Name: Zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę mikroskopowego monitorowania adhezji pneumokoków do komórek śródbłonka człowieka w warunkach stałego przepływu. Technika ta umożliwia szczegółową wizualizację struktur komórkowych i ilościową analizę bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt został sfinansowany przez DFG (BE 4570/4-1) dla S.B.

<ol><li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae%3A+transmission%2C+colonization+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li>
<li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li>
<li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin%28ogen%29-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+plasmin%28ogen%29-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix%2C+dissolution+of+fibrin+and+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li>
<li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).</li>
<li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li>
<li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+Research+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li>
<li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease%3A+Focus+on+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124, 1412-1425 (2014).</li>
<li>Luttge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+induces+exocytosis+of+weibel-palade+bodies+in+pulmonary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).</li>
<li>Cornish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+in+a+Pipe+of+Rectangular+Cross-Section%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+A%22%5BJournal%5D)">Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section.</a> Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).</li>
<li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li>
<li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues%3A+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Reviews+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li>
<li>Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+a+miniaturized+capillary+electrophoresis-based+chemical+analysis+system+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip.</a> Science. 261 (5123), 895-897 (1993).</li>
<li>Magnusson, M. K., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+Structure%2C+assembly%2C+and+cardiovascular+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).</li>
<li>Zerlauth, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibronectin+as+a+marker+for+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases.</a> The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).</li>
<li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2012.+Microfluidic+3D+cell+culture%3A+potential+application+for+tissue-based+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li>
<li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li>
<li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li>
<li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li>
<li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo%3A+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li>
<li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+A+manual+of+basic+Technique%2C+5th+edition%22">Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition</a>. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).</li>
<li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+JA+%22Epithelial+cell+culture-+a+practical+approach%22">Epithelial cell culture- a practical approach</a>. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).</li>
<li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+%28hpIgR%29+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li>
<li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li>
<li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-cell+patterning+lab+chip%3A+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li>
<li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration-on-a-chip%3F+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Symulacja interakcji bakterii z mechanowrażliwymi białkami gospodarza, takimi jak VWF, wymaga perfuzyjnego systemu hodowli komórek, który umożliwia generowanie określonego, jednokierunkowego i ciągłego przepływu cieczy, generując w ten sposób niezawodne naprężenia ścinające. Opisano już kilka układów pomp mikroprzepływowych. Obszerny przegląd przeprowadzony przez Bergmanna i wsp. podsumowuje kluczowe aspekty różnych dwu- i trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych17.
T...

Patogeneza zakażeń pneumokokowych charakteryzuje się wieloaspektową interakcją z różnorodnymi związkami macierzy zewnątrzkomórkowej oraz komponentami ludzkiej hemostazy, takimi jak plazminogen i VWF1,2,3,4,5,6,7,8. Wielodomenowe glikoproteinowe VWF pełni rolę kluczowego regulatora zrównoważonej hemostazy, pośrednicząc w rekrutacji trombocytów i włączaniu fibryny w miejscu formowania się zakrzepu naczyniowego9. Znaczenie funkcjonalnego, aktywnego VWF dla kontroli krwawienia i gojenia ran wykazuje choroba von Willebranda, powszechne dziedziczne zaburzenie krzepnięcia10.
Kształtkowy VWF krąży w ludzkim układzie krwiwłonokształtnej w stężeniu do 14,0 µg/mL11,10. W odpowiedzi na uszkodzenie naczyniowe lokalne uwalnianie VWF z ciałek Weibela-Palade'a (WBP) komórek śródbłonka ulega znacznemu zwiększeniu11,12. Poprzednie badania wykazują, że przyleganie pneumokoków do ludzkich komórek śródbłonka oraz produkcja przez nie pneumolizyny, toksyny tworzącej pory, istotnie stymuluje wydzielanie VWF do światła naczynia13. Siły hydrodynamiczne przepływu krwi indukują strukturalne otwarcie mechanoreaktywnych domen VWF. Przy szybkościach przepływu rzędu 10 dyn/cm2 VWF multimeryzuje w długie nici białkowe o długości do kilkuset mikrometrów, które pozostają przytwierdzone do podśródbłonka10,12.
Aby zrozumieć funkcję zmultimeryzowanych nici VWF generowanych pod wpływem naprężeń ścinających w interakcji pneumokoków z powierzchnią śródbłonka, opracowano podejście do infekcji kultur komórkowych oparte na mikroprzepływach. Wykorzystano urządzenie mikroprzepływowe z systemem pompy ciśnienia powietrza sterowanym programowo. Umożliwiło to ciągłą, jednokierunkową recyrkulację pożywki do hodowli komórkowych z określoną prędkością przepływu. W ten sposób system wywierał określone naprężenie ścinające na powierzchnię komórek śródbłonka, które pozostawały przytwierdzone wewnątrz specjalistycznych szkiełek z kanałami. Podejście to pozwoliło na symulację siły ścinania w strumieniu krwi ludzkiego układu naczyniowego, w którym nici VWF są generowane na zróżnicowanych komórkach śródbłonka w określonych, stałych warunkach przepływu. W tym celu komórki śródbłonka hodowano w specjalnych szkiełkach z kanałami (patrz Tabela materiałów), które zostały dostosowane do analiz mikroskopowych podczas przepływu. Mikroprzepływowy system pomp zapewnił wysoką definicję i kontrolę naprężeń ścinających niezbędnych do formowania wydłużonych nici VWF na konfluencyjnej warstwie komórek śródbłonka. Po stymulacji sekrecji VWF w konfluencyjnie wyhodowanych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) poprzez suplementację histaminą, formowanie nici indukowano poprzez przyłożenie naprężenia ścinającego (ԏ) wynoszącego 10 dyn/cm2. Naprężenie ścinające jest definiowane jako siła działająca na warstwę komórek. Jest ono obliczane w przybliżeniu zgodnie z Cornish et. al.14 za pomocą równania 1: 
<img alt="Wzór na skręcanie τ=(6η/h²w)Φ; równanie do analizy naprężenia ścinającego." src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">
Gdzie ԏ = naprężenie ścinające w dyn/cm2, η = lepkość w (dyn∙s)/cm2, h = połowa wysokości kanału, w = połowa szerokości kanału, a Φ = szybkość przepływu w mL/min.
Wynik równania 1 zależy od różnych wysokości i szerokości poszczególnych użytych szkiełek (patrz Tabela materiałów). W tej badaniu zastosowano szkiełko z kanałem Luer o rozmiarze 0.4 µm, co przełożyło się na współczynnik szkiełka komory wynoszący 131.6 (patrz wzór 2). 
<img alt="Równowaga statyczna, wzór τ=131.6×η×Φ, równania dla analizy momentu obrotowego." src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2">
Lepkość medium w temperaturze 37 °C wynosi 0,0072 dyn∙s/cm² i zastosowano naprężenie ścinające równe 10 dyn/cm². Przełożyło się to na szybkość przepływu wynoszącą 10,5 mL/min (patrz wzór 3). 
<img alt="Równanie obliczania strumienia świetlnego Φ=10/(0,0072×131,6)=10,5, przedstawiające wzór optyczny." src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3">
W niniejszym materiale szczegółowo opisano adaptację i udoskonalenie procedury mikrofluidycznej hodowli komórkowej z wykorzystaniem jednokierunkowego systemu przepływu laminarnego do badania i wizualizacji mechanizmów infekcji bakteryjnej w układzie naczyniowym gospodarza. Generowanie nici VWF na warstwach śródbłonka można również stymulować, stosując inne systemy pomp zdolne do wywierania ciągłego i stabilnego naprężenia ścinającego15.
Po hodowli pierwotnych komórek śródbłonka do stanu konfluencji w przepływie i stymulacji tworzenia nici VWF, do warstwy komórek śródbłonka dodano pneumokoki wykazujące czerwoną fluorescencję (RFP)16 pod stałą kontrolą mikroskopową. Przyczepianie się bakterii do nici VWF na powierzchni komórek śródbłonka było wizualizowane mikroskopowo i monitorowane w czasie rzeczywistym przez maksymalnie trzy godziny przy użyciu swoistych dla VWF przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Dzięki temu podejściu określono rolę VWF jako kofaktora adhezji sprzyjającego przyczepianiu się bakterii do śródbłonka naczyniowego8.
Oprócz mikroskopowej wizualizacji sekrecji białek i zmian konformacyjnych, metodę tę można wykorzystać do monitorowania w czasie rzeczywistym poszczególnych etapów procesów infekcji bakteryjnej oraz do ilościowego określenia liczby przyczepionych bakterii w różnych punktach czasowych infekcji. Specjalistyczny system pomp sterowany oprogramowaniem zapewnia również możliwość hodowli komórek śródbłonka w określonych, stałych warunkach przepływu przez okres do kilku dni oraz umożliwia inkubację w zdefiniowanym pulsacyjnym przepływie medium. Co więcej, metoda ta może być stosowana w przypadku różnych typów komórek. Dostosowanie protokołu barwienia pozwala również na detekcję i wizualizację bakterii zinternalizowanych w komórkach eukariotycznych.
Niniejszy manuskrypt opisuje zaawansowany protokół eksperymentalny, który może służyć jako zdefiniowane, niezawodne i powtarzalne podejście do wydajnej i wszechstronnej charakterystyki procesów patofizjologicznych.

<table><tbody><tr><td>1 ml strzykawka Luer</td><td>Fisher Scientific 10303002</td><td></td><td>o pojemności 1 ml do wstrzykiwania żelatyny za pomocą połączenia luer szkiełek</td></tr><tr><td>Strzykawka Luer 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>9077136</td><td>Do płukania/wstrzykiwania płynów do połączeń luer w prowadnicach komory kanałowej</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience teraz thermo fisher</td><td>00-4555-56</td><td>mieszanina proteaz stosowana do delikatnego odwarstwiania komórek śródbłonka</td></tr><tr><td>AlexaFluor350-sprzężona z falloidyną</td><td>Abcam</td><td>ab176751</td><td>brak stężenia dostępnego u producenta, roztwór podstawowy wystarcza na 300 tets, firma zaleca stosowanie 100 &mikro; L o rozcieńczeniu 1:1,000, niebieska fluorescencja (ustawienia filtra DAPI)</td></tr><tr><td>AlexaFluor488-sprzężone kozie przeciwciało anty-mysie</td><td>Thermo Fisher Sientific</td><td>A11001</td><td>stężenie podstawowe: 2 mg / ml do barwienia immunologicznego ludzkiego VWF w szkiełku mikroprzepływowym po utrwaleniu PFA, zielona fluorescencja</td></tr><tr><td>AlexaFluor568-sprzężone przeciwciało anty-królicze pochodzenia koziego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>Stężenie podstawowe: 2 mg/ml do barwienia immunologicznego pneumokoków na szkiełku mikroprzepływowym po utrwaleniu pFA, czerwona fluorescencja</td></tr><tr><td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>BD 249210</td><td>złożone podłoże do hodowli bakteryjnych</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-25G</td><td>rozpuszczona, do przygotowania buforu blokującego</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych z filtrem</td><td>TPP</td><td>90026</td><td>hodowla HUVEC w niepowlekanych kolbach do hodowli komórkowych o powierzchni 25 cm2</td></tr><tr><td>Wirówka Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>392304</td><td>odwirowania bakterii (objętość >2 ml)</td></tr><tr><td>Wirówka Allegra X-30</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B06314</td><td>wirowanie komórek eukariotycznych</td></tr><tr><td>Wirówka Z 216 MK</td><td>Hermle</td><td>305.00 V05 - Z 216 M</td><td>odwirowanie bakterii (objętości mniejsze niż 2 ml)</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>3886.2</td><td>stosowany w stężeniu 0,2 mg/ml do hodowli pneumokoków przekształconych za pomocą konstruktu genetycznego przenoszącego białko czerwonej fluorescencji i kasetę odporności na chloramfenikol</td></tr><tr><td>Zacisk do rurki perfuzyjnej</td><td>ibidi</td><td>10821</td><td>do utrzymywania cieczy w rurce przed podłączeniem suwaka do układu pompy</td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td> Rozmiar inkubatora <td>Fisher Scientific</td><td>MIDI 40</td><td>jest idealnie dostosowany do wielkości jednostki przepływowej z podłączonym suwakiem kanałowym i był używany do uprawy przepływowej przy 37 stopniach; C i 5% CO2</td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18 AIC</td><td>do inkubacji bakterii i komórek w określonej atmosferze przy 5% CO2 i 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Kolumbia płytki agarowe z krwią</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>PA-254005.06</td><td>Złożone podłoże hodowlane na bazie agaru dla S. pneumoniae uzupełnione 7% krwią owczą</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell</td><td>Latitude 3440</td><td>Comuter z oprogramowaniem pompy ciśnieniowej</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td>Mikroskop odwrotny ze stolikiem pokrytym podgrzewaną komorą i jednostką fluorescencyjną wyposażoną w filtr fluorescencyjny, ksenonowe źródło światła (SP8, DMi8) i DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 megapiksela)</td></tr><tr><td>Di wodorofosforan potasu (KH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>3904.1</td><td>używany do buforu PBS</td></tr><tr><td>Materiał suszący</td><td>Merck</td><td>101969</td><td>pomarańczowe kulki krzemionkowe do suszenia stosowane w szklanej butelce z adapterem rurki</td></tr><tr><td>Suplement ECGM Mix</td><td>Promocell</td><td>C-39215</td><td>mieszanka suplementów do ECGM -pożywka, wymagana do wstępnej hodowli komórek śródbłonka: 0,02 ml / ml Surowica cielęca płodu, 0,004 ml / ml suplement na wzrost komórek śródbłonka, 0,1 ng / ml naskórkowy czynnik wzrostu, 1 ng / ml zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów, 90 i mikro; g/ml heparyny, 1 i mikro; g/ml Hydrokortyzon</td></tr><tr><td>ECGMS</td><td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>ECGM uzupełniony o 5 % [w/w] FCS i 1 mM MgSO4 w celu zwiększenia adhezji komórek</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka (EKG w stanie gotowym)</td> Pożywka hodowlana <td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>HUVEC, już uzupełniona wszystkimi składnikami mieszanki suplementów</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>biochrom teraz Merck</td><td>S 0415</td><td>suplement do hodowli komórkowych, stosowany do analiz zakażeń</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie VWF przeciwko ludzkim kozom</td><td>FITC Abcam</td><td>ab8822</td><td>stężenie podstawowe: 10 mg/mL, do immunodetekcji globularyzowanego i multimeryzowanego VWF w przepływie</td></tr><tr><td>Fluidic Unit</td><td>ibidi</td><td>10903</td> jednostka <td>fluidyczna do uprawy przepływowej</td></tr><tr><td>Żelatyna (wieprzowa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-1890-100g</td><td>do wstępnego powlekania powierzchni kanału mikroślizgowego</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek histaminy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H-7250-10MG</td><td>do indukcji wydzielania VWF ze śródbłonka Weibel Palade Bodies</td></tr><tr><td>Ludzka komórka śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Promocell</td><td>C-12203 Lot-Nr. 396Z042</td><td>pierwotne komórki śródbłonka od dawcy połączonego, przechowywane w krypkoserwie w ciekłym azocie</td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało specyficzne dla VWF pochodzące od myszy (monoklonalne)</td> <td>Santa Cruz</td><td>sc73268</td><td>stężenie zapasów: 200 &mikro; g/ml do barwienia immunologicznego VWF na szkiełku mikroprzepływowym po utrwaleniu PFA</td></tr><tr><td>Port iniekcyjny</td><td>ibidi</td><td>10820</td><td>do wstrzykiwania histaminy lub bakterii do rurki zbiornika podczas cyrkulacji przepływu</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td> Mikroskop światła odwróconego <td>Zeiss</td><td>Axiovert 35M</td><td>do kontroli odrywania i zliczania komórek eukariotycznych za pomocą 40-krotnego obiektywu wodnego umożliwiającego 400-krotne powiększenie</td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe I0,4 (ibiTreat472microslides)</td><td>ibidi</td><td>80176</td><td>fizycznie zmodyfikowane szkiełka do uprawy fludic (&mu; &ndash; Suwak I0,4Luer o wysokości kanału 0,4 mm, głośności kanału 100 &mu; l, obszar wzrostu 2,5 cm i obszar powlekania 25,4 cm2) Odpowiedni do wszystkich rodzajów testów przepływu, obróbka fizyczna generuje hydrofilową i adhezyjną powierzchnię.</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4, nieuwodniony)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>Do przygotowania podłoża ECGMS</td></tr><tr><td>Pompa mikroprzepływowa Pompa ciśnieniowa</td><td>ibidi</td><td>10905</td><td>Komora ciśnieniowa</td></tr><tr><td>Neubauer</td><td>Karl Hecht GmbH& Co KG</td><td>40442002</td><td>mikroskopijna komora zliczająca do HUVEC</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710-S</td><td>do sieciowania próbek</td></tr><tr><td>Zestaw perfuzyjny</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>Zestaw perfuzyjny żółty/zielony ma średnicę rurki 1,6 mm, długość rurki 50 cm, całkowitą objętość roboczą 13,6 ml, objętość martwej probówki 2,8 ml i wielkość zbiornika 10 ml. w połączeniu z &mikroszkiełkiem L0,4Luer, w 37 &deg; C i lepkość 0,0072 dyn x s/cm2 zakres natężenia przepływu od 3,8 ml/min do 33,9 mL/min i naprężenie ścinające między 3,5 dyn/cm2 a 31,2 dyn/cm2. o długości 50 cm do mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td></td><td></td> <td>roztwór przygotowano przy użyciu następujących substancji chemicznych: 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4, 0,24 g/L KH2PO4 , pH 7,4</td></tr><tr><td>Kuwety plastikowe</td><td>Sarstedt</td><td>67,741</td> <td>(2 x optyczne) do pomiaru OD przy 600 nm</td></tr><tr><td>Surowica swoista dla pneumokoków Pineda</td><td></td><td></td><td>hodowana u królika przy użyciu inaktywowanego termicznie Streptococcus pneumoniae NCTC10319 i D39, oczyszczonego IgG za pomocą kolumny białkoA-sefarozy.</td></tr><tr>Płyta <td></td><td></td> z <td>polistyrenu lub styropianu</td><td>jest to krok zapobiegawczy, aby uniknąć stresu zimna na komórkach zasianych w prowadnicach kanałowych. Można użyć dowolnego rodzaju styropianu, takiego jak opakowanie, pudełko. Talerz może mieć grubość 0,5 cm i powinien mieć rozmiar 20 cm2.</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>6781.1</td><td>używany do buforu PBS</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące pompą (PumpControl v1.5.4)</td><td>ibidi</td><td>v1.5.4</td><td>Oprogramowanie komputerowe do sterowania pompą ciśnieniową, ustawiania warunków przepływu i uruchamiania/kończenia przepływu</td></tr><tr><td>Probówki reakcyjne 1,5/2,0 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.706/ 72.695.500</td><td>wymagane do rozcieńczania przeciwciał</td></tr><tr><td>Probówki reakcyjne o pojemności 50 ml objętość</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,48,004</td><td></td></tr><tr><td>Pneumokoki wyrażające RFP</td><td>Narodowa Kolekcja Kultur Typów, Public Health England</td><td>10,319</td><td>Streptococcus pneumoniae serotyp 47 eksprymujący RFP połączony z białkiem podobnym do ahistone'a zintegrowany z genomem Pipety</td></tr><tr><td>serologiczne 5, 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025/ 86.1254.025</td><td>do pipetowania większych objętości</td></tr><tr><td>Węglan sodu (Na2CO3, bez wody)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451614-25G</td><td>do przygotowania 100 mM buforu węglanu sodu</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu (NaH2PO4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>P030.2</td><td>stosowany do buforu PBS</td></tr><tr><td>Fotometr spektralny Libra S22</td><td>Biochrom</td><td>80-2115-20</td><td>pomiar gęstości optycznej (OD) zawiesiny bakteryjnej przy 600 nm</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td>do przygotowania buforu blokującego</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td>Stosowany w 0,1% stężeniu końcowym rozcieńczonym w dH20 do przenikania komórek eukariotycznych po utrwaleniu PFA</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>oxoid</td><td>LP0021</td><td>bakterie są hodowane w suplemencie THB z 1% [w/w] ekstraktem drożdżowym = kompletne podłoże do hodowli bakterii THY</td></tr></tbody></table>

zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interakcja Streptococcus pneumoniae z powierzchnią komórek śródbłonka odbywa się za pośrednictwem przepływu krwi za pośrednictwem białek mechanowrażliwych, takich jak czynnik von Willebranda (VWF). Ta glikoproteina zmienia swoją konformację molekularną w odpowiedzi na naprężenia ścinające, odsłaniając w ten sposób miejsca wiązania dla szerokiego spektrum interakcji gospodarz-ligand. Ogólnie rzecz biorąc, wiadomo, że hodowla pierwotnych komórek śródbłonka pod określonym przepływem ścinającym sprzyja specyficznemu różnicowaniu komórkowemu i tworzeniu stabilnej i ściśle połączonej warstwy śródbłonka przypominającej fizjologię wewnętrznej wyściółki naczynia krwionośnego. W związku z tym funkcjonalna analiza interakcji między patogenami bakteryjnymi a układem naczyniowym gospodarza z udziałem białek wrażliwych na mechanizm wymaga ustanowienia systemów pomp, które mogą symulować fizjologiczne siły przepływu, o których wiadomo, że wpływają na powierzchnię komórek naczyniowych.
Urządzenie mikroprzepływowe użyte w tym badaniu umożliwia ciągłą i bezpulsacyjną recyrkulację płynów o określonym natężeniu przepływu. Sterowany komputerowo system pomp ciśnieniowych powietrza wywiera określone naprężenie ścinające na powierzchnie komórek śródbłonka, generując ciągły, jednokierunkowy i kontrolowany przepływ medium. Zmiany morfologiczne komórek i przyczepienia bakterii mogą być monitorowane mikroskopowo i określane ilościowo w przepływie za pomocą specjalnych szkiełek kanałowych, które są przeznaczone do wizualizacji mikroskopowej. W przeciwieństwie do statycznego zakażenia hodowli komórkowej, które na ogół wymaga utrwalenia próbki przed znakowaniem immunologicznym i analizami mikroskopowymi, szkiełka mikroprzepływowe umożliwiają zarówno oparte na fluorescencji wykrywanie białek, bakterii i składników komórkowych po utrwaleniu próbki; seryjne barwienie immunofluorescencyjne; i bezpośrednia detekcja oparta na fluorescencji w czasie rzeczywistym. W połączeniu z bakteriami fluorescencyjnymi i specyficznymi przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie, ta procedura infekcji zapewnia wydajny wieloskładnikowy system wizualizacji dla szerokiego spektrum zastosowań naukowych związanych z procesami naczyniowymi.

Hodowla pierwotnych HUVEC w stałym przepływie jednokierunkowym prowadzi do powstania zlewnej i gęsto upakowanej warstwy komórek, co sprzyja powstawaniu komórkowych WPBs wypełnionych mechanosensytywnym VWF13,14. Niniejszy protokół opisuje zastosowanie bezpulsyjnego systemu recyrkulacji opartego na pompie ciśnienia powietrza do analizy infekcji, która wymaga odtworzenia warunków naprężenia ścinającego występującego w ludzkim przepływie krwi.
<p class="jove_cont...

To badanie opisuje mikroskopowe monitorowanie przylegania pneumokoków do ciągów czynnika von Willebranda wytwarzanych na powierzchni zróżnicowanych ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka pod wpływem naprężeń ścinających w określonych warunkach przepływu. Protokół ten można rozszerzyć o szczegółową wizualizację określonych struktur komórkowych i kwantyfikację bakterii poprzez zastosowanie różnicowych procedur barwienia immunologicznego.

Zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Zastosowanie tego systemu hodowli komórek śródbłonka umożliwia przyswojenie sytuacji w przepływie krwi. W tej sytuacji możemy analizować procesy infekcji bakteryjnych, w tym również identyfikację wektorów bakteryjnych, a także wektorów komórkowych, które są zaangażowane w ten proces. Technika ta toruje drogę do zbadania wpływu infekcji bakteryjnych na integralność naczyń krwionośnych, w tym również wpływu na mechanizmy morfogenezy, reakcje zapalne i regulację immunologiczną.Technika ta wymaga specjalnego obchodzenia się z komórkami śródbłonka i dlatego opis wizualny jest lepszy niż tylko słowne wyjaśnienie. Metoda ta zapewnia wgląd w kilka innych obszarów badań skorelowanych z perfundowanymi układami naczyniowymi, takich jak różnicowanie komórek śródbłonka, gojenie się ran, geneza guza i angiogeneza. Jednym z kluczowych kroków jest standaryzowana hodowla komórek, a także dokładna obsługa pierwotnych komórek śródbłonka.Technika ta wymaga specjalnego obchodzenia się z kulturą komórkową, której nie można wyjaśnić tylko słownie. Na początek pracuj w sterylnym środowisku, korzystając z czystej ławki. Za pomocą pipety wstrzyknąć 100 mikrolitrów 2% sterylnego, przefiltrowanego roztworu PBS żelatyny wieprzowej do pojedynczego zbiornika szkiełka kanałowego o zrównoważonej temperaturze.Umieść pokrytą żelatyną szkiełko kanałowe na cienkiej płytce z polistyrenu lub styropianu, aby zapobiec spadkowi temperatury szkiełka, za pomocą jednomililitrowej strzykawki Luer, aby dodać 100 mikrolitrów czterokrotnej zawiesiny HUVEC razy 10 do piątej na mililitr na mililitr do szkiełka w celu wysiewu i uprawy HUVEC. Inkubuj szkiełko kanałowe za pomocą HUVEC przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie napełnij każdy zbiornik pożywki na obu końcach zjeżdżalni kanałowej 60 mikrolitrami pożywki ECGMS.Inkubuj przez kolejną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie, aby wyregulować pompę mikroprzepływową, najpierw podłącz zestaw do perfuzji zrównoważonej do zespołu pompy, napełnij 13,6 mililitra pożywki ECGMS i uruchom oprogramowanie sterujące pompą. W menu ustawień zespołu fluidycznego wybierz odpowiedni zestaw perfuzyjny i typ szkiełka komorowego za pomocą przewijanych okien.Wybierz 0,007 sekundy dyny na centymetr kwadratowy w oprogramowaniu dla średniej lepkości. Na zewnątrz inkubatora podłącz szklaną butelkę wypełnioną suszącymi kulkami krzemionki do rurki ciśnieniowej. Wybierz parametry przepływu w menu oprogramowania, ustaw ciśnienie na 40 milibarów i przepłucz rurki pompy płynnym medium, uruchamiając ciągły przepływ medium.Zapewniamy szczelne przyleganie ogniw poprzez zastosowanie subkonfluentnie hodowanych HUVEC, a dodatkowo skupiamy się na usuwaniu pęcherzyków powietrza z systemu, a także korzystamy z niezależnego zasilania układu pompowego. Dotknij połączeń przewodów, aby usunąć pęcherzyki powietrza i upewnić się, że w układzie pompy nie krążą żadne pęcherzyki powietrza. Aby podłączyć suwak kanałowy, zatrzymaj cyrkulację przepływu w oprogramowaniu sterującym pompą i przytrzymaj przepływ medium i rurkę perfuzyjną, zaciskając rurki w pobliżu przyłącza Luer.Podłącz suwak kanału, unikając w ten sposób pęcherzyków powietrza. Na karcie zaawansowane oprogramowania sterującego pompą użyj kreatora cykli narzędzia programowego, aby zaprogramować żądane cykle naprężeń ścinających dla uprawy przepływu. Zaprogramuj poziomy naprężeń ścinających dla cyrkulacji przepływu i rozpocznij długotrwałą perfuzję.Zacznij od pięciu dyn na centymetr kwadratowy, co odpowiada natężeniu przepływu 5,44 mililitra na minutę przez 30 minut, a następnie ciągły przepływ przy naprężeniu ścinającym 10 dyna na centymetr kwadratowy, co odpowiada natężeniu przepływu 10,85 mililitra na minutę. Kontroluj zrównoważone pompowanie w zbiorniku. Umieść jednostkę fluidyczną z podłączonym szkiełkiem kanałowym w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Uruchom sterowanie oprogramowaniem mikroskopu i dostosuj podstawowe ustawienia monitorowania mikroskopu fluorescencyjnego, wybierając odpowiednie ustawienia filtra. W celu wizualizacji mikroskopowej umieść jednostkę fluidyczną w komorze grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umieść szkiełko kanałowe na stoliku wstępnie rozgrzanego mikroskopu.Kontroluj morfologię komórek i integralność warstwy HUVEC przed wstrzyknięciem histaminy i bakterii do krążenia przepływowego. Utrzymuj ustawienie przepływu. Indukować uwalnianie VWF z żywotnych śródbłonka ciał Palade poprzez wstrzyknięcie 136 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu podstawowego histaminy przez port iniekcyjny do pożywki ECGMS krążącej w rurkach perfuzyjnych.W celu immunofluorescencyjnego wykrywania multimeryzowanych ciągów VWF należy wstrzyknąć 20 mikrogramów skoniugowanego przeciwciała FITC specyficznego dla VWF w objętości 200 mikrolitrów PBS do krążących 13,6 mililitrów pożywki ECGMS. Aby określić ilościowo przyłączanie pneumokoków do ciągów VWF generowanych na powierzchniach komórek HUVEC, należy wstrzyknąć 1,35 razy 10 do ósmej CFU na mililitr RFP wyrażającej pneumokoki w maksymalnej objętości jednego mililitra do pożywki ECGMS za pomocą portu iniekcyjnego. Wybierz obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 63X do powiększenia mikroskopu i dostosuj ustawienia filtra fluorescencyjnego w oprogramowaniu mikroskopu do kanału RFP z filtrem detekcyjnym 540 nanometrów do wykrywania zapytania ofertowego wyrażającego pneumokoki.W celu ilościowego określenia przyczepiania się bakterii do ciągów VWF, należy utworzyć migawki stosów Z z co najmniej 30 reprezentatywnych widoków pola, z których każdy zawiera około 10 morfologicznie nienaruszonych HUVEC i policzyć ilość pneumokoków. Aby ocenić przyczepienie się bakterii po utrwaleniu przed barwieniem immunofluorescencyjnym, zatrzymaj przepływ, usuń 10 mililitrów pożywki ECGMS ze zbiorników pompy i dodaj 10 mililitrów PBS uzupełnionego 5% paraformaldehydem i postępuj zgodnie z manuskryptem. W tym protokole główne etapy eksperymentalne rozpoczynają się od wstępnej hodowli pierwotnych komórek śródbłonka do subkonfluencji w kolbach do hodowli komórkowych.Komórki są następnie wysiewane do szkiełka kanałowego pokrytego żelatyną. Bakterie są hodowane na płytkach agarowych, a następnie hodowane w złożonej płynnej pożywce do środkowej fazy logarytmicznej. W przypadku hodowli komórek mikroprzepływowych szkiełko kanałowe z komórkami śródbłonka jest połączone z rurkami perfuzyjnymi jednostki płynowej systemu pompowego i poddawane stałemu przepływowi w celu różnicowania komórek.Wytwarzanie strun VWF indukowano przez wstrzyknięcie histaminy przy naprężeniu ścinającym 10 sekund dyn na centymetr kwadratowy i monitorowano mikroskopowo za pomocą detekcji immunofluorescencyjnej przy użyciu przeciwciał specyficznych dla VWF znakowanych FITC. Po wstrzyknięciu białka czerwonej fluorescencji wykazującego ekspresję bakterii do krążącego podłoża, przyłączenie Pneumokoków do strun VWF zostało mikroskopowo zwizualizowane w czasie rzeczywistym poprzez emisję fluorescencji na głębokości 450 nanometrów. Po utrwaleniu komórek za pomocą PFA, barwienie immunofluorescencyjne różnicowe zapewnia wizualizację przyczepienia się bakterii w określonych punktach czasowych infekcji.Najważniejszym krokiem tej procedury jest zapewnienie szczelnego mocowania komórek na powierzchni suwaka poprzez dostosowanie fizjologicznych poziomów naprężeń ścinających i unikanie ekstremalnych wahań ciśnienia pompy. Oprócz wizualizacji mikroskopowej, technika ta może być stosowana do badania efektów farmakologicznych nowych leków przeciwinfekcyjnych, a także do analizy długoterminowych konsekwencji procesów infekcji naczyniowych. Ten system pomp perfekuje patogeny bakteryjne pod ciśnieniem powietrza, aby zapobiec przenoszeniu przez aerozole.Zaleca się przestrzeganie środków ostrożności związanych z bezpieczeństwem biologicznym.

pneumococcus-infection-primary-human-endothelial-cells-constant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza praca opisuje różne metody hodowli biofilmu Pseudomonas aeruginosa na hodowlach ludzkich komórkach nabłonkowych dróg oddechowych. Protokoły te można dostosować do badania różnych aspektów tworzenia biofilmu, w tym wizualizacji biofilmu, barwienia biofilmu, pomiaru jednostek tworzących kolonie (CFU) w biofilmie oraz badania cytotoksyczności biofilmu.

Modele kokultury biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych komórkach dróg oddechowych człowieka

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Źródło: Jagau, H. i wsp. Zakażenie Pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym przyczepiania się pneumokoków do sznurków czynnika von Willebranda (VWF) na komórkach śródbłonka w warunkach stałego przepływu pożywki. Przedstawiono w nim etapy stymulowania uwalniania VWF, znakowania strun i ilościowego określania wiązania bakterii.

Ocena przyczepiania się pneumokoków do pierwotnych komórek śródbłonka człowieka przy stałym przepływie pożywki

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

W tym miejscu przedstawiamy protokół budowy systemu narządów na chipie (OOC) mającego naśladować pneumonektomię. System ten bada potencjalną korelację między upośledzeniem glikokaliksu a powikłaniami po pneumonektomii.

Modelowanie glikokaliksu śródbłonka po pneumonektomii w chipie fluidycznym 3D - podejście do wytwarzania systemu narządów na chipie opartych na naczyniach krwionośnych

Poznaj metodę mikroskopowego monitorowania adhezji pneumokoków do komórek śródbłonka człowieka w warunkach stałego przepływu. Technika ta umożliwia szczegółową wizualizację struktur komórkowych i ilościową analizę bakterii.

Zakażenie pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie

Przeglądaj więcej filmów