Name: Modelowanie struktury czwartorzędowej za pomocą chemicznej sieciowania spektrometrii mas: rozszerzenie raportów TX-MS Jupyter (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Poznaj modelowanie struktury czwartorzędowej białek za pomocą chemicznej sieciowania spektrometrii mas z wykorzystaniem serwera Cheetah-MS i Jupyter Notebook. Ta metoda umożliwia analizę interakcji białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Knuta i Alice Wallenbergów (grant nr 2016.0023) oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (grant nr P2ZHP3_191289). Ponadto dziękujemy firmie S3IT, Uniwersytetowi w Zurychu, za infrastrukturę obliczeniową i wsparcie techniczne.

1. Prześlij przepływ pracy na https://txms.org.
<ol>
	<li>Przejdź do https://txms.org i kliknij "Użyj Cheetah-MS."</li>
	<li>Aby przesłać przepływ pracy, należy dostarczyć dwa pliki PDB i jeden plik MS/MS mzML lub MGF. Możesz również kliknąć przycisk "załaduj przykładowe dane", aby zobaczyć wersję demonstracyjną przepływu pracy. 
	UWAGA: Proszę zajrzeć na stronę podręcznika systemowego serwera WWW, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przesyłania zadania. Serwer WWW obsługuje różne nierozszczepialne agenty sieciujące, do 12 modyfikacji potranslacyjnych (PTM), opcje związane z modelowaniem obliczeniowym i analizą danych MS. Na stronie przesyłania zaprojektowano również małe przyciski pomocy, aby wyświetlić więcej informacji dotyczących każdej opcji.</li>
</ol>
2. Uruchom Cheetah-MS.
UWAGA: Konwertuj formaty specyficzne dla dostawcy na mzML lub MGF za pomocą oprogramowania ProteoWizard MSConvert19.
<ol>
	<li>Prześlij dane MS do https://txms.org. Następnie klikamy na "Wybierz plik" i wybieramy dane MS, które muszą być w formatach danych mzML/MGF class18. 
	UWAGA: Przykładowe dane są dostępne na stronie https://txms.org. Dane te są również bezpośrednio dostępne pod numerem zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621.</li>
	<li>Prześlij dwa pliki PDB do https://txms.org. Kliknij "Wybierz plik" i wybierz pliki PDB do przesłania. 
	UWAGA: Jeśli nie istnieją żadne struktury eksperymentalne, utwórz modele, używając na przykład serwerów WWW SWISS-MODEL20, jeśli dostępne są struktury homologów, lub trRosetta21,22 lub Robetta23,24 do przewidywania struktury de novo.</li>
	<li>Prześlij nowy przepływ pracy. Kliknij "Prześlij", aby otrzymać znacznik identyfikatora zadania. Następnie postępuj zgodnie z formularzem do sekcji wyników, używając tego tagu. 
	UWAGA: Obliczanie wyniku wymaga czasu, dlatego należy poczekać, aż zakończy się przepływ pracy, i zapisać znacznik identyfikatora zadania, aby powrócić do strony wyników. Obliczenia są przeprowadzane na zdalnej infrastrukturze obliczeniowej. Jeśli chcesz uruchomić TX-MS lokalnie, zapoznaj się z Hauri et al.10.</li>
	<li>Sprawdź raport Jupyter Notebook przy użyciu przeglądarki online. Następnie przewiń w dół do sekcji "Raport" w sekcji wyników za pomocą tagu identyfikatora zadania.</li>
</ol>
3. Zainstaluj JupyterHub.
<ol>
	<li>Zainstaluj platformę Docker zgodnie z instrukcjami w https://docs.docker.com/install/.</li>
	<li>Pobierz kontener platformy Docker JupyterHub z rozszerzeniem Jupyter openBIS25. Ogólne polecenie to "docker pull malmstroem/jove:latest", ale może się różnić na innych platformach. 
	UWAGA: Aby zapoznać się z ogólną dyskusją na temat pobierania kontenerów, zapoznaj się z https://www.docker.com/get-started. Kontener można również pobrać ze strony zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621. 
	UWAGA: Kod źródłowy rozszerzenia Jupyter openBIS jest dostępny tutaj: https://pypi.org/project/jupyter-openbis-extension/.</li>
	<li>Uruchom kontener platformy Docker: docker run -p 8178:8000 malmstroem/jove:latest. 
	UWAGA: Port używany domyślnie przez JupyterHub to 8000. Ten port jest konfigurowalny, a powyższe polecenia muszą zostać odpowiednio dostosowane, jeśli zostaną zmienione. Port 8178 jest arbitralnym wyborem i może zostać zmieniony. Przykładowe adresy URL podane poniżej należy odpowiednio dostosować.</li>
	<li>Wejdź pod adres: http://127.0.0.1:8178. Zaloguj się, używając nazwy użytkownika "user" i hasła "user." 
	UWAGA: Adres http://127.0.0.1 oznacza, że kontener platformy Docker jest uruchomiony na komputerze lokalnym. Jeśli kontener platformy Docker jest uruchamiany na serwerze, użyj adresu IP lub adresu URL serwera (np. https://example.com). Kontener docker jest oparty na Ubuntu Bionic 18.04, JupyterHub 0.9.6 i rozszerzeniu Jupyter openBIS 0.2. Możliwe jest zainstalowanie tego w innych systemach operacyjnych, ale nie zostało to przetestowane.</li>
</ol>
4. Pobierz raport.
<ol>
	<li>Utwórz nowy notes, klikając pozycję Nowy| Python 3 za pomocą menu znajdującego się w prawej górnej części strony. Spowoduje to otwarcie nowej karty z notatnikiem o nazwie Bez tytułu (lub podobnym).</li>
	<li>Kliknij "Konfiguruj połączenia openBIS" w menu narzędzi Jupyter.</li>
	<li>Wpisz nazwę: txms; Adres internetowy: https://txms.org; użytkownik: gość; Hasło: guestpasswd.</li>
	<li>Kliknij "Połącz".</li>
	<li>Wybierz nowe połączenie i kliknij "Wybierz połączenie"."</li>
	<li>Wyszukaj szablon raportu (np. /CHEETAH/WF70) i kliknij Download. 
	UWAGA: Musisz dostosować szablon raportu na podstawie wyników i raportu uzyskanych z uruchomienia zadania na serwerze internetowym Cheetah-MS.</li>
	<li>Uruchom ponownie raport, klikając pozycję Komórka | Uruchom wszystko.</li>
</ol>
5. Rozszerz raport.
<ol>
	<li>Dodaj nową komórkę na dole: Komórka | Wstaw poniżej.</li>
	<li>Wpisz poszukiwany kod. Przykład można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki poniżej.</li>
	<li>Uruchom komórkę, naciskając "Shift-Enter".</li>
</ol>

<ol><li>Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerman%2C+HM+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22">Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography</a>. 58 (6), 899-907 (2002).</li>
<li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Probing+of+a+Protein+Phosphatase+2A+Network+by+Chemical+Cross-Linking+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural Probing of a Protein Phosphatase 2A Network by Chemical Cross-Linking and Mass Spectrometry.</a> Science. 337 (6100), 1348-1352 (2012).</li>
<li>Hoopmann, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kojak%3A+efficient+analysis+of+chemically+cross-linked+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Kojak: efficient analysis of chemically cross-linked protein complexes.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2190-2198 (2015).</li>
<li>Seebacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+cross-linking+analysis+using+mass+spectrometry%2C+isotope-coded+cross-linkers%2C+and+integrated+computational+data+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Protein cross-linking analysis using mass spectrometry, isotope-coded cross-linkers, and integrated computational data processing.</a> Journal of Proteome Research. 5 (9), 2270-2282 (2006).</li>
<li>Rinner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cross-linked+peptides+from+large+sequence+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of cross-linked peptides from large sequence databases.</a> Nature Methods. 5 (4), 315-318 (2008).</li>
<li>Walzthoeni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+discovery+rate+estimation+for+cross-linked+peptides+identified+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">False discovery rate estimation for cross-linked peptides identified by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 9 (9), 901-903 (2012).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cross-linked+peptides+from+complex+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of cross-linked peptides from complex samples.</a> Nature Methods. 9 (9), 904-906 (2012).</li>
<li>Chu, F., Baker, P. R., Burlingame, A. L., Chalkley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+Chimeras%3A+a+Bioinformatics+Strategy+for+Identification+of+Cross-linked+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Finding Chimeras: a Bioinformatics Strategy for Identification of Cross-linked Peptides.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 9 (1), 25-31 (2010).</li>
<li>Holding, A. N., Lamers, M. H., Stephens, E., Skehel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hekate%3A+Software+Suite+for+the+Mass+Spectrometric+Analysis+and+Three-Dimensional+Visualization+of+Cross-Linked+Protein+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Hekate: Software Suite for the Mass Spectrometric Analysis and Three-Dimensional Visualization of Cross-Linked Protein Samples.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5923-5933 (2013).</li>
<li>Hauri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+quaternary+protein+structures+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of quaternary protein structures in complex biological samples.</a> Nature Communications. 10 (1), 192(2019).</li>
<li>Röst, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSWATH+enables+automated%2C+targeted+analysis+of+data-independent+acquisition+MS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 219-223 (2014).</li>
<li>Röst, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenMS%3A+a+flexible+open-source+software+platform+for+mass+spectrometry+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenMS: a flexible open-source software platform for mass spectrometry data analysis.</a> Nature Methods. 13 (9), 741-748 (2016).</li>
<li>Quandt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+synthetic+peptides+to+benchmark+peptide+identification+software+and+search+parameters+for+MS%2FMS+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22EuPA+Open+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Using synthetic peptides to benchmark peptide identification software and search parameters for MS/MS data analysis.</a> EuPA Open Proteomics. 5, 21-31 (2014).</li>
<li>Bradley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+modeling+with+Rosetta+in+CASP6%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Free modeling with Rosetta in CASP6.</a> Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 61 (S7), 128-134 (2005).</li>
<li>Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+protein-protein+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution protein-protein docking.</a> Current Opinion in Structural Biology. 16 (2), 183-193 (2006).</li>
<li>Khakzad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cheetah-MS%3A+a+web+server+to+model+protein+complexes+using+tandem+cross-linking+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cheetah-MS: a web server to model protein complexes using tandem cross-linking mass spectrometry data.</a> Bioinformatics. , (2021).</li>
<li>Malmström, L. Chapter 15: Computational Proteomics with Jupyter and Python. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMalmstr%C3%B6m%2C+L+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 15, Clifton, N.J. 237-248 (1977).</li>
<li>Martens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mzML--a+community+standard+for+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">mzML--a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
<li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li>
<li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWISS-MODEL%3A+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46 (W1), W296-W303 (2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protein+structure+prediction+using+predicted+interresidue+orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Improved protein structure prediction using predicted interresidue orientations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (3), 1496-1503 (2020).</li>
<li>Koehler Leman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+modeling+and+design+in+Rosetta%3A+recent+methods+and+frameworks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Macromolecular modeling and design in Rosetta: recent methods and frameworks.</a> Nature Methods. 17 (7), 665-680 (2020).</li>
<li>Chivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+CASP6+structures+using+automated+Robetta+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Prediction of CASP6 structures using automated Robetta protocols.</a> Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 61 (S7), 157-166 (2005).</li>
<li>Chivian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+prediction+of+CASP-5+structures+using+the+Robetta+server%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automated prediction of CASP-5 structures using the Robetta server.</a> Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 53 (S6), 524-533 (2003).</li>
<li>Bauch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((openBIS%3A+a+flexible+framework+for+managing+and+analyzing+complex+data+in+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">openBIS: a flexible framework for managing and analyzing complex data in biology research.</a> BMC Bioinformatics. 12, 468(2011).</li>
<li>Lima, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIM-XL%3A+A+powerful+and+user-friendly+tool+for+peptide+cross-linking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SIM-XL: A powerful and user-friendly tool for peptide cross-linking analysis.</a> Journal of Proteomics. 129, 51-55 (2015).</li>
<li>Happonen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+Streptococcus+pyogenes-human+protein-protein+interaction+map+reveals+localization+of+opsonizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A quantitative Streptococcus pyogenes-human protein-protein interaction map reveals localization of opsonizing antibodies.</a> Nature Communications. 10, 2727(2019).</li>
<li>Khakzad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+Streptococcus+pyogenes+M1+protein+interactions+with+human+immunoglobulin+G+using+integrative+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural determination of Streptococcus pyogenes M1 protein interactions with human immunoglobulin G using integrative structural biology.</a> PLOS Computational Biology. 17 (1), E1008169(2021).</li>
<li>Khakzad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cross-linking+MS+of+the+complement+system+MAC+assembled+on+live+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">In vivo cross-linking MS of the complement system MAC assembled on live Gram-positive bacteria.</a> Frontiers in Genetics. 11, (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nowoczesne przepływy pracy obliczeniowej są często złożone, z wieloma narzędziami od wielu różnych dostawców, złożonymi współzależnościami, dużymi ilościami danych i wieloaspektowymi wynikami. W związku z tym coraz trudniej jest dokładnie udokumentować wszystkie kroki wymagane do uzyskania wyniku, co utrudnia odtworzenie danego wyniku. W tym miejscu przedstawiamy ogólną strategię, która łączy automatyzację i łatwość zautomatyzowanego przepływu pracy, który generuje ogólny raport, z elastycznością w dostosowywaniu raportu w powtarzalny sposób.
Aby protokół działał, muszą być spełnione trzy wymagania: po pierwsze, białka wybrane do analizy muszą oddziaływać w taki sposób, aby doświadczenie chemicznego sieciowania mogło wytworzyć usieciowane gatunki w wystarczająco wysokim stężeniu, aby można je było wykryć za pomocą spektrometru masowego; Różne spektrometry masowe mają różne poziomy detekcji i są również zależne od protokołu akwizycji, a także od wyboru odczynnika sieciującego. Obecna wersja protokołu TX-MS dopuszcza tylko DSS, homobifunkcyjny odczynnik sieciujący lizynę i lizynę. Jednak to ograniczenie wynika przede wszystkim z możliwości, że etap uczenia maszynowego musiałby zostać dostosowany do innych odczynników. To ograniczenie zostało ulepszone w serwerze WWW Cheetah-MS, ponieważ można rozważyć dwa dodatkowe odczynniki sieciujące, ale wszystkie trzy są odczynnikami nierozszczepialnymi. Po drugie, te dwa białka muszą mieć albo eksperymentalnie określoną strukturę, albo być modelowane przy użyciu technik modelowania porównawczego lub technik de novo . Nie wszystkie białka mogą być modelowane, ale połączenie ulepszonego oprogramowania i stałego osadzania struktur eksperymentalnych w PDB zwiększa liczbę białek, które można modelować. Po trzecie, oddziałujące białka powinny pozostać wystarczająco podobne w swoich stanach związanych i niezwiązanych, tak aby algorytmy dokowania używane przez TX-MS i Cheetah-MS mogły tworzyć struktury czwartorzędowe o odpowiedniej jakości, aby umożliwić punktację. Wymóg ten jest stosunkowo niejasny, ponieważ akceptowalna jakość jest wysoce zależna od systemu, gdzie mniejsze białka o znanej strukturze są na ogół łatwiejsze do porównania niż większe białka o nieznanej strukturze.
W przypadku wyniku ujemnego należy najpierw sprawdzić, czy TX-MS znalazł intra-linki, wiązania krzyżowe między pozostałościami, które są częścią tego samego łańcucha polipeptydowego. Jeśli żadne z nich nie zostaną wykryte, najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że coś poszło nie tak z przygotowaniem próbki lub pozyskiwaniem danych. Jeśli wiele wiązań odległości nie obsługuje modeli, należy przeprowadzić wizualną inspekcję modeli, aby upewnić się, że konformacja jest podparta przez usieciowane pozostałości. Nie ma oczywistego sposobu na przegrupowanie jednego z interaktorów bez przerwania co najmniej jednego ogniwa krzyżowego. Jeśli istnieją wiązania krzyżowe większe niż dozwolona odległość dla danego odczynnika sieciującego, spróbuj poprawić modelowanie interaktorów poprzez włączenie danych dotyczących sieciowania.
Możliwe jest użycie alternatywnych aplikacji w celu uzyskania równoważnych wyników, pod warunkiem, że czułość wybranego oprogramowania jest porównywalna z czułością TX-MS. Na przykład istnieją wersje online RosettaDock, HADDOCK i inne. Możliwa jest również analiza danych dotyczących sieciowania chemicznego za pomocą xQuest/xProphet 5,6, plink7 i SIM-XL26.
Stale stosujemy TX-MS i Cheetah-MS w nowych projektach 27,28,29, ulepszając w ten sposób raporty tworzone za pomocą tych podejść, aby umożliwić bardziej szczegółową analizę wyników bez powiększania raportów.

Interakcje białko-białko stanowią podstawę struktury i funkcji systemów biologicznych. Dostęp do czwartorzędowych struktur białek może zapewnić wgląd w to, jak dwa lub więcej białek oddziałuje na siebie, tworząc struktury wyższego rzędu. Niestety, uzyskanie struktur czwartorzędowych pozostaje wyzwaniem; znajduje to odzwierciedlenie w stosunkowo niewielkiej liczbie wpisów w Protein DataBank (PDB) 1 zawierających więcej niż jeden polipeptyd. Interakcje białko-białko można badać za pomocą technologii takich jak krystalografia rentgenowska, NMR i cryo-EM, ale uzyskanie wystarczającej ilości oczyszczonego białka w warunkach, w których można zastosować metody, może być czasochłonne.
Chemiczna spektrometria mas sieciowania została opracowana w celu uzyskania danych eksperymentalnych na temat interakcji białko-białko z mniejszymi ograniczeniami w przygotowaniu próbki, ponieważ spektrometria mas może być używana do pozyskiwania danych o dowolnie złożonych próbkach2,3,4,5,6,7,8,9. Jednak kombinatoryczny charakter analizy danych i stosunkowo niewielka liczba usieciowanych peptydów wymagają, aby próbki były frakcjonowane przed analizą. Aby zaradzić temu brakowi, opracowaliśmy TX-MS, metodę, która łączy modelowanie obliczeniowe z chemicznym sieciowaniem spektrometrii mas10. TX-MS może być używany na dowolnie złożonych próbkach i jest znacznie bardziej czuły w porównaniu z poprzednimi metodami10. Osiąga to poprzez ocenę wszystkich danych związanych z daną interakcją białko-białko jako zestaw, zamiast interpretować każde widmo MS niezależnie. TX-MS wykorzystuje również do trzech różnych protokołów akwizycji MS: MS1 o wysokiej rozdzielczości (hrMS1), akwizycji zależnej od danych (DDA) i akwizycji niezależnej od danych (DIA), co dodatkowo daje możliwości identyfikacji usieciowanego peptydu poprzez połączenie wielu obserwacji. Obliczeniowy przepływ pracy TX-MS jest złożony z kilku powodów. Po pierwsze, opiera się na wielu programach do analizy MS11,12,13 do tworzenia modeli struktury białka14,15. Po drugie, ilość danych może być znaczna. Po trzecie, etap modelowania może pochłaniać znaczne ilości mocy obliczeniowej komputera.
W związku z tym, TX-MS najlepiej sprawdza się jako zautomatyzowany, uproszczony przepływ pracy obliczeniowej za pośrednictwem serwera WWW Cheetah-MS16, który działa na dużych infrastrukturach obliczeniowych, takich jak chmury komputerowe lub klastry. Aby ułatwić interpretację wyników, stworzyliśmy interaktywny Jupyter Notebook17. W tym miejscu pokazujemy, w jaki sposób można rozszerzyć raport Jupyter Notebook, aby uzyskać bardziej dogłębną analizę danego wyniku.

<table><tbody><tr><td>Dwa pliki Banku Danych Białek zawierające białka będące przedmiotem zainteresowania.</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Przykładowe pliki dostępne na txms.org i zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621</td></tr><tr><td>Plik danych mzML uzyskany na próbce, w której białka będące przedmiotem zainteresowania zostały usieciowane.</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Przykładowe pliki dostępne na txms.org lub zenodo.org, DOI 10.5281/zenodo.3361621</td></tr></tbody></table>

modelowanie struktury czwartorzędowej za pomocą chemicznej sieciowania spektrometrii mas: rozszerzenie raportów tx-ms jupyter

Quaternary Structure Modeling Through Chemical Cross-Linking Mass Spectrometry: Extending TX-MS Jupyter Reports

Interakcje białko-białko mogą być trudne do zbadania, ale dostarczają wglądu w funkcjonowanie systemów biologicznych. Ukierunkowana sieciowanie spektrometrii mas (TX-MS), metoda łącząca modelowanie struktury białek czwartorzędowych i chemiczną spektrometrię mas z sieciowaniem, tworzy modele struktury o wysokiej dokładności na podstawie danych uzyskanych ze złożonych, niefrakcjonowanych próbek. Usuwa to jedną z głównych przeszkód w analizie struktury kompleksu białek, ponieważ białka będące przedmiotem zainteresowania nie muszą być już oczyszczane w dużych ilościach. Serwer WWW Cheetah-MS został opracowany, aby uproszczona wersja protokołu była bardziej dostępna dla społeczności. Biorąc pod uwagę tandemowe dane MS/MS, Cheetah-MS generuje Jupyter Notebook, graficzny raport podsumowujący najważniejsze wyniki analizy. Rozszerzenie Jupyter Notebook może zapewnić bardziej szczegółowe informacje i lepiej zrozumieć model oraz wspierające go dane spektrometrii mas. Przedstawiony tutaj protokół techniczny przedstawia niektóre z najczęstszych rozszerzeń i wyjaśnia, jakie informacje można uzyskać. Zawiera bloki pomagające w analizie danych akwizycji tandemowych MS/MS oraz ogólnego wpływu wykrytych XL na raportowane modele czwartorzędowe. Wynik takich analiz można zastosować do modeli konstrukcyjnych, które są osadzone w notatniku za pomocą NGLView.

TX-MS dostarcza wyników strukturalnych opartych na eksperymentalnych ograniczeniach wynikających z MS. Działa poprzez łączenie różnych typów akwizycji danych MS z modelowaniem obliczeniowym. Dlatego pomocne jest oddzielne analizowanie każdego zestawu danych MS oraz zapewnienie wizualizacji wynikowej struktury. Dane uzupełniające 1  zawierają przykładowy notatnik, który może analizować dane DDA i DIA wytworzone jako wynik TX-MS. Użytkownicy mogą wybrać interesujące ich XL. Po uruchomieniu notatnika wyświetlone zostanie widmo MS2 dla tego XL, w którym różne kolory pomagają odróżnić fragmenty związane z pierwszym peptydem, drugim peptydem oraz kombinatoryczne jony fragmentacyjne. XL może być również zmapowany na strukturę przy użyciu widżetu NGLView osadzonego w notatniku Jupyter.
Inna komórka w tym notatniku może pomóc użytkownikom w parsowaniu i wizualizacji danych DIA. Jednak wizualizacja danych DIA jest trudniejsza, ponieważ analizowane dane muszą zostać przygotowane w odpowiednim formacie.
Rycina 1 przedstawia przykładową strukturę M1 i albuminy z naniesionymi na nią najważniejszymi połączeniami sieciowymi (XL). Metoda TX-MS pozwoliła na uzyskanie wszystkich XL po analizie danych hrMS1, DDA i DIA, natomiast protokół RosettaDock dostarczył modele obliczeniowe.
Ponieważ niniejszy raport jest notatnikiem Jupyter, w nowych komórkach notatnika można dodać dowolny poprawny kod w języku Python. Na przykład poniższy kod utworzy histogram liczby zliczeń MS2, wskazując, jak dobrze każdy mostek dwusiarczkowy jest wspierany przez podstawowe dane. 
import seaborn as sns 
sns.distplot(ms2['count']);
<img alt="Schemat kompleksu białko-DNA; biologia strukturalna; oddziaływania białkowe; modelowanie molekularne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60311/60311fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Model strukturalny Streptococcus pyogenes M1 białko i albuminy ludzkiej z naniesionymi na strukturę wiązaniami krzyżowymi (XLs). Białko M1 przedstawiono w kolorze szarym; tworzy ono homodimer. Sześć cząsteczek albuminy przedstawiono w parach w różnych odcieniach niebieskiego. Wiązania sieciujące i odległości zaznaczono na czerwono z czarnym tekstem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60311/60311fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Plik uzupełniający. Dane z notatnika Jupyter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60311/Supplementary%20Data%201.ipynb" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ukierunkowana spektrometria mas sieciowania tworzy czwartorzędowe modele struktury białek przy użyciu danych spektrometrii mas uzyskanych przy użyciu maksymalnie trzech różnych protokołów akwizycji. W przypadku wykonywania jako uproszczony przepływ pracy na serwerze internetowym Cheetah-MS wyniki są raportowane w Jupyter Notebook. W tym miejscu pokazujemy techniczne aspekty tego, w jaki sposób można rozszerzyć Jupyter Notebook w celu uzyskania bardziej dogłębnej analizy.

Modelowanie struktury czwartorzędowej za pomocą chemicznej sieciowania spektrometrii mas: rozszerzenie raportów TX-MS Jupyter

Protein-protein interactions can be challenging to study yet provide insights into how biological systems function. Targeted cross-linking mass ...

Ta metoda wykorzystuje możliwości Jupyter Notebook do dostarczania informacyjnych i atrakcyjnych wizualnie raportów, jednocześnie umożliwiając użytkownikom rozszerzanie i dostosowywanie raportu w powtarzalny i identyfikowalny sposób. Ta elastyczna technika pozwala na uchwycenie wszystkich modyfikacji użytkownika w wystarczającej szczegółowości, aby można je było odtworzyć w późniejszym czasie lub przez innego użytkownika. Chociaż metoda ta jest ogólnie stosowana w każdej dziedzinie badań, jest ona przeznaczona przede wszystkim dla nauk przyrodniczych Mucor, obszaru badań, który może generować złożone dane.Przed rozpoczęciem analizy otwórz stronę internetową spektrometrii mas z ukierunkowanym sieciowaniem. Po przejściu do witryny internetowej pojawi się ekran powitalny z ogólnym opisem usługi TX MS.web. W zakładce tutorial można zapoznać się ze szczegółowym opisem świadczonych usług, w tym informacjami o tym, jak korzystać z usługi i jak analizować wyniki.Na karcie pobierania można pobrać oprogramowanie i zasoby. Całe oprogramowanie jest dostępne na licencji open source. Na karcie Licencja znajduje się 3-klauzulowa licencja BSD, która jawnie sprawia, że oprogramowanie jest w jak najszerszym zakresie użytecznym.Zakładka Kontakt zawiera informacje kontaktowe, które można przesyłać pytania lub komentarze. Aby przesłać wiadomość e-mail z prośbą o poświadczenia użytkownika, wróć do karty Gepard i kliknij hiperłącze adresu e-mail u dołu strony. Wprowadź odpowiednie informacje w wierszu tematu w treści wiadomości e-mail.Odpowiedź zostanie wysłana tak szybko, jak to możliwe. Po otrzymaniu wiadomości e-mail z potwierdzeniem i danymi uwierzytelniającymi użytkownika, zaloguj się i prześlij dane spektrometrii mas na stronę internetową. Kliknij przycisk Prześlij przepływ pracy, a następnie wprowadź tytuł i opis.Następnie kliknij wyświetl przepływ pracy i wybierz przepływ pracy Gepard. Po wykonaniu czynności kreatora użyj przeglądarki online, aby sprawdzić Jupyter Notebook. Aby zainstalować JupyterHub, zainstaluj platformę Docker zgodnie z instrukcjami i pobierz kontener platformy Docker JupyterHub z rozszerzeniem Jupyter openBIS.Po uruchomieniu Dockera uruchom P8171:8000 malmstroem/jove:latest container. Przejdź do wskazanego adresu internetowego i zaloguj się za pomocą loginu i hasła Użytkownika. Aby pobrać raport, kliknij przycisk nowy w języku Python 3, aby otworzyć nową kartę z notesem bez tytułu.Kliknij konfiguruj połączenia openBIS w menu narzędzi Jupyter i wprowadź TX MS jako nazwę, adres internetowy TX MS jako adres URL, Guest dla użytkownika i G-U-E-S-T-P-A-S-S-W-D jako hasło. Wybierz nowe połączenie i kliknij przycisk Wybierz połączenie, aby wyszukać raport. Następnie kliknij, pobierz w komórce i uruchom wszystko, aby zwrócić raport.Aby rozszerzyć raport, kliknij komórkę i wstaw poniżej, aby dodać nową komórkę na dole. Następnie kliknij kod i naciśnij Shift i Enter, aby uruchomić komórkę. Aby przesłać raport, kliknij przycisk przesyłania, aby utworzyć nowy zestaw danych.Przedstawiono tutaj reprezentatywną strukturę M1 i albuminy z górnymi wiązaniami krzyżowymi odwzorowanymi na strukturze. Wszystkie powiązania krzyżowe uzyskano za pomocą ukierunkowanej spektrometrii mas sieciowania po przeanalizowaniu danych MS1 zależnych i niezależnych danych o wysokiej rozdzielczości, a modele obliczeniowe zostały dostarczone przez protokół RosettaDock. Ważne jest, aby pamiętać, że interakcje białek są zróżnicowane pod względem ich stabilności.W związku z tym Twoje wyniki mogą się różnić. Obecna metodologia ogranicza się do oddziaływań binarnych i dlatego nie może być stosowana do bardziej złożonych struktur czwartorzędowych białek. Jednak modelowanie pojedynczych par może stanowić dobrą podstawę do budowania bardziej złożonych konstrukcji.Szczegóły dotyczące interfejsu wiązania mogą być przydatne na wiele sposobów, na przykład do sugerowania mutacji, które mogą stabilizować lub destabilizować interakcje białek. Może to być pomocne w lepszym zrozumieniu roli interakcji białko-białko.

quaternary-structure-modeling-through-chemical-cross-linking-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Spektrometria mas sprzężona z mobilnością jonów to rozwijająca się technologia fazy gazowej, która rozdziela jony na podstawie ich przekroju czynnego zderzeń oraz masy. Metoda ta dostarcza trójwymiarowych informacji o ogólnej topologii i kształcie kompleksów białkowych. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy podstawową procedurę konfiguracji i optymalizacji instrumentu, kalibracji czasów dryfu oraz interpretacji danych.

Spektrometria mas z mobilnością jonów w polu falowym T: podstawowe procedury eksperymentalne w analizie kompleksów białkowych

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Peptydy bogate w cysteinę składają się w odrębne trójwymiarowe struktury w zależności od ich połączeń dwusiarczkowych. Ukierunkowana synteza pojedynczych izomerów dwusiarczkowych jest wymagana, gdy utlenianie buforu nie prowadzi do pożądanego połączenia dwusiarczkowego. Protokół dotyczy selektywnej syntezy peptydów z wiązaniami 3-dwusiarczkowymi oraz ich analizy strukturalnej z wykorzystaniem badań NMR i MS/MS.

Synteza i oznaczanie struktury izomerów PIIIA μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych

Tutaj prezentujemy, jak można wykorzystać rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) do uzyskania informacji o obwiedniach o niskiej rozdzielczości reprezentujących struktury makromolekularne. W połączeniu z technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości, takimi jak krystalografia rentgenowska i magnetyczny rezonans jądrowy, SAXS może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wielodomenowych białek i kompleksów makromolekularnych w roztworze.

Badania strukturalne makrocząsteczek w roztworze z wykorzystaniem rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem

Opisano eksperymentalne procedury znakowania kowalencyjnego na bazie dietylopirowęglanów z detekcją spektrometryczną mas. Wodorowęglan dietylu jest po prostu mieszany z białkiem lub kompleksem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania, co prowadzi do modyfikacji reszt aminokwasowych dostępnych w rozpuszczalniku. Zmodyfikowane pozostałości można zidentyfikować po mineralizacji proteolitycznej i analizie metodą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas.

Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Poznaj modelowanie struktury czwartorzędowej białek za pomocą chemicznej sieciowania spektrometrii mas z wykorzystaniem serwera Cheetah-MS i Jupyter Notebook. Ta metoda umożliwia analizę interakcji białkowych.

Modelowanie struktury czwartorzędowej za pomocą chemicznej sieciowania spektrometrii mas: rozszerzenie raportów TX-MS Jupyter

Przeglądaj więcej filmów