Nanowzorce substratów DNA origami struktur nieorganicznych do zastosowań detekcyjnych
27 września 2019
Tutaj opisujemy protokół tworzenia dyskretnych i dokładnych nieorganicznych nanostruktur na podłożach, używając kształtów origami DNA jako szablonów prowadzących. Metoda jest demonstrowana poprzez tworzenie plazmonicznych złotych anten w kształcie muszki na przezroczystym podłożu (szafirze).
Protokół ten łączy technikę origami DNA opartą na oddolnej podstawie z metodami nanowytwarzania od góry do dołu, umożliwiając równoległe wytwarzanie nieorganicznych nanostruktur o rozmiarach poniżej 10 nanometrów na różnych podłożach. Technika ta może być wykorzystana do stworzenia miliardów dokładnych nanostruktur jednocześnie, praktycznie w dowolnym kształcie, bez konieczności stosowania drogich metod modelowania. Metoda ta może zostać wykorzystana w zastosowaniach detekcyjnych, takich jak spektroskopia Ramana ze wzmocnieniem powierzchniowym, a także w tworzeniu nowych metapowierzchni optycznych.
Chociaż protokół ten jest dość prosty, potrzebne są bardziej dyscyplinarne umiejętności produkcyjne, a zatem demonstracja wizualna będzie przydatna dla badaczy z różnych środowisk. Procedurę z Petteri Piskunen zademonstruje Sofia Julin, kolejna studentka z naszego laboratorium. Aby przygotować zapas pasm odcinkowych, wymieszaj równe ilości wszystkich oligonukleotydów potrzebnych do budowy muszki i wymieszaj 20 mikrolitrów nici rusztowania M13 MP18 z 40 mikrolitrami roztworu podstawowego zszywek i 40 mikrolitrami buforu składanego 2,5 X w probówce do PCR o pojemności 200 mikrolitrów.
Następnie wyżarzać mieszaninę reakcyjną w termocyklerze od 90 do 27 stopni Celsjusza, jak opisano w tabeli. Aby przygotować podłoże, zanurz około siedmiu do siedmiu milimetrów wiórów wyciętych z szafirowej płytki w szklanym pojemniku z acetonem o temperaturze 52 stopni Celsjusza na co najmniej 15 minut przed przeniesieniem wiórów do szklanego pojemnika z izopropanolem na dwie minuty sonikacji. Pod koniec sonikacji należy użyć pęsety, aby usunąć wiórki z izopropanolu i natychmiast wysuszyć wiórki azotem przy najwyższym możliwym przepływie, z powierzchniami wiórów równoległymi do kierunku przepływu.
W przypadku chemicznego osadzania z fazy gazowej warstwy krzemu wspomaganego plazmą, umieść wysuszone wióry w przyrządzie do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą i ustaw parametry osadzania zgodnie z modelem przyrządu i kalibracją, aby wyhodować około 50 nanometrów amorficznego krzemu. W celu obróbki plazmą tlenową warstwy amorficznego krzemu, umieść chipy w przyrządzie do trawienia jonów reaktywnych i ustaw parametry trawienia, aby wygenerować plazmę tlenową zgodnie z modelem przyrządu i kalibracją. Następnie uruchom program obróbki plazmą tlenową.
W ciągu 30 minut od obróbki plazmą tlenową wymieszaj pięć mikrolitrów złożonego i oczyszczonego roztworu origami DNA z czterema mikrolitrami buforu fałdowego i jednym mikrolitrem jednego molowego chlorku magnezu. Umieść 10 mikrolitrów mieszaniny origami DNA na każdym chipie poddanym plazmie tlenowej i przykryj chipy na pięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyj powierzchnie chipów 100 mikrolitrami wody destylowanej, kilkakrotnie spłukując wodę tam iz powrotem pipetą, unikając dotykania środków chipsów.
Po spopieleniu jeszcze dwa do trzech razy, jak pokazano, natychmiast wysusz wióry przepływem azotu. Aby wyhodować maskę z dwutlenku krzemu, wymieszaj 100 gramów żelu krzemionkowego z 30 mililitrami wody destylowanej. Umieść mieszaninę żelu krzemionkowego w eksykatorze i oddziel żel za pomocą perforowanej płytki.
Po 24 godzinach umieścić chipsy z zaadsorbowanym origami DNA na perforowanej platformie w eksykatorze i umieścić fiolkę zawierającą 10 mililitrów ortokrzemianu tetraetylu po jednej stronie chipsów i fiolkę zawierającą 10 mililitrów 25% wodorotlenku amonu po drugiej stronie chipsów. Następnie zamknij komorę na 20-godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji na obszarach bez struktur origami DNA utworzy się film dwutlenku krzemu, tworząc 10 do 20 nanometrową maskę wzorzystą z otworami w kształcie origami DNA.
W celu reaktywnego wytrawiania jonowego dwutlenku krzemu należy umieścić chipy w przyrządzie do wytrawiania jonami reaktywnymi i ustawić parametry trawienia tak, aby wytrawiać tylko dwa do pięciu manometrów dwutlenku krzemu, aby odsłonić amorficzną warstwę krzemu pod otworami w masce dwutlenku krzemu. Wszystkie parametry trawienia powinny być zoptymalizowane pod kątem wybranych instrumentów, ponieważ prawidłowe parametry zależą od rodzaju sprzętu i konkretnej konfiguracji. Może być potrzebne kilka iteracji.
Po uruchomieniu programu anizotropowego wytrawiania plazmowego dwutlenku krzemu ustaw parametry trawienia tak, aby przebijały się przez 50-nanometrową warstwę amorficznego krzemu. Następnie uruchom program do izotropowego wytrawiania plazmą krzemową. W przypadku fizycznego osadzania z fazy gazowej należy załadować wióry do komory parowania przyrządu do fizycznego osadzania z fazy gazowej i wybrać klej do metalu docelowego.
Ustaw program kontroli grubości dla materiału docelowego i grubości i uruchom wiązkę elektronów, wyrównując wiązkę do celu i zwiększając prąd wiązki, aż do osiągnięcia szybkości osadzania 0,05 nanometra na sekundę. Następnie odparowują, aż do osiągnięcia końcowej grubości dwóch nanometrów. Pod koniec parowania należy wybrać drugi metal docelowy bez odpowietrzania komory lub przerywania procesu i ustawić grubość.
Ustaw wiązkę elektronów względem celu, aż zostanie osiągnięta szybkość osadzania 0,05 nanometra na sekundę, a następnie odparuj, aż do osiągnięcia grubości 20 nanometrów. Metalowa struktura DNA w kształcie origami zostanie stworzona przez otwory w masce z dwutlenku krzemu o łącznej wysokości 22 nanometrów. Po odpowietrzeniu komory usunąć próbki.
W celu usunięcia kwasu fluorowodorowego zanurz próbki w wytrawiaczu na bazie kwasu fluorowodorowego i delikatnie wymieszaj próbki za pomocą plastikowej pęsety. Poczekaj, aż warstwa dwutlenku krzemu całkowicie się wytrawi, a warstwa metalu oderwie się przed spłukaniem próbek podwójnie destylowaną wodą i izopropanolem. Następnie wysuszyć próbki strumieniem azotu, jak pokazano.
W celu reaktywnego wytrawiania jonowego pozostałego krzemu amorficznego, umieść wióry w przyrządzie do trawienia jonami reaktywnymi i ustaw parametry trawienia w celu usunięcia wszystkich 50 nanometrów krzemu amorficznego. Uruchom program izotropowego wytrawiania plazmą krzemu amorficznego, aby usunąć pozostały krzem amorficzny. Następnie wyjmij próbki ze sprzętu do trawienia jonów reaktywnych i przechowuj je w zakrytym pojemniku.
Elektroforeza w żelu agarozowym i mikroskopia sił atomowych mogą być wykorzystane do analizy fałdowania DNA origami i jakości oczyszczania glikolu polietylenowego. Tutaj pokazano reprezentatywne obrazy z mikroskopii sił atomowych po wzroście maski z dwutlenku krzemu. Na tych obrazach można zaobserwować skaningową mikroskopię elektronową końcowych nanostruktur metalowych.
Na tych wykresach przeanalizowano funkcjonalność optyczną metalicznych nanostruktur, wyznaczonych za pomocą origami DNA z muszką. Wzrost maski z dwutlenku krzemu ma kluczowe znaczenie dla tego procesu i jest dość wrażliwy na wilgotność i reaktywność TEOS. Dlatego parametry te powinny być dokładnie kontrolowane pod kątem odtwarzalności.
Jeśli technika origami DNA zostanie dodatkowo połączona z wysoce uporządkowanymi wzorcami DNA, może to utorować drogę do wytwarzania metamateriałów i powierzchni w widzialnym zakresie długości fal
.Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół tworzenia precyzyjnych nieorganicznych nanostruktur na podłożach z wykorzystaniem origami DNA jako szablonów. Metoda ta została zilustrowana poprzez wytwarzanie plazmonicznych złotych anten typu bowtie na podłożach szafirowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nanotechnologia
- Inżynieria biomolekularna
- Inżynieria materiałowa
Wprowadzenie
- Technika origami DNA umożliwia tworzenie złożonych nanostruktur.
- Metody nanofabrykacji odgórnej (top-down) pozwalają na uzyskanie wysokiej precyzji w formowaniu struktur.
- Połączenie tych technik może prowadzić do innowacyjnych zastosowań w sensoryce i optyce.
- Demonstracje wizualne są pomocne dla badaczy z różnych dziedzin.
Cel badania
- Opracowanie metody równoległej fabrykacji nieorganicznych nanostruktur.
- Wykazanie możliwości wykorzystania origami z DNA do tworzenia nanostruktur z elementami o rozmiarach poniżej 10 nm.
- Zbadanie potencjalnych zastosowań w spektroskopii Ramana z wzmocnieniem powierzchniowym oraz w optycznych metapowierzchniach.
Zastosowane metody
- Przygotowanie struktur DNA origami poprzez wyżarzanie termiczne.
- Przygotowanie podłoża obejmujące czyszczenie i obróbkę plazmową.
- Osadzanie dwutlenku krzemu i następujące po nim reaktywne trawienie jonowe.
- Fizyczne osadzanie z fazy gazowej w celu stworzenia struktur metalicznych przez maskę.
Główne wyniki
- Skuteczne wytworzenie złotych anten typu bowtie na podłożach szafirowych.
- Wykazanie skalowalności metody w celu produkcji miliardów nanostruktur.
- Walidacja protokołu poprzez analizę wizualną i strukturalną.
- Wskazanie potencjalnych zastosowań w zaawansowanych technologiach detekcji.
Wnioski
- Protokół ten oferuje prosty sposób wytwarzania nanostruktur.
- Połączenie origami DNA z tradycyjnymi metodami zwiększa możliwości wytwarzania.
- Technika ta otwiera nowe możliwości dla innowacyjnych zastosowań w nanotechnologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nanopatterning wspomagany origami DNA umożliwia skalowalną fabrykację nieorganicznych nanostruktur z precyzją poniżej 10 nm do zastosowań w sensoryce. To hybrydowe podejście bottom-up/top-down pozwala na wysokoprzepustową produkcję plazmonicznych i optycznych metamateriałów bez konieczności stosowania kosztownej litografii. Metoda ta usprawnia walidację celów oraz opracowywanie testów poprzez dostarczanie powtarzalnych, istotnych w kontekście chorób powierzchni nanostrukturalnych do detekcji molekularnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia precyzyjną kontrolę przestrzenną nanostruktur metalicznych w celu zbadania mechanizmów wzmocnienia plazmonicznego w biosensoryce.
- Wartość operacyjna: Wspiera równoległe wytwarzanie miliardów jednolitych nanostruktur, co zmniejsza zmienność w testach wiązania z celem.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia tworzenie zestandaryzowanych podłoży aktywnych w SERS z mierzalnymi obszarami wzmocnienia pola elektromagnetycznego (hotspots) w celu wiarygodnego określania sygnatur molekularnych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia skalowalność analiz dzięki seryjnej produkcji chipów sensorowych kompatybilnych z przepływami pracy w wysokoprzepustowym przesiewaniu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia regulowane interfejsy optyczne do podłużnego monitorowania biomarkerów w przedklinicznych modelach chorób.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ponowne wykorzystanie podłoża dla różnych analitów poprzez funkcjonalizację powierzchni, co wspiera ciągłość translacyjną.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta łączy biologię odkrywczą z opracowywaniem testów poprzez generowanie mierzalnych odczytów optycznych, które wspierają identyfikację wiodących związków oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących oddziaływań nanostruktura-biocząsteczka poprzez kontrolowane wzmocnienie pola plazmonicznego.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe sygnały SERS, umożliwiając przesiewanie bibliotek związków w kierunku unieruchomionych celów.
- Analityka: Generuje mierzalne przesunięcia pików i zmiany intensywności, które korelują z powinowactwem wiązania i kinetyką.
- Badania translacyjne: Łączy optymalizację nanostruktur z walidacją przedkliniczną dzięki spójnej wydajności optycznej między partiami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę nanofabrykacyjną dla wielu programów detekcyjnych dzięki modułowemu projektowi DNA origami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Przewidywalność pewności parametrów detekcji dzięki deterministycznej geometrii nanostruktur i strojeniu plazmonicznemu.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki litografii z użyciem masek, co redukuje zmienność między partiami.
- Wartość strategiczna: Zmniejszenie ryzyka biologicznego na późnych etapach dzięki możliwości wczesnej walidacji optycznej hipotez dotyczących wiązania celu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja programów sensorowych z uwzględnieniem ryzyka, oparta na skalowalnej i niskokosztowej produkcji nanostruktur.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu nanotechnologii DNA oraz osadzania cienkich warstw metodami plazmowymi.
- Zależy od kontrolowanego dostępu do systemów trawienia jonowego oraz naparowania wiązką elektronów.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji przetwarzania TEOS wrażliwego na wilgoć w celu zapewnienia powtarzalności maski.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metod przy rozszerzeniu zakresu na podłoża niemetaliczne lub alternatywne anality.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość wzrostu maski z dwutlenku krzemu na warunki środowiskowe, zgodnie z opisem w protokole.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:02
DNA Origami Assembly
1:34
Substrate Preparation
2:09
Amorphous Silicon (a-Si) Layer Plasma-Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) and Oxygen Plasma Treatment
2:49
DNA Origami Deposition
3:44
Silicon Dioxide (SiO2) Mask Growth
4:38
Reactive Ion Etching (RIE)
5:25
Physical Vapor Deposition (PVD)
6:35
Hydrofluoric Acid (HF) Liftoff
7:05
Remaining a-Si RIE
7:38
Results: Representative Bowtie DNA Origami Imaging and Functional Analyses
8:15
Conclusion
