System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Protokół ten umożliwia zobaczenie różnych typów kultur i obserwację ich interakcji z macierzą zewnątrzkomórkową. Główną zaletą tej metody jest to, że uzyskana matryca jest regenerowana przez fibroblasty i będzie dość podobna do tych generowanych in vivo. Uważamy, że ta choroba nie ma znaczenia w przypadku stosowania fibroblastów otrzymywanych z pieczenia potraw.

Ustalenie matrycy z tych komórek może nam wyjaśnić, w jaki sposób może ona wpływać na przykład na uporczywą sytuację. Metody te mogą być również stosowane na przykład do badań fizycznych osób, które przeżyły z właściwości matrycy. Wizualizacja tego protokołu ważne jest, aby obserwować technikę pipetowania kroków, które musisz wykonać.

Wypróbowanie tych metod po raz pierwszy prawdopodobnie zajmie więcej czasu niż oczekiwano. Nasza rada jest taka, aby przygotować się jak najwięcej z wyprzedzeniem i wykorzystać okresy czasu na przygotowanie się do kolejnych kroków. Zacznij od przygotowania 0,2% roztworu żelatyny, 1% aldehydu glutarowego i jednego molowego roztworu etanoloaminy zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Upewnij się, że każdy roztwór przepuściłeś przez filtr 0,22 mikrometra przed użyciem. Następnie przygotuj kwas askorbinowy i bufor do lizy. Rozcieńczyć paciorkowiec PBS zgodnie z opisem w manuskrypcie i przygotować DMEM z 10% FBS.

Przygotuj denaturowane 2% BSA, dodając 2 gramy BSA do 100 mililitrów sterylnej wody i podgrzewając ją we wrzącej łaźni wodnej przez siedem minut. Następnie uzupełnij FBS penicyliną, streptomycyną, gentamycyną i amfoterycyną B. Kultura rekombinowanych telomerów transfekowała unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty napletka i DMEM za pomocą 10% FBS i utrzymywała je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby ustalić pierwotną kulturę fibroblastów, pokrój próbki tkanek na małe kawałki o wielkości około dwóch do trzech mililitrów w kostkach i zasiew je w FPS z wysokim stężeniem antybiotyków.

Kiedy pojawią się pierwsze fibroblasty, zastąp pożywkę pożywką FBM w celu utrzymania komórek. Dodaj dwa mililitry 0,2% roztworu żelatyny do każdego dołka na sześciodołkowej płytce i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać żelatynę i przemyć każdą studzienkę dwoma mililitrami PBS.

Dodaj dwa mililitry 1% aldehydu glutarowego do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez trzydzieści minut, co usieciuje żelatynę. Odessać aldehyd glutarowy i umyć studzienki w dwóch mililitrach PBS przez pięć minut. Aby zablokować pozostały aldehyd glutarowy, dodaj dwa mililitry jednej molowej etanoloaminy i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez trzydzieści minut.

Odessać etanoloaminę i powtórzyć płukanie PBS. Dodaj jeden mililitr DMEM z 10% FPS. Jeśli podłoże natychmiast zmieni kolor na różowy, usuń je, umyj studzienki raz dwoma mililitrami PBS i dodaj kolejny mililitr DMEM.

Wysiewaj jeden mililitr zawiesiny fibroblastów z 5 x 10 do piątych komórek w każdym dołku i hoduj komórki, aż do osiągnięcia 100% zbieżności. Następnie usuń pożywkę i zastąp ją DMEM z 10% FBS i 50 mikrogramami na mililitr kwasu askorbinowego. Wymieniaj pożywkę co dwa dni przez sześć dni.

Dwa dni po ostatnim zabiegu kwasem askorbinowym usuń pożywkę i umyj studzienki dwoma mililitrami PBS. Po umyciu powoli dodaj jeden mililitr podgrzanego buforu do lizy i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć do dziesięciu minut, aż fibroblasty zostaną zmielone. Nie usuwając buforu do lizy, ostrożnie dodaj dwa mililitry PBS do każdej studzienki, a następnie odessaj około 2,5 mililitra.

Powtórz ten proces dwukrotnie, w sumie trzy prania. Po ostatnim praniu dodaj dwa mililitry PBS z paciorkowcem. Uszczelnij płytkę folią i utrzymuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy.

Hoduj komórki HUVEC i EMB-2 z 2% FBS aż do maksymalnej konfluencji. Następnie wymień pożywkę na EBM-2 bez FBS na osiem godzin. Aby przygotować matryce do wysiewu komórek, wyjmij je z lodówki i pozostaw w temperaturze pokojowej na godzinę.

Zablokuj matryce, dodając dwa mililitry denaturowanego termicznie 2% BSA i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie odessać BSA i umyć je dwoma mililitrami PBS. Zasiew 2 x 10 do piątej komórki HUVEC do każdej studzienki płytki pokrytej matrycami pochodzącymi z fibroblastów.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin, a następnie zbadaj struktury przypominające rurki pod standardowym mikroskopem jasnego pola przy 20-40-krotnym powiększeniu. Protokół ten wykorzystano do zbadania wpływu leczenia PDGF na tworzenie macierzy pochodzącej z fibroblastów. Trzecie fibroblasty BGH, które inkubowano z PDGF, wykazywały bardziej wyrównany rozkład komórek w matrycach niż te inkubowane bez PDGF.

Ekspresja kolagenu 1 i białka fibronektyny została zwiększona w matrycach pochodzących z fibroblastów stymulowanych przez PDGF, a w konsekwencji zwiększyła się grubość matrycy. Co więcej, histogramy kierunkowości pokazują, że kolagen 1 i fibronektyna wykazują równoległe wzorce. Kiedy komórki HUVEC zostały wysiane na zdecelularyzowanych matrycach pochodzących z fibroblastów stymulowanych przez PDGF, rozwinęły one więcej struktur przypominających naczynia włosowate niż w warunkach, w których nie były stymulowane.

Potwierdzenie, że matryce pochodzące z fibroblastów stymulowanych PDGF-BB sprzyjają aktywacji komórek śródbłonka. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować roztwory z wyprzedzeniem i upewnić się, że komórki są gotowe przed rozpoczęciem. Oprócz badań nad komórkami śródbłonka, matryce mogą być również obsadzane komórkami nabłonkowymi i można obserwować reakcję na czynniki zewnętrzne, takie jak stan w pożywce lub leki cytotoksyczne.

Generowanie macierzy zewnątrzkomórkowej ma kluczowe znaczenie w projektowaniu eksperymentów makrośrodowiska guza