Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych

Protokół ułatwia preparację mięśni lotu pośredniego znakowanych GFP od Drosophila w różnych momentach rozwoju poczwarek w celu oceny zmian w ekspresji genów i białek. Korzystając z tych technik, można uzyskać wysoko wzbogaconą próbkę mięśni lotu z minimalną degradacją białka RNA, która jest odpowiednia dla podejść RT-PCR, western blot lub omicznych. Te specjalistyczne sekcje wymagają praktyki i umiejętności, ale liczba poczwarek, które można wypreparować, oraz jakość próbek poprawiają się wraz z doświadczeniem.

Wizualna demonstracja tej sekcji ma kluczowe znaczenie dla określenia, jak odróżnić mięśnie lotu od tkanek niemięśniowych i ułatwienia szybkiej izolacji mięśni lotu od próbek poczwarek. Aby zainscenizować poczwarki, użyj zwilżonego pędzla, aby zebrać i przenieść pre-poczwarki na 60-milimetrową szalkę Petriego, a następnie określić płeć poczwarek pod mikroskopem dwuokularowym. Samce identyfikuje się po obecności jąder, które pojawiają się jako półprzezroczyste kule na nieprzezroczystych poczwarkach.

Po oznaczeniu potrawy godziną, datą i genotypem much, poczwarki dojrzewają w inkubatorze w temperaturze od 25 do 27 stopni Celsjusza do odpowiedniego etapu. W przypadku rozbioru IFM przed 48 H APF, za pomocą zwilżonego pędzla przenieść odpowiednio przygotowane poczwarki do czarnej naczynia preparacyjnego wypełnionej około 2/3 schłodzonym PBS. Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym użyj 5 kleszczy, aby popchnąć jedną z poczwarek na dno czarnej miski preparcyjnej.

Dostosuj powiększenie mikroskopu i ustaw ostrość, aż poczwarki będą wyraźnie widoczne. Używając jednej pary kleszczy do uchwycenia przedniej części poczwarki, szturchnij poczwarki pojedynczą końcówką drugiej pary kleszczy, nieco poza środkiem w jamie brzusznej, tuż za klatką piersiową. Użyj pierwszej pary kleszczy, aby usunąć przednią połowę obudowy poczwarki i uszczypnąć odsłonięte poczwarki tuż za klatką piersiową, aby oddzielić brzuch od klatki piersiowej.

Następnie delikatnie ściśnij przednią część klatki piersiowej, aby odsłonić fluorescencyjnie znakowane IFM. Następnie za pomocą kleszczy wyrzuć pozostałą tuszę na przeciwną stronę szalki i w ten sam sposób rozkrój kolejne poczwarki. Kiedy wszystkie poczwarki zostaną wypreparowane, użyj kleszczy, aby zebrać włókna IFM i uporządkuj włókna w stos na dnie czarnego naczynia preparacyjnego.

Użyj kleszczy, aby wypchnąć wszelkie zanieczyszczenia z pola view i usuń z próbek wszelkie mięśnie, tłuszcz, skórki lub inne niechciane tkanki inne niż IFM. Następnie za pomocą przyciętej końcówki pipety przenieś stos IFM do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 250 mikrolitrów schłodzonego PBS. Do rozbioru IFM po 48 H APF należy użyć lekko zwilżonego pędzla, aby przenieść poczwarki na pasek dwustronnej taśmy klejącej zamontowanej na szkiełku mikroskopowym.

Ustaw poczwarki w linii, brzuszną stroną do dołu i z przodu w kierunku dołu szkiełka. Kiedy wszystkie poczwarki zostaną umieszczone, użyj kleszczy, aby rozdzielić i otworzyć pierwszą obudowę poczwarki powyżej przednich przetchlinków, a następnie delikatnie przesuń parę kleszczy grzbietowo, w kierunku tylnej, przecinając obudowę poczwarki, gdy kleszcze się poruszają. Uwolnić poczwarki z otwartego etui i natychmiast przenieść poczwarki do kropli PBS na drugim szkiełku mikroskopowym.

Kiedy wszystkie poczwarki zostaną uwolnione, użyj cienkich nożyczek, aby odciąć odwłok poczwarki od klatki piersiowej i wepchnij odwłoki do osobnego stosu. Kiedy wszystkie klatki piersiowe zostaną usunięte, użyj kawałka bibuły, aby usunąć większość PBS i stos brzuchów. Dodaj kroplę świeżego, schłodzonego PBS do pozostałych klatek piersiowych, a następnie użyj nożyczek do cięcia od głowy wzdłuż podłużnej osi ciała jednym ruchem, aby podzielić klatkę piersiową na pół.

Kiedy wszystkie poczwarki zostaną wypreparowane, użyj 5 kleszczy, aby wybrać jedną z półsekcji i delikatnie włóż końcówki jednego kleszcza powyżej i poniżej środka IFM. Trzymając nieruchomo pierwszą parę kleszczy, użyj cienkich nożyczek, aby odciąć jeden koniec IFM od naskórka i ścięgien, a następnie obróć poczwarki o 180 stopni, aby umożliwić odcięcie drugiego końca IFM od naskórka i ścięgien. Użyj kleszczy, aby przenieść wiązkę IFM z klatki piersiowej na krawędź pęcherzyka PBS, używając napięcia wody, aby utrzymać wiązkę na miejscu.

Następnie popchnij tuszę na przeciwną stronę szkiełka i w ten sam sposób rozetnij resztę IFM. Po zebraniu wszystkich IFM użyj 5 kleszczy, aby usunąć wszelkie fragmenty mięśni skokowych lub naskórka, które mogły znaleźć się w próbkach. Następnie użyj napięcia wody, aby delikatnie uchwycić wypreparowane IFM między parą kleszczy i umieść IFM w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej 250 mikrolitrów schłodzonego PBS.

Dane sekwencjonowania mRNA z IFM BRUNO1 IR pokazują zmiany w ekspresji na poziomie jednostki genowej w porównaniu z danymi sekwencjonowania typu dzikiego. Stosując spektrometrię mas całego proteomu na wypreparowanych IFM, obserwuje się podobną regulację na poziomie białka i izoformy białka. Po wprowadzeniu linii pułapki białkowej do końcowego intronu Mhc, włączenie białka znakowanego GFP można zaobserwować w IFM jako dwie kropki po obu stronach linii M przy 90 H APF, podczas gdy w tkance mięśniowej nóg sygnał GFP można zaobserwować równomiernie w poprzek linii M sarkomery.

W przypadku stosowania RT-PCR na wypreparowanym IFM, przejście izoformy Mhc z zdarzenia eksonu 34 do 37 znakowanego GFP na zdarzenie nieznakowanego eksonu 34 do 35 można wykryć między 30 a 48 godzinami po utworzeniu poczwarki w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Z danych sekwencjonowania mRNA wynika, że tkanki mięśni nóg i skoków wyrażają wszystkie trzy izoformy Mhc, utrzymując ekspresję izoformy znakowanej GFP w dojrzałych mięśniach. Zarówno mutant Spalt major, jak i BRUNO1 IR-IFM, nie zdołały wyłączyć ekspresji izoformy Mhc znakowanej GFP w miarę rozwoju, co spowodowało profil ekspresji izoformy przypominający profil tkanki mięśniowej nóg i skoków.

Pamiętaj, że sekcje powinny być wykonane w czasie krótszym niż 30 minut, aby zapobiec degradacji RNA. I, aby zadbać o ograniczenie zanieczyszczenia innymi typami komórek. Metoda ta generuje próbki wzbogacone IFM odpowiednie do podejść biochemicznych, takich jak RT-PCR lub western blotting, a także podejść w stylu omicznym, takich jak spektrometria mas, sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, wychwytywanie konformacji chromatyny i metabolomika.

Sekcje te mogą uzupełnić potężne podejścia genetyczne u Drosophila o dane na poziomie systemowym w celu zbadania podstawowych mechanizmów rozwoju i regulacji genów.