Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Celem metody jest wytworzenie synapsy immunologicznej, która jest przykładem koniugacji międzykomórkowej utworzonej przez komórkę prezentującą antygen i limfocyt T-pomocniczy. Naszym celem jest zarejestrowanie pierwszych etapów powstawania synaps immunologicznych oraz zarejestrowanie zdarzeń transportowych zachodzących w limfocycie T-pomocniczym. To ostatecznie doprowadzi do spolaryzowanego wydzielania w synapsie immunologicznej.

Przedstawione tutaj podejście obejmuje koniugację między komórkami, akwizycję poklatkową, mikroskopię fluorescencyjną o szerokim polu widzenia, a następnie przetwarzanie obrazu. Poprawia to stosunek sygnału do szumu obrazów, zwiększa rozdzielczość czasową i umożliwia jednoczesne pozyskiwanie kilku fluorochromów w powstających koniugatach synaptycznych i zmniejsza wybielanie fluorescencyjne. Ponadto protokół jest kompatybilny z protokołami utrwalania komórek w punkcie końcowym, które umożliwią barwienie i analizę immunofluorescencyjną.

Protokół ten jest również kompatybilny z laserową skaningową mikroskopią fluorescencyjną i innymi najnowocześniejszymi technikami mikroskopii. Procedurę zademonstrują Ana Bello, doktorantka, Alejandro Garrido, technik i Solange Moreno, doktorantka. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 150 mikrolitrów fibronektyny do każdej studzienki szkiełka z ośmioma komorami mikrodołkowymi i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do jednej godziny.

Po okresie inkubacji odessać fibronektynę i przemyć każdą studzienkę 200 mikrolitrami PVS przez dwie minuty, delikatnie wstrząsając. Powtórz to pranie jeszcze raz i pozostaw drugie pranie w studzience. Przenieś 10 mililitrów zlewającej się prekultury komórek Raji do 15-mililitrowej probówki z dnem w kształcie litery V.

Wirować w temperaturze 300 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad komórek w ciepłym, kompletnym podłożu o stężeniu 1 miliona komórek na mililitr. Aby oznaczyć komórki Raji, przenieś wymaganą liczbę komórek w pożywce hodowlanej do dwumililitrowej probówki.

Do szkiełka z ośmioma komorami mikrodołkowymi potrzebne jest łącznie 1,6 mililitra zawiesiny komórek. Dodaj niebieski tracker komórek do końcowego stężenia 10 mikromolów. Ponownie zawiesić zabarwione na niebiesko komórki śledzące komórki i przenieść 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki przygotowanych szkiełek komorowych pokrytych fibronektyną.

Inkubuj szkiełko komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 30 minut do jednej godziny. Następnie delikatnie potrząśnij szkiełkami komory na mikroskopie, aby upewnić się, że komórki Raji są przylegające. Dokładnie umyj każdą studzienkę ciepłym, kompletnym podłożem do hodowli komórkowych, aby wyeliminować nadmiar niebieskiego narzędzia do śledzenia komórek.

Upewnij się, że komórki Raji są przyklejone do dolnej części płytek i wykazują przerwy między sobą i nie zlewają się. 50-60% zbiegu komórek jest odpowiednie. Najpierw dodaj enterotoksynę gronkowcową E w stężeniu jednego mikrograma na mililitr do każdej studzienki.

Upewnij się, że komórki Raji są pulsowane superantygenem, w przeciwnym razie receptor limfocytów T z komórek Jurkat nie rozpozna SCE i synapsa nie zostanie utworzona. Inkubować szkiełko komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez co najmniej 30 minut. Następnie należy uzyskać wcześniej wyhodowaną kulturę komórek Jurkat w stężeniu od 1 do 2 milionów komórek na milimetr.

Obserwuj komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym, a następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki z dnem w kształcie litery V. Wirować w temperaturze 300 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić komórki w ciepłym, kompletnym podłożu hodowlanym o stężeniu 1 miliona komórek na mililitr.

Następnie utrzymuj komórki Jurkata w hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla, aż będą gotowe do użycia. Pobrać z inkubatora szkiełka komory zawierające niebieskie komórki Raji z adhezyjnym przyłączeniem impulsowym Staphylococcus Enterotoxin E do śledzenia komórek. Ostrożnie odsysaj pożywkę hodowlaną z każdej studzienki jeden po drugim za pomocą pipety umieszczonej w rogu studzienki.

Natychmiast zastąp pożywkę 200 mikrolitrami zawieszonych komórek Jurkat w pożywce do hodowli komórkowych. Jeśli wykonywany jest film poklatkowy, szybko przejdź do mikroskopu. Zlokalizuj szkiełko z komorą na kelnerze do pomiaru mikroskopu i wybierz odpowiednie pola.

Przygotuj mikroskop i komorę inkubacyjną przed obrazowaniem. Po dodaniu komórek Jurkata do każdej studzienki zawierającej komórki Raji, szybko zlokalizuj szkiełko komorowe z mikrodołkiem na podgrzewanym inkubatorze mikroskopowym i wybierz kilka pozycji XY. Jeśli planowany jest tylko eksperyment końcowy, inkubuj szkiełko w komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez jedną do dwóch godzin.

Po okresie hodowli sprawdź, czy nie tworzy się koniugat, a następnie utrwal koniugaty zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby naprawić ogniwa, dodaj ciepłe RPMI bez FCS i delikatnie potrząśnij. Zassać RMPI i dodać 200 mikrolitrów PFA lub wstępnie schłodzonego acetonu do każdej studzienki.

Inkubować szkiełko komorowe w temperaturze pokojowej lub na lodzie przez 20 minut. Następnie umyj każdą studzienkę dwukrotnie PVS i dodaj 200 mikrolitrów roztworu hartującego. W tym badaniu generowane są koniugaty synaps immunologicznych Jurkat-Raji i prawidłowo obrazowane są wczesne etapy tworzenia synaps immunologicznych.

Strategia ta indukuje tworzenie synaps immunologicznych, jednocześnie wykonując obrazowanie poklatkowe. Reprezentatywne koniugaty synaptyczne Jurkat-Raji uzyskane za pomocą tej techniki są pokazane tutaj, w tym obraz kanału transmisyjnego, niebieskiego kanału śledzenia komórek i oba te kanały są połączone. Można zaobserwować niektóre koniugaty synaptyczne, w tym te składające się tylko z jednej komórki Jurkat i kilku komórek Raji, które są złożonymi sprzęgami.

Zmniejszające się stężenia komórek pozwolą uniknąć tworzenia złożonych koniugatów komórkowych, ale mogą nie zapewnić wystarczającej liczby koniugatów komórkowych do późniejszej analizy ruchu spolaryzowanego, co z kolei zmniejszy szanse na znalezienie i zobrazowanie pojawiających się koniugatów synaptycznych. Dekonwolucja obrazów kanału fluorescencji GFP-CD63 wykonywana jest za pomocą odpowiedniego oprogramowania do dekonwolucji z wykorzystaniem opcji optycznej szerokokątnej i odpowiednich parametrów optycznych. Ten zdekonwoluowany kanał został następnie połączony z niebieskim szerokim kanałem śledzenia komórek.

Nastąpiła poprawa zarówno stosunku sygnału do szumu, jak i ostrości. Pokazano tutaj reprezentatywny stos Z ustalonego koniugatu synapsy immunologicznej. Immunofluorescencję przeprowadza się przy użyciu falloidyny do wizualizacji F-aktyny, anty-CD63 do wizualizacji MVB i anty-gamma-tubuliny do wizualizacji MTOC, podczas gdy tracker komórek oznaczony na niebiesko komórki Raji.

Opcjonalne transfiksowanie komórek Jurkat pozwoli na wizualizację ruchu granulek wydzielniczych w żywych komórkach. Na przykład, gdy GFP-CD63 ulega ekspresji, można zarejestrować ruch pęcherzyków ozdobionych GFP-CD63. Protokół jest zgodny z protokołami utrwalania punktu końcowego, które pozwolą na dalsze protokoły barwienia immunofluorescencyjnego i analizy.

Istnieją eksperymentalne modele produktywności, które mogą uprościć obrazowanie w synapsie immunologicznej, ale modele te nie emulują złożonej i nieregularnej powierzchni komórek prezentujących antygen, które mogą powodować niefizjologiczne interakcje w synapsie immunologicznej. Opisane tutaj podejście jest odpowiednie do odtworzenia i potwierdzenia pewnych złożoności biologicznych zachodzących w synapsie immunologicznej. Superantygen jest niebezpieczną toksyną, dlatego należy założyć rękawiczki i upuścić zużytą końcówkę na niebezpieczne pudełko.