Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka
8 lutego 2020
Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.
Rak jasnokomórkowy nerki lub CCRCC jest najczęstszym podtypem raka nerki. Lokalizacja CCRCC ma korzystny wynik w przypadku operacji. Jednak u jednej trzeciej pacjentów z CCRCC rozwiną się odległe przerzuty do płuc.
Prowadzi to do bardzo złych wyników dla pacjentów. Niestety, nie jest dostępna żadna terapia dla tego śmiertelnego etapu. Ponieważ molekularny mechanizm przerzutów pozostaje aluzyjny.
Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie i porównanie dwóch niedawno opracowanych modeli zwierzęcych dla CCRCC z przerzutami. Pierwszym modelem jest mysz z tematu implantacji. W tym modelu mysim heterogeniczny CCRCC jest wszczepiany do torebki nerkowej myszy.
Wzrost guza i przerzuty są korzystne po 10 tygodniach. Drugim modelem jest model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka lub model CAM. W tym modelu kurczaka heterogeniczny CCRCC jest zagnieżdżany w jaju.
Wzrost guza i krążące komórki nowotworowe są aktywne po 10 dniach od implantacji, zanim zarodek się wykluje. Przerzuty do płuc są możliwe po 24 dniach od implantacji. Czyli dwa tygodnie po wykluciu.
Te dwa nowatorskie modele będą przydatne do dalszych badań nad mechanizmem molekularnym stojącym za przerzutami w CCRCC. Należy pamiętać, że procedura CAM nie jest przedstawiona w tym filmie. Szczegółowy protokół dla modelu CAM został opisany i sfilmowany w innym artykule Trove autorstwa Sharrowa i wsp.
Po znieczuleniu myszy należy całkowicie zdezynfekować grzbiet myszy za pomocą jodu powidonu trzy razy. Następnie raz dodaj 70% ethnol i wytrzyj go do sucha sterylnymi wacikami. Następnie nałóż trzy sterylne opatrunki medyczne kolejno pokrywające całe plecy w celu stworzenia pola operacyjnego, a także unieruchomienia myszy.
Przed operacją operatorzy powinni zdezynfekować palce powidonem. Umieść mysz w pozycji leżącej. I użyj palców, aby zlokalizować lewą nerkę tuż pod lewym bokiem.
Użyj kleszczy i nożyczek, aby rozciąć warstwę skóry i mięśni w określonym miejscu. Użyj sterylnych bawełnianych wacików i kleszczyków, aby częściowo usunąć lewą nerkę z jamy brzusznej. Załaduj strzykawkę insulinową lub niestandardową strzykawkę Hamiltona z przygotowaną oddzielnie zawiesiną komórek nowotworowych.
Wstrzyknąć 20 mikrolitrów zawiesiny komórkowej pod kapsułkę nerkową. Powoli wyciągnij igłę, aby zestalić roztwór macierzy pozakomórkowej. A także w celu zapobiegania krwotokowi lub wyciekowi komórek nowotworowych.
A następnie użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby wepchnąć nerkę z powrotem do brzucha. Użyj szwu, aby zszyć warstwę mięśniową. Zdezynfekuj skórę jodowidonem.
I zamknij skórę za pomocą automatycznych klipsów do ran. Ortotopowe komórki nowotworowe z powodzeniem rosły na nerce myszy, co potwierdzono za pomocą BLI. Chociaż nie było różnicy w pierwotnym wzroście, tylko heterogenny guz przerzutowy miał silne przerzuty do płuc.
Przerzuty zostały również potwierdzone przez immunohistochemię. Podobnie, liczba krążących komórek nowotworowych była wyższa u myszy z guzem przerzutowym niż u myszy z guzem bez przerzutów. Zgodnie z modelem mysim, model CAM również nie wykazał różnicy we wzroście między guzami przerzutowymi i nieprzerzutowymi.
Z drugiej strony liczba krążących komórek nowotworowych była znacznie wyższa w jajach z guzami przerzutowymi. Wykrywalne histologicznie przerzuty zaobserwowano w płucach wyklutych kurcząt. Podsumowując, w protokole tym zilustrowano dwa nowe modele zwierzęce dla przerzutowego CCRCC.
Zarówno model myszy, jak i kurczaka wiernie odwzorowywały przerzuty do płuc obserwowane w klinice. Te dwa modele przedkliniczne będą przydatne do poszerzenia wiedzy na temat mechanizmu molekularnego stojącego za przerzutami. A także odkrycie nowych metod leczenia przerzutowego CCRCC.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia dwa nowe modele zwierzęce dla przerzutowego jasnokomórkowego raka nerki (CCRCC), odpowiadając na brak kompleksowych modeli do badań przedklinicznych. Modele obejmują model mysi z implantacją ortotopową oraz model błony chorioallantoicznej kurczaka; oba wykazują przerzuty do płuc podobne do przypadków klinicznych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Modele zwierzęce
- Badania nad przerzutami
Wstęp
- Jasnokomórkowy rak nerki (CCRCC) jest najczęstszym podtypem raka nerki.
- Zlokalizowany CCRCC rokuje pomyślnie po zastosowaniu leczenia chirurgicznego.
- U jednej trzeciej pacjentów z CCRCC rozwija się przerzut nowotworu do odległych narządów, w szczególności do płuc.
- Obecnie nie istnieje skuteczna terapia dla tego zaawansowanego stadium choroby.
Cel badania
- Opracowanie i walidacja nowych modeli zwierzęcych do badania przerzutów CCRCC.
- Ułatwienie badań przedklinicznych nad mechanizmami rozwoju choroby.
- Poprawa zrozumienia procesu przerzutowania do płuc w przypadku CCRCC.
Zastosowane metody
- Ortotopowa implantacja komórek nowotworowych u myszy.
- Wykorzystanie modelu błony chorioallantoicznej kurczaka.
- Obserwacja rozwoju przerzutów do płuc w obu modelach.
- Porównanie wyników modeli z przypadkami klinicznymi.
Główne wyniki
- W obu modelach zwierzęcych pomyślnie wykazano przerzuty do płuc.
- Modele te ściśle odpowiadają klinicznym przypadkom CCRCC.
- Modele te stanowią platformę do dalszych badań nad strategiami terapeutycznymi.
- Uzyskano wgląd w molekularne mechanizmy przerzutowania.
Wnioski
- Nowo opracowane modele są wartościowe w badaniach przedklinicznych nad CCRCC.
- Umożliwiają one lepsze zrozumienie procesów przerzutniczych w raku nerki.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać te modele do eksploracji potencjalnych terapii.
Często zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Przerzutowy jasnokomórkowy rak nerki (ccRCC) wciąż stanowi istotne wyzwanie terapeutyczne ze względu na brak skutecznych metod leczenia oraz niewystarczającą wiedzę na temat mechanizmów przerzutowania. Opisane modele ortotopowe u myszy oraz model błony chorioallantoidalnej (CAM) u kurcząt stanowią komplementarne systemy przedkliniczne do badania przerzutów do płuc, umożliwiając walidację celów terapeutycznych i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania leków. Modele te zwiększają pewność prognostyczną w rozwoju terapii poprzez odtwarzanie klinicznych wzorców przerzutowania w immunokompetentnych i kosztowo efektywnych platformach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie potencjału nowotworowego i przerzutowego napędzanego przez utratę VHL w heterogenicznych populacjach ccRCC.
- Wartość operacyjna: Ortotopowa implantacja u immunokompetentnych myszy pozwala zachować interakcje między guzami a zrębem, które są kluczowe dla walidacji celu.
- Wartość naukowa: Ułatwia funkcjonalną walidację genów i szlaków związanych z przerzutowaniem poprzez testy kolonizacji płuc in vivo.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnej liczby krążących komórek nowotworowych (CTC) jako odczytu farmakodynamicznego podczas przesiewu związków.
- Wartość operacyjna: Model CAM zapewnia szybki i kosztowo efektywny wzrost guza (10 dni), co ułatwia standaryzację wysokoprzepustowych analiz.
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę intrawazacji poprzez detekcję CTC zarówno w systemach mysich, jak i CAM, co pozwala na wczesną ewaluację badanych związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modele odtwarzają kliniczne przerzuty do płuc, zapewniając systemy istotne dla przebiegu choroby w celu odkrywania i walidacji biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Rozszerzony model CAM u inkubowanych kurcząt (24 dni) umożliwia wykrywanie mikroprzerzutów za pomocą immunohistochemii w badaniach podłużnych.
- Wartość naukowa: Wspiera tworzenie ksenotransplantatów pochodzących od pacjentów (PDX) z heterogenicznych populacji nowotworowych w celu zachowania ciągłości przedklinicznej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Modele te integrują poszczególne etapy procesu odkrywania: ortotopowe modele mysie służą do weryfikacji hipotez i walidacji szlaków we wczesnej fazie odkrywania, podczas gdy CAM umożliwia szybki rozwój testów i przygotowanie do skriningu. Oba systemy generują dane ilościowe, takie jak masa guza, poziom CTC oraz kwantyfikacja ognisk przerzutowych, co pozwala na podejmowanie decyzji go/no-go. Modele te pełnią rolę wielokrotnego użytku platform do ograniczania ryzyka związanego z celami terapeutycznymi i dostrajania translacyjnych biomarkerów, redukując ryzyko biologiczne w procesie identyfikacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Walidacja celów terapeutycznych poprzez ocenę wzrostu guza i przerzutów do płuc u gospodarzy immunokompetentnych.
- Przesiewanie: Zapewnienie zestandaryzowanych, powtarzalnych systemów do monitorowania farmakodynamiki w oparciu o CTC w kampaniach przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwienie ilościowego porównania obciążenia przerzutowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) i odczytów immunohistochemicznych (IHC).
- Badania translacyjne: Powiązanie etapu odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez heterogeniczne modele nowotworowe kompatybilne z PDX.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie skalowalnej, międzyplatformowej możliwości generowania modeli przerzutowych w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechaniczną w badaniach nad przerzutami poprzez dostarczenie klinicznie istotnych modeli przerzutów do płuc.
- Wartość operacyjna: Model CAM skraca czas, zmniejsza nakład pracy i koszty w porównaniu z tradycyjnymi modelami mysimi, zapewniając jednocześnie trwałe tworzenie się nowotworu i intrawasację.
- Wartość strategiczna: Usprawnia selekcję portfolio poprzez umożliwienie wczesnej oceny potencjału przerzutowego i skuteczności terapeutycznej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko dzięki ilościowym punktom końcowym przerzutowania w walidacji przedklinicznej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w ortotopowych technikach chirurgicznych oraz w przygotowaniu komórek nowotworowych do implantacji w modelu mysim.
- Procedury na myszach są zależne od sterylnej infrastruktury chirurgicznej oraz protokołów znieczulenia.
- Wykonanie modelu CAM wymaga dostępu do zarodkowych jaj oraz urządzeń inkubacyjnych.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania zawiesiny komórek nowotworowych oraz objętości wstrzykiwanych dawek (20 µL) we wszystkich modelach.
- Wykrywanie przerzutów opiera się na walidacji histopatologicznej za pomocą BLI i IHC, co wymaga dostępu do zasobów obrazowania i patomorfologii.
