Name: Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj metodę obrazowania ludzkiej synapsy immunologicznej między komórkami Raji a limfocytami T Jurkat. Technika fluorescencyjna pozwala obserwować polaryzowaną sekrecję i dynamikę interakcji immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim byłym i obecnym członkom laboratorium za ich hojny wkład. Prace te były wspierane przez dotacje hiszpańskiego Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), Plan Nacional de Investigación Científica (SAF2016-77561-R dla M.I., które zostały częściowo przyznane ze środków FEDER-EC). Dziękujemy Facultad de Medicina (UAM) i Departamento de Audiovisuales Facultad de Medicina za ich wsparcie i zaplecze zapewnione do wyprodukowania filmu. Dziękujemy firmie NIKON-Europe za ciągłe i doskonałe wsparcie techniczne i teoretyczne. Bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez firmę Nikon.

1. Przygotowanie preparatów do przylegania komórek Raji
<ol>
	<li>Dodać 150 μl fibronektyny (100 μg/ml) na studzienkę do szkiełka z 8 mikrodołkami (szkiełko z plastikową komorą z dnem) i inkubować przez 30 minut do 1 godziny w temperaturze 37 °C. Ten substrat adhezyjny pozwoli na wiązanie komórek Raji z dnem studni (krok 2), tworzenie żywych koniugatów z komórkami Jurkata (etap 4) i wychwytywanie mikroskopii poklatkowej (krok 6), a także jest kompatybilne z opcjonalnym wiązaniem paraformaldehydu (PFA) (krok 7). 
	nuta: Do utrwalania acetonu należy użyć szkiełek ze szklaną dolną komorą i poli-L-lizyny (20 μg/ml) zamiast fibronektyny, ponieważ aceton rozpuszcza plastik. Szkiełko z 8 mikrodołkami (1 cm2 dołki, maksymalna objętość 300 μl) lub równoważne jest elastycznym i odpowiednim formatem.</li>
	<li>Odessać fibronektynę za pomocą pipety automatycznej o pojemności 200 μl i przemyć każdą studzienkę 200 μl PBS przez 2 minuty, delikatnie wstrząsając. Powtórz to pranie jeszcze raz. Na tym etapie szkiełko komorowe można przechowywać w PBS przez 1-2 tygodnie w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przyleganie komórek Raji do szkiełek komory i znakowanie 7-amino-4-chlorometylokumaryny (CMAC)
<ol>
	<li>Przenieś 10 ml zlewającej się (1-2 x 106 komórek/ml) hodowli wstępnej komórek Raji do 15 ml probówki z dnem w kształcie litery V. Dobrze wymieszaj i użyj 10 μl do policzenia komórek w komorze Neubauera lub równoważnej.</li>
	<li>Odwirować pozostałe komórki o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zawieś osad komórkowy w ciepłym, kompletnym pożywce hodowlanej (RPMI 1640 uzupełniony 10% FCS, 2 mM glutaminy, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) w stężeniu10-6 komórek/ml. Użyj równania podanego poniżej: 
	([ ]początkowy x Vpoczątkowy = [ ]końcowy x Vkońcowy), gdzie [ ]początkowy oznacza początkowe stężenie komórki, Vpoczątkowe = początkowa objętość zawiesiny komórki, [ ]końcowe = końcowe stężenie komórki, Vkońcowe = końcowa objętość zawiesiny komórki. 
	nuta: W zależności od stężenia komórek w hodowli wyjściowej, możliwe jest pobranie większej liczby komórek niż jest to potrzebne, ale ważne jest, aby utrzymać pozostałe komórki w hodowli (37 °C) do końca doświadczenia, aby zapobiec potencjalnym problemom (patrz krok 2.6).</li>
	<li>Oznacz komórki Raji, aby umożliwić ich identyfikację podczas tworzenia koniugatu synaptycznego. W tym eksperymencie znakowanie 7-amino-4-chlorometylokumaryny (CMAC) przeprowadza się w kroku 2.4.2.
	<ol>
		<li>Przenieść wymaganą liczbę komórek Raji z pożywki hodowlanej do probówki o pojemności 2 ml. Do szkiełka z 8 mikrodołkami potrzeba łącznie 1,6 ml zawiesiny komórek (200 μl na studzienkę).</li>
		<li>Dodać CMAC do końcowego stężenia 10 μM. Utrzymuj komórki w ciemności, przykrywając probówkę folią aluminiową, ponieważ CMAC jest wrażliwy na światło. Potrzeba 200 μl zawierających 2 x 10 5 komórek Raji na 1 cm2 studzienki. Tak więc, jeśli trzeba przygotować 8 studzienek, wymagane są komórki 1,6 x 106 Raji. 
		nuta: Znakowanie komórek Raji za pomocą niebieskiego znacznika komórek (CMAC, wzbudzenie UV i emisja niebieskiego) odróżnia je od komórek Th, gdy tworzą się koniugaty synaptyczne. Barwnik ten jest kompatybilny z utrwalaczami PFA i acetonu i umożliwia dalsze zabiegi immunofluorescencyjne. Staraj się unikać ekspozycji na światło. Znakowanie komórek Raji w puli za pomocą CMAC, a następnie ponowne zawieszenie przed przyklejeniem komórek Raji do szkiełek komory pokrytych fibronektyną zapewnia jednorodne znakowanie komórek Raji za pomocą CMAC w różnych studzienkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki barwione CMAC i, po aspiracji PBS do szkiełka komorowego z kroku 1.2, przenieść 200 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki szkiełek komory pokrytych fibronektyną przygotowanych w kroku 1.1-1.2. Inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 min-1 h. 
	nuta: Na tym etapie adhezja i etykietowanie CMAC będą odbywać się jednocześnie, co pozwala zaoszczędzić czas. Należy pamiętać, że komórki Raji szybko się osadzają i należy zachować ostrożność, aby utrzymać jednorodne stężenie w zawiesinie komórkowej przed wysiewem. Na tym etapie nie jest konieczne przemywanie CMAC przez wirowanie, ponieważ mycie CMAC będzie łatwiejsze do wykonania w kroku 2.7 (kiedy znakowane komórki Raji są już przyklejone do szkiełek komory). Ponieważ CMAC jest obecny w zawiesinie komórek w dużym nadmiarze, niebieskie tło fluorescencji jest zbyt wysokie, aby odróżnić komórki zabarwione na niebiesko. Sprawdź fluorescencję CMAC komórek w kroku 2.7 po umyciu CMAC.</li>
	<li>Upewnij się, że komórki Raji są przyklejone do dna studzienek, delikatnie potrząsając szkiełkami komory na mikroskopie. Upewnij się, że komórki wyświetlają przerwy między sobą i nie są zbieżne (Rysunek 1, środkowy panel). 50-60% zbiegu komórek jest odpowiednie.
	<ol>
		<li>Jeśli większość komórek skutecznie przylega do szkiełka komory i nie zaobserwowano żadnych przerw między komórkami, umyj każdą studzienkę ciepłym kompletnym podłożem i ponownie zawieś pożywkę za pomocą automatycznej pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć nadmiar komórek. Sprawdzaj zbieg po każdym etapie ponownego zawieszenia.</li>
		<li>Jeśli komórki nie przylegają, powtórz ponownie etap adhezji i zwiększ czas adhezji i/lub liczbę komórek. 
		nuta: W tym miejscu można się zatrzymać, inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc (O/N) i kontynuować zgodnie z protokołem następnego dnia. Proszę potwierdzić następnego dnia, że komórki Raji pozostają przylegające i znakowane CMAC za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie dokładnie umyj każdą studzienkę ciepłym dodatkiem RPMI, aby wyeliminować nadmiar CMAC i sprawdź, czy nie ma niebieskiej emisji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). 
	nuta: Aby uniknąć stosowania olejku immersyjnego (lepkiego i lepkiego) oraz obiektywów olejowych o dużej aperturze numerycznej, można użyć obiektywów o bardzo dużej odległości (tj. 20x lub 40x) do szybkiego sprawdzenia oznakowania CMAC za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
3. Puls CMAC — znakowane komórki Raji enterotoksyną gronkowcową E
<ol>
	<li>Dodaj enterotoksynę gronkowcową E (SEE, 1 μg/ml) do każdej studzienki. SEE można wygodnie rozcieńczać w pożywce do hodowli komórkowych (roztwór roboczy o stężeniu 100 μg/ml) z zamrożonych preparatów SEE (1 mg/ml w PBS). Użyj 2 μl 100x roztworu roboczego na 200 μl mikrostudzienki. 
	ostrożność: Na tym etapie użyj rękawiczek i wyrzuć zużytą końcówkę do pudełka z zagrożeniem biologicznym.</li>
	<li>Inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 30 minut. Efekt SEE utrzymuje się przez co najmniej 3-4 h. 
	nuta: W razie potrzeby SEE może być dodawany do odwiertów w różnych punktach czasowych, jeśli planowane są odrębne konfiguracje poklatkowe (krok 5) i/lub w zależności od punktu czasowego rozpoczęcia eksperymentów z punktem końcowym (krok 6).</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek Jurkat
<ol>
	<li>Do tego eksperymentu należy użyć wcześniej wyhodowanej kultury komórek Jurkata (1-2 x 106 komórek/ml). Użyj komórek ze standardowej kolby hodowlanej lub z poprzedniej transfekcji zgodnie ze standardowymi protokołami elektroporacji, jak opisano wcześniej23. Transfekcja komórek Jurkata pozwoli na poklatkową wizualizację ruchu granulek wydzielniczych w żywych komórkach. Na przykład, gdy GFP-CD63 (marker MVB) jest wyrażany, można zarejestrować ruch pęcherzyków ozdobionych GFP-CD63 (Wideo 1).</li>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Jeśli zaobserwuje się nadmiar martwych komórek (>20-30%), przed użyciem należy przeprowadzić wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll przy użyciu standardowych protokołów24, aby wyeliminować nadmiar martwych komórek (martwe komórki wykazują większą gęstość niż żywe komórki) (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml, probówki z dnem w kształcie litery V i użyj 10 μl do liczenia za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować pozostałe komórki zgodnie z opisem w kroku 2.2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w tym samym stężeniu co komórki Raji (1 x 106/ml) przy użyciu świeżej, ciepłej pożywki hodowlanej. Wykonaj kroki 2.2-2.3.</li>
	<li>Utrzymuj komórki Jurkata w hodowli (37 °C, 5% CO2 ) w oczekiwaniu na Krok 4. 
	nuta: W drugiej opcji (transfekcja) liczba żywych komórek będzie znacznie niższa niż w pierwszej. Dlatego rozważ użycie większej początkowej objętości hodowli komórkowej, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do eksperymentu. Z 10 x 106 komórek Jurkat na kuwetę elektroporacyjną i transfekcję, tylko 2-4 x 106 komórek Jurkat przetrwa po 48 godzinach transfekcji, a niektóre z tych komórek zostaną utracone podczas etapu Ficoll. Tak więc jedna kuweta do elektroporacji jest na ogół wystarczająca, aby rzucić wyzwanie przylegającym komórkom Raji z impulsami SEE z 8 mikrostudzienek (potrzebne 1,6 x 106 transfekowanych komórek Jurkata).</li>
</ol>
5. Współwysiewanie komórek Raji i Jurkat
<ol>
	<li>Wyjąć z inkubatora szkiełka komorowe zawierające znakowane CMAC, pulsacyjne, sklejone komórki Rajiego z kroku 3.2. Na tym etapie nie jest konieczne mycie CMAC, ponieważ zostało to już zrobione w kroku 2.7.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki, jeden po drugim, z jednego rogu studzienki za pomocą automatycznej pipety o pojemności 200 μl. Nie pozwól, aby podłoże w studni całkowicie wyschło.</li>
	<li>Natychmiast zastąpić pożywkę 200 μl zawieszonych komórek Jurkat w pożywce do hodowli komórkowych (1 x 106/ml) przygotowanej w kroku 4.5. Jeśli wykonywane jest obrazowanie poklatkowe, przejdź do kroku 6 natychmiast po tym kroku, ponieważ komórki Jurkata mają tendencję do osadzania się i bardzo szybkiego tworzenia koniugatów synaptycznych. Dla wygody, mikrostudzienki zawierające pulsacyjne, przylegające do SEE komórki Raji, które na tym etapie nie otrzymują wysiewu komórkami Jurkat, powinny być utrzymywane z pożywką do hodowli komórkowych do czasu kolejnego wyzwania komórkami Jurkat. Pozwoli to na elastyczne późniejsze wyzwanie z komórkami Jurkat w celu uzyskania dodatkowych podejść eksperymentalnych poklatkowych lub kinetycznych, w punkcie końcowym.</li>
	<li>Jeśli ma zostać wykonany film poklatkowy, szybko przejdź do kroku 6. Polega to na kohodowli przez 1-2 godziny w inkubatorze mikroskopowym lub równoważnym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić tworzenie koniugatu synaptycznego i jednoczesną akwizycję obrazu. Jeśli przewiduje się analizę punktu końcowego, ale bez upływu czasu, sprawdź tworzenie koniugatu po okresie wspólnej hodowli za pomocą mikroskopu (jak w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) przed utrwaleniem komórek (krok 7).</li>
</ol>
6. Obrazowanie poklatkowe pojawiających się koniugatów synaptycznych
<ol>
	<li>Przygotuj mikroskop i komorę inkubacyjną przed obrazowaniem. W przykładzie pokazanym na filmie 1 szczegółowe ustawienia mikroskopii są pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2. 
	nuta: Jeśli planowany jest eksperyment poklatkowy, wszystkie ustawienia mikroskopu i uzupełnienia (komora do hodowli komórek otoczenia itp.) powinny być przygotowane przed dodaniem zawiesiny Jurkat do szkiełka komorowego z przylegającymi komórkami Raji. Poniższe kroki są opisane dla mikroskopu komercyjnego (tabela materiałów). Można jednak użyć dowolnego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w inkubator do hodowli komórkowych.
	<ol>
		<li>Do obrazowania ruchu spolaryzowanego należy używać mikroskopu z 60-krotnym zanurzeniem w oleju i dużą aperturą numeryczną.</li>
		<li>Upewnij się, że system automatycznego ustawiania ostrości jest włączony i dostosuj przesunięcie, aby ustawić ostrość komórek Raji związanych z dolną powierzchnią. Proszę zapoznać się z Rysunek 1, Wideo 1 i Wideo 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po dodaniu Jurkata do każdej studzienki zawierającej przylegające komórki Raji w kroku 5.3, szybko zlokalizuj szkiełko komory mikrostudzienki na wstępnie podgrzanym (1-2 h) inkubatorze mikroskopowym (tj. OKOlab) i wybierz kilka pozycji XY za pomocą mikroskopu, pól, w których prawdopodobnie zarejestruje powstającą formację IS, utworzoną przez, na przykład, komórkę transfekowaną Jurkatem, która wpadnie w ognisko mikroskopu.</li>
	<li>Użyj wstępnie podgrzanego inkubatora mikroskopowego, ponieważ zaobserwowano, że stolik stabilizowany temperaturowo utrzymuje stabilne pozycje X, Y, Z. Kryteriami dla wygodnego pola XY są: dobrze skoncentrowane i niezlewające się komórki Raji (tj. wykazujące przerwy między komórkami) oraz obecność transfekowanych komórek Jurkata (można to sprawdzić, łącząc kanały transmitancji i UV lub GFP). Komórki Jurkata będą osadzać się bardzo szybko (kilka minut) na szkiełku komorowym, a szanse na zobrazowanie powstających synaps będą się zmniejszać z czasem (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Możliwe jest zakończenie eksperymentu po upływie określonego czasu lub przejście do Kroku 7 i ustalenie koniugatów do późniejszej immunofluorescencji i analiz. 
	nuta: Możliwe jest wybranie do 16 różnych pól mikroskopowych z maksymalnie 4 różnych mikrodołków w celu jednoczesnej, wielodołkowej akwizycji poklatkowej z odpowiednią rozdzielczością czasową (1-2 minuty na klatkę). Ograniczenie opiera się zarówno na liczbie, jak i intensywności (wpływającej na ekspozycję kamery) różnych fluorochromów, które mają być obrazowane (w zależności od liczby eksprymowanych białek fluorescencyjnych, z wyjątkiem CMAC). Jednym ze sposobów na zwiększenie liczby klatek na sekundę jest nagrywanie dla kanału CMAC tylko w jednym z każdych "n" ram czasowych dla GFP (tj. n = 8, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2), ponieważ komórki Raji są przylegające do dna studni i nie poruszają się łatwo jak komórki Jurkata. Ponadto korzystnie wpływa to na żywotność komórek, ponieważ częsta ekspozycja na światło UV może je uszkodzić. Spróbuj dostosować liczbę klatek na sekundę do 1 klatki co 1 minutę lub krócej (tj. 20 s na klatkę w Wideo 1, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2), ponieważ polaryzacja MVB trwa od kilku minut do godzin. Do przeprowadzenia tego wielokanałowego przechwytywania niezbędny jest mikroskop wyposażony w zmotoryzowaną wieżyczkę epifluorescencyjną i odpowiednie pasmowo-przepustowe filtry fluorescencyjne lub ich odpowiedniki.</li>
</ol>
7. Punkt końcowy tworzenia koniugatów synaptycznych i fiksacja
<ol>
	<li>Jeśli planowany jest tylko eksperyment z punktem końcowym (1-2 godziny inkubacji, aby umożliwić tworzenie koniugatów synaptycznych jest odpowiednia), inkubować szkiełko w komorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1-2 godziny. Sprawdź tworzenie koniugatu po okresie hodowli (jak w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1), a następnie utrwal koniugaty acetonem lub PFA (utrwalenie będzie zależało od antygenów i przeciwciał, które zostaną użyte w kolejnej immunofluorescencji). W takim przypadku inkubacja nie wymaga inkubatora ze stopniem mikroskopowym. Zapoznaj się z filmem 3, aby zapoznać się z przykładem.</li>
	<li>Aby utrwalić komórki, umyj studzienkę przez delikatne potrząsanie ciepłym podłożem RPMI (37 °C) bez FCS (albumina z surowicy może wytrącać się przy utrwalaniu acetonu). Odessać i dodać 200 μl PFA lub wstępnie schłodzonego acetonu do każdej studzienki. Inkubować szkiełko komorowe odpowiednio w temperaturze pokojowej (RT) lub na lodzie przez 20 min. 
	nuta: W celu utrwalenia acetonu należy wstępnie schłodzić aceton w temperaturze -20 °C i wstępnie schłodzić szkiełko komory w temperaturze 4 °C. Usunąć plastikowe pokrywki, gdy aceton jest używany do utrwalenia komórek hodowanych w 8-dołkowych szkiełkach komorowych ze szklanym dnem.</li>
	<li>Przemyć każdą studzienkę dwukrotnie PBS i dodać 200 μl roztworu hartowniczego (PBS, 50 mM NH4Cl). Inkubować szkiełko komorowe w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Na tym etapie szkiełko komorowe może pozostać przez co najmniej miesiąc w temperaturze 4 °C przed wykonaniem protokołu immunofluorescencji, zgodnie z opisem8. Pokrywka zapobiega parowaniu.</li>
</ol>
8. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Wykonaj dekonwolucję obrazu po akwizycji (tj. dekonwolucję Huygensa lub równoważną, Tabelę materiałów) serii poklatkowych i/lub nieruchomych zdjęć nieruchomych komórek. Dekonwolucja poprzez zastosowanie odpowiedniego oprogramowania (np. za pomocą opcji optycznej "szerokiego pola" w Huygens) i odpowiednich parametrów optycznych. Dekonwolucja wymaga przetwarzania obrazu funkcji mierzonego rozproszenia punktów (PSF) mikroskopu4.</li>
	<li>Alternatywnie, można użyć oprogramowania do obliczenia wyidealizowanego PSF poprzez automatyczne wczytywanie parametrów optycznych zawartych wśród metadanych z plików mikroskopowych. Te parametry optyczne obejmują długość fali fluorochromu, współczynnik załamania światła, aperturę numeryczną obiektywu oraz technikę obrazowania (konfokalne, szerokokątne itp.)4.</li>
	<li>Następnie oprogramowanie do obrazowania wykorzystuje PSF i różne algorytmy dekonwolucji (tj. QMLE i CMLE w oprogramowaniu Huygens) w procesie obliczeniowym krok po kroku, którego wyniki można następnie w sposób ciągły wizualizować i zatrzymywać (lub wznawiać), gdy jest to wymagane przez użytkownika. Na tym etapie użytkownik może zmienić liczbę skrętów i/lub stosunek sygnału do szumu i wznowić dekonwolucję. Oprogramowanie do dekonwolucji działa dobrze z seriami poklatkowymi (X,Y,T) (wideo 2) i stosami Z (X,Y,Z) (wideo 3). Zdekonwolucyjne kanały zostały następnie połączone z CMAC, kanałem surowym, ponieważ cytozolowe, rozproszone fluorochromy nie poprawiają się przez dekonwolucję4,9.</li>
</ol>

<ol><li>Fooksman, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+T+cell+activation+and+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of T cell activation and synapse formation.</a> Annual Review of Immunology. 28, 79-105 (2010).</li>
<li>de la Roche, M., Asano, Y., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+the+cytolytic+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origins of the cytolytic synapse.</a> Nature Reviews. Immunology. 16, 421-432 (2016).</li>
<li>Griffiths, G. M., Tsun, A., Stinchcombe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+focal+point+for+endocytosis+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a focal point for endocytosis and exocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 189, 399-406 (2010).</li>
<li>Calvo, V., Izquierdo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Polarized+Secretory+Traffic+at+the+Immune+Synapse+in+Living+T+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Imaging Polarized Secretory Traffic at the Immune Synapse in Living T Lymphocytes.</a> Frontiers in Immunology. 9, 684(2018).</li>
<li>Friedl, P., den Boer, A. T., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+immune+responses%3A+diversity+and+adaptation+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tuning immune responses: diversity and adaptation of the immunological synapse.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 532-545 (2005).</li>
<li>Xie, J., Tato, C. M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+immune+system+talks+to+itself%3A+the+varied+role+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">How the immune system talks to itself: the varied role of synapses.</a> Immunological Reviews. 251, 65-79 (2013).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+Secretion%2C+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Alonso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diacylglycerol+kinase+alpha+regulates+the+formation+and+polarisation+of+mature+multivesicular+bodies+involved+in+the+secretion+of+Fas+ligand-containing+exosomes+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Diacylglycerol kinase alpha regulates the formation and polarisation of mature multivesicular bodies involved in the secretion of Fas ligand-containing exosomes in T lymphocytes.</a> Cell Death & Differentiation. 18, 1161-1173 (2011).</li>
<li>Mazzeo, C., Calvo, V., Alonso, R., Merida, I., Izquierdo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+D1%2F2+is+involved+in+the+maturation+of+multivesicular+bodies+and+secretion+of+exosomes+in+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Protein kinase D1/2 is involved in the maturation of multivesicular bodies and secretion of exosomes in T and B lymphocytes.</a> Cell Death & Differentiation. 23, 99-109 (2016).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature Communications. 2, 282(2011).</li>
<li>Montoya, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ICAM-3+in+the+initial+interaction+of+T+lymphocytes+and+APCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of ICAM-3 in the initial interaction of T lymphocytes and APCs.</a> Nature Immunology. 3, 159-168 (2002).</li>
<li>Abraham, R. T., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jurkat+T+cells+and+development+of+the+T-cell+receptor+signalling+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm.</a> Nature Reviews. Immunology. 4, 301-308 (2004).</li>
<li>Huse, M., Quann, E. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shouts%2C+whispers+and+the+kiss+of+death%3A+directional+secretion+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Shouts, whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells.</a> Nature Immunology. 9, 1105-1111 (2008).</li>
<li>Peters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+granules+are+secretory+lysosomes%2C+containing+both+perforin+and+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 173, 1099-1109 (1991).</li>
<li>Vignaux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR%2FCD3+coupling+to+Fas-based+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">TCR/CD3 coupling to Fas-based cytotoxicity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 181, 781-786 (1995).</li>
<li>de Saint Basile, G., Menasche, G., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+biogenesis+and+exocytosis+of+cytotoxic+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of biogenesis and exocytosis of cytotoxic granules.</a> Nature Reviews. Immunology. 10, 568-579 (2010).</li>
<li>Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+center+polarity+and+the+immunological+synapse%3A+protein+kinase+C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing center polarity and the immunological synapse: protein kinase C and beyond.</a> Frontiers in Immunology. 3, 235(2012).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> The Journal of Cell Biology. 202, 779-792 (2013).</li>
<li>Jang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Cell-Cell+Communication+in+a+Vertical+Orientation+Reveals+High-Resolution+Structure+of+Immunological+Synapse+and+Novel+PD-1+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Imaging of Cell-Cell Communication in a Vertical Orientation Reveals High-Resolution Structure of Immunological Synapse and Novel PD-1 Dynamics.</a> Journal of Immunology. 195, 1320-1330 (2015).</li>
<li>Kupfer, A., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+cytotoxic+and+helper+T+cell+functions%3A+immunofluorescence+microscopic+studies+of+single+cells+and+cell+couples%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of cytotoxic and helper T cell functions: immunofluorescence microscopic studies of single cells and cell couples.</a> Annual Review of Immunology. 7, 309-337 (1989).</li>
<li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature Reviews. Immunology. 11, 672-684 (2011).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+bilayers+at+the+vanguard+of+immune+cell+activation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies.</a> Journal of Structural Biology. 168, 152-160 (2009).</li>
<li>Jambrina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+influx+through+receptor-operated+channel+induces+mitochondria-triggered+paraptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium influx through receptor-operated channel induces mitochondria-triggered paraptotic cell death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278, 14134-14145 (2003).</li>
<li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7 1(2009).</li>
<li>Herranz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+C+delta+Regulates+the+Depletion+of+Actin+at+the+Immunological+Synapse+Required+for+Polarized+Exosome+Secretion+by+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase C delta Regulates the Depletion of Actin at the Immunological Synapse Required for Polarized Exosome Secretion by T Cells.</a> Frontiers in Immunology. 10, 851(2019).</li>
<li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42, 864-876 (2015).</li>
<li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Microscopy%3A+A+Concise+Guide+to+Current+Imaging+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Microscopy: A Concise Guide to Current Imaging Methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79, (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Ograniczeniem tego protokołu jest to, że nie wszystkie synapsy będą idealnie zorientowane prostopadle do osi optycznej. Korzystając z tej techniki, nie ma sposobu, aby przewidzieć i/lub wpłynąć na idealną orientację obrazowania synaps immunologicznych. Aby rozwiązać ten problem, wykluczamy z kolejnych analiz wszystkie losowo schwytane synapsy, które ostatecznie nie spełniają idealnych kryteriów. Synapsy te, w odpowiednim momencie, nie są zbyt częste. Możliwe jest jednak obejście tego ograniczenia za pomocą kilku podejść eksperymentalnych4.
Spolaryzowane uwalnianie (degranulacja) CD63 można określić ilościowo za pomocą innych technik uzupełniających, takich jak barwienie powierzchni komórki CD63 (relokalizacja CD63 na powierzchnię komórki) w żywych komórkach (nie utrwalonych i nieprzepuszczalnych), po kroku 6, a następnie mycie i utrwalanie, jak pokazano wcześniej8. Ponadto można przeprowadzić uwalnianie CD63 na egzosomach 8,9 i kwantyfikację egzosomów za pomocą analiz śledzenia nanocząstek 9,25. Podejścia te są z pewnością zgodne z naszym protokołem, pod warunkiem, że fiksacja jest wykonywana po immunofluorescencji powierzchni żywych komórek.
Odkryliśmy, że idealna liczba komórek (dla studzienki o średnicy 1cm2 w szkiełku z 8 dołkami) to 4 x 105 komórek (2 x 105 komórek Raji i 2 x 105 komórek Jurkata), ponieważ skutecznie przylegają one do dna studzienki. Skuteczność wiązania z mikroszkiełkami z tworzywa sztucznego (przy użyciu fibronektyny) lub szklanym dnem (przy użyciu poli-L-lizyny) zwykle nie stanowi problemu. Wyższa liczba komórek może nie powodować przerw między przylegającymi komórkami, a następnie złożonymi koniugatami synaptycznymi (ryc. 1); Obie sytuacje nie są pożądane, gdy pojedyncze koniugaty komórka-komórka muszą być obrazowane, na przykład w eksperymentach z polaryzacją MTOC lub granulek wydzielniczych. Mniejsza liczba komórek może zmniejszyć szanse na znalezienie koniugatów, zwłaszcza gdy transfekowane komórki Jurkata są prowokowane APC w celu wytworzenia synaps. Należy pamiętać, że zaobserwowaliśmy, że stabilizowany temperaturowo inkubator ze stopniem X/Y umieszczony na stoliku mikroskopu X/Y przed rozpoczęciem protokołu (tj. 1-2 godziny wcześniej w celu ustabilizowania stolika/mikroskopu) utrzymuje stabilne parametry X,Y,Z, co ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego obrazowania. System automatycznego ustawiania ostrości ostatecznie skompensuje niewielkie zmiany Z.
Gdy niektóre techniki transdukcji genów, takie jak elektroporacja, są stosowane do ekspresji fluorescencyjnych białek chimerycznych (tj. GFP-CD63) w klonach Jurkat (Wideo 1), znaczna część komórek może umrzeć po elektroporacji. Może to stanowić problem, ponieważ chociaż martwe komórki nie tworzą synaps, gdy są w nadmiarze nad żywymi, transfekowanymi komórkami, mogą zakłócać tworzenie koniugatów tworzonych przez żywe komórki Th. Odkryliśmy, że staranna eliminacja martwych komórek z transfekowanych kultur za pomocą pożywki o gradionym gradiencie gęstości zgodnie ze standardowymi protokołami przed etapem tworzenia koniugatu może rzeczywiście zwiększyć szanse na prawidłowe zobrazowanie koniugatów. Ponadto niska skuteczność transfekcji (<20%) może być ważnym zastrzeżeniem, ponieważ to, w połączeniu z umiarkowaną wydajnością tworzenia koniugatów (około 60%)25, zmniejszy prawdopodobieństwo znalezienia koniugatów wykonanych przez transfekowane komórki. Nie stanowi to problemu, gdy nietransfekowane komórki są używane do otrzymywania koniugatów w eksperymentach z punktami końcowymi i późniejszej fiksacji. 8 szkiełek z komorą mikrodołkową jest kompatybilnych z konwencjonalnymi protokołami immunofluorescencji. Zwiększa to elastyczność powyższego protokołu o różnych celach. Mocowanie acetonem może stanowić problem do rozważenia w przypadku korzystania ze zjeżdżalni komorowych ze studzienkami z plastikowym dnem. Istnieją jednak dostępne na rynku 8 szkiełek mikroskopowych z 8 mikrodołkami, zawierające szklane dno, które są kompatybilne z utrwalaniem acetonu. Zdejmij plastikowe pokrywki, gdy aceton jest używany do utrwalenia komórek hodowanych w 8 szkiełkach mikroskopowych ze szklanym dnem.
Zaleca się, aby mikroskop był wyposażony w zmotoryzowany stolik XY, zmotoryzowaną wieżyczkę epifluorescencyjną i system automatycznego ustawiania ostrości (np. Perfect Focus System) lub równoważne dodatki. Gdy wymagana jest akwizycja wielodołkowa25, system automatycznego ustawiania ostrości zapewni stabilną ostrość przez cały czas trwania eksperymentu. Wcześniejsze doświadczenia wskazują, że poprzez ustanowienie odpowiedniego przesunięcia ostrości na komórkach Raji, zarówno ruch limfocytów T (Wideo 1), jak i ruchy stolika/szkiełka mikroskopu w eksperymentach wielopunktowych XY, mogą być kompensowane. Jest to rzeczywiście wygodne do robienia zdjęć poklatkowych z wieloma dołkami.
Użyto czarno-białej, panchromatycznej i chłodzonej kamery z ładowanym urządzeniem sprzężonym (CDD), ale pożądana jest kamera o wyższej czułości, fluorescencyjna naukowa z komplementarnym półprzewodnikiem metalowo-tlenkowym (sCMOS), ponieważ skróci to czas naświetlania kamery i poprawi rozdzielczość czasową. Zastosowane przez nas krótkie czasy naświetlania aparatu (od 100 ms do 500 ms) w połączeniu z automatyczną migawką fluorescencyjną pozwalają na długotrwałe uchwycenie poklatkowe (do 24 h) z odpowiednią rozdzielczością czasową (1 klatka na minutę lub mniej, dla maksymalnie 16 pozycji XY) bez znacznego blaknięcia fluorescencji i/lub utraty żywotności komórek. Zmotoryzowany stolik umożliwia przechwytywanie wielopunktowe (XY) i zwiększa szansę na znalezienie i zobrazowanie pojawiających się i rozwijających się synaps w idealnej orientacji, ale także umożliwia akwizycję obrazu w szkiełkach wielodołkowych, gdy różne klony Jurkata muszą być jednocześnie sprzężone25. Duża apertura numeryczna obiektywu (tj. 60x, 1,4) jest niezbędna do uzyskania najlepszych wyników przy analizie ruchu granulek wydzielniczych.
RAJI-SEE-Jurkat stanowi dobrze ugruntowany model synapsy immunologicznej, który był używany przez niezliczoną liczbę badaczy od czasu jego pierwotnegoopisu11. Dostosowaliśmy nasz protokół do tego modelu, aby prawidłowo zobrazować wczesne etapy powstawania IS. Naszym celem było udoskonalenie wczesnych podejśćstosowanych wcześniej do badania polaryzacji MTOC i mechanizmów wydzielniczych w stosunku do IS. Godne uwagi jest to, że koniugaty wykonane za pomocą tego protokołu powodują reorganizację F-aktyny w synapsie, konfigurując kanoniczny SMAC, jednocześnie z ruchem spolaryzowanym MVB25. Te kluczowe zdarzenia zostały również przeanalizowane i potwierdzone za pomocą mikroskopii konfokalnej25.
Różnice kinetyczne w ruchu spolaryzowanym istnieją między różnymi typami IS. Na przykład spolaryzowany transport granulek litycznych z CTL odbywa się w ciągu kilku sekund lub bardzo kilku minut, podczas gdy kilka pęcherzyków zawierających cytokiny z limfocytów Th trwa od kilku minut do kilku godzin. Te różnice czasowe muszą być wzięte pod uwagę z wyprzedzeniem, aby opracować najlepszą strategię i wybrać najodpowiedniejsze podejście eksperymentalne i obrazowe, ponieważ w przypadku niektórych strategii obrazowania (np. laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej (LSCM)) czas może być czynnikiem ograniczającym, ponieważ czas przechwytywania jest znacznie dłuższy niż odpowiednia rozdzielczość czasu (1 minuta lub mniej)4. Nie stanowi to ograniczenia, gdy używana jest mikroskopia fluorescencyjna o szerokim polu widzenia (WFFM), jak opisano w powyższym protokole. Ponieważ w CTL polaryzacja MTOC w kierunku synapsy trwa tylko kilka minut 3,6,17, w celu prawidłowego zobrazowania tych synaps konieczne są różne specyficzne, najnowocześniejsze podejścia mikroskopowe, różniące się od opisanego tutaj (ale o wyższej rozdzielczości przestrzennej i czasowej)26,27, głównie podczas obrazowania kilku pól mikroskopowych (przechwytywanie wielopunktowe). Te nowe podejścia o wysokiej rozdzielczości mogą być również wykorzystane do obrazowania synaps wytwarzanych przez limfocyty Th, chociaż względy ekonomiczne i/lub logistyczne (tj. podstawowy sprzęt wymagany do niektórych z tych technik obrazowania kosztuje 6-7 razy więcej niż ten opisany tutaj) z pewnością mogą stanowić ograniczenie dla tych najnowocześniejszych metod obrazowania4. Fakt, że IS wytwarzane przez limfocyty Th są długowieczne, oraz okoliczność, że w limfocytach Th MTOC, pęcherzyki wydzielnicze zawierające limfokiny i MVB potrzebują od kilku minut do godzin na transport i dokowanie do IS22, sprawia, że protokół ten jest idealnym, niedrogim podejściem do obrazowania Th-APC IS.
WFFM w połączeniu z dekonwolucją obrazu po akwizycji stanowi ciekawe podejście i nie tylko względy ekonomiczne przemawiają za tą strategią. Wewnętrzna słaba rozdzielczość w osi Z (najważniejsze zastrzeżenie techniki) może być poprawiona za pomocą dekonwolucji obrazu po akwizycji4 (porównaj Wideo 1 z Wideo 2). Dekonwolucja wykorzystuje oparte na obliczeniach podejście do przetwarzania obrazu, które może poprawić stosunek sygnału do szumu oraz rozdzielczość i kontrast obrazu od27 do 2 razy, do 150-100 nm w osi XY i 500 nm w osi Z4.
Zastosowanie wyższej czułości, dużej prędkości odczytu i szerokiego zakresu dynamiki, nowych fluorescencyjnych kamer sCMOS poprawi jakość obrazów i zmniejszy blaknięcie fluorescencji. Elastyczność oferowana przez opisany tutaj protokół koniugacji komórka-komórka pozwala na połączenie opisanego podejścia komórkowego z kilkoma najnowocześniejszymi technikami mikroskopowymi, zarówno w komórkach żywych, jak i w komórkach utrwalonych, a oczekiwany wynik rzeczywiście poszerzy naszą wiedzę na temat synapsy immunologicznej.
Chociaż wdrożyliśmy i zwalidowaliśmy protokół, wykorzystując łatwe w obsłudze, dobrze znane linie komórkowe, potencjał tego podejścia może pozwolić na wizualizację bardziej fizjologicznych interakcji, gdy używane są pierwotne limfocyty T i różne typy komórek prezentujących antygen (takie jak komórki dendrytyczne makrofagów)5. W tym kontekście protokół ten został również rozszerzony i zwalidowany przy użyciu pulsacyjnej linii komórkowej EL-4 myszy z superantygenem (SEB), używanej jako APC, do prowokacji pierwotnych mysich limfoblastów T9. Rzeczywiście, pierwotne limfocyty T, w szczególności CTL, powodowały bardziej krótkotrwałe i dynamiczne kontakty synaptyczne (patrz Dodatkowe wideo 8 w odnośniku9) do tych obserwowanych za pomocą modelu SEE-Raji i Jurkat. Zmienność trybów kontaktu synaptycznego można najlepiej zaobserwować w przypadku pierwotnych interakcji limfocytów T z komórkami dendrytycznymi lub komórkami B w dwuwymiarowych odpowiednikach tkankowych in vitro, które można również rejestrować i analizować przy użyciu tego protokołu. Ponadto, oprócz superantygenów, technika ta może być stosowana do obrazowania innych typów synaps. Na przykład można go zastosować w transgenicznym, specyficznym dla antygenu modelu limfocytów T TCR, na przykład przy użyciu mysiego systemu OT1/OT2 specyficznego dla albuminy jaja kurzego lub poprzez transfekcję limfocytów T z receptorami limfocytów T specyficznymi dla antygenu. Otwiera to niezliczone możliwości eksperymentalne na najbliższą przyszłość.

Głównym celem metody jest generowanie konsygnatów synaps immunologicznych (IS) komórka-komórka utworzona przez komórkę prezentującą antygen (APC) pulsowaną superantygenami SEE i efektorową komórką Th, oraz rejestrowanie obrazów odpowiadających pierwszym etapom tworzenia synaps immunologicznych i późniejszym zdarzeniom transportu (występującym zarówno w APC, jak i w limfocytacji Th), to ostatecznie doprowadzi do spolaryzowanego wydzielania w IS. Ustanowienie IS przez limfocyty T po związaniu ich receptora komórkowego (TCR) z antygenami związanymi z MHC-II na APC organizuje niezwykle dynamiczną, plastyczną i krytyczną instancję zaangażowaną w specyficzne dla antygenu, humoralne i komórkowe odpowiedzi immunologiczne1,2. IS jest definiowany przez tworzenie specjalnego wzorca supramolekularnego kompleksu aktywacyjnego (SMAC) charakteryzującego się procesem reorganizacji aktyny3. Po budowie IS przez limfocyty T z APC, polaryzacja pęcherzyków wydzielniczych w kierunku IS wydaje się być związana ze spolaryzowanym wydzielaniem w przerwie synaptycznej. Wydaje się, że ta skoncentrowana maszyneria jednoznacznie dostarcza układowi odpornościowemu doskonale regulowanego fortelu w celu zwiększenia skuteczności krytycznych funkcji efektorowych wydzielniczych limfocytów T, jednocześnie zmniejszając niespecyficzną, cytokinową stymulację komórek postronnych, zabijanie nieistotnych komórek docelowych i apoptotyczne samobójstwo poprzez śmierć komórki indukowaną aktywacją (AICD)4.
Konsekwencje IS różnią się w zależności od natury zarówno limfocytów T, jak i APC. Kontakt synaptyczny limfocytów Th (zwykle komórek CD4 +) z APC wykazującym antygen związany z MHC-II powoduje aktywację limfocytów T (wydzielanie cytokin, proliferację itp.), a w niektórych przypadkach apoptozę za pośrednictwem AICD4. W przypadku cytotoksycznych limfocytów T (CTL) (głównie komórek CD8 +) oddziałujących z APC prezentujących antygen związany z MHC-I, wynik różni się w zależności od wstępnej stymulacji CTL antygenem lub nie. W ten sposób naiwne CTL identyfikujące kompleksy antygenu-MHC-I na APC są "przygotowane" do niszczenia komórek docelowych i podziału. Zagruntowane CTL tworzą również synapsy z komórkami docelowymi (tj. komórkami zakażonymi wirusami lub komórkami nowotworowymi) powodującymi eksterminację komórek specyficznych dla antygenu5,6.
Spolaryzowane wydzielanie egzosomów w synapsie immunologicznej to rozwijający się i wymagający obszar badań związanych z istotnymi odpowiedziami immunologicznymi7. Wykazano, że ciała wielopęcherzykowe (MVB) przenoszące pęcherzyki śródświetlne (ILV) doświadczają spolaryzowanego transportu w kierunku IS8,9 (Wideo 1) po stymulacji TCR antygenem. Fuzja tych MVB w błonie synaptycznej indukuje ich degranulację i uwalnianie ILV jako egzosomów do szczeliny synaptycznej8,10. Dzieje się tak w IS utworzonym przez komórki Jurkata typu Th, które zostały poproszone o działanie komórek Raji pokrytych superantygenem SEE, działających jako APC11, stymulowane przez TCR limfoblasty CD4 + i zaszczepione CTL. Tak więc synapsy wytwarzane przez komórki Jurkata stanowią cenny model do badania spolaryzowanego ruchu wydzielniczego egzosomów. Ponadto kilka dekad badań wykazało, że wiele fundamentalnych spostrzeżeń na temat sygnalizacji TCR pochodzi z badań z transformowanymi liniami komórek T, a najbardziej znanym z tych systemów modelowych jest białaczkowa linijka limfocytów T Jurkat 12.
Powstanie w pełni rozwiniętego IS daje kilka kluczowych wyników biologicznych, w tym aktywację limfocytów Th, aktywację naiwnych CTL lub zabijanie komórek docelowych przez zapoczątkowane CTL, oprócz anergii lub AICD5. W związku z tym istnieją dwa główne typy wydzielniczych IS tworzonych przez limfocyty T, które skutkują bardzo różnorodnymi, ale podobnie krytycznymi funkcjami efektorów immunologicznych1,6,13. Z jednej strony, IS z zaszczepionych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) indukuje szybką polaryzację (od sekund do kilku minut) granulek litycznych (zwanych "lizosomami wydzielniczymi") w kierunku IS. Degranulacja granulek litycznych indukuje wydzielanie perforyny i granzymów do szczeliny synaptycznej 14, które są cząsteczkami proapoptotycznymi. Wydzielana perforyna i granzymy następnie indukują zabijanie komórek docelowych15,16. CTL tworzą tymczasowe synapsy, trwające tylko kilka minut, gdy komórki docelowe są mordowane3,17. Wynika to prawdopodobnie z faktu, że optymalne zadanie CTL wymaga szybkiego i tymczasowego kontaktu w celu rozprowadzenia jak największej liczby śmiertelnych uderzeń do wielu komórek docelowych3,17. W przeciwieństwie do tego, limfocyty Th, takie jak komórki Jurkat, generują stabilne, długotrwałe IS (od 10-30 minut do godzin), ponieważ wydaje się to być konieczne zarówno do kierunkowego, jak i ciągłego wydzielania cytokin stymulujących3,17. Cytokiny są również zamknięte w pęcherzykach wydzielniczych, a niektóre z nich (np. IL-2, IFN-γ) doświadczają spolaryzowanego transportu do IS17 i wydzielania. Jedną z podstawowych cech IS jest tworzenie się eksploracyjnych, słabych i przejściowych kontaktów między limfocytem T a APC (Wideo 1), które mogą powodować silniejsze oddziaływanie i ustanowienie dojrzałego IS, pod warunkiem, że TCR identyfikuje pokrewne kompleksy antygen-MHC i że zostaną ustanowione odpowiednie połączenia kostymulacyjne5. Zarówno początek pierwszych kontaktów, jak i założenie dojrzałego, całkowicie produktywnego IS są z natury procesami stochastycznymi, szybkimi i asynchronicznymi5,18. Co więcej, rzadko zdarza się tworzenie koniugatów komórka-komórka19, co może stanowić wyzwanie dla technik obrazowania (patrz sekcje Wyniki i Dyskusja).
Innym głównym wyzwaniem w badaniu polaryzacji centrum organizującego mikrotubule (MTOC) i granulek wydzielniczych w limfocytach T jest to, że cały proces jest szybki (od sekund do kilku minut), szczególnie w CTL. Biorąc pod uwagę te fakty, większość wczesnych podejść konfrontowała strategię punktu końcowego, w której APC/komórki docelowe i limfocyty T są mieszane razem i zbiegane przez wirowanie o niskiej prędkości, faworyzować tworzenie koniugatu komórka-komórka, inkubowane przez kilka minut, utrwalane, a następnie oceniane pod kątem relokacji MTOC i/lub pęcherzyków wydzielniczych w kierunku IS20. Podejście to ma dwa istotne ograniczenia: nie uzyskano żadnych danych dotyczących żywego transportu i uzyskano wysoki poziom polaryzacji MTOC/granulek wydzielniczych tła, prawdopodobnie ze względu na stochastyczny charakter IS establishment18. Co więcej, jakakolwiek korelacja między stymulowanymi przez TCR, początkowymi zdarzeniami sygnalizacyjnymi (tj. Wewnątrzkomórkowy wzrost wapnia, reorganizacja aktyny) a polaryzacją pęcherzyków wydzielniczych jest problematyczna do zbadania. W związku z tym niezbędne przepisy dotyczące odpowiedniego obrazowania IS w żywych komórkach łączą się w celu zwiększenia materializacji koniugatu komórka-komórka, synchronizacji wytwarzania IS i, jeśli to możliwe, zagwarantowania ustanowienia koniugatów komórkowych w określonych polach mikroskopowych XY i pozycjach Z. Opracowano kilka strategii, aby uniknąć wszystkich tych problemów. Wyjaśnienie tych metod, ich zalet i słabości wykracza poza zakres tego artykułu. Zapoznaj się z wcześniej opublikowanymi recenzjami poruszającymi te ważne kwestie1,4,5,21.
Fakt, że limfocyty IS są długowieczne, oraz fakt, że w limfocytach Th MTOC, granulki wydzielnicze zawierające limfokiny i MVB potrzebują od kilku minut do godzin, aby przenieść się i zadokować do klasy IS<sup="xref">22 sprawia, że Th-APC JEST idealnym kandydatem do obrazowania przy użyciu opisanego tutaj protokołu.

<table><tbody><tr><td>Aparat Nikon DS-QI1MC</td><td>Nikon</td><td>MQA11550</td><td>Chłodzona głowica kamery</td></tr><tr><td>CMAC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C2110</td><td>Cell tracker niebieski</td></tr><tr><td>Komórki JURKAT</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-152</td><td>Efektor limfocytów T</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 well ibiTreat, &mu;-Slide 8 well Glass-Bottom</td><td>IBIDI</td><td>Cat.No: 80826, 80827</td><td>Hodowla komórkowa i wspomaganie obrazowania komórkowego</td></tr><tr><td>Mikroskop NIKON Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td>NIKON Eclipse Ti-E</td><td>Fluorescencyjny mikroskop szerokokątny, w pełni zmotoryzowany, wyposażony w opcję Perfect Focus System (PFS)</td></tr><tr><td>Inkubator mikroskopowy z 3-kanałowym ręcznym mieszalnikiem gazów i modułem bełkotki/wilgotności OKOLAB</td><td></td><td>H201-NIKON-TI-S-ER</td><td>Atmosfera hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Raji Cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-86</td><td>APC</td></tr><tr><td>RPMI medium GIBCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21875034</td><td>Pożywka</td></tr> hodowlana <tr><td>Streptococcus Enterotoxin E (SEE)</td><td>Toxin Technology, Inc</td><td>EP404</td><td>Oprogramowanie do toksyn bakteryjnych</td></tr><tr><td>Huygens Essential</td><td>SVI</td><td>Oprogramowanie Huygens Essential</td><td>Image Deconvolution</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>NIH</td><td>Image J</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>Nikon NIS-AR</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements AR</td><td>Oprogramowanie do przechwytywania i analizy obrazów</td></tr></tbody></table>

obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Imaging the Human Immunological Synapse

Celem metody jest wygenerowanie synapsy immunologicznej (IS), przykładu koniugacji między komórkami utworzonymi przez komórkę prezentującą antygen (APC) i komórkę limfocytów T (Th) wspomagającą efektor, oraz zarejestrowanie obrazów odpowiadających pierwszym etapom powstawania IS i późniejszym zdarzeniom transportowym (występującym zarówno w APC, jak i w komórce Th). Wydarzenia te ostatecznie doprowadzą do spolaryzowanego wydzielania w IS. W tym protokole wykorzystano komórki Jurkat poddane impulsom enterotoksyny E Staphylococcus (SEE) komórkom Raji jako modelowi synapsy komórkowej, ze względu na bliskość tego systemu eksperymentalnego do rzeczywistości biologicznej (koniugaty synaptyczne komórki Th-APC). Przedstawione tutaj podejście obejmuje koniugację między komórkami, akwizycję poklatkową, mikroskopię fluorescencyjną o szerokim polu widzenia (WFFM), a następnie przetwarzanie obrazu (dekonwolucja po akwizycji). Poprawia to stosunek sygnału do szumu (SNR) obrazów, zwiększa rozdzielczość czasową, umożliwia zsynchronizowane pozyskiwanie kilku fluorochromów w powstających koniugatach synaptycznych i zmniejsza bielenie fluorescencji. Ponadto protokół jest dobrze dopasowany do protokołów utrwalania komórek w punkcie końcowym (paraformaldehyd, aceton lub metanol), co pozwoliłoby na dalsze barwienie i analizy immunofluorescencyjne. Protokół ten jest również kompatybilny z laserową skaningową mikroskopią konfokalną (LSCM) i innymi najnowocześniejszymi technikami mikroskopii. Głównym zastrzeżeniem jest to, że tylko te granice limfocytów T, APC (zwane interfejsami IS), które znajdowały się pod kątem 90° do płaszczyzny ostrości wzdłuż osi Z, mogły być prawidłowo zobrazowane i przeanalizowane. Istnieją inne modele eksperymentalne, które upraszczają obrazowanie w wymiarze Z i następujące po nim analizy obrazu, ale te podejścia nie emulują złożonej, nieregularnej powierzchni APC i mogą sprzyjać niefizjologicznym interakcjom w IS. W związku z tym zastosowane tu podejście eksperymentalne jest odpowiednie do reprodukcji i konfrontacji z pewnymi złożonościami biologicznymi zachodzącymi w IS.

Postępowaliśmy zgodnie z opisanym protokołem, aby wygenerować koniugaty synaps immunologicznych Jurkat-Raji oraz prawidłowo obrazować wczesne etapy formowania się IS. Naszym celem było usprawnienie wczesnych metod20, stosowanych wcześniej do badania polaryzacji MTOC i aparatu wydzielniczego w kierunku IS. Metody te opierały się na strategii punktu końcowego, która nie pozwalała na obrazowanie formowania się IS ani wczesnych zdarzeń synaptycznych, ponieważ w tych strategiach formowanie się IS następowało obowiązkowo w osadzie zmieszanych, odwirowanych komórek, a nie pod mikroskopem. Nasz protokół został zaprojektowany tak, aby uniknąć tego głównego ograniczenia, ponieważ podejście to opierało się na zastosowaniu odpowiedniego stężenia komórek (Kroki 2 i 3), aby sprzyjać tworzeniu się koniugatów IS między komórkami bezpośrednio na szkiełkach przedmiotowych z komorami (szkiełko z 8 mikrokomorami), umieszczonych w podgrzewanym inkubatorze stolika mikroskopowego (w Kroku 4). Strategia ta indukuje formowanie się IS równocześnie z rejestracją obrazów w trybie time-lapse (Video 1).
Rysunek 1 przedstawia synaptyczne koniugaty Jurkat-Raji, które uzyskano zgodnie z protokołem (krok 5.2). Obraz przedstawia pierwszą klatkę z reprezentatywnego eksperymentu time-lapse. Do dołka o powierzchni 1 cm2 dodano 2 x 105 komórek Raji oraz 2 x 105 komórek Jurkat. Górny panel pokazuje kanał transmitancji, środkowy panel składa się z kanału CMAC (niebieski) (komórki Raji), a dolny panel przedstawia oba połączone kanały: transmitancji oraz CMAC. Żółte strzałki wskazują niektóre koniugaty synaptyczne dla odniesienia, natomiast zielone strzałki wskazują koniugaty synaptyczne utworzone przez jedną komórkę Jurkat i kilka komórek Raji (koniugaty złożone). Zmniejszenie stężenia komórek (105 lub mniej komórek w dołku 1 cm2) zapobiegnie tworzeniu się złożonych koniugatów komórkowych, ale może zabraknąć koniugatów komórkowych do późniejszej analizy polaryzacji transportu (patrz poniżej), co z kolei zmniejszy szanse na znalezienie i obrazowanie powstających koniugatów synaptycznych.
Rysunek 2 przedstawia zrzuty ekranu odpowiadające parametrom obrazowania zastosowanym do jednoczesnej rejestracji dwóch różnych fluorochromów (CMAC i GFP-CD63) przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (np. NIKON NIS_AR) w reprezentatywnym eksperymencie time-lapse odpowiadającym Wideo 1.
Wideo 1 (Synapsy immunologiczne, dane surowe) przedstawia limfocyt T Jurkat wykazujący ekspresję GFP-CD63 (marker ciałek wielopęcherzykowych-MVB, zielone pęcherzyki) oraz tworzenie się podwójnej synapsy pomiędzy jedną komórką Jurkat a dwiema komórkami Raji znakowanymi CMAC w kolorze niebieskim (jedna z nich ulega pochłanianiu). Zarejestrowano jednoczesny ruch MVB wewnątrz komórki Jurkat w kierunku obszarów synaptycznych (częstotliwość przechwytywania klatek = 1 klatka co 20 sekund dla GFP-CD63; prędkość odtwarzania wideo = 2 klatki na s). Konjugaty synaptyczne pozyskano i zobrazowano zgodnie z opisanym powyżej protokołem (Krok 6.2), co umożliwiło obrazowanie powstających synaps (Wideo 1). Jednoczesne przechwytywanie kanałów fluorescencji GFP-CD63 i CMAC przeprowadzono przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (tj. NIS-AR, Tabela materiałów). Wideo przedstawia surowe dane z reprezentatywnego eksperymentu time-lapse. System automatycznego ustawiania ostrości zdefiniowano z odpowiednim przesunięciem względem komórek Raji związanych z szklanym dnem, aby zapewnić stabilną ostrość w trakcie całego eksperymentu.
Wideo 2 (synapsy immunologiczne, po dekonwolucji) odpowiada Wideo 1, jednak dekonwolucja obrazów kanału fluorescencji GFP-CD63 została przeprowadzona przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do dekonwolucji (np. Huygens), z wykorzystaniem opcji optycznej „wide field” oraz właściwych parametrów optycznych (krok 8). Ten zdekonwolwowany kanał został następnie połączony z surowym kanałem CMAC. Wyraźna jest poprawa zarówno stosunku sygnału do szumu, jak i ostrości obrazu. Dekonwolucję wykonano po akwizycji, zgodnie z powyższym opisem. Szczegółowe informacje dotyczące oprogramowania do dekonwolucji znajdują się w punkcie4.
Wideo 3 (synapsa immunologiczna po utrwaleniu i barwieniu immunofluorescencyjnym) przedstawia stos obrazów Z-stack (wielkość kroku z = 0.8 µm, 5 klatek) utrwalonego koniugatu IS po kroku 6 protokołu (utrwalenie acetonem). Po utrwaleniu przeprowadzono immunofluorescencję zgodnie ze standardowymi protokołami25, wykorzystując falloidynę do wizualizacji F-aktyny (zielony), przeciwciało anty-CD63 do wizualizacji MVB (magenta) oraz przeciwciało anty-γ-tubulinę do wizualizacji MTOC (czerwony). CMAC (niebieski) znakuje komórkę Raji. Następnie koniugat obrazowano za pomocą epifluorescencji, a kilka kanałów poddano dekonwolucji przy użyciu opcji optycznej „wide field” i odpowiednich parametrów optycznych (krok 7). Dekonwolucyjnie przetworzone kanały zostały następnie połączone z surowym kanałem CMAC, jak wskazano na poszczególnych panelach (odpowiednio: CMAC plus Transmitancja-TRANS, CMAC plus falloidyna, CMAC plus anty-CD63 oraz CMAC plus anty-γ-tubulina). Biała strzałka wskazuje synapsę, zielona strzałka wskazuje MVB, a żółta strzałka wskazuje MTOC. Szczegółowa kwantyfikacja polaryzacji MVB i MTOC została opisana w innym opracowaniu25.
Przedstawione tutaj podejście obejmuje tworzenie koniugatów międzykomórkowych oraz jednoczesną akwizycję obrazów w czasie rzeczywistym przy użyciu szerokopowierzchniowej mikroskopii fluorescencyjnej (WFFM), a następnie przetwarzanie obrazu (dekonwolucja po akwizycji). Strategia ta poprawiła stosunek sygnału do szumu (SNR) obrazów, zwiększyła ich rozdzielczość czasową i umożliwiła zsynchronizowaną akwizycję kilku fluorochromów w powstających koniugatach synaptycznych4. Ponadto protokół jest dobrze dostosowany do późniejszych metod utrwalania komórek w punkcie końcowym (paraformaldehyd, aceton lub metanol), co pozwala na dalsze barwienie immunofluorescencyjne i analizy25 (Wideo 3). Protokół ten jest również kompatybilny z konfokalną mikroskopią skaningową oraz innymi nowoczesnymi technikami mikroskopowymi.
<img alt="Obrazowanie komórkowe, mikroskopia fluorescencyjna TRANS i CMAC, analiza obrazów złożonych, wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60312/60312fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywne podwójne pole widzenia mikroskopowego dla koniugatów synaptycznych. Obraz przedstawia pierwszą klatkę z reprezentatywnego eksperymentu time-lapse wykonanego zgodnie z protokołem. Górny panel pokazuje kanał transmitancji, środkowy panel kanał CMAC (komórki Raji), a dolny panel oba połączone kanały. Żółte strzałki służą jako referencja i wskazują niektóre koniugaty synaptyczne. Zielone strzałki wskazują złożone koniugaty synaptyczne (tzn. jedną komórkę Jurkat tworzącą synapsy z więcej niż jedną komórką Raji). Obraz wykonano za pomocą obiektywu 40x EWD (0,6 NA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/60312fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ustawienia mikroskopii poklatkowej z filtrami CMAC i GFP-CD63; obrazowanie fluorescencyjne; regulacje kamery." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60312/60312fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ustawienia mikroskopu do obrazowania poklatkowego. Obraz składa się z kilku zrzutów ekranu przedstawiających parametry obrazowania zastosowane do jednoczesnej rejestracji dwóch różnych fluorochromów (CMAC i GFP-CD63) przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (tj. NIKON NIS_AR) w reprezentatywnym eksperymencie poklatkowym odpowiadającym Wideo 1. Każda klatka dla kanału GFP-CD63 była rejestrowana co 20 s. Aby zachować żywotność komórek w trakcie eksperymentu, rejestrowano tylko jedną klatkę dla kanału UV na osiem klatek dla kanału GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/60312fig2alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej; dynamika błony komórkowej; fluorescencja w 2,0 min; badanie mikroskopowe." src="/files/ftp_upload/60312/60312vid1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Wideo 1"> 
Wideo 1: Synapsy immunologiczne utworzone przez komórkę Jurkat wykazującą ekspresję GFP-CD63, dane surowe. Komórki B Raji oznakowane barwnikiem cell tracker blue (CMAC, niebieski) poddano pulsacji SEE przez 30 min, a następnie utworzono synapsy z komórkami Jurkat wykazującymi ekspresję GFP-CD638. Rejestrowano sekwencje czasowe (time-lapse) dla kanałów GFP-CD63 oraz CMAC (20 s na klatkę; prędkość odtwarzania wideo = 2 klatki na s), z czego przedstawiono reprezentatywny przykład. Obraz zarejestrowano przy użyciu obiektywu 60x PLAN APO (1,4 NA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/Video_1.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, żywa komórka, 7 min, zielona fluorescencja, struktury subkomórkowe." src="/files/ftp_upload/60312/60312vid2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Wideo 2"> 
Wideo 2: Synapsy immunologiczne utworzone przez komórkę Jurkat wykazującą ekspresję GFP-CD63, po dekonwolucji. Tak jak w Wideo 1, lecz obrazy zostały poddane dekonwolucji przy użyciu oprogramowania do dekonwolucji. Widoczne jest poprawienie stosunku sygnału do szumu oraz zwiększona ostrość wynikająca z eliminacji zakłócającej fluorescencji poza ogniskiem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/Video_2.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Obrazowanie komórek z markerami CMAC, PHAL, CD63, gamma-tubuliny; wyniki mikroskopii fluorescencyjnej." src="/files/ftp_upload/60312/60312vid3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Wideo 3"> 
Wideo 3: Utrwalona i poddana immunobarwieniu synapsa immunologiczna. Obraz przedstawia reprezentatywny, utrwalony koniugat synaptyczny po Kroku 7 protokołu i późniejszej immunofluorescencji. CMAC (niebieski) znakuje komórki Raji, transmitancja (TRANS) pokazuje koniugat synaptyczny (biała strzałka), faloidyna znakuje F-aktynę (zielony), przeciwciało anty-CD63 znakuje MVB (magenta, zielona strzałka), a przeciwciało anty-γ-tubulina znakuje MTOC (czerwony, żółta strzałka). Kanały te zostały obrazowane za pomocą epifluorescencji, poddane dekonwolucji i nałożone na siebie zgodnie z oznaczeniami. Wideo zawiera stos Z-stack (rozmiar kroku z = 0,8 μm, 5 klatek). Biała strzałka wskazuje obszar kontaktu synaptycznego, zielona strzałka wskazuje MVB, a żółta strzałka wskazuje MTOC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60312/Video_3.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Celem metody jest wytworzenie synapsy immunologicznej, która jest przykładem koniugacji międzykomórkowej utworzonej przez komórkę prezentującą antygen i limfocyt T-pomocniczy. Naszym celem jest zarejestrowanie pierwszych etapów powstawania synaps immunologicznych oraz zarejestrowanie zdarzeń transportowych zachodzących w limfocycie T-pomocniczym. To ostatecznie doprowadzi do spolaryzowanego wydzielania w synapsie immunologicznej.Przedstawione tutaj podejście obejmuje koniugację między komórkami, akwizycję poklatkową, mikroskopię fluorescencyjną o szerokim polu widzenia, a następnie przetwarzanie obrazu. Poprawia to stosunek sygnału do szumu obrazów, zwiększa rozdzielczość czasową i umożliwia jednoczesne pozyskiwanie kilku fluorochromów w powstających koniugatach synaptycznych i zmniejsza wybielanie fluorescencyjne. Ponadto protokół jest kompatybilny z protokołami utrwalania komórek w punkcie końcowym, które umożliwią barwienie i analizę immunofluorescencyjną.Protokół ten jest również kompatybilny z laserową skaningową mikroskopią fluorescencyjną i innymi najnowocześniejszymi technikami mikroskopii. Procedurę zademonstrują Ana Bello, doktorantka, Alejandro Garrido, technik i Solange Moreno, doktorantka. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 150 mikrolitrów fibronektyny do każdej studzienki szkiełka z ośmioma komorami mikrodołkowymi i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do jednej godziny.Po okresie inkubacji odessać fibronektynę i przemyć każdą studzienkę 200 mikrolitrami PVS przez dwie minuty, delikatnie wstrząsając. Powtórz to pranie jeszcze raz i pozostaw drugie pranie w studzience. Przenieś 10 mililitrów zlewającej się prekultury komórek Raji do 15-mililitrowej probówki z dnem w kształcie litery V.Wirować w temperaturze 300 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad komórek w ciepłym, kompletnym podłożu o stężeniu 1 miliona komórek na mililitr. Aby oznaczyć komórki Raji, przenieś wymaganą liczbę komórek w pożywce hodowlanej do dwumililitrowej probówki.Do szkiełka z ośmioma komorami mikrodołkowymi potrzebne jest łącznie 1,6 mililitra zawiesiny komórek. Dodaj niebieski tracker komórek do końcowego stężenia 10 mikromolów. Ponownie zawiesić zabarwione na niebiesko komórki śledzące komórki i przenieść 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki przygotowanych szkiełek komorowych pokrytych fibronektyną.Inkubuj szkiełko komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 30 minut do jednej godziny. Następnie delikatnie potrząśnij szkiełkami komory na mikroskopie, aby upewnić się, że komórki Raji są przylegające. Dokładnie umyj każdą studzienkę ciepłym, kompletnym podłożem do hodowli komórkowych, aby wyeliminować nadmiar niebieskiego narzędzia do śledzenia komórek.Upewnij się, że komórki Raji są przyklejone do dolnej części płytek i wykazują przerwy między sobą i nie zlewają się. 50-60% zbiegu komórek jest odpowiednie. Najpierw dodaj enterotoksynę gronkowcową E w stężeniu jednego mikrograma na mililitr do każdej studzienki.Upewnij się, że komórki Raji są pulsowane superantygenem, w przeciwnym razie receptor limfocytów T z komórek Jurkat nie rozpozna SCE i synapsa nie zostanie utworzona. Inkubować szkiełko komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez co najmniej 30 minut. Następnie należy uzyskać wcześniej wyhodowaną kulturę komórek Jurkat w stężeniu od 1 do 2 milionów komórek na milimetr.Obserwuj komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym, a następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki z dnem w kształcie litery V. Wirować w temperaturze 300 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić komórki w ciepłym, kompletnym podłożu hodowlanym o stężeniu 1 miliona komórek na mililitr.Następnie utrzymuj komórki Jurkata w hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla, aż będą gotowe do użycia. Pobrać z inkubatora szkiełka komory zawierające niebieskie komórki Raji z adhezyjnym przyłączeniem impulsowym Staphylococcus Enterotoxin E do śledzenia komórek. Ostrożnie odsysaj pożywkę hodowlaną z każdej studzienki jeden po drugim za pomocą pipety umieszczonej w rogu studzienki.Natychmiast zastąp pożywkę 200 mikrolitrami zawieszonych komórek Jurkat w pożywce do hodowli komórkowych. Jeśli wykonywany jest film poklatkowy, szybko przejdź do mikroskopu. Zlokalizuj szkiełko z komorą na kelnerze do pomiaru mikroskopu i wybierz odpowiednie pola.Przygotuj mikroskop i komorę inkubacyjną przed obrazowaniem. Po dodaniu komórek Jurkata do każdej studzienki zawierającej komórki Raji, szybko zlokalizuj szkiełko komorowe z mikrodołkiem na podgrzewanym inkubatorze mikroskopowym i wybierz kilka pozycji XY. Jeśli planowany jest tylko eksperyment końcowy, inkubuj szkiełko w komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez jedną do dwóch godzin.Po okresie hodowli sprawdź, czy nie tworzy się koniugat, a następnie utrwal koniugaty zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby naprawić ogniwa, dodaj ciepłe RPMI bez FCS i delikatnie potrząśnij. Zassać RMPI i dodać 200 mikrolitrów PFA lub wstępnie schłodzonego acetonu do każdej studzienki.Inkubować szkiełko komorowe w temperaturze pokojowej lub na lodzie przez 20 minut. Następnie umyj każdą studzienkę dwukrotnie PVS i dodaj 200 mikrolitrów roztworu hartującego. W tym badaniu generowane są koniugaty synaps immunologicznych Jurkat-Raji i prawidłowo obrazowane są wczesne etapy tworzenia synaps immunologicznych.Strategia ta indukuje tworzenie synaps immunologicznych, jednocześnie wykonując obrazowanie poklatkowe. Reprezentatywne koniugaty synaptyczne Jurkat-Raji uzyskane za pomocą tej techniki są pokazane tutaj, w tym obraz kanału transmisyjnego, niebieskiego kanału śledzenia komórek i oba te kanały są połączone. Można zaobserwować niektóre koniugaty synaptyczne, w tym te składające się tylko z jednej komórki Jurkat i kilku komórek Raji, które są złożonymi sprzęgami.Zmniejszające się stężenia komórek pozwolą uniknąć tworzenia złożonych koniugatów komórkowych, ale mogą nie zapewnić wystarczającej liczby koniugatów komórkowych do późniejszej analizy ruchu spolaryzowanego, co z kolei zmniejszy szanse na znalezienie i zobrazowanie pojawiających się koniugatów synaptycznych. Dekonwolucja obrazów kanału fluorescencji GFP-CD63 wykonywana jest za pomocą odpowiedniego oprogramowania do dekonwolucji z wykorzystaniem opcji optycznej szerokokątnej i odpowiednich parametrów optycznych. Ten zdekonwoluowany kanał został następnie połączony z niebieskim szerokim kanałem śledzenia komórek.Nastąpiła poprawa zarówno stosunku sygnału do szumu, jak i ostrości. Pokazano tutaj reprezentatywny stos Z ustalonego koniugatu synapsy immunologicznej. Immunofluorescencję przeprowadza się przy użyciu falloidyny do wizualizacji F-aktyny, anty-CD63 do wizualizacji MVB i anty-gamma-tubuliny do wizualizacji MTOC, podczas gdy tracker komórek oznaczony na niebiesko komórki Raji.Opcjonalne transfiksowanie komórek Jurkat pozwoli na wizualizację ruchu granulek wydzielniczych w żywych komórkach. Na przykład, gdy GFP-CD63 ulega ekspresji, można zarejestrować ruch pęcherzyków ozdobionych GFP-CD63. Protokół jest zgodny z protokołami utrwalania punktu końcowego, które pozwolą na dalsze protokoły barwienia immunofluorescencyjnego i analizy.Istnieją eksperymentalne modele produktywności, które mogą uprościć obrazowanie w synapsie immunologicznej, ale modele te nie emulują złożonej i nieregularnej powierzchni komórek prezentujących antygen, które mogą powodować niefizjologiczne interakcje w synapsie immunologicznej. Opisane tutaj podejście jest odpowiednie do odtworzenia i potwierdzenia pewnych złożoności biologicznych zachodzących w synapsie immunologicznej. Superantygen jest niebezpieczną toksyną, dlatego należy założyć rękawiczki i upuścić zużytą końcówkę na niebezpieczne pudełko.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Źródło: Bello-Gamboa, A. et al., Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej.J. Vis. Exp.(2019 rok) Ten film demonstruje badanie in vitro tworzenia synaps immunologicznych między komórką prezentującą antygen a limfocytami T pomocniczymi za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Receptory limfocytów T pomocniczych oddziałują z kompleksem antygenu-MHC-II w komórkach prezentujących antygen i tworzą synapsy immunologiczne, po których następują ruchy pęcherzyków wydzielniczych w kierunku synapsy, co...

Tworzenie synaps immunologicznych między limfocytami T pomocniczymi a komórkami prezentującymi antygen

Ten film analizuje tworzenie się synaps immunologicznych między limfocytami T w nieoczyszczonych preparatach pan-leukocytów a enterotoksyną B, komórkami Raji Staphylococcus aureus obciążonymi SEB. Wzbogacenie CD3 i F-aktyny obserwuje się w synapsie immunologicznej za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Analiza synaps immunologicznych między ludzkimi limfocytami T a komórkami Raji załadowanymi SEB przy użyciu obrazowej cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

Tutaj ilustrujemy protokół obrazowania za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED, cytotoksycznej synapsy immunologicznej komórek NK rekapitulowanej na szkle. Za pomocą tej metody uzyskujemy rozdzielczość sub-100 nm białek synapsy i cytoszkieletu.

Wizualizacja synapsy immunologicznej za pomocą dwukolorowej nanoskopii STED (Time-Gated Stimulated Emission Depletion)

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.

Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

Poznaj metodę obrazowania ludzkiej synapsy immunologicznej między komórkami Raji a limfocytami T Jurkat. Technika fluorescencyjna pozwala obserwować polaryzowaną sekrecję i dynamikę interakcji immunologicznych.

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Przeglądaj więcej filmów