykazali, że fibroblasty stymulowane PDGF generowały grubszą macierz oraz wyższy stopień orientacji włókien7. Fibroblasty BJ-hTERT inkubowano z PDGF lub bez niego, a obserwowane reprezentatywne obszary wykazały bardziej uporządkowany rozkład komórek w macierzach wytworzonych przez fibroblasty stymulowane PDGF (Rysunek 1a). Ek...

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ...

Protokół ten umożliwia zobaczenie różnych typów kultur i obserwację ich interakcji z macierzą zewnątrzkomórkową. Główną zaletą tej metody jest to, że uzyskana matryca jest regenerowana przez fibroblasty i będzie dość podobna do tych generowanych in vivo. Uważamy, że ta choroba nie ma znaczenia w przypadku stosowania fibroblastów otrzymywanych z pieczenia potraw.Ustalenie matrycy z tych komórek może nam wyjaśnić, w jaki sposób może ona wpływać na przykład na uporczywą sytuację. Metody te mogą być również stosowane na przykład do badań fizycznych osób, które przeżyły z właściwości matrycy. Wizualizacja tego protokołu ważne jest, aby obserwować technikę pipetowania kroków, które musisz wykonać.Wypróbowanie tych metod po raz pierwszy prawdopodobnie zajmie więcej czasu niż oczekiwano. Nasza rada jest taka, aby przygotować się jak najwięcej z wyprzedzeniem i wykorzystać okresy czasu na przygotowanie się do kolejnych kroków. Zacznij od przygotowania 0,2% roztworu żelatyny, 1% aldehydu glutarowego i jednego molowego roztworu etanoloaminy zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Upewnij się, że każdy roztwór przepuściłeś przez filtr 0,22 mikrometra przed użyciem. Następnie przygotuj kwas askorbinowy i bufor do lizy. Rozcieńczyć paciorkowiec PBS zgodnie z opisem w manuskrypcie i przygotować DMEM z 10% FBS.Przygotuj denaturowane 2% BSA, dodając 2 gramy BSA do 100 mililitrów sterylnej wody i podgrzewając ją we wrzącej łaźni wodnej przez siedem minut. Następnie uzupełnij FBS penicyliną, streptomycyną, gentamycyną i amfoterycyną B. Kultura rekombinowanych telomerów transfekowała unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty napletka i DMEM za pomocą 10% FBS i utrzymywała je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby ustalić pierwotną kulturę fibroblastów, pokrój próbki tkanek na małe kawałki o wielkości około dwóch do trzech mililitrów w kostkach i zasiew je w FPS z wysokim stężeniem antybiotyków.Kiedy pojawią się pierwsze fibroblasty, zastąp pożywkę pożywką FBM w celu utrzymania komórek. Dodaj dwa mililitry 0,2% roztworu żelatyny do każdego dołka na sześciodołkowej płytce i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać żelatynę i przemyć każdą studzienkę dwoma mililitrami PBS.Dodaj dwa mililitry 1% aldehydu glutarowego do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez trzydzieści minut, co usieciuje żelatynę. Odessać aldehyd glutarowy i umyć studzienki w dwóch mililitrach PBS przez pięć minut. Aby zablokować pozostały aldehyd glutarowy, dodaj dwa mililitry jednej molowej etanoloaminy i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez trzydzieści minut.Odessać etanoloaminę i powtórzyć płukanie PBS. Dodaj jeden mililitr DMEM z 10% FPS. Jeśli podłoże natychmiast zmieni kolor na różowy, usuń je, umyj studzienki raz dwoma mililitrami PBS i dodaj kolejny mililitr DMEM.Wysiewaj jeden mililitr zawiesiny fibroblastów z 5 x 10 do piątych komórek w każdym dołku i hoduj komórki, aż do osiągnięcia 100% zbieżności. Następnie usuń pożywkę i zastąp ją DMEM z 10% FBS i 50 mikrogramami na mililitr kwasu askorbinowego. Wymieniaj pożywkę co dwa dni przez sześć dni.Dwa dni po ostatnim zabiegu kwasem askorbinowym usuń pożywkę i umyj studzienki dwoma mililitrami PBS. Po umyciu powoli dodaj jeden mililitr podgrzanego buforu do lizy i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć do dziesięciu minut, aż fibroblasty zostaną zmielone. Nie usuwając buforu do lizy, ostrożnie dodaj dwa mililitry PBS do każdej studzienki, a następnie odessaj około 2,5 mililitra.Powtórz ten proces dwukrotnie, w sumie trzy prania. Po ostatnim praniu dodaj dwa mililitry PBS z paciorkowcem. Uszczelnij płytkę folią i utrzymuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy.Hoduj komórki HUVEC i EMB-2 z 2% FBS aż do maksymalnej konfluencji. Następnie wymień pożywkę na EBM-2 bez FBS na osiem godzin. Aby przygotować matryce do wysiewu komórek, wyjmij je z lodówki i pozostaw w temperaturze pokojowej na godzinę.Zablokuj matryce, dodając dwa mililitry denaturowanego termicznie 2% BSA i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie odessać BSA i umyć je dwoma mililitrami PBS. Zasiew 2 x 10 do piątej komórki HUVEC do każdej studzienki płytki pokrytej matrycami pochodzącymi z fibroblastów.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin, a następnie zbadaj struktury przypominające rurki pod standardowym mikroskopem jasnego pola przy 20-40-krotnym powiększeniu. Protokół ten wykorzystano do zbadania wpływu leczenia PDGF na tworzenie macierzy pochodzącej z fibroblastów. Trzecie fibroblasty BGH, które inkubowano z PDGF, wykazywały bardziej wyrównany rozkład komórek w matrycach niż te inkubowane bez PDGF.Ekspresja kolagenu 1 i białka fibronektyny została zwiększona w matrycach pochodzących z fibroblastów stymulowanych przez PDGF, a w konsekwencji zwiększyła się grubość matrycy. Co więcej, histogramy kierunkowości pokazują, że kolagen 1 i fibronektyna wykazują równoległe wzorce. Kiedy komórki HUVEC zostały wysiane na zdecelularyzowanych matrycach pochodzących z fibroblastów stymulowanych przez PDGF, rozwinęły one więcej struktur przypominających naczynia włosowate niż w warunkach, w których nie były stymulowane.Potwierdzenie, że matryce pochodzące z fibroblastów stymulowanych PDGF-BB sprzyjają aktywacji komórek śródbłonka. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować roztwory z wyprzedzeniem i upewnić się, że komórki są gotowe przed rozpoczęciem. Oprócz badań nad komórkami śródbłonka, matryce mogą być również obsadzane komórkami nabłonkowymi i można obserwować reakcję na czynniki zewnętrzne, takie jak stan w pożywce lub leki cytotoksyczne.Generowanie macierzy zewnątrzkomórkowej ma kluczowe znaczenie w projektowaniu eksperymentów makrośrodowiska guza.

fibroblast-derived-3d-matrix-system-applicable-to-endothelial-tube

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Test tworzenia probówek jest szybką, mierzalną metodą pomiaru angiogenezy in vitro. Komórki śródbłonka łączy się z kondycjonowanymi pożywkami i plateruje ekstraktem z błony podstawnej. Tworzenie się rurki następuje w ciągu kilku godzin, a nowo utworzone kanaliki można łatwo określić ilościowo.

Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Celem tego protokołu jest bezpośrednie biodrukowanie komórek nabłonka piersi jako wielokomórkowych sferoid na wstępnie utworzonych sieciach śródbłonka, aby szybko stworzyć modele 3D kokultury piersi i śródbłonka, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych leków.

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia szybkiego systemu in vitro, który wspiera trójwymiarową hodowlę i późniejsze różnicowanie światła pierwotnych komórek nabłonka prostaty.

System hodowli 3D oparty na szybkiej wkładce filtrującej do pierwotnego różnicowania komórek gruczołu krokowego

Poznaj metodę tworzenia matryc 3D pochodzących z fibroblastów do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka. Technika ta umożliwia badanie interakcji komórkowych w środowisku zbliżonym do in vivo.

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Przeglądaj więcej filmów