Zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie

Zastosowanie tego systemu hodowli komórek śródbłonka umożliwia przyswojenie sytuacji w przepływie krwi. W tej sytuacji możemy analizować procesy infekcji bakteryjnych, w tym również identyfikację wektorów bakteryjnych, a także wektorów komórkowych, które są zaangażowane w ten proces. Technika ta toruje drogę do zbadania wpływu infekcji bakteryjnych na integralność naczyń krwionośnych, w tym również wpływu na mechanizmy morfogenezy, reakcje zapalne i regulację immunologiczną.

Technika ta wymaga specjalnego obchodzenia się z komórkami śródbłonka i dlatego opis wizualny jest lepszy niż tylko słowne wyjaśnienie. Metoda ta zapewnia wgląd w kilka innych obszarów badań skorelowanych z perfundowanymi układami naczyniowymi, takich jak różnicowanie komórek śródbłonka, gojenie się ran, geneza guza i angiogeneza. Jednym z kluczowych kroków jest standaryzowana hodowla komórek, a także dokładna obsługa pierwotnych komórek śródbłonka.

Technika ta wymaga specjalnego obchodzenia się z kulturą komórkową, której nie można wyjaśnić tylko słownie. Na początek pracuj w sterylnym środowisku, korzystając z czystej ławki. Za pomocą pipety wstrzyknąć 100 mikrolitrów 2% sterylnego, przefiltrowanego roztworu PBS żelatyny wieprzowej do pojedynczego zbiornika szkiełka kanałowego o zrównoważonej temperaturze.

Umieść pokrytą żelatyną szkiełko kanałowe na cienkiej płytce z polistyrenu lub styropianu, aby zapobiec spadkowi temperatury szkiełka, za pomocą jednomililitrowej strzykawki Luer, aby dodać 100 mikrolitrów czterokrotnej zawiesiny HUVEC razy 10 do piątej na mililitr na mililitr do szkiełka w celu wysiewu i uprawy HUVEC. Inkubuj szkiełko kanałowe za pomocą HUVEC przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie napełnij każdy zbiornik pożywki na obu końcach zjeżdżalni kanałowej 60 mikrolitrami pożywki ECGMS.

Inkubuj przez kolejną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie, aby wyregulować pompę mikroprzepływową, najpierw podłącz zestaw do perfuzji zrównoważonej do zespołu pompy, napełnij 13,6 mililitra pożywki ECGMS i uruchom oprogramowanie sterujące pompą. W menu ustawień zespołu fluidycznego wybierz odpowiedni zestaw perfuzyjny i typ szkiełka komorowego za pomocą przewijanych okien

Wybierz 0,007 sekundy dyny na centymetr kwadratowy w oprogramowaniu dla średniej lepkości. Na zewnątrz inkubatora podłącz szklaną butelkę wypełnioną suszącymi kulkami krzemionki do rurki ciśnieniowej. Wybierz parametry przepływu w menu oprogramowania, ustaw ciśnienie na 40 milibarów i przepłucz rurki pompy płynnym medium, uruchamiając ciągły przepływ medium.

Zapewniamy szczelne przyleganie ogniw poprzez zastosowanie subkonfluentnie hodowanych HUVEC, a dodatkowo skupiamy się na usuwaniu pęcherzyków powietrza z systemu, a także korzystamy z niezależnego zasilania układu pompowego. Dotknij połączeń przewodów, aby usunąć pęcherzyki powietrza i upewnić się, że w układzie pompy nie krążą żadne pęcherzyki powietrza. Aby podłączyć suwak kanałowy, zatrzymaj cyrkulację przepływu w oprogramowaniu sterującym pompą i przytrzymaj przepływ medium i rurkę perfuzyjną, zaciskając rurki w pobliżu przyłącza Luer.

Podłącz suwak kanału, unikając w ten sposób pęcherzyków powietrza. Na karcie zaawansowane oprogramowania sterującego pompą użyj kreatora cykli narzędzia programowego, aby zaprogramować żądane cykle naprężeń ścinających dla uprawy przepływu. Zaprogramuj poziomy naprężeń ścinających dla cyrkulacji przepływu i rozpocznij długotrwałą perfuzję.

Zacznij od pięciu dyn na centymetr kwadratowy, co odpowiada natężeniu przepływu 5,44 mililitra na minutę przez 30 minut, a następnie ciągły przepływ przy naprężeniu ścinającym 10 dyna na centymetr kwadratowy, co odpowiada natężeniu przepływu 10,85 mililitra na minutę. Kontroluj zrównoważone pompowanie w zbiorniku. Umieść jednostkę fluidyczną z podłączonym szkiełkiem kanałowym w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Uruchom sterowanie oprogramowaniem mikroskopu i dostosuj podstawowe ustawienia monitorowania mikroskopu fluorescencyjnego, wybierając odpowiednie ustawienia filtra. W celu wizualizacji mikroskopowej umieść jednostkę fluidyczną w komorze grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść szkiełko kanałowe na stoliku wstępnie rozgrzanego mikroskopu.

Kontroluj morfologię komórek i integralność warstwy HUVEC przed wstrzyknięciem histaminy i bakterii do krążenia przepływowego. Utrzymuj ustawienie przepływu. Indukować uwalnianie VWF z żywotnych śródbłonka ciał Palade poprzez wstrzyknięcie 136 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu podstawowego histaminy przez port iniekcyjny do pożywki ECGMS krążącej w rurkach perfuzyjnych.

W celu immunofluorescencyjnego wykrywania multimeryzowanych ciągów VWF należy wstrzyknąć 20 mikrogramów skoniugowanego przeciwciała FITC specyficznego dla VWF w objętości 200 mikrolitrów PBS do krążących 13,6 mililitrów pożywki ECGMS. Aby określić ilościowo przyłączanie pneumokoków do ciągów VWF generowanych na powierzchniach komórek HUVEC, należy wstrzyknąć 1,35 razy 10 do ósmej CFU na mililitr RFP wyrażającej pneumokoki w maksymalnej objętości jednego mililitra do pożywki ECGMS za pomocą portu iniekcyjnego. Wybierz obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 63X do powiększenia mikroskopu i dostosuj ustawienia filtra fluorescencyjnego w oprogramowaniu mikroskopu do kanału RFP z filtrem detekcyjnym 540 nanometrów do wykrywania zapytania ofertowego wyrażającego pneumokoki.

W celu ilościowego określenia przyczepiania się bakterii do ciągów VWF, należy utworzyć migawki stosów Z z co najmniej 30 reprezentatywnych widoków pola, z których każdy zawiera około 10 morfologicznie nienaruszonych HUVEC i policzyć ilość pneumokoków. Aby ocenić przyczepienie się bakterii po utrwaleniu przed barwieniem immunofluorescencyjnym, zatrzymaj przepływ, usuń 10 mililitrów pożywki ECGMS ze zbiorników pompy i dodaj 10 mililitrów PBS uzupełnionego 5% paraformaldehydem i postępuj zgodnie z manuskryptem. W tym protokole główne etapy eksperymentalne rozpoczynają się od wstępnej hodowli pierwotnych komórek śródbłonka do subkonfluencji w kolbach do hodowli komórkowych.

Komórki są następnie wysiewane do szkiełka kanałowego pokrytego żelatyną. Bakterie są hodowane na płytkach agarowych, a następnie hodowane w złożonej płynnej pożywce do środkowej fazy logarytmicznej. W przypadku hodowli komórek mikroprzepływowych szkiełko kanałowe z komórkami śródbłonka jest połączone z rurkami perfuzyjnymi jednostki płynowej systemu pompowego i poddawane stałemu przepływowi w celu różnicowania komórek.

Wytwarzanie strun VWF indukowano przez wstrzyknięcie histaminy przy naprężeniu ścinającym 10 sekund dyn na centymetr kwadratowy i monitorowano mikroskopowo za pomocą detekcji immunofluorescencyjnej przy użyciu przeciwciał specyficznych dla VWF znakowanych FITC. Po wstrzyknięciu białka czerwonej fluorescencji wykazującego ekspresję bakterii do krążącego podłoża, przyłączenie Pneumokoków do strun VWF zostało mikroskopowo zwizualizowane w czasie rzeczywistym poprzez emisję fluorescencji na głębokości 450 nanometrów. Po utrwaleniu komórek za pomocą PFA, barwienie immunofluorescencyjne różnicowe zapewnia wizualizację przyczepienia się bakterii w określonych punktach czasowych infekcji.

Najważniejszym krokiem tej procedury jest zapewnienie szczelnego mocowania komórek na powierzchni suwaka poprzez dostosowanie fizjologicznych poziomów naprężeń ścinających i unikanie ekstremalnych wahań ciśnienia pompy. Oprócz wizualizacji mikroskopowej, technika ta może być stosowana do badania efektów farmakologicznych nowych leków przeciwinfekcyjnych, a także do analizy długoterminowych konsekwencji procesów infekcji naczyniowych. Ten system pomp perfekuje patogeny bakteryjne pod ciśnieniem powietrza, aby zapobiec przenoszeniu przez aerozole.

Zaleca się przestrzeganie środków ostrożności związanych z bezpieczeństwem biologicznym.