Name: Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę preparacji mięśni lotu Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym oznakowaniem GFP. Technika umożliwia izolację próbek o wysokiej czystości do analiz proteomicznych i sekwencjonowania głębokiego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Andreasowi Ladurnerowi i Frankowi Schnorrerowi za hojne wsparcie. Dziękujemy Sandrze Esser za doskonałą pomoc techniczną i Akanksha Roy za wygenerowanie danych ze spektrometrii mas. Dziękujemy centrom hodowli w Bloomington i Wiedniu za dostarczanie much. Dziękujemy Core Facility Bioimaging za pomoc w obrazowaniu konfokalnym oraz Zentrallabor für Proteinanalytik za analizę próbek spektrometrii mas, oba w Centrum Biomedycznym LMU (Martinsried, DE). Nasze prace były wspierane przez Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) przy Uniwersytecie Ludwiga Maximiliana w Monachium (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS) oraz International Max Planck Research School (EN).

1. Inscenizacja poczwarek
<ol>
	<li>Hoduj muchy o pożądanym genotypie w butelkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Albo wykonaj nowy rzut kolby preparacyjnej, albo ustaw krzyżówkę z co najmniej 20 samicami dziewiczych much. Trzymaj butelki, aż muchy zaczną się przepoczwarzać.</li>
	<li>Zbierz poczwarki za pomocą zwilżonego pędzla i przenieś na zwilżoną bibułę filtracyjną na 60-milimetrowej szalce Petriego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Określ płeć poczwarek, zbierając odpowiednią płeć do eksperymentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). Samce identyfikuje się po obecności jąder, które pojawiają się jako półprzezroczyste kulki w nieprzezroczystej poczwarce.</li>
	<li>Oznacz szalkę Petriego godziną, datą i genotypem, a następnie postarzej poczwarki do pożądanego etapu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H). 
	nuta: Utrzymuj krzyżówki/stada i wiek poczwarek w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze (tj. 25 °C lub 27 °C w przypadku krzyżówek RNAi, ponieważ zwiększona aktywność Gal4 w wyższych temperaturach zwiększa skuteczność powalania40). Upewnij się, że wilgotność jest wystarczająco wysoka, aby poczwarki nie wysychały podczas starzenia się przez kilka dni.</li>
</ol>
2. Sekcja IFM przed 48 h APF
<ol>
	<li>Zbierz niezbędny sprzęt, w tym dwa kleszczyki klasy biologicznej #5, pipetę, końcówki do pipet, suchy lód i (w przypadku próbek RNA) odczynnik izolacyjny (patrz Tabela materiałów). Ponadto schłodzić na lodzie czarne naczynia rozwarstwiające (patrz tabela materiałów), 1x bufor soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) i 1,5 ml probówek do mikrowirówek na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą zwilżonego pędzla przenieś zainscenizowane poczwarki do czarnej naczynia preparacyjnego wypełnionej około dwóch trzecich zimnym 1x PBS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A,B). Przejdź do fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego. 
	nuta: Użyj tylu poczwarek, ile można wyciąć w ciągu 30 minut. W zależności od doświadczenia waha się to od 3 do 15 poczwarek. Zobacz Metody uzupełniające, aby zapoznać się z omówieniem alternatyw dla czarnych naczyń preparacyjnych.</li>
	<li>Używając kleszczyków #5, popchnij jedną z poczwarek na dno czarnej naczynia preparacyjnej i dostosuj powiększenie mikroskopu i ostrość, aby wyraźnie zobaczyć poczwarkę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Chwyć przednią część poczwarki jednym kleszczem (<silna klasa="xfig">Ryc. 2D), a następnie szturchnij poczwarki pojedynczą końcówką drugiego kleszcza nieco poza środkiem w jamie brzusznej, tuż za klatką piersiową. To utrzymuje poczwarkę w miejscu i zapobiega przemieszczaniu się IFM do jamy brzusznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). 
	nuta: Rozpocznij mierzenie czasu trwania sekcji od tego punktu, gdy tylko integralność poczwarki zostanie zakłócona. Użyj określonej długości sekcji (na przykład 20-30 minut), aby zminimalizować śmierć mięśni i związane z nią zmiany transkryptomiczne i proteomiczne. Wypreparuj jak najwięcej much w tym okresie.</li>
	<li>Za pomocą pierwszych kleszczy usuń przednią połowę obudowy poczwarki (<silna klasa="xfig">Ryc. 2F).</li>
	<li>Użyj tych samych kleszczy, aby uszczypnąć odsłonięte poczwarki tuż za klatką piersiową i oddzielić brzuch od klatki piersiowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie ściśnij przednią część klatki piersiowej (przez <35 h APF) lub rozerwij klatkę piersiową, aby odsłonić fluorescencyjnie znakowane IFM (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2H). IFM łatwo odczepiają się od naskórka, ponieważ przyczepy ścięgien we wczesnych punktach czasowych są delikatne. Wyrzuć pozostałą tuszę za pomocą kleszczy, aby przepchnąć ją na przeciwną stronę naczynia.</li>
	<li>Powtarzając kroki 2.3–2.7, wypreparuj dodatkowe poczwarki.</li>
	<li>Zbierz włókna IFM za pomocą kleszczy i ułóż je w stos na dnie czarnego naczynia preparacyjnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I,J). Usuń wszelkie zanieczyszczenia, wypychając je poza pole view za pomocą kleszczy. 
	nuta: Przy nabraniu wprawy końcówki kleszczy można zbliżyć do siebie, nie dotykając się nawzajem. Ta technika może być używana do luźnego chwytania IFM bez ich niszczenia. Alternatywne metody obejmują delikatne popychanie lub podnoszenie IFM za pomocą jednej końcówki lub całkowicie zamkniętych kleszczy lub pobieranie części tłuszczu lub innej tkanki za pomocą IFM i usuwanie tłuszczu, jak opisano w kroku 2.10.</li>
	<li>Kontrola jakości próbki mięśni IFM, za pomocą kleszczy do usuwania mięśni, tłuszczu, naskórka itp. z próbki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2K,L). 
	nuta: W przypadku Mef2-Gal4, IFM jest znakowany silniej niż inne typy mięśni we wczesnych punktach czasowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2K,K'), umożliwiając usunięcie mięśni skokowych i mięśni larwalnych w oparciu o intensywność fluorescencji i kształt mięśni. Tkanka tłuszczowa i tkanka naskórka wyglądają inaczej i nie są oznaczone specyficzną dla mięśni etykietą fluorescencyjną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2K,K'). Zobacz sekcję dyskusji, aby zapoznać się z innymi liniami Gal4, które oznaczają IFM.</li>
	<li>Za pomocą przyciętej końcówki pipety przenieś stos IFM do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 250 μl schłodzonego 1x PBS (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 2M-O). Przejdź natychmiast do sekcji 4. 
	nuta: Próbki IFM mogą zostać utracone przez zwykłe przyklejenie się do boku końcówki pipety. Kilkakrotnie pipetowanie buforu w górę i w dół przed pobraniem IFM może sprawić, że standardowe końcówki będą mniej lepkie, a silikonowane lub perfluoroalkoksylowe (PFA) końcówki o niższych napięciach powierzchniowych mogą pomóc w zapobieganiu utracie próbki.</li>
</ol>
3. Sekcja IFM po 48 godzinach APF
<ol>
	<li>Zbierz niezbędny sprzęt, w tym dwa kleszczyki klasy biologicznej #5, drobne nożyczki, standardowe szklane szkiełka mikroskopowe, taśmę dwusztyftową, pipetę, końcówki do pipet, suchy lód i (w przypadku zastosowań RNA) odczynnik izolacyjny (patrz Tabela materiałów). Schłodzić 1x PBS i probówki mikrowirówkowe na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą lekko zwilżonego pędzla przenieś poczwarki na pasek dwustronnej taśmy klejącej zamontowany na szkiełku mikroskopowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Umieść poczwarki w linii zorientowanej w tej samej orientacji (brzusznie do dołu i do przodu w kierunku dołu szkiełka). 
	nuta: Uważaj, aby nie użyć zbyt dużo wody na pędzel lub filtr, w przeciwnym razie poczwarki nie będą się dobrze trzymać. Jeśli poczwarki się nie przyklejają, wysusz je, najpierw przenosząc do suchego filtra lub bibuły. Zamontuj tyle poczwarek, ile można wyciąć w ciągu 30 minut, najlepiej ~10 poczwarek.</li>
	<li>Usuń poczwarkę z etui na poczwarkę. Użyj kleszczy, aby rozdzielić i otworzyć skrzynkę poczwarki powyżej przetchlinków przednich (<silna klasa="xfig">Ryc. 3B).</li>
	<li>Delikatnie przesuń parę kleszczy grzbietowo w kierunku tyłu, przecinając obudowę poczwarki, gdy kleszcze się poruszają (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B'). Uważaj, aby nie rozerwać leżącej pod spodem poczwarki. Uwolnij poczwarkę z otwartego pudełka i natychmiast przenieś ją do kropli 1x PBS na drugim szkiełku mikroskopowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B",C).</li>
	<li>Powtórz kroki 3.3 i 3.4 dla wszystkich poczwarek w linii, a następnie odłóż na bok suwak z taśmą dwupatyczkową.</li>
	<li>Za pomocą cienkich nożyczek odetnij odwłok poczwarki od klatki piersiowej i wepchnij go do osobnego stosu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D,D'). Powtórz dla pozostałych poczwarek. 
	nuta: Rozpocznij mierzenie czasu trwania sekcji od kroku 3.6, gdy tylko integralność poczwarki zostanie zakłócona. Wypreparuj jak najwięcej much w ciągu 20-30 minut, aby zapobiec śmierci komórki i związanym z nią zmianom transkryptomicznym i proteomicznym. Podczas preparacji 1 d dorosłych lub poczwarek >90 h, często wygodnie jest w późniejszych krokach dodatkowo usunąć głowę cienkimi nożyczkami.</li>
	<li>Za pomocą bibuły usuń większość 1x PBS (zazwyczaj mętny z zawieszonym tłuszczem), a także stos brzuchów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3E). Dodaj kroplę świeżego, schłodzonego 1x PBS do pozostałych torsów.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową na pół (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F,F'), przecinając od głowy w dół podłużnej osi ciała jednym ruchem. Alternatywnie, jeśli głowa została usunięta, najpierw włóż nożyczki w miejscu, w którym głowa była przymocowana i przetnij górną połowę klatki piersiowej wzdłużnie między IFM. Następnie przetnij brzuszną stronę klatki piersiowej drugim cięciem w tej samej orientacji.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.7 i 3.8 dla wszystkich poczwarek, które mają zostać wycięte, generując stos półsekcji klatki piersiowej w pobliżu środka szkiełka. Upewnij się, że na szkiełku jest wystarczająca ilość schłodzonego 1x PBS, aby hemisekcje nie wyschły. 
	nuta: Po 48 godzinach APF IFM są na tyle duże, że są widoczne dla wprawnego oka pod standardowym mikroskopem preparacyjnym. Na tym etapie protokołu mięśnie z etykietą fluorescencyjną mogą zostać przeniesione do fluorescencyjnego zakresu preparacyjnego, aby pomóc w identyfikacji IFM lub w celach treningowych, ale nie jest to konieczne.</li>
	<li>Wypreparuj IFM z klatki piersiowej. Odizoluj jedną z półsekcji za pomocą kleszczy #5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3G,H). Delikatnie włóż końcówki jednego kleszcza powyżej i poniżej środka IFM (<silna klasa="xfig">Rysunek 3G',H'). Trzymając pierwsze kleszcze nieruchomo, użyj cienkich nożyczek, aby odciąć jeden koniec IFM od naskórka i ścięgien. Następnie odetnij drugi koniec IFM od naskórka (<silna klasa="xfig">Rysunek 3G'',H''). 
	nuta: W zależności od orientacji klatki piersiowej po pierwszym cięciu IFM, przydatne jest obrócenie klatki piersiowej o 180°, aby drugie cięcie IFM było łatwiejsze do wykonania.</li>
	<li>Usuń wiązkę IFM z klatki piersiowej za pomocą kleszczy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3G''',H'''), przenosząc ją na krawędź pęcherzyka PBS, aby użyć napięcia wody do utrzymania jej na miejscu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3I). Popchnij tuszę na przeciwną stronę zjeżdżalni. Powtórz te czynności dla pozostałych hemisekcji klatki piersiowej, generując kolekcję wypreparowanych IFMs. 
	nuta: Jeśli IFM nie pozostają w schludnym stosie, usuń część 1x PBS za pomocą chusteczki. Uważaj, aby nie dopuścić do wyparowania wszystkich PBS i upewnij się, że wypreparowane IFM i hemithoraxs pozostają pokryte buforem.</li>
	<li>Po przeprowadzeniu sekcji wszystkich IFM szybko przeprowadź kontrolę jakości wypreparowanego mięśnia. Za pomocą kleszczy #5 usuń wszelkie fragmenty mięśni skokowych lub naskórka, które mogły znaleźć się w próbce (<silna klasa="xfig">Rysunek 3J-K''). 
	nuta: Mięsień skoku wygląda inaczej niż IFM. Jeśli rozwarstwia się mięsień znakowany Mef2-Gal4 pod wpływem fluorescencji, mięsień skokowy ma słabszą fluorescencję oraz inny kształt i teksturę. W normalnym świetle wydaje się prawie przezroczysty, podczas gdy IFM są nieprzezroczyste, mlecznożółte (<silna klasa="xfig">Rysunek 3J-J'',K).</li>
	<li>Używając naprężenia wody, chwyć (ale nie zgniataj) rozcięte IFM między parą kleszczy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3L). Przenieś IFM do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wstępnie napełnionej 250 μl schłodzonego 1x PBS (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3M). Natychmiast przejść do punktu 4. 
	nuta: Kiedy końcówki kleszczy są zbliżane do siebie i wyjmowane z roztworu buforowego, napięcie wody powoduje wychwytywanie pęcherzyka buforu między końcówkami kleszczy. Jeśli IFM są również obecne w tym pęcherzyku, można je wyjąć z roztworu i łatwo przenieść do innego pojemnika wypełnionego buforem. Ważne jest, aby ścisnąć kleszcze, aby zbliżyć końcówki do siebie, nie dotykając się nawzajem, aby uniknąć maceracji tkanki uchwyconej w pęcherzyku buforowym.</li>
</ol>
4. Osadzanie i przechowywanie próbki IFM
<ol>
	<li>Osadzaj IFM, odwirowując probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml przez 3–5 minut przy 2,000 x g w wirówce stołowej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 4A,B).</li>
	<li>Usuń bufor za pomocą końcówki pipety (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>W przypadku zastosowań RNA należy ponownie zawiesić osad IFM w 50–100 μl żądanego bufora izolacyjnego RNA (patrz Tabela materiałów, <silna klasa = "xfig">Rysunek 4D). W przeciwnym razie przejdź do kroku 4.4. 
	nuta: IFM mogą być zamrażane na sucho po kroku 4.2 w celu przygotowania spektrometrii mas lub izolacji RNA za pomocą komercyjnych zestawów (patrz reprezentatywne wyniki). W przypadku zastosowań RNA lepsze wyniki uzyskuje się poprzez natychmiastowe ponowne zawieszenie i zamrożenie osadu IFM w buforze izolacyjnym</li>.
	<li>Zamrożenie próbki na suchym lodzie lub szybkie zamrożenie w ciekłym azocie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4E). Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie gotowe do kolejnych etapów przygotowania próbki do dalszej analizy. 
	nuta: Po kriopkonserwacji próbki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy przed przetworzeniem w celu dalszego badania.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole przedstawiamy podstawową technikę preparowania IFM Drosophila z poczwarek we wczesnym i późnym stadium w celu dalszej izolacji białka, DNA, RNA lub innych makrocząsteczek. Protokół można łatwo dostosować do preparowania IFM od dorosłych much. Demonstrujemy użyteczność naszego protokołu preparacji w zastosowaniach mRNA-Seq, proteomiki i RT-PCR. Dzięki ciągłemu doskonaleniu technologii omicznych, które umożliwiają analizę próbek z mniejszą ilością materiału wyjściowego i niższymi stężeniami wejściowymi, sekcje te prawdopodobnie staną się cenne dla wielu dodatkowych zastosowań. Ponieważ IFM są uznanym modelem ludzkich miopatii 4,24 i rozwoju specyficznego dla typu mięśni 9,12, przewidujemy na przykład metabolomikę wzbogaconą o IFM, badania konformacji chromatyny za pośrednictwem 3C lub 4C, ocenę sieci splicingowej za pomocą interakcji CLiP lub fosfoproteomikę miofibrylogenezy.
Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że w wyniku tych rozbiorów powstaje próbka wzbogacona o IFM zamiast czystej próbki IFM. Jest to nieuniknione ze względu na unerwienie neuronów ruchowych, przyczepy ścięgien i inwazję tchawicy włókien mięśniowych. Analiza bioinformatyczna może być wykorzystana do identyfikacji genów lub białek wzbogaconych w IFM, ale potrzebne są dalsze eksperymenty, aby wykazać, że są one w rzeczywistości specyficzne dla IFM. Czystość próbki można oznaczyć za pomocą opublikowanych markerów specyficznych dla tkanki, takich jak Stripe45 (ścięgno), Act79B 4,44 (mięsień rurkowy), Act88F15 (IFM) lub syb46 (specyficzny dla neuronów). Możliwe jest użycie takich markerów do normalizacji zbiorów danych do treści specyficznej dla IFM, ale ostrzega się, że czasowe zmiany w ekspresji genów używanych do normalizacji, na przykład genów specyficznych dla IFM lub tubuliny, mogą skłaniać do takiego podejścia.
W ostatnich latach opracowano genetycznie kodowane metody znakowania specyficznego dla tkanki, na przykład znakowanie EC47,48 lub znakowanie PABP49,50 w celu izolacji RNA, które mogą pomóc w uzyskaniu próbki RNA naprawdę specyficznej tkankowo. Znakowanie EC wymaga jednak stałego karmienia much47 i dlatego nie ma zastosowania w stadiach poczwarki. Czułość i kompletność transkryptomów znakowanych PABP może mieć ograniczenia51. Podejścia FACS do izolowania pojedynczych włókien mięśniowych są skomplikowane ze względu na duży rozmiar i syncytialny charakter IFM. Podejścia w stylu INTACT52,53 mogą być stosowane do izolowania określonych przedziałów subkomórkowych od IFM, co może okazać się przydatne do izolowania czystych populacji jąder lub mitochondriów IFM. Ręczne sekcje są nadal aktualnym standardem w celu uzyskania nienaruszonej tkanki IFM w większości dalszych zastosowań.
Jakość próbki zależy od kilku krytycznych etapów procesu preparacji. Sekcje są wymagające technicznie, a szybkość preparowania i czystość próbki rosną wraz z doświadczeniem. Preparacja przez krótki czas (20–30 minut) w schłodzonym buforze bez detergentu i natychmiastowe zamrożenie pomaga zachować integralność próbki, jak zaobserwowano wcześniej w przypadku izolacji ścięgien myszy54. IFM można z powodzeniem zamrażać na sucho po usunięciu całego buforu z osadu, ale szczególnie w przypadku izolacji RNA, zamrażanie próbek w buforze izolacyjnym ma tendencję do uzyskiwania lepszych wyników. IFM z maksymalnie 20 oddzielnych sekcji są łączone przed izolacją RNA lub białka, co pozwala na zwiększenie skali i zebranie wystarczającej ilości materiału, nawet z wczesnych punktów czasowych lub mutantów16,32, do dalszej analizy.
W przypadku zastosowań RNA najbardziej krytycznym krokiem może być izolacja samego RNA. Izolacja tiocyjanianianu guanidyny, fenolu i chloroformu (metoda 1 powyżej) przewyższa większość testowanych zestawów komercyjnych i, jak wcześniej wspomniano, jest znacznie tańsza55. Zmienność obserwowana w wynikach izolacji RNA w przypadku zestawów komercyjnych jest zgodna z wcześniejszymi obserwacjami56,57. Następnie dodajemy glikogen podczas wytrącania izopropanolu, aby pomóc odzyskać całe RNA. Oprócz wydajności RNA ważne jest, aby zweryfikować integralność RNA, aby upewnić się, że próbka nie została rozdrobniona lub zdegradowana podczas procesów rozwarstwiania i izolacji. Istotne jest również, aby pracować bez RNaz. Wreszcie, wybór RT-kit może mieć wpływ na czułość procesu odwrotnej transkrypcji. Chociaż często nie omawia się ich szczegółowo, wszystkie te punkty wpływają na jakość próbki IFM i danych uzyskanych z dalszych aplikacji.
Kilka ważnych modyfikacji odróżnia protokół od istniejących protokołów sekcji IFM. Chociaż istnieje szczegółowy protokół preparacji immunofluorescencji IFM19, protokół ten przedstawia inne podejście do sekcji poczwarek, które umożliwia szybszą izolację tkanki IFM. Pozwala to na pobranie dużych ilości tkanki IFM (relatywnie rzecz biorąc) przy ograniczonym czasie preparacji, aby zapobiec zmianom proteomu lub transkryptomu. Inne protokoły opisują preparację dorosłego IFM w celu wizualizacji barwienia GFP w poszczególnych miofibrylach39 lub do barwienia mięśni ciała larwalnego58, ale nie dotyczą one preparacji w stadium poczwarki lub izolacji RNA lub białka. Podejście to różni się również od istniejącego protokołu mikrodysekcji poczwarek IFM z kriosekcji38, który może generować czystszą próbkę IFM, ale jest bardziej pracochłonny i wytwarza mniej materiału. W porównaniu z innymi protokołami szybkiej selekcji IFMu dorosłych 38,39, IFM są izolowane w buforze PBS bez detergentu, aby ograniczyć indukcję stresu i inne poważne zmiany ekspresji.
Kluczowym postępem w tym protokole jest włączenie żywego, fluorescencyjnego reportera, co pozwala na izolację IFM we wczesnych stadiach poczwarki. Standardowo używamy Mef2-GAL4 59 do sterowania UAS-CD8::GFP lub UAS-GFP::Gma60. Pozwala to na różnicowe znakowanie IFM (mięśnie lotu są silniej znakowane i mają inny kształt niż inne mięśnie poczwarki), a także wykonywanie manipulacji opartych na GAL4-UAS, na przykład eksperymentów ratunkowych lub RNAi. Możliwe jest również połączenie Mef2-GAL4 z tub-GAL80ts, aby uniknąć wczesnej śmiertelności związanej z RNAi lub z UAS-Dcr2 w celu zwiększenia wydajności RNAi40.
Dostępne są dodatkowe sterowniki GAL4 lub linie GFP, które różnią się specyficznością typu mięśni, wzorcem ekspresji czasowej i siłą sterownika19,61, które mogą być używane zamiast Mef2-GAL4. Na przykład Act88F-GAL4 jest po raz pierwszy wyrażany około 24 godzin APF, więc nie można go używać dla wcześniejszych punktów czasowych; jednak silnie oznacza IFM i może być przydatny, aby uniknąć wczesnej śmiertelności związanej z RNAi. Him-GFP lub Act88F-GFP oznaczają IFM, ponownie z ograniczeniami czasowymi, ale unikają zależności GAL4 od ekspresji markera i mogą być przydatne w połączeniu ze zmutowanym tłem będącym przedmiotem zainteresowania. Listy innych możliwych linii znaczników są dostępne19. Należy również zauważyć, że stosowanie transgenów i systemu GAL4/UAS może powodować artefakty ekspresji genów, dlatego ważne jest stosowanie odpowiednich kontroli, na przykład linii sterującej skrzyżowanej ze szczepem tła typu dzikiego, tak aby takie artefakty były przypuszczalnie takie same we wszystkich próbkach.
Wraz z dołączonym filmem, ten szczegółowy protokół ma na celu ułatwienie dostępu do sekcji IFM poczwarki i promowanie stosowania podejść omicznych do badania rozwoju mięśni. Połączenie mocy genetyki i biologii komórki Drosophila z biochemią i testami omicznymi dostępnymi dzięki wypreparowanemu IFM może przyczynić się do pogłębienia mechanistycznego zrozumienia miogenezy i funkcji mięśni. Przyszłe badania łączące obserwacje transkryptomu i regulacji proteomu na poziomie systemowym z wynikami metabolicznymi i funkcjonalnymi zapewnią głębsze zrozumienie specyficznego rozwoju typu mięśniowego i patogenezy zaburzeń mięśniowych.

Nowoczesne technologie omiczne dostarczają ważnych informacji na temat rozwoju mięśni i mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń mięśni u ludzi. Na przykład analiza danych transkryptomicznych w połączeniu z weryfikacją genetyczną i biochemiczną w modelach zwierzęcych ujawniła, że utrata czynnika splicingu RBM20 powoduje kardiomiopatię rozstrzeniową ze względu na regulację docelowej sieci ponad 30 genów sarkomerowych wcześniej związanych z chorobami serca, w tym tytyny1,2,3.
W drugim przykładzie, badania z hodowli komórkowych, modeli zwierzęcych i pacjentów wykazały, że dystrofia miotoniczna jest spowodowana zakłóceniem regulacji RNA spowodowanym sekwestracją ślepoty mięśniowej (MBNL) i regulacją w górę CELF14,5. Dynamika krzyżowa i czasowa między MBNL i CELF1 (zwana również CUGBP1 lub Bruno-Like 2) pomaga wyjaśnić utrzymujące się wzorce splicingu embrionalnego u pacjentów z dystrofią miotoniczną. Dodatkowo, duża sieć nieprawidłowo regulowanych celów pomaga wyjaśnić złożoną naturę choroby4,6,7,8. Większość takich badań wykorzystuje podejścia omiczne w organizmach modeli genetycznych, aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw chorób mięśni ludzkich. Ponadto podkreślają znaczenie pierwszego zrozumienia czasowej i specyficznej dla typu tkanki ekspresji genów, modyfikacji białek i wzorców metabolicznych w zdrowych mięśniach, aby zrozumieć zmiany w chorych lub starzejących się mięśniach.
Drosophila melanogaster to kolejny dobrze znany model genetyczny organizmu. Struktura sarkomeru, jak również poszczególne składniki sarkomery, są wysoce konserwatywne od much do kręgowców4,9,10, a mięśnie lotu pośredniego (IFM) stały się potężnym modelem do badania wielu aspektów rozwoju mięśni11,12. Po pierwsze, mięśnie lotu fibrylarnego różnią się funkcjonalnie i morfologicznie od rurkowatych mięśni ciała11,13, co pozwala na badanie mechanizmów rozwojowych specyficznych dla danego typu mięśni. Czynniki transkrypcyjne, w tym Spalt major (Salm)14, Extradenticle (Exd) i Homothorax (Hth)15 zostały zidentyfikowane jako regulatory losu fibrillar. Dodatkowo, za Salm, homolog CELF1 Bruno1 (Bru1, Aret) kieruje specyficznym dla fibrylaru programem splicingu16,17.
Po drugie, IFM są ważnym modelem do zrozumienia samego procesu miogenezy, od fuzji mioblastów i przyłączania miotubówek do miofibrylogenezy i dojrzewania sarkomeru9,18,19. Po trzecie, genetyka Drosophila pozwala na badanie wkładu poszczególnych białek, domen białkowych i izoform białek w powstawanie, funkcję i właściwości biofizyczne sarkomeru20,21,22,23. Wreszcie, modele IFM zostały opracowane do badania wielu zaburzeń mięśni u ludzi, takich jak dystrofia miotoniczna, miopatie miofibrylarne, choroby zwyrodnieniowe mięśni, aktynopatie itp.24,25,26,27, i dostarczyły ważnych informacji na temat mechanizmów chorobowych i potencjalnych terapii28,29,30. W związku z tym Drosophila jest użytecznym modelem do rozwiązywania wielu otwartych pytań w dziedzinie miogenezy, w tym mechanizmów transkrypcji, splicingu i regulacji chromatyny specyficznych dla typu mięśni, a także roli metabolizmu w rozwoju mięśni. Zastosowanie nowoczesnych technologii omicznych, w szczególności w połączeniu z szeroką gamą testów genetycznych, biochemicznych i biologicznych dostępnych u Drosophila, może znacznie przyczynić się do lepszego zrozumienia rozwoju mięśni, starzenia się i chorób.
IFM to największe mięśnie w locie, rozciągające się prawie 1 mm na całej długości klatki piersiowej u dorosłych31,32. Jednak ten mały rozmiar stwarza wyzwanie polegające na uzyskaniu wystarczającej ilości próbki, aby zastosować technologie omiczne u Drosophila w sposób specyficzny dla typu tkanki. Co więcej, IFM są częścią dorosłej muskulatury, która powstaje w stadiach poczwarki. Mioblasty łączą się, tworząc miotuby, które przyczepiają się do ścięgien około 24 godziny po utworzeniu poczwarki (APF) i przechodzą etap zagęszczenia niezbędny do zainicjowania miofibrylogenezy około 30 godzin APF (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-D)18,33,34.
Włókna mięśniowe następnie rosną i obejmują całą długość klatki piersiowej, przy czym miofibryle przechodzą początkową fazę wzrostu skoncentrowaną na dodawaniu sarkomeru do około 48 h APF, a następnie przechodzą do fazy dojrzewania, w której sarkomery rosną na długość i szerokość i są przebudowywane, aby ustanowić aktywację rozciągania przez 72 h APF (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-D)32, 35. Początek dojrzewania włókien jest przynajmniej częściowo kontrolowany przez Salm i E2F32,36,37, a wiele izoform białka sarkomerowego specyficznych dla IFM, których splicing jest kontrolowany przez Bru1, jest włączanych podczas tej fazy16,17. Dojrzałe muchy zamykają się od 90–100 h APF. Oznacza to, że aby badać rozwój mięśni, IFM musi zostać wyizolowany z wystarczającą ilością, jakością i czystością z wielu punktów czasowych poczwarki, aby ułatwić analizę przy użyciu podejść omicznych.
Opublikowano kilka protokołów do analizy IFM. Chociaż protokoły te działają dobrze w zamierzonych zastosowaniach, żaden z nich nie jest idealny dla podejść omicznych. Protokoły, które zachowują morfologię IFM do immunofluorescencji poczwarek i dorosłych IFM19, izolują włókna IFM do oceny mechanicznej31, lub wykorzystują mikrodysekcję IFM poczwarki z kriosekcji38 są zbyt specjalistyczne, czasochłonne i pracochłonne, aby racjonalnie uzyskać wystarczającą ilość tkanki IFM do zastosowań omicznych. Inne protokoły zostały opracowane do szybkiej sekcji specyficznie dorosłych IFM38,39, dlatego nie mają zastosowania do stadiów poczwarki i używają, które nie są idealne lub mogą być niekompatybilne, na przykład, z izolacją RNA. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania nowych podejść do izolowania poczwarki IFM do zastosowań biochemicznych lub omicznych.
Tutaj prezentujemy protokół do analizy IFM podczas stadium poczwarki, który został z powodzeniem wykorzystany do analizy mRNA-Seq od 16 h APF do stadium dorosłego16,32. W protokole zastosowano etykietę białka zielonej fluorescencji (GFP) do identyfikacji IFM na wszystkich etapach rozwoju poczwarki i dorosłego osobnika, umożliwiając preparację na żywo pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Podejście to jest mniej pracochłonne, z wyższą przepustowością niż istniejące protokoły preparacji IFM. Pozwala to na szybką izolację i kriokonserwację próbek, generując wystarczającą ilość materiału po kilku rundach sekcji, aby można było zastosować metody omiczne, a także standardową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) lub western blotting.
Prezentujemy protokół w dwóch częściach, pokazując, jak szybko rozłożyć IFM na czynniki pierwsze zarówno przed 48 h APF (podczas wczesnej metamorfozy, kiedy przyczepy IFM są bardziej wątłe), jak i po 48 h APF (gdy plan ciała poczwarki i przyczepy IFM są dobrze zdefiniowane). Pokazujemy, że możemy wyizolować wysokiej jakości RNA z wypreparowanych IFM we wszystkich punktach czasowych i prezentujemy dane na temat różnych podejść do izolacji RNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec pokazujemy zastosowanie protokołu rozbioru do mRNA-Seq, spektrometrii mas i RT-PCR na przykładzie homologu CELF1 Bruno1. Pokazujemy błędną ekspresję izoform białka sarkomeru w danych proteomicznych z mutacji IFM Bruno1 i badamy regulację Bruno1 w przypadku C-końcowego splicingu łańcucha ciężkiego miozyny (Mhc). Wyniki te ilustrują, w jaki sposób dane omiczne mogą zapewnić głębsze zrozumienie zjawisk biologicznych, uzupełniając eksperymenty genetyczne i biochemiczne.

<table><tbody><tr><td>5x bufor High Fidelity (HF)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F518L</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane 60 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z643084-600EA</td><td>Szalki Greinera, 60 mm x 15 mM, wentylowane</td></tr><tr><td>miska sekcyjna (szkło)</td><td>Augusta Laborbedarf</td><td>42021010</td><td>Lymphbecken, czarne szkło, 4 cm x 4 cm</td></tr><tr><td>Czarne silikonowe naczynia preparacyjne: węgiel aktywny w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9157</td><td>Dostępne również w większości aptek</td></tr><tr><td>Czarne silikonowe naczynia preparacyjne: Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>Naczynia są wytwarzane przez zmieszanie Sylgarda (~50g) z węglem aktywnym w proszku (200 mg) i utwardzenie go na szalkach Petriego (~4 szalki 60 mm).</td></tr><tr><td>Niebieski tłuczek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td>Każdy tłuczek do granulek, który można sterylizować, może być również używany ze szlifierką napędzaną silnikiem</td></tr><tr><td>Aparat w telefonie komórkowym, Samsung Galaxy S9</td><td>Samsung</td><td>SM-G960F/DS</td><td>używany do zdjęć nie zrobionych pod mikroskopem</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3691,0500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny, Leica SP8X pionowy konfokalny</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny, Zeiss LSM 780 odwrócony konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td><td>www.zeiss.com</td></tr><tr><td>Podwójna taśma klejąca</td><td>Scotch/3M</td><td>3M ID 70005108587</td><td>Taśma dwustronna, dostępna w większości biurowych Uchwyty</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Inox z prostą końcówką 11 cm, klasa biologiczna z końcówką 0,05 mm x 0,02 mm</td></tr><tr><td>EtOH (100%, RNaza darmowy)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencyjny mikroskop preparacyjny, Leica DFC310 FX Kamera</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, Leica Application Suite (LAS) wersja 4.0.0</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny, Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>Mucha: Bru1[M2]</td><td></td><td></td><td>Mucha; Ten papier</td></tr><tr><td>Mucha: Bru1 [M3]</td><td></td><td></td> <td>Mucha kolba; Ten artykuł</td></tr><tr><td>Mucha: Mef2-GAL4</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC:27390</td><td>Mucha</td></tr><tr><td>Mucha: salm[1]</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>3274</td><td>Mucha</td></tr><tr><td>Mucha: salm[FRT]</td><td></td><td></td><td>Mucha; patrz Spletter et al., Elife, 2018</td></tr><tr><td>Fly: UAS-Bru1IR</td><td>Vienna Drosophila Research Center</td><td>GD41568</td><td>Fly stock, RNAi spinka do włosów</td></tr><tr><td>Fly: UAS-GFP::Gma</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC:31776</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Fly: UAS-mCD8a::GFP</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC:5130</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Fly: w[1118]</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>3605</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Fly: weeP26</td><td></td><td></td><td>Fly stock; patrz Clyne et al., Genetics, 2003</td></tr><tr><td>GFP detection reagent, GFP-Booster</td><td>ChromoTek</td><td>gba488-100</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu, Photoshop CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>www.adobe.com</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>2-propanol</td></tr><tr><td>Metoda 1 (izolacja RNA): TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>izotiocyjanian guanidyny i jednofazowy roztwór fenolu</td></tr><tr><td>Metoda 2 (izolacja RNA): Metoda 1 + TURBO Zestaw bez DNA</td> Izolacja TRIzolu <td>Invitrogen</td><td>AM1907</td>, <td>a następnie leczenie zestawem do usuwania DNA</td></tr><tr><td>Metoda 3 (izolacja RNA): Zestaw Direct-zol RNA Miniprep Plus Zymo</td><td>Research</td><td>R2070S</td><td>Izolacja RNA w TRIzolu, ale nad komercyjnymi kolumnami zamiast przy użyciu separacji faz. Zalecane leczenie DNazą wykonane z użyciem Monarch Dnazy I w buforze reakcyjnym Monarch DNazy I.</td></tr><tr><td>Metoda 4 (izolacja RNA): RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Zastosowaliśmy dostarczoną obróbkę DNazą. Granulki IFM homogenizowano w buforze RTL, zgodnie z sugestiami dla tkanek zwierzęcych.</td></tr><tr><td>Metoda 5 (izolacja RNA): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td>Zastosowaliśmy protokół dla " Oczyszczanie RNA z tkanek włóknistych".</td></tr><tr><td>Metoda 6 (izolacja RNA): Zestaw Monarch Total RNA Miniprep New</td><td>England Biolabs</td><td>T2010G</td><td>Zastosowaliśmy protokół dla tkanek / leukocytów i poddaliśmy lizie w 300 &mu; L odczynnika do ochrony RNA.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12400</td><td>Probówki do mikrofuge bez RNaz, 1,5 ml</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>12342108</td><td>Szkiełka standardowe, nienaładowane, 1 mm</td></tr><tr><td>Ostrza mikrotomu</td><td>PFM Medical</td><td>207500003</td><td>C35 pióro 80 mm</td></tr><tr><td>Monarch DNase I</td> New <td>England Biolabs</td><td>T2004-21</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNase I Bufor reakcyjny</td><td>Nowość Anglia Biolabs</td><td>T2005-21</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Thermo Fisher</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq Polimeraza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0480X</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>Marabu</td><td>1910000000</td><td>Marabu Fino Round No. 0 lub podobny pędzel z dowolnego materiału artystycznego</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>bufor PBS (1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami do roztworów 1 l, pH 7,4</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet PFA PureTip</td><td>Elemental Scientific</td><td>ES-7000-0101</td><td>Opcjonalny zamiennik standardowych końcówek do pipet w celu zmniejszenia strat próbki; 100 mL, otwór 0,8 mm</td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530XL</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5161</td><td>Uniwersalna pipeta 200 ml Wskazówki</td></tr><tr><td>Zestaw Preomics iST 8x Zestaw</td> do przygotowania peptydów <td>Preomics</td><td>P.O.00001</td><td>do spektrometrii</td></tr> mas <tr><td>Q Exactive spektrometr</td> mas Spektrometria mas <td>Thermo Fisher</td><td>725500</td><td>została wykonana w Zakładzie Analizy Białek Centrum Biomedycznego LMU</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania RNA kubitów</td><td>Life Technologies</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen rodamino-falloidyna</td><td>, sondy molekularne</td><td></td><td></td>10063052</tr><tr><td>Stężenie RNA Podejście 1 & Ślady integralności RNA, Bioanalizator</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Stężenie RNA Podejście 2, Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Stężenie RNA Podejście 3, Fluorometr Qubit 4</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico Chips</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Promega</td><td>A7937</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz, pirowęglan dietylu (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>DEPC uzdatnia wodę przez noc, a następnie autoklawu, aby usunąć całą RNazę.</td></tr><tr><td>Zestaw RT #1: Zestaw odwrotnej transkrypcji Super Script III</td><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td></tr><tr><td>Zestaw RT #2: Zestaw</td><td>do odwrotnej transkrypcji</td>LunaScript <td>New England Biolabs</td><td>E3010S</td></tr><tr><td>Zestaw RT #3: Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiNova Zestaw</td><td>do odwrotnej transkrypcji</td><td>Qiagen</td><td>205410</td></tr><tr><td>Bufor do montażu na suwaku, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>zawierające DAPI</td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne: GraphPad Prism</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td>www.graphpad.com</td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne: Microscoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Zakupione w ramach pakietu: Office Home & Student 2019</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5405000760</td><td>Eppendorf Wirówka 5425 lub równoważna</td></tr><tr><td>Chusteczki higieniczne/ Kimwipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td>Standardowe chusteczki do tkanek</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350796</td><td>Pipeta plastikowa</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td> <td>VannasFine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>Krawędź tnąca 3 mm, średnica końcówki 0,05 mm, długość 8 cm</td></tr><tr><td>Papier Whatman</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004-070</td><td>Koła z bibuły filtracyjnej, klasa 4, 70 mm</td></tr></tbody></table>

sekcja mięśni lotu drosophila melanogaster dla podejść omicznych

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Mięsień lotu Drosophila to potężny model do badania różnorodnych procesów, takich jak regulacja transkrypcji, alternatywne splicing, metabolizm i mechanobiologia, które wpływają na rozwój mięśni i miofibrylogenezę. Dane omiczne, takie jak te generowane przez spektrometrię mas lub głębokie sekwencjonowanie, mogą dostarczyć ważnych mechanistycznych wglądów w te procesy biologiczne. W przypadku takich podejść korzystna jest analiza próbek specyficznych dla tkanek w celu zwiększenia zarówno selektywności, jak i swoistości omicznych odcisków palców. W tym miejscu przedstawiamy protokół preparacji znakowanych fluorescencyjnie mięśni lotu z żywych poczwarek w celu wygenerowania wysoce wzbogaconych próbek mięśni do zastosowań omicznych. Najpierw opisujemy, jak preparować mięśnie lotu we wczesnych stadiach poczwarki (<48 h po utworzeniu poczwarki [APF]), kiedy mięśnie są rozpoznawalne przez znakowanie białkiem zielonej fluorescencji (GFP). Następnie opisujemy, jak preparować mięśnie od późnych poczwarek (>48 h APF) lub dorosłych, gdy mięśnie są rozróżnialne pod mikroskopem preparacyjnym. Dołączony protokół wideo sprawi, że te wymagające technicznie sekcje będą szerzej dostępne dla społeczności badawczej zajmującej się mięśniami i Drosophila. W przypadku zastosowań RNA oznaczamy ilość i jakość RNA, które można wyizolować w różnych punktach czasowych i przy różnych podejściach. Ponadto pokazujemy, że Bruno1 (Bru1) jest niezbędny do czasowego przesunięcia w splicingu ciężkiego łańcucha miozyny (Mhc), wykazując, że wypreparowane mięśnie mogą być wykorzystywane do zastosowań w mRNA-Seq, spektrometrii mas i reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Ten protokół preparacyjny pomoże promować analizy omiczne specyficzne dla tkanek i może być ogólnie stosowany do badania wielu biologicznych aspektów miogenezy.

Mięsień lotu Drosophila to potężny model do badania regulacji transkrypcji, alternatywnego splicingu, metabolizmu i mechanobiologii. Przedstawiamy protokół preparacji znakowanych fluorescencyjnie mięśni lotnych z żywych poczwarek w celu wygenerowania wysoce wzbogaconych próbek, idealnych do proteomiki i głębokiego sekwencjonowania. Próbki te mogą dostarczyć ważnych mechanistycznych wglądów w różne aspekty rozwoju mięśni.

Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Protokół ułatwia preparację mięśni lotu pośredniego znakowanych GFP od Drosophila w różnych momentach rozwoju poczwarek w celu oceny zmian w ekspresji genów i białek. Korzystając z tych technik, można uzyskać wysoko wzbogaconą próbkę mięśni lotu z minimalną degradacją białka RNA, która jest odpowiednia dla podejść RT-PCR, western blot lub omicznych. Te specjalistyczne sekcje wymagają praktyki i umiejętności, ale liczba poczwarek, które można wypreparować, oraz jakość próbek poprawiają się wraz z doświadczeniem.Wizualna demonstracja tej sekcji ma kluczowe znaczenie dla określenia, jak odróżnić mięśnie lotu od tkanek niemięśniowych i ułatwienia szybkiej izolacji mięśni lotu od próbek poczwarek. Aby zainscenizować poczwarki, użyj zwilżonego pędzla, aby zebrać i przenieść pre-poczwarki na 60-milimetrową szalkę Petriego, a następnie określić płeć poczwarek pod mikroskopem dwuokularowym. Samce identyfikuje się po obecności jąder, które pojawiają się jako półprzezroczyste kule na nieprzezroczystych poczwarkach.Po oznaczeniu potrawy godziną, datą i genotypem much, poczwarki dojrzewają w inkubatorze w temperaturze od 25 do 27 stopni Celsjusza do odpowiedniego etapu. W przypadku rozbioru IFM przed 48 H APF, za pomocą zwilżonego pędzla przenieść odpowiednio przygotowane poczwarki do czarnej naczynia preparacyjnego wypełnionej około 2/3 schłodzonym PBS. Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym użyj 5 kleszczy, aby popchnąć jedną z poczwarek na dno czarnej miski preparcyjnej.Dostosuj powiększenie mikroskopu i ustaw ostrość, aż poczwarki będą wyraźnie widoczne. Używając jednej pary kleszczy do uchwycenia przedniej części poczwarki, szturchnij poczwarki pojedynczą końcówką drugiej pary kleszczy, nieco poza środkiem w jamie brzusznej, tuż za klatką piersiową. Użyj pierwszej pary kleszczy, aby usunąć przednią połowę obudowy poczwarki i uszczypnąć odsłonięte poczwarki tuż za klatką piersiową, aby oddzielić brzuch od klatki piersiowej.Następnie delikatnie ściśnij przednią część klatki piersiowej, aby odsłonić fluorescencyjnie znakowane IFM. Następnie za pomocą kleszczy wyrzuć pozostałą tuszę na przeciwną stronę szalki i w ten sam sposób rozkrój kolejne poczwarki. Kiedy wszystkie poczwarki zostaną wypreparowane, użyj kleszczy, aby zebrać włókna IFM i uporządkuj włókna w stos na dnie czarnego naczynia preparacyjnego.Użyj kleszczy, aby wypchnąć wszelkie zanieczyszczenia z pola view i usuń z próbek wszelkie mięśnie, tłuszcz, skórki lub inne niechciane tkanki inne niż IFM. Następnie za pomocą przyciętej końcówki pipety przenieś stos IFM do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 250 mikrolitrów schłodzonego PBS. Do rozbioru IFM po 48 H APF należy użyć lekko zwilżonego pędzla, aby przenieść poczwarki na pasek dwustronnej taśmy klejącej zamontowanej na szkiełku mikroskopowym.Ustaw poczwarki w linii, brzuszną stroną do dołu i z przodu w kierunku dołu szkiełka. Kiedy wszystkie poczwarki zostaną umieszczone, użyj kleszczy, aby rozdzielić i otworzyć pierwszą obudowę poczwarki powyżej przednich przetchlinków, a następnie delikatnie przesuń parę kleszczy grzbietowo, w kierunku tylnej, przecinając obudowę poczwarki, gdy kleszcze się poruszają. Uwolnić poczwarki z otwartego etui i natychmiast przenieść poczwarki do kropli PBS na drugim szkiełku mikroskopowym.Kiedy wszystkie poczwarki zostaną uwolnione, użyj cienkich nożyczek, aby odciąć odwłok poczwarki od klatki piersiowej i wepchnij odwłoki do osobnego stosu. Kiedy wszystkie klatki piersiowe zostaną usunięte, użyj kawałka bibuły, aby usunąć większość PBS i stos brzuchów. Dodaj kroplę świeżego, schłodzonego PBS do pozostałych klatek piersiowych, a następnie użyj nożyczek do cięcia od głowy wzdłuż podłużnej osi ciała jednym ruchem, aby podzielić klatkę piersiową na pół.Kiedy wszystkie poczwarki zostaną wypreparowane, użyj 5 kleszczy, aby wybrać jedną z półsekcji i delikatnie włóż końcówki jednego kleszcza powyżej i poniżej środka IFM. Trzymając nieruchomo pierwszą parę kleszczy, użyj cienkich nożyczek, aby odciąć jeden koniec IFM od naskórka i ścięgien, a następnie obróć poczwarki o 180 stopni, aby umożliwić odcięcie drugiego końca IFM od naskórka i ścięgien. Użyj kleszczy, aby przenieść wiązkę IFM z klatki piersiowej na krawędź pęcherzyka PBS, używając napięcia wody, aby utrzymać wiązkę na miejscu.Następnie popchnij tuszę na przeciwną stronę szkiełka i w ten sam sposób rozetnij resztę IFM. Po zebraniu wszystkich IFM użyj 5 kleszczy, aby usunąć wszelkie fragmenty mięśni skokowych lub naskórka, które mogły znaleźć się w próbkach. Następnie użyj napięcia wody, aby delikatnie uchwycić wypreparowane IFM między parą kleszczy i umieść IFM w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej 250 mikrolitrów schłodzonego PBS.Dane sekwencjonowania mRNA z IFM BRUNO1 IR pokazują zmiany w ekspresji na poziomie jednostki genowej w porównaniu z danymi sekwencjonowania typu dzikiego. Stosując spektrometrię mas całego proteomu na wypreparowanych IFM, obserwuje się podobną regulację na poziomie białka i izoformy białka. Po wprowadzeniu linii pułapki białkowej do końcowego intronu Mhc, włączenie białka znakowanego GFP można zaobserwować w IFM jako dwie kropki po obu stronach linii M przy 90 H APF, podczas gdy w tkance mięśniowej nóg sygnał GFP można zaobserwować równomiernie w poprzek linii M sarkomery.W przypadku stosowania RT-PCR na wypreparowanym IFM, przejście izoformy Mhc z zdarzenia eksonu 34 do 37 znakowanego GFP na zdarzenie nieznakowanego eksonu 34 do 35 można wykryć między 30 a 48 godzinami po utworzeniu poczwarki w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Z danych sekwencjonowania mRNA wynika, że tkanki mięśni nóg i skoków wyrażają wszystkie trzy izoformy Mhc, utrzymując ekspresję izoformy znakowanej GFP w dojrzałych mięśniach. Zarówno mutant Spalt major, jak i BRUNO1 IR-IFM, nie zdołały wyłączyć ekspresji izoformy Mhc znakowanej GFP w miarę rozwoju, co spowodowało profil ekspresji izoformy przypominający profil tkanki mięśniowej nóg i skoków.Pamiętaj, że sekcje powinny być wykonane w czasie krótszym niż 30 minut, aby zapobiec degradacji RNA. I, aby zadbać o ograniczenie zanieczyszczenia innymi typami komórek. Metoda ta generuje próbki wzbogacone IFM odpowiednie do podejść biochemicznych, takich jak RT-PCR lub western blotting, a także podejść w stylu omicznym, takich jak spektrometria mas, sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości, wychwytywanie konformacji chromatyny i metabolomika.Sekcje te mogą uzupełnić potężne podejścia genetyczne u Drosophila o dane na poziomie systemowym w celu zbadania podstawowych mechanizmów rozwoju i regulacji genów.

dissection-drosophila-melanogaster-flight-muscles-for-omics

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.

Disekcja NMJ larw Drosophila

Identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw uszkodzeń mięśni jest kluczowa. Przedstawiamy tutaj technikę histologiczną przygotowywania skrawków z laniny oraz skrawków mrożonych mięśni klatki piersiowej Drosophila. Pozwala to na analizę morfologii mięśni oraz lokalizację białek i innych składników komórek mięśniowych.

Przekroje woskowe i mrożone mięśni dorosłych osobników Drosophila

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

Mięśnie lotu Drosophila są używane jako modelowy system dla rozwoju i fizjologii mięśni. Ten film opisuje muskulaturę lotu dorosłych osobników i przedstawia protokół analizy rozwijających się pośrednich mięśni lotu, które są odpowiednie do sekwencjonowania RNA z poczwarek.

Drosophila Rozwarstwienie mięśni lotu pośredniego późnej poczwarki (IFM): metoda wysokoprzepustowego pobierania tkanek

Ten film demonstruje protokół oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych w grzbietowych mięśniach podłużnych Drosophila. Procedura polega na barwieniu neuronów i mięśni dwoma odrębnymi przeciwciałami i porównaniu wzorców fluorescencji między muchami zmutowanymi i dzikimi. Zmniejszenie barwienia neuronów u zmutowanych much wskazuje na neurodegenerację, podczas gdy struktura mięśni pozostaje nienaruszona.

Ocena integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych mięśni grzbietowych podłużnych u Drosophila

Badania morfogenezy neuronów za pomocą neuronów dendrytycznych larw Drosophila korzystają z wizualizacji in situ białek neuronalnych i naskórkowych za pomocą immunofluorescencji. Opisujemy procedurę, która poprawia analizę immunofluorescencyjną neuronów da i otaczających komórek naskórka poprzez usunięcie tkanki mięśniowej ze ściany ciała larwy.

Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka

Przedstawiamy metodę ilościowego określania powierzchni mięśniowej, która jest pośrednią metodą określania masy mięśniowej u dorosłych Drosophila. Demonstrujemy zastosowanie naszej metodologii, analizując pośrednie mięśnie lotu w modelu Drosophila choroby dystrofii miotonicznej.

Optyczne oznaczanie obszaru mięśni w przekroju poprzecznym dorosłych mięśni lotu pośredniego Drosophila melanogaster

W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Drosophila to sprawdzony model do badania kluczowych cząsteczek regulujących miogenezę. Jednak obecne metody są niewystarczające do określenia dynamiki transkrypcji mRNA i dystrybucji przestrzennej w obrębie syncytii. Aby rozwiązać ten problem, zoptymalizowaliśmy metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA, która umożliwia wykrywanie i kwantyfikację mRNA w skali pojedynczej cząsteczki.

Badanie dynamiki transkrypcji mięśni w skalach jednocząsteczkowych u Drosophila

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

Poznaj metodę preparacji mięśni lotu Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym oznakowaniem GFP. Technika umożliwia izolację próbek o wysokiej czystości do analiz proteomicznych i sekwencjonowania głębokiego.

Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych

Przeglądaj więcej filmów