Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Nasz protokół pokonuje ograniczone okno obrazowania bioluminescencyjnego, dołączając znacznik GFP, który ułatwia również wykrywanie i ilościowe określanie mikroprzerzutów za pomocą analizy PCR. Ponieważ znacznik GFP omija ograniczone okno akwizycji bioluminescencji, można zobrazować więcej obiektów bez utraty sygnału, a potencjał wyników fałszywie ujemnych jest ograniczony. Badanie to będzie przydatne dla naukowców w ocenie skuteczności terapeutycznej środków przeciwnowotworowych.

Metodologia ta stanowi użyteczny model dla naukowców zainteresowanych EMT, opornością na leki i mechanizmami nowotworowych komórek macierzystych związanych z procesem przerzutowym, a także dla opracowywania leków przeciwnowotworowych. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, przetrzyj lewy czwarty gruczoł sutkowy alkoholem i użyj cienkich kleszczyków do zębów szczura, aby lekko podnieść czwarty gruczoł sutkowy. Upewniając się, że końcówka jest ścięta do góry, włóż igłę o rozmiarze 25 dołączoną do jednomililitrowej strzykawki zawierającej 100 mikrolitrów mieszanki matrycy błony podstawnej komórek i lekko cofnij tłok, aby upewnić się, że igła nie styka się z żadnymi naczyniami krwionośnymi.

Aby uzyskać wyniki porównawcze, miejsce wstrzyknięcia komórki nowotworowej musi być takie samo u wszystkich zwierząt biorcy. Jeśli krew nie dostanie się do strzykawki, powoli wstrzyknij całą objętość roztworu do poduszeczki tłuszczowej sutka. Pod skórą pojawi się okrągła, wypukła masa.

Odczekaj od 10 do 15 sekund, aż matryca błony podstawnej stwardnieje przed usunięciem igły i pozwól ksenoprzeszczepowi swobodnie rosnąć bez przerwy przez siedem do 10 dni przed wykonaniem pomiaru wielkości guza. Następnie użyj suwmiarki, aby zmierzyć rozmiar ksenoprzeszczepu u wszystkich myszy i określić objętość guza, korzystając z równania, jak wskazano. Przed obrazowaniem badanych zwierząt należy wyobrazić trzy dodatkowe myszy z guzem przez 40 minut w dwuminutowych odstępach, używając parametrów wskazanych, aby uzyskać kinetykę lucyferyny do badania.

Użyj zmierzonego sygnału bioluminescencji szczytowej, aby zdefiniować optymalne okno czasowe akwizycji obrazu dla wszystkich kolejnych punktów czasowych. Aby wykonać obrazowanie przerzutów, przykryj guz pierwotny rękawem wyciętym z czarnej rękawicy i umieść znieczuloną mysz w skanerze, a następnie zobrazuj sygnał lucyferyny przy użyciu tych samych parametrów, jak właśnie pokazano z brzuszną stroną myszy skierowaną w stronę kamery do obrazowania przerzutów do płuc i grzbietową stroną myszy skierowaną w stronę kamery do obrazowania przerzutów do mózgu. Korzystając ze skanera i oprogramowania do analizy danych, narysuj obszar zainteresowania na obrazowanym obszarze, aby upewnić się, że cały narząd zainteresowania jest pokryty, aby umożliwić ocenę obciążenia przerzutami i określić ilościowo moc bioluminescencji jako całkowity strumień i fotony na sekundę.

Natychmiast po kwantyfikacji sygnału bioluminescencji należy pobrać tkankę mózgową i płucną i szybko przepłukać narządy w PBS, aby usunąć wszelkie powierzchowne plamy krwi. Umieść narządy na czarnej plastikowej płytce o niskiej autofluorescencji i przetransportuj próbki do wielospektralnego skanera fluorescencyjnego wyposażonego w funkcję rozmieszania widmowego w celu wykrycia GFP. Aby uzyskać wielospektralne obrazy GFP pobranych narządów, należy zeskanować narządy w odległości od 500 do 720 nanometrów z krokiem o wielkości 10 nanometrów.

Aby uzyskać profil autofluorescencji tkanek, należy zeskanować wycięte narządy myszy kontrolnych, którym nie wstrzyknięto. Dodatkowo zobrazuj tkanki GFP dodatnie, takie jak guz pierwotny, aby uzyskać mieszany profil GFP autofluorescencji. Przetwarzaj te widma zgodnie z protokołem producenta, aby utworzyć bibliotekę spektralną z czystym GFP i profilami automatycznej fluorescencji.

Po potwierdzeniu dokładności biblioteki spektralnej i oddzieleniu sygnału GFP od tła autofluorescencji tkankowej, użyj tej samej biblioteki do rozmieszania wszystkich obrazów podczas badania. W celu ekstrakcji DNA po szybkim zamrożeniu umieść cały mózg w pięciomililitrowej probówce homogenizującej zawierającej dwa mililitry buforu do lizy DNA i użyj homogenizatora ustawionego na 50 do homogenizacji tkanki. Gdy tkanka zostanie w pełni zhomogenizowana, przenieś jeden mililitr lizatu do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej wolnej od DNAzy i RNAZ i wyizoluj DNA zgodnie z protokołem producenta.

Dodać 500 mikrolitrów 100% etanolu do izolatu i wymieszać próbkę przez inwersję. Po trzech minutach w temperaturze pokojowej za pomocą pipety przenieś wełnisty osad DNA do nowej probówki wolnej od dwumililitrowej DNAzy i RNAzy. Pozostaw próbkę do wyschnięcia na powietrzu przez minutę przed dodaniem jednego mililitra 75% etanolu do probówki i odwróceniem probówki trzy do sześciu razy w celu umycia próbki.

Wyrzuć etanol po ostatniej inwersji przed przemyciem DNA jeszcze dwa razy świeżym etanolem na pranie, jak właśnie pokazano. Po ostatnim praniu wysuszyć próbkę na powietrzu przez 10 sekund przed rozpuszczeniem DNA w 52 mikrolitrach ośmiomilimolowego wodorotlenku sodu. Przenieść dwulitrową porcję DNA do fiolki ze spektrofotometrem i określić ilościowo stężenie DNA w próbce, stosując stosunek absorbancji między A260 a 280 zgodnie ze wzorem.

Dostosuj stężenie DNA w próbce do 50 nanogramów na mikrolitr z dodatkowymi ośmiomilimolowymi wodorotlenkami sodu i zaprojektuj parę starterów specyficzną dla egzogennej zielonej sekwencji GFP we własnym zakresie, korzystając z portalu internetowego do projektowania starterów typu open source do wykrywania PCR w czasie rzeczywistym znacznika GFP i komórek przerzutowych, które zaatakowały i skolonizowały dystalne miejsca guza. Następnie użyj szybkiego odczynnika do PCR w czasie rzeczywistym i maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, która obsługuje szybki protokół PCR w czasie rzeczywistym do ilościowej analizy PCR próbki w czasie rzeczywistym. W celu wykrycia przerzutowych komórek raka piersi w płucach użyj nożyczek preparacyjnych, aby otworzyć jamę klatki piersiowej i przeciąć obok serca i grasicy, aby odsłonić tchawicę.

Wprowadzić do tchawicy igłę o rozmiarze 22 dołączoną do 10-mililitrowej strzykawki zawierającej roztwór Bouina i naciskać tłok, aż zapadnięte płuca staną się spuchnięte około dwoma mililitrami roztworu. Wyjąć strzykawkę i igłę, gdy płuca zostaną napompowane i przenieść całe płuco do 15-mililitrowej probówki zawierającej świeży roztwór Bouina. Delikatnie odwróć probówkę kilka razy przed pozostawieniem chusteczki do namoczenia przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia przepłucz płuca wodą i umieść próbkę w probówce z 70% etanolem. Następnie użyj mikroskopu preparacyjnego, aby policzyć liczbę przerzutowych białych plam i guzków na powierzchni płuc. Pomiar objętości guza za pomocą suwmiarki jest dobrze znaną metodą oceny skuteczności leczenia.

Aby uzyskać porównywalne sygnały między grupami badawczymi, należy przeprowadzić badanie kinetyki BLI przed obrazowaniem w celu określenia najlepszych ram czasowych obrazowania. Ze względu na lepszy stosunek sygnału do tła, BLI całego ciała in vivo jest dość czuły w wykrywaniu sygnałów przerzutów o niskim poziomie w porównaniu z podejściem GFP. Jednak ze względu na stabilny charakter cząsteczki GFP, naukowcy mają wystarczająco dużo czasu na przetworzenie tuszy przed wychwyceniem sygnałów GFP z narządów docelowych w badaniach z podwójnym reporterem.

Ten przykład z życia wzięty pokazuje, w jaki sposób pomiary wielkości guza suwmiarki mogą zniekształcić interpretację danych, ponieważ ten ksenoprzeszczep stracił większość zawartości żywotnych komórek nowotworowych, zachowując jednocześnie swoją dużą masę i kształt. Wykrywanie molekularne za pomocą PCR w czasie rzeczywistym może również dostarczyć przekonujących dowodów na przerzuty do mózgu w ortotopowym modelu raka piersi przy użyciu egzogennego sekwencjonowania DNA GFP, ponieważ transfekowana sekwencja DNA GFP nie występuje naturalnie u ludzi ani gryzoni. Miejsce implantacji powinno być fizjologicznie i anatomicznie związane z nowotworem złośliwym.

Zarówno ekspresję genu nowotworowego, jak i białka można ocenić w miejscach pierwotnych i dystalnych, a komórki przerzutowe można wyizolować w celu dalszej charakterystyki.