Name: Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Poznaj dwa nowe modele zwierzęce przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki: implantację ortotopową u myszy oraz model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka. Oba modele wiernie odwzorowują przerzuty płucne obserwowane klinicznie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez UCLA JCCC seed grant, UCLA 3R grant, UCLA CTSI i UC TRDRP (LW). Dziękujemy Zakładowi Obrazowania Przedklinicznego Instytutu Crumpa, TPCL oraz Wydziałowi Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych UCLA (DLAM) za pomoc w opracowaniu metod eksperymentalnych. Cytometrię przepływową przeprowadzono w UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility, które są wspierane przez National Institutes of Health awards P30 CA016042 i 5P30 AI028697, oraz przez JCCC, UCLA AIDS Institute, David Geffen School of Medicine na UCLA, Biuro Kanclerza UCLA, oraz Biuro Rektora UCLA ds. Badań. Usługi konsultingowe w zakresie statystyk i analizy danych były świadczone przez program UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiology, and Research Design (BERD), który jest wspierany przez NIH/National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), wyznaczony jako Komitet Badań nad Zwierzętami Kanclerza UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 i ARC 2017-102-01A). Protokół 2002-049-53 jest zoptymalizowany pod kątem implantacji komórek nowotworowych ccRCC do torebki nerkowej myszy Nude lub BALB/c. Eksperymenty z implantacją guza w zapłodnionych jajach kurzych przed wykluciem nie wymagają zatwierdzenia przez IACUC. Aby wydłużyć czas tworzenia się przerzutów do płuc, zarodki z guzem CAM mogą się wykluć i wyrosnąć na kurczęta. Protokół 2017-102-01A obejmuje te eksperymenty na zwierzętach.
1. Badania ortotopowe guzów u myszy
UWAGA: Harmonogram tego eksperymentu jest pokazany w Rysunek 1A. Procedury te zostały zaadaptowane z poprzednich publikacji11,12.
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej do szczepienia
	<ol>
		<li>Odłączyć komórki RENCA VHL-WT i VHL-KO od szalek hodowlanych za pomocą trypsyny/EDTA.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawieś we wstępnie schłodzonej mieszaninie PBS i roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej w stosunku 1:1 o stężeniu 1 x 105 komórek/μL. 
		UWAGA: W przypadku implantów heterogenicznych należy stosować komórki VHL-WT:VHL-KO w stosunku 1:4, a w przypadku implantów jednorodnych samą VHL-WT.</li>
		<li>Przenieś zawieszone komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i trzymaj na lodzie aż do implantacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Implantacja do torebki nerkowej
	<ol>
		<li>Znieczulenie: Rozgrzej ciepłą podkładkę do 37 °C i przykryj ją kawałkiem grubej, sterylnej zasłony. Znieczulić mysz przez inhalację izofluranu przez komorę indukcyjną lub dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie 1% pentobarbitalu sodu w dawce 10 ml / kg.</li>
		<li>Ogolić włosy z miejsca operowanego. Ten krok można pominąć w przypadku nagich myszy.</li>
		<li>Dezynfekcja i obłożenie chirurgiczne: Całkowicie zdezynfekuj grzbiet myszy 3x jodem powidonu, a następnie 70% etanolem 1x i wytrzyj do sucha sterylnymi wacikami. Następnie zastosuj kolejno trzy sterylne opatrunki medyczne, pokrywając całe plecy, aby stworzyć pole operacyjne, a także unieruchomić mysz.</li>
		<li>Nacięcie i eksterioryzacja nerki: Przed operacją należy zdezynfekować palce operatora powidonem lub użyć pary sterylnych rękawiczek. Umieść mysz w pozycji leżącej i palcami zlokalizuj lewą nerkę tuż pod lewym bokiem. Użyj kleszczy i nożyczek, aby przeciąć skórę i warstwę mięśni pod określonym miejscem. Użyj sterylnych bawełnianych wacików i kleszczyków, aby częściowo usunąć lewą nerkę z jamy brzusznej.</li>
		<li>Implantacja komórek nowotworowych: Załaduj zawiesinę komórkową przygotowaną w kroku 1.1 do strzykawek insulinowych lub niestandardowych strzykawek Hamiltona (specyfikacja znajduje się w tabeli materiałów). Wstrzyknąć 20 μl zawieszonych komórek pod kapsułkę nerkową. 
		UWAGA: O udanym wstrzyknięciu decyduje utworzenie się półprzezroczystego wybrzuszenia na powierzchni nerki. Przypadkowe wstrzyknięcie do miąższu nerki powoduje krwawienie i śmiertelność pooperacyjną sięgającą nawet 90% z powodu śmiertelnego krwotoku w miejscu wstrzyknięcia.</li>
		<li>Powoli wyciągnij igłę, aby umożliwić zestalenie się roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej i zapobiec krwotokowi lub wyciekowi komórek nowotworowych. Następnie za pomocą sterylnego wacika wepchnij nerkę z powrotem do jamy brzusznej.</li>
		<li>Szycie ran: Użyj nici VICTRYL powlekanej 5-0, aby zszyć warstwę mięśniową. Zdezynfekuj skórę powidonem raz i zamknij skórę za pomocą autoklipsów do ran.</li>
		<li>Odzyskiwanie: Umieść mysz na ciepłej podkładce, aż się obudzi. Jeśli mysz została znieczulona przez inhalację, odstaw izofluran i trzymaj mysz na ciepłej podkładce, dopóki się nie obudzi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) i pobieranie tkanek
	<ol>
		<li>Sześć tygodni po implantacji guza wykonaj obrazy BLI na bazie lucyferazy świetlika. Następnie poddaj myszy eutanazji za pomocą inhalacji izofluranu, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.</li>
		<li>Zbierz krew do wykrywania krążących komórek nowotworowych (CTC) za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Pobieranie guzów i narządów będących przedmiotem zainteresowania (nerki, płuca, wątroba, jelita i śledziona) przy użyciu techniki pobierania sterylnych tkanek22. Utrwal je w 4% paraformaldehydzie na noc w celu zatopienia w wosku parafinowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Model ksenoprzeszczepu guza CAM
UWAGA: Te procedury zostały zaadaptowane i zmodyfikowane na podstawie wcześniej opublikowanych protokołów23,24. Harmonogram tej procedury jest pokazany w Rysunek 1B. W tym artykule przedstawiono tylko uproszczony protokół. Aby zapoznać się ze szczegółowymi protokołami, zapoznaj się z innym artykułem JoVE opublikowanym przez naszą grupę25.
<ol>
	<li>Inkubacja wstępna: Inkubować świeżo zniesione, zapłodnione jaja kurze w obrotowym inkubatorze jaj w temperaturze 37 °C i wilgotności 55-65% przez 7 dni.</li>
	<li>Upuść CAM i otwórz okno (7 dzień rozwoju):
	<ol>
		<li>Zlokalizuj i oznacz worek powietrzny i żyły. 
		UWAGA: Zwykle 10-15% jaj jest usuwanych, ponieważ są one albo niezapłodnione, albo umierają w ciągu 7 dni od zapłodnienia.</li>
		<li>Utwórz nowy worek powietrzny na zaznaczonej żyle.</li>
		<li>Wyznacz nowy worek powietrzny, nałóż taśmę pakową i włóż jaja z powrotem do inkubatora. 
		UWAGA: W tym miejscu procedurę można wstrzymać. Zaleca się wznowienie zabiegów w ciągu tego samego dnia, ponieważ worek powietrzny może się poruszać.</li>
		<li>Otwórz okno: Używając zakrzywionych nożyczek do mikropreparacji i kleszczy z igłami, wytnij okrągłe okienko o wymiarach 1,5 x 1,5 cm w skorupie. 
		UWAGA: Przerwanie CAM jest sygnalizowane przez krew i kawałek CAM obecny na odciętym kawałku skorupy.</li>
		<li>Uszczelnij otwór przezroczystym opatrunkiem medycznym i umieść jaja w stacjonarnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i wilgotności 55%-65%. 
		UWAGA: Użyj tego samego inkubatora do jaj, co w kroku 2.1. Wyłącz rotator, aby go zatrzymać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola stanu zdrowia (9 dzień rozwoju): Usuń martwe komórki jajowe, a następnie losowo pogrupuj pozostałe komórki jajowe w celu implantacji komórek nowotworowych. 
	UWAGA: Idealnie, wskaźnik przeżycia w tym momencie wynosi około 80% dnia rozwoju 0.</li>
	<li>Przeszczepienie komórek nowotworowych do nowo odsłoniętego CAM (10 dzień rozwoju)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej w podwójnej objętości wstępnie schłodzonego RPMI 1640 (z L-glutaminą). Odłączyć ogniwa RENCA i ponownie zawiesić w powyższym roztworze do uzyskania stężenia 2 x 104 komórek/μL. 
		UWAGA: Do implantów heterogenicznych należy stosować komórki VHL-WT:VHL-KO w stosunku 1:1, a do implantacji jednorodnej samą VHL-WT.</li>
		<li>Aby wstępnie zestalić zawiesinę komórek, należy napełnić 100 μl każdej mieszanki komórek końcówkami do pipet o pojemności 200 μl i umieścić je w inkubatorze komórkowym na 15 minut.</li>
		<li>Wszczepić 100 μl zawiesiny komórkowej dla każdej komórki jajowej na powierzchni CAM przez okienko. 
		UWAGA: Niektóre protokoły wymagają zarysowania CAM przed implantacją23. Nie jest to konieczne w przypadku komórek RENCA, ponieważ rosną one bardzo szybko.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj komórki na CAM przez 10 dni i fotografuj co 2 dni.</li>
	<li>Poddaj eutanazji i zbierz guza, krew i narządy.
	<ol>
		<li>W 20. dniu rozwoju (10. dzień guza) należy pobrać krew przez żyłę kosmówkowo-omocznikową za pomocą heparynizowanej strzykawki o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Poddaj zarodki eutanazji, umieszczając je na lodzie na 15 minut.</li>
		<li>Zbierz i zważ guzy. Wypreparuj płuca i wątroby przy użyciu sterylnej techniki pobierania tkanek, podobnej do tej stosowanej u myszy22. 
		UWAGA: Wątroby kurczaków mają dwa płaty, które są pierwszymi narządami widocznymi w jamie brzusznej. Nie należy ich mylić z płucami. Płuca kurczaka znajdują się pod sercem i przegrodą26. Udane pobranie płuc można potwierdzić za pomocą odsłoniętych żeber.</li>
		<li>Utrwal guzy i wypreparowane narządy w 4% paraformaldehydzie na noc w celu zatopienia w wosku parafinowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykluj kurczaki.
	<ol>
		<li>Aby umożliwić dłuższy okres wzrostu guza, kontynuuj inkubację do 21 dnia i pozwól kurczakom wykluć się w temperaturze 37 °C i wilgotności co najmniej 60%. 
		UWAGA: Kurczaki naturalnie wykluwają się po 21 dniu w ciągu 24 godzin, ale czasami mają problemy z samodzielnym wykluciem. W takim przypadku pomaga rozbicie skorupek jajek. Ważne jest, aby kurczaki zakończyły proces wylęgu w ciągu 24 godzin, ponieważ po tym czasie umrą z powodu braku składników odżywczych.</li>
		<li>Hoduj kurczaki w obiekcie dla zwierząt (2017-102-01A) przez 2 tygodnie.</li>
		<li>W 34. dniu rozwoju (24. dzień guza) pisklęta należy poddać eutanazji za pomocą inhalacji izofluranu, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.</li>
		<li>Wypreparuj płuca za pomocą sterylnej techniki pobierania tkanek, podobnej do tych stosowanych u myszy22. Następnie utrwal je na noc w 4% paraformaldehydzie w celu zatopienia w wosku parafinowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Immunohistochemia
UWAGA: Wszystkie sekcje tkanek i barwienie H&E zostały wykonane przez Translational Pathology Core Laboratory (TPCL) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles.
<ol>
	<li>Piec szkiełka w temperaturze 65 °C przez 20 minut i 3x deparafinować za pomocą ksylenu i ponownie nawadniać seryjnie ze 100% etanolu do wody.</li>
	<li>Odzyskaj antygeny w buforze cytrynianowym gotowanym w parowarze do warzyw przez 25 minut.</li>
	<li>Zastosuj 1% BSA do blokowania. Następnie nanieść przeciwciała pierwszorzędowe (anty-VHL, anty-HA, anty-flag) przygotowane w stosunku rozcieńczenia 1:200 w PBS. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po przemyciu 3x TBST (7 min każde), inkubować szkiełka z przeciwciałem drugorzędowym w rozcieńczeniu 1:200. Przemyć 3x TBST (po 7 minut) i nałożyć odczynniki DAB, a następnie przeciwbarwić hematoksyliną.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Przetwarzaj krew myszy lub kurczaka za pomocą buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC) zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Wystarczająca liza RBC jest szczególnie ważna podczas analizy krwi CAM, ponieważ RBC kurczaka są jądrzaste i nie można ich łatwo odróżnić w cytometrii przepływowej przy użyciu rozproszenia do przodu i boku.</li>
	<li>Uruchom cytometrię przepływową na lizacie krwi i przeanalizuj dane pod kątem ekspresji mStrawberry i EGFP.</li>
	<li>Ustaw bramki główne w oparciu o rozproszenie z przodu i z boku, z wyłączeniem gruzu, martwych komórek i niezlizanych erytrocytów.</li>
	<li>Ustaw bramki fluorescencyjne na podstawie niebarwionych próbek i pojedynczych barwionych kontroli. Użyj lizatu krwi zagruntowanego VHL-WT, VHL-KO lub nieznakowanymi komórkami RENCA jako odpowiednio pojedynczych barwionych i niebarwionych kontroli.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, H. T., McGovern, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Renal-cell carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).</li>
<li>Bianchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+metastatic+sites+in+renal+cell+carcinoma%3A+a+population-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis.</a> Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).</li>
<li>Hsieh, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009(2017).</li>
<li>Foster, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+the+von+Hippel-Lindau+disease+tumour+suppressor+gene+in+non-familial+clear+cell+renal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma.</a> Human Molecular Genetics. 3, (1994).</li>
<li>Young, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+VHL+Gene+Alterations+and+their+Relationship+to+Clinical+Parameters+in+Sporadic+Conventional+Renal+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma.</a> Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).</li>
<li>Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL%2C+the+story+of+a+tumour+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">VHL, the story of a tumour suppressor gene.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+molecular+analysis+of+clear-cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).</li>
<li>Choueiri, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+aberrant+VHL%2FHIF+pathway+elements+in+predicting+clinical+outcome+to+pazopanib+therapy+in+patients+with+metastatic+clear-cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma.</a> Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).</li>
<li>Hsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+cellular+functions+of+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%3A+insights+from+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms.</a> Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).</li>
<li>Albers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+mutation+of+Vhl+and+Trp53+causes+renal+cysts+and+tumours+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).</li>
<li>Schokrpur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+VHL+Knockout+Generates+an+Improved+Model+for+Metastatic+Renal+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 29032(2016).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Non-integrating+Lentiviral+Approach+Overcomes+Cas9-Induced+Immune+Rejection+to+Establish+an+Immunocompetent+Metastatic+Renal+Cancer+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model.</a> Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).</li>
<li>Heerboth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">EMT and tumor metastasis.</a> Clinical and Translational Medicine. 4, 6(2015).</li>
<li>DeBord, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+as+a+versatile+patient-derived+xenograft+%28PDX%29+platform+for+precision+medicine+and+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research.</a> American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology.</a> Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).</li>
<li>Ismail, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+Therapy+of+Malignant+Ovarian+Tumours+Cultivated+on+CAM%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM.</a> Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).</li>
<li>Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+human+neoplasm+on+the+chick+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane.</a> The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).</li>
<li>Janse, E. M., Jeurissen, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+function+of+two+non-lymphoid+cell+populations+in+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo.</a> Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).</li>
<li>Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+stem+cell+identification+in+the+developing+thymus+and+bursa+of+Fabricius+of+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+fur+Zellforschung+und+Mikroskopische+Anatomie%22%5BJournal%5D)">Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick.</a> Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).</li>
<li>Solomon, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolomon%2C+JB+%22Foetal+and+neonatal+immunology+%28Frontiers+of+biology%29%22">Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology)</a>. 20, North-Holland Pub. Co. (1971).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+Animal+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Sterile+Tissue+Harvest%22%5BJournal%5D)">Lab Animal Research.</a> Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cancer+metastasis+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2815(2011).</li>
<li>Fergelot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+experimental+renal+cell+carcinoma+model+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo.</a> Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).</li>
<li>Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSharrow%2C+AC+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , In Press (2019).</li>
<li>Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aL%C5%91w%2C+P+%22Atlas+of+Animal+Anatomy+and+Histology%22">Atlas of Animal Anatomy and Histology</a>. , 265-324 (2016).</li>
<li>Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+xenografts+of+urological+cancers+on+chicken+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+to+study+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Precision+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis.</a> Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).</li>
<li>Casar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cleaved+CDCP1+promotes+early+tumor+dissemination+via+complexing+with+activated+beta1+integrin+and+induction+of+FAK%2FPI3K%2FAkt+motility+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling.</a> Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dla wielu pacjentów z nowotworami nabłonkowymi przerzuty do ważnych narządów są główną przyczyną śmiertelności. Dlatego tak ważne jest znalezienie mechanizmu leżącego u podstaw choroby przerzutowej i nowej drogi leczenia. Niestety, brakuje odpowiednich przerzutowych modeli zwierzęcych ccRCC. Wyzwanie to w dużej mierze wynika z niemożności odtworzenia ccRCC u myszy, pomimo generowania wielu transgenicznych modeli myszy VHL z nokautem ukierunkowanym na nabłonek nerek 9,10<sup class="xref"...

Rak nerkowokomórkowy (RCC) jestsiódmym najczęściej występującym nowotworem w Stanach Zjednoczonych. Szacuje się, że rocznie 74 000 Amerykanów jest nowo zdiagnozowanych, co odpowiada za ponad 14 000 zgonów (podtyp histologiczny jasnokomórkowy lub ccRCC jest najczęstszym podtypem, stanowiącym około 80% przypadków RCC). Pacjenci z miejscowym nowotworem złośliwym są leczeni nefrektomią i mają korzystny wskaźnik 5-letniego przeżycia wynoszący 73%1. Jednak u 25%-30% pacjentów rozwijają się odległe przerzuty do ważnych narządów, takich jak płuca, co skutkuje słabym średnim przeżyciem wynoszącym 13 miesięcy i 5-letnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym zaledwie 11%1,2,3. Potrzebne jest dalsze zrozumienie mechanizmu przerzutów, aby poprawić śmiertelne wyniki w przypadku przerzutowego ccRCC.
Utrata genu supresorowego VHL jest charakterystyczną zmianą genetyczną obserwowaną w większości przypadków ccRCC u ludzi4,5,6,7. Jednak dokładny onkogenny mechanizm utraty VHL w ccRCC nie jest znany. Ponadto stan wyrażenia VHL nie jest predyktorem wyniku w ccRCC8. Warto zauważyć, że pomimo licznych prób nokautu VHL ukierunkowanego na nabłonek nerkowy, naukowcom nie udało się wygenerować nieprawidłowości nerek poza przednowotworowymi zmianami torbielowatymi obserwowanymi u myszy9, nawet w połączeniu z delecją innych supresorów nowotworów, takich jak PTEN i p5310. Wyniki te potwierdzają tezę, że sama utrata VHL jest niewystarczająca do nowotworzenia lub późniejszych spontanicznych przerzutów.
Niedawno, nasze laboratorium stworzyło nową linię komórkową VHL knockout (VHL-KO), wykorzystując delecję genu VHL za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w mysiej linii komórkowej VHL+ ccRCC (RENCA, lub VHL-WT)11,12. Wykazaliśmy, że VHL-KO jest nie tylko mezenchymalnym, ale także promuje przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) komórek VHL-WT12. Wiadomo, że EMT odgrywa ważną rolę w procesie przerzutowym13. Nasze prace wykazały ponadto, że odległe przerzuty do płuc występują tylko przy jednoczesnej implantacji komórek VHL-KO i VHL-WT w nerce, co wspiera kooperacyjny mechanizm przerzutów. Co ważne, nasz ortotopowo wszczepiony model VHL-KO i VHL-WT prowadzi do silnych przerzutów do płuc, podsumowując kliniczne przypadki ccRCC. Ten spontaniczny model ccRCC z przerzutami kompensuje brak transgenicznego modelu myszy z przerzutami, zwłaszcza w przypadku opracowywania nowych leków przeciwprzerzutowych. Protokół ten demonstruje implantację torebki nerkowej heterogenicznych populacji komórek genetycznie modyfikowanych komórek RENCA.
Modele CAM kurczaków mają długą historię w badaniach nad angiogenezą i biologią nowotworów ze względu na ich liczne zalety, jak podsumowano w Tabeli 114,15,16,17,18. Krótko mówiąc, okno czasowe dla wzrostu guza CAM jest krótkie, co pozwala na maksymalnie 11 dni, aż CAM zostanie zniszczony po wykluciu się kurczaka16. Pomimo krótkiego czasu wzrostu, bogate zaopatrzenie w składniki odżywcze i stan niedoboru odporności zarodka kurczaka umożliwiają bardzo skuteczne wszczepienie guza16,19,20,21. Wreszcie, koszt każdego zapłodnionego jaja wynosi ~ 1 USD, w porównaniu do ponad 100 USD za mysz SCID. Razem, model CAM może służyć jako cenny alternatywny model zwierzęcy w tworzeniu nowych PDX przy dużej oszczędności czasu i kosztów w porównaniu z myszą. W tym protokole oceniliśmy, czy model był w stanie podsumować biologię przerzutowego ccRCC obserwowaną w mysim modelu ortotopowym.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(SCID) Mysz</td>
			<td>krzywka</td>
			<td>nuta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>koszt</td>
			<td>>100 $ za sztukę</td>
			<td>~$1 za sztukę</td>
			<td>Rentowność w zakresie 50-75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potrzeba obudowy barierowej</td>
			<td>tak</td>
			<td>Nie</td>
			<td>Jeszcze bardziej obniża koszty i upraszcza seryjne monitorowanie guzów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guz widoczny bezpośrednio</td>
			<td>Nie</td>
			<td>tak</td>
			<td>Rysunek 3A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas do pierwszego wszczepienia (RENCA)</td>
			<td>2 tygodnie</td>
			<td>2-4 dni</td>
			<td>Odnośnik 14, 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punkt końcowy wzrostu (RENCA)</td>
			<td>3-6 tygodni</td>
			<td>10 dni</td>
			<td>Odnośnik 14, 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obserwowane przerzuty (RENCA)</td>
			<td>tak</td>
			<td>Tak u piskląt</td>
			<td>Rysunek 3D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przejścia szeregowe</td>
			<td>tak</td>
			<td>tak</td>
			<td>Odnośnik 16-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przejście do myszy (RENCA)</td>
			<td>tak</td>
			<td>tak</td>
			<td>Hu, J. i in. w trakcie przeglądu (2019)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utrzymuj heterogeniczność guza</td>
			<td>tak</td>
			<td>tak</td>
			<td>Hu, J. i in. w trakcie przeglądu (2019)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Zalety i ograniczenia modeli myszy i CAM. W tej tabeli porównano oba modele pod kątem ich zalet i ograniczeń pod względem wymaganego czasu, kosztów, pracy, a także biologii. Model CAM ma zalety w zakresie wydajności, ale ma również swoje unikalne ograniczenia ze względu na różną morfologię ptaków i ssaków. Dlatego ważne jest, aby potwierdzić, że model może zachować biologię ksenoprzeszczepów.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna, 0,1% EDTA w HBSS bez wodorowęglanu wapnia, magnezu i sodu</td><td>Corning</td><td>25053CI</td><td></td></tr><tr><td>8050-N/18 Micro 8V Max Zestaw narzędzi</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-VHL</td><td>Abcam</td><td>ab135576</td><td></td></tr><tr><td>BD Lo-Dose U-100 Strzykawki do insuliny</td><td>BD Biosciences</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555899</tr><tr><td>BDGogrodalne zastosowanie i igły podskórne PrecisionGlide</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td></td></tr><tr><td>DAB Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>DB801R</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Firefly, sól potasowa</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia i magnezu</td><td>Gibco</td><td>LS14190250</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK Tag Przeciwciało monoklonalne (FG4R)</td><td>eBioscience</td><td>14-6681-82</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 Proof</td><td>Cylinders Management</td><td>43196-11</td><td>Przygotuj 70% w wodzie</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, zatwierdzona przez USDA</td><td>Regiony Fisher Scientific</td><td>10-437-028</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Ostre nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterylne waciki</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-456-885</td><td></td></tr><tr><td>FisherbrandWysoka precyzja, prosta, stożkowa, ultra cienka pęseta/kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek FisherbrandPremium: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu, 4%, buforowany, pH 6,9 (ok. 10% roztworu formaliny), do histologii</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.00496.5000</td><td></td></tr><tr><td>Dostosowana strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>80408</td><td>25 i mikro; L, Model 702 SN, Grubość: 30, Styl punktu: 4, Kąt: 30, Długość igły: 17 mm</td></tr><tr><td>Przeciwciało z sondą HA (Y-11)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc805</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Hovabator Genesis 1588 Deluxe Inkubator do jaj Zestaw Combo</td><td>Magazyn</td><td>HB1588D</td><td></td></tr><tr><td>roztworem Isothesia (Isoflurane)</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>1169567762</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II System obrazowania in vivo</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR Matryca membranowa</td><td>Corning</td><td>C354230</td><td></td></tr><tr><td>Medline Zasłona na instrumenty chirurgiczne, przezroczysty klej, 24 "x 18"</td> <td>Medex Supply</td><td>MED-DYNJSD2158</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur BSA, frakcja V [albumina surowicy bydlęcej] Izolacja szoku cieplnego</td><td>MilliporeSigma</td><td>2910-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100X, 10 000 j.m. Penicylina, 10 000 ug/ml Streptomycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-33-0</td><td>Przygotuj 1% w soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>115-035-062</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodu powidonu USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Dostępny jod, do użytku laboratoryjnego</td><td>Ricca Chemical</td><td>395516</td><td></td></tr><tr><td>pSicoR</td><td>Addgene</td><td>11579</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat dichlorowodorku puromycyny, 99%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC227420500</td><td></td></tr><tr><td>Renca</td><td></td><td>ATCC CRL-2947</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X z L-Glutaminą</td><td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>Scientific 96-dołkowe płytki bez listew, niskoprofilowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0700</td><td></td></tr><tr><td>SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-200, 200 i mikro; l, 960 (10 stojaków po 96 sztuk)</td><td>Taśma</td> wysyłkowa Thomas Scientific <td>1159M40</td><td></td></tr><tr><td>, uniwersalna, 1,89" x 109,4 jarda, jasnobrązowa, opakowanie 6 rolek</td><td>Office Depot</td><td>220717</td><td></td></tr><tr><td>Szew</td><td>Ethicon</td><td>J385H</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm Przezroczysty opatrunek Oryginalny styl ramy 2 3/8" x 2 3/4"</td> <td>Moore Medical</td><td>1634</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana podkładka termiczna z kurczakiem</td><td>K& H manufacturing</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Clear Laboratory Tubing - ściana 1/4 x 3/8 x 1/16 (50 stóp)</td> <td>Tygon</td><td>AACUN017</td><td></td></tr><tr>nokaut VHL za pośrednictwem<td>VHL-KO</td><td></td><td></td><td>CRISPR/Cas9, a następnie znakowany lentiwirusowo za pomocą znakowanej flagą EGFP i lucyferazy świetlika</td></tr><tr><td>VHL-WT</td><td></td><td></td><td>Lentiviralnie znakowany fluorescencyjnym białkiem mStrawberry znakowanym HA i lucyferazem</td></tr> <tr><td>świetlikówŚwiatowy instrument precyzyjny KLESZCZE IRIS 10CM CVD SERR</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-331</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw automatycznych klipsów do ran</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td>ZESTAW</td><td></td></tr><tr><td>ACS Ksyleny (histologiczne), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td></td></tr></tbody></table>

porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Comparing Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

Przerzutowy rak jasnokomórkowy nerki (ccRCC) jest najczęstszym podtypem raka nerki. Zlokalizowany ccRCC ma korzystny wynik chirurgiczny. Jednak u jednej trzeciej pacjentów z ccRCC rozwiną się przerzuty do płuc, co wiąże się z bardzo złym wynikiem dla pacjentów. Niestety, nie jest dostępna żadna terapia dla tego śmiertelnego etapu, ponieważ molekularny mechanizm przerzutów pozostaje nieznany. Od 25 lat wiadomo, że utrata funkcji genu supresorowego guza von Hippla-Lindaua (VHL) jest patognomoniczna ccRCC. Nie stworzono jednak klinicznie istotnego transgenicznego mysiego modelu ccRCC. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie i porównanie dwóch nowo opracowanych modeli zwierzęcych dla przerzutowego ccRCC. Pierwszym z nich jest implantacja nerki w modelu mysim. W naszym laboratorium system edycji genów CRISPR został wykorzystany do wyeliminowania genu VHL w kilku liniach komórkowych RCC. Ortotopowa implantacja heterogenicznych populacji ccRCC do torebki nerkowej stworzyła nowe modele ccRCC, które rozwijają silne przerzuty do płuc u myszy immunokompetentnych. Drugim modelem jest system błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka (CAM). W porównaniu z modelem myszy, ten model jest bardziej czasochłonny, pracochłonny i opłacalny. Model ten wspierał również solidne tworzenie guza i wewnątrznaczynienie. Ze względu na krótki, 10-dniowy okres wzrostu guza w CAM, nie zaobserwowano jawnych przerzutów metodą immunohistochemiczną (IHC) w pobranych tkankach zarodka. Jednak, gdy wzrost guza został przedłużony o dwa tygodnie u wyklutego kurczaka, mikroprzerzutowe zmiany ccRCC zaobserwowano przez IHC w płucach. Te dwa nowatorskie modele przedkliniczne będą przydatne do dalszego badania mechanizmu molekularnego stojącego za przerzutami, a także do ustanowienia nowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) w celu opracowania nowych metod leczenia przerzutowego ccRCC.

Każdy eksperyment przeprowadzono co najmniej 3x, chyba że zaznaczono inaczej. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Istotność statystyczną określano za pomocą sparowanego testu t Studenta w przypadku dwóch grup lub jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) w przypadku trzech lub więcej grup. Do ustalenia istotności przyjęto próg wartości p wynoszący 0,05.
Ortotopowo wszczepione komórki RENCA pomyślnie r...

Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Metastatic clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common subtype of kidney cancer. Localized ccRCC has a favorable surgical outcome. However, ...

Rak jasnokomórkowy nerki lub CCRCC jest najczęstszym podtypem raka nerki. Lokalizacja CCRCC ma korzystny wynik w przypadku operacji. Jednak u jednej trzeciej pacjentów z CCRCC rozwiną się odległe przerzuty do płuc.Prowadzi to do bardzo złych wyników dla pacjentów. Niestety, nie jest dostępna żadna terapia dla tego śmiertelnego etapu. Ponieważ molekularny mechanizm przerzutów pozostaje aluzyjny.Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie i porównanie dwóch niedawno opracowanych modeli zwierzęcych dla CCRCC z przerzutami. Pierwszym modelem jest mysz z tematu implantacji. W tym modelu mysim heterogeniczny CCRCC jest wszczepiany do torebki nerkowej myszy.Wzrost guza i przerzuty są korzystne po 10 tygodniach. Drugim modelem jest model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka lub model CAM. W tym modelu kurczaka heterogeniczny CCRCC jest zagnieżdżany w jaju.Wzrost guza i krążące komórki nowotworowe są aktywne po 10 dniach od implantacji, zanim zarodek się wykluje. Przerzuty do płuc są możliwe po 24 dniach od implantacji. Czyli dwa tygodnie po wykluciu.Te dwa nowatorskie modele będą przydatne do dalszych badań nad mechanizmem molekularnym stojącym za przerzutami w CCRCC. Należy pamiętać, że procedura CAM nie jest przedstawiona w tym filmie. Szczegółowy protokół dla modelu CAM został opisany i sfilmowany w innym artykule Trove autorstwa Sharrowa i wsp.Po znieczuleniu myszy należy całkowicie zdezynfekować grzbiet myszy za pomocą jodu powidonu trzy razy. Następnie raz dodaj 70% ethnol i wytrzyj go do sucha sterylnymi wacikami. Następnie nałóż trzy sterylne opatrunki medyczne kolejno pokrywające całe plecy w celu stworzenia pola operacyjnego, a także unieruchomienia myszy.Przed operacją operatorzy powinni zdezynfekować palce powidonem. Umieść mysz w pozycji leżącej. I użyj palców, aby zlokalizować lewą nerkę tuż pod lewym bokiem.Użyj kleszczy i nożyczek, aby rozciąć warstwę skóry i mięśni w określonym miejscu. Użyj sterylnych bawełnianych wacików i kleszczyków, aby częściowo usunąć lewą nerkę z jamy brzusznej. Załaduj strzykawkę insulinową lub niestandardową strzykawkę Hamiltona z przygotowaną oddzielnie zawiesiną komórek nowotworowych.Wstrzyknąć 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej pod kapsułkę nerkową. Powoli wyciągnij igłę, aby zestalić roztwór macierzy pozakomórkowej. A także w celu zapobiegania krwotokowi lub wyciekowi komórek nowotworowych.A następnie użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby wepchnąć nerkę z powrotem do brzucha. Użyj szwu, aby zszyć warstwę mięśniową. Zdezynfekuj skórę jodowidonem.I zamknij skórę za pomocą automatycznych klipsów do ran. Ortotopowe komórki nowotworowe z powodzeniem rosły na nerce myszy, co potwierdzono za pomocą BLI. Chociaż nie było różnicy w pierwotnym wzroście, tylko heterogenny guz przerzutowy miał silne przerzuty do płuc.Przerzuty zostały również potwierdzone przez immunohistochemię. Podobnie, liczba krążących komórek nowotworowych była wyższa u myszy z guzem przerzutowym niż u myszy z guzem bez przerzutów. Zgodnie z modelem mysim, model CAM również nie wykazał różnicy we wzroście między guzami przerzutowymi i nieprzerzutowymi.Z drugiej strony liczba krążących komórek nowotworowych była znacznie wyższa w jajach z guzami przerzutowymi. Wykrywalne histologicznie przerzuty zaobserwowano w płucach wyklutych kurcząt. Podsumowując, w protokole tym zilustrowano dwa nowe modele zwierzęce dla przerzutowego CCRCC.Zarówno model myszy, jak i kurczaka wiernie odwzorowywały przerzuty do płuc obserwowane w klinice. Te dwa modele przedkliniczne będą przydatne do poszerzenia wiedzy na temat mechanizmu molekularnego stojącego za przerzutami. A także odkrycie nowych metod leczenia przerzutowego CCRCC.

comparing-metastatic-clear-cell-renal-cell-carcinoma-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

W tym filmie opisujemy wszczepianie komórek rakowych na błonę kosmówkowo-omoczniową kurczaka w celu wygenerowania modelu in ovo. Model z powodzeniem wszczepia komórki raka jajnika w celu zbadania progresji raka ginekologicznego.

Modelowanie raka błony moczowo-omoczniowej kurczaka: model in ovo do badania nowotworzenia i przerzutów komórek rakowych

Ten film demonstruje procedurę dożylnego wstrzykiwania komórek rakowych do naczyń krwionośnych błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu wygenerowania modelu przerzutów raka CAM. Wstrzyknięte komórki ostatecznie tworzą rozproszone kolonie pojedynczych komórek nowotworowych, co pozwala na badanie inwazji raka i przerzutów.

Dożylne wstrzyknięcie komórek rakowych do naczyń błony moczowo-omoczniowej kurczaka: procedura mająca na celu ustalenie modelu raka błony moczowo-omoczniowej w celu zbadania inwazji raka i przerzutów

W tym filmie opisujemy izolację przerzutowych kolonii komórek rakowych z błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) kurczaka przy użyciu hodowli jaj bez skorupy. Ta metoda pomaga w badaniach przesiewowych pod kątem czynników, które mogą być odpowiedzialne za przerzuty raka.

Izolacja kolonii komórek rakowych z kurczaka CAM: procedura izolowania komórek rakowych z kultur jaj bez skorupek

W tym filmie rozwijamy ortotopowy mysi model raka nerkowokomórkowego. Model ten skutkuje powtarzalnymi guzami pierwotnymi w wstrzykniętej nerce i przerzutami w płucach, co pozwala na ocenę postępu choroby i leczenia.

Generowanie modelu raka nerkowokomórkowego: protokół rozwoju ortotopowego mysiego modelu RCC poprzez donerkową implantację komórek rakowych

Modele spontanicznej progresji choroby raka nerkowokomórkowego z przerzutami (RCC) mogą być używane do oceny leczenia w klinicznie istotnych warunkach. Protokół ten demonstruje różne procedury ortotopowej implantacji komórek nowotworowych nerki, prawidłowej nefrektomii, a na koniec przedstawia przewodnik po sekcji zwłok do wizualnej i bioluminescencyjnej oceny obciążenia i lokalizacji przerzutów.

Modelowanie spontanicznego przerzutowego raka nerkowokomórkowego (mRCC) u myszy po nefrektomii

Ludzkie komórki szpiczaka mnogiego (MM) wymagają wspierającego mikrośrodowiska komórek mezenchymalnych i składników macierzy zewnątrzkomórkowej do przetrwania i proliferacji. Stworzyliśmy model zarodka kurczaka in vivo z wszczepionym ludzkim szpiczakiem i komórkami mezenchymalnymi, aby zbadać wpływ leków przeciwnowotworowych na wzrost, inwazję i angiogenezę guza.

Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza

Implementacja ortotopowego modelu raka nerkowokomórkowego u myszy immunokompetentnych daje badaczowi klinicznie istotny system zdefiniowany przez obecność pierwotnego guza nerki i przerzutów do płuc u tego samego zwierzęcia. System ten może być stosowany do przedklinicznego testowania różnych metod leczenia in vivo.

Syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych

Inwazja okołonerwowa jest agresywnym fenotypem dla raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz innych nowotworów. Model błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia został wykorzystany do badania angiogenezy, inwazji raka i przerzutów. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ten model można wykorzystać do oceny inwazji okołonerwowej in vivo.

Błona naczyniówkowo-omocznaniowa piskląt w modelu in vivo do oceny inwazji okołonerwowej w raku głowy i szyi

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Poznaj dwa nowe modele zwierzęce przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki: implantację ortotopową u myszy oraz model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka. Oba modele wiernie odwzorowują przerzuty płucne obserwowane klinicznie.

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Przeglądaj więcej filmów