Name: Stłuczenie Uszkodzenie rdzenia kręgowego poprzez mikrochirurgiczną laminektomię w regeneracyjnym aksolotlu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Naucz się mikrochirurgicznej laminektomii w aksolotlu Ambystoma mexicanum, aby wprowadzić kontrolowane uszkodzenie rdzenia kręgowego. Ta metoda naśladuje urazy kliniczne i wspiera badania nad regeneracją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Michael Pedersen, Uniwersytet w Aarhus za wiedzę i czas poświęcony na opracowanie protokołów MRI i przygotowanie całego projektu. Peter Agger, Uniwersytet w Aarhus za jego wiedzę i czas poświęcony na opracowanie protokołów MRI. Steffen Ringgard, Uniwersytet w Aarhus za jego wiedzę i czas poświęcony na opracowanie protokołów MRI. Rozwój modelu SCI u aksolotla był wspierany przez The A.P. Møller Maersk Foundation, The Riisfort Foundation, The Linex Foundation i The ELRO Foundation.

Wszystkie obowiązujące przepisy instytucjonalne i rządowe dotyczące etycznego wykorzystywania zwierząt były przestrzegane podczas tego badania. Badanie zostało przeprowadzone pod numerem identyfikacyjnym zezwolenia: 2015-15-0201-0061 przez Duński Inspektorat Doświadczeń na Zwierzętach. Zwierzętami były meksykańskie aksolotle (Ambystoma mexicanum, średnia masa ciała ± choroby przenoszone drogą płciową: 12,12 g ± 1,25 g).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj aksolotla do znieczulenia.
	<ol>
		<li>Używaj wysokiej jakości, nieuzdatnionej chemicznie wody z kranu. Jeśli nie jest dostępny, użyj 40% roztworu Holtfretera.</li>
		<li>Rozpuścić 200 mg 4-aminobenzoesanu etylu (benzokainy) w 3 ml acetonu. Roztwór ten rozpuścić w 1 l wody z kranu lub 40% roztworze Holtfretera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj standardowej szalki Petriego (o średnicy 100 mm) umieszczonej pod mikroskopem stereoskopowym jako stołu operacyjnego. Umieść tkaninę chirurgiczną na szalce Petriego. 
	nuta: Użycie szalki Petriego jako obszaru operacyjnego umożliwia poruszanie się i obracanie zwierzęcia bez dotykania go, zapewniając stabilność kręgosłupa podczas operacji.</li>
	<li>Przygotuj wszystkie sterylne narzędzia mikrochirurgiczne (tj. nożyczki i kleszcze anatomiczne).</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
	<li>Umieść aksolotla w pojemniku z roztworem benzokainy na około 45 minut, aby zapewnić głębokie i stabilne znieczulenie. 
	nuta: Podane stężenie benzokainy spowoduje znieczulenie we wszystkich rozmiarach aksolotlów.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma oznak znieczulenia ogólnego w ciągu 30-45 minut. Należą do nich całkowity brak ruchów skrzelowych, odruch prostowania lub reakcja na bodźce dotykowe lub bolesne (delikatne szczypanie pajęczyny u stóp).</li>
	<li>Aby utrzymać znieczulenie, zawiń zwierzęta w ręczniki papierowe zwilżone roztworem znieczulającym. Regularnie nawilżaj je tym roztworem podczas zabiegu chirurgicznego, aby upewnić się, że skóra i skrzela są wilgotne.</li>
	<li>Odzyskaj zwierzę po operacji, umieszczając je w pojemniku zawierającym świeżą wodę z kranu. Obserwuj oznaki powrotu do zdrowia, takie jak ruchy skrzeli i odzyskany odruch prostowania, w ciągu 1 h16.</li>
</ol>
3. Mikrochirurgiczna laminektomia
UWAGA: Laminektomia jest wykonywana pod mikroskopem stereoskopowym.
<ol>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na szalce Petriego. Zawiń go w ręczniki papierowe, tak aby ogon był odsłonięty. 
	nuta: Ręczniki papierowe doskonale nadają się do zapewnienia stabilności podczas całego zabiegu.</li>
	<li>Zidentyfikuj tylne kończyny. Wykonaj pierwsze nacięcie tylko ogonowo do nich.
	<ol>
		<li>Za pomocą mikronożyczek wykonaj pionowe nacięcie od stępki, aż do wyczucia kostnej wypukłości wyrostków kolczystych. 
		nuta: Zachowaj szczególną ostrożność podczas chwytania kilu i skóry kleszczami, ponieważ łatwo uszkadzają one delikatną skórę.</li>
		<li>Rozciągnij cięcie na boki, tak aby nacięcie przebiegało przez całą szerokość ogona.</li>
		<li>Chwyć wyrostek kolczysty za pomocą kleszczy, aby zapewnić odpowiednią głębokość.</li>
		<li>Przedłuż pionowe nacięcia 1 mm poniżej wyrostka kolczystego po obu stronach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść zwierzę na jednej stronie, aby wykonać nacięcia brzuszne i poziome, jak podano poniżej.
	<ol>
		<li>Za pomocą mikronożyczek, zaczynając od brzusznego punktu pionowego nacięcia, wykonaj poziome nacięcie o długości około 15 mm dla zwierząt o wadze 10-20 g. Spraw, aby nacięcie było dłuższe w przypadku większych zwierząt i krótsze w przypadku mniejszych zwierząt.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek przeprowadź sekcję przyśrodkowo przez poziome nacięcie, aż kręgosłup zostanie wyczulony w linii środkowej.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.3, 3.3.1 i 3.3.2 po drugiej stronie zwierzęcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wypreparowaniu w głębokiej płaszczyźnie przyśrodkowej z obu stron, przeprowadź sekcję przez linię środkową, łącząc w ten sposób dwa poziome nacięcia.
	<ol>
		<li>Przesuń wolny kawałek ogona i stępki na bok, odsłaniając wyrostki kolczyste (Rysunek 1).</li>
		<li>Zamocuj końcówkę za pomocą mokrych ręczników papierowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie ułóż zwierzę w pozycji leżącej z głową skierowaną w stronę niedominującej strony chirurga.
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy chwyć wyrostki kolczyste tuż doogonowe do kończyn tylnych. Delikatnie unieś zarówno w górę, jak i w kierunku głowy zwierzęcia.</li>
		<li>Umieść ostrza mikronożyczek poziomo wokół procesu i delikatnie go przytnij. Podnośnik na procesie zapewnia, że jest on teraz usuwany, odsłaniając rdzeń kręgowy.</li>
		<li>Chwyć wyrostek kolczysty tuż doogonowo do tego, który został właśnie usunięty i powtórz kroki 3.5.1 i 3.5.2. 
		nuta: Powinno to pozostawić odsłonięty rdzeń kręgowy odpowiadający dwóm poziomom kręgów. Podczas wykonywania laminektomii często pojawia się biała, pienista wydzielina. Rdzeń kręgowy można łatwo rozpoznać po charakterystycznym połysku, a także naczyniu biegnącym wzdłuż linii środkowej.</li>
		<li>W zależności od wielkości zwierzęcia odsłonięty obszar może nie być wystarczająco szeroki. Za pomocą dwóch par kleszczy chwyć blaszki po obu stronach rdzenia kręgowego i przekręć je na boki delikatnym ruchem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przedstawiamy uraz typu kontuzjowanego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Trzymaj zwierzę w pozycji leżącej.</li>
	<li>Użyj szalki Petriego, aby przenieść zwierzę na oddział urazowy.</li>
	<li>Poproś asystenta, aby poświecił latarką na rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Umieść cylinder zespołu urazowego kontuzji nad odsłoniętym rdzeniem kręgowym za pomocą mikroregulatorów na jednostce. Wyceluj przez cylinder.</li>
	<li>Opuść cylinder, aż zrówna się z blaszkami.</li>
	<li>Przymocuj opadający pręt do elektromagnesu. Umieść żądany cylinder regulacji wysokości opadania na jednostce urazowej.</li>
	<li>Umieść opadający pręt w cylindrze. 
	nuta: W przypadku badania z zaślepioną próbą chirurg powinien teraz opuścić salę, nie wiedząc, czy zwierzę zostanie przydzielone do grupy urazowej, czy pozorowanej grupy chirurgicznej.</li>
	<li>Wyłącz elektromagnes. Pręt opada na odsłonięty rdzeń kręgowy.</li>
	<li>Użyj regulacji wysokości, aby podnieść pręt z rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Potwierdź uraz, patrząc na rdzeń kręgowy pod mikroskopem. Zranione miejsce będzie wyglądało na ciemniejsze i widoczne będzie krwawienie z naczynia linii środkowej.</li>
</ol>
5. Wprowadzenie do zranienia ostrym narzędziem
UWAGA: Wykonaj te kroki po wydaniu 3.5.4.
<ol>
	<li>Za pomocą mikronożyczek przetnij rdzeń kręgowy w idealnym pionowym cięciu.</li>
	<li>Powtórz cięcie 2 mm po ogonowej stronie ciała. 
	nuta: Długość usuniętego fragmentu rdzenia kręgowego można dostosować zgodnie z wymaganiami badania. Jednak cięcie o grubości 2 mm będzie można zregenerować10.</li>
	<li>Upewnij się, że cięcia są zakończone. Po zakończeniu poczuj, jak ostrza nożyczek ocierają się o brzuszną część kanału kręgowego.</li>
	<li>Podnieś 2 mm kawałek rdzenia kręgowego z kanału kręgowego.</li>
</ol>
6. Zamykanie rany pooperacyjnej
<ol>
	<li>Zwróć zwierzę na stół operacyjny. W badaniu z zaślepioną próbą zmień położenie stępki tak, aby rdzeń kręgowy nie był widoczny dla chirurga.</li>
	<li>Trzymaj zwierzę w pozycji leżącej.
	<ol>
		<li>Rozpocznij zakładanie szwów nylonowych 10.0 od najbardziej ogonowej części poziomego nacięcia. Zamknij rany w jednej warstwie. 
		nuta: Nie chwytaj skóry zbyt mocno, ponieważ spowoduje to martwicę.</li>
		<li>Pracuj w kierunku pionowej części nacięcia.</li>
		<li>Po osiągnięciu kąta obróć szalkę Petriego i zszyj drugie poziome nacięcie.</li>
		<li>Założyć szwy na pionowe nacięcia.</li>
		<li>Nie zakładaj szwów w najwyższej części stępki, ponieważ skóra w tym miejscu nie będzie w stanie utrzymać.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Powrót zwierzęcia do roztworu wolnego od znieczulenia
<ol>
	<li>Podnieś szalkę Petriego ze zwierzęciem i zanurz obie bardzo delikatnie w słodkiej wodzie na głębokość zaledwie 5 cm i pozwól zwierzęciu zsunąć się. 
	nuta: Płytka głębokość wody zapewnia, że zwierzę nie będzie próbowało wypłynąć na powierzchnię, aby oddychać.</li>
	<li>Nie zmieniaj wody w pierwszym tygodniu.</li>
	<li>Podczas karmienia zwierząt upewnij się, że karma jest umieszczona w pobliżu głowy zwierzęcia. 
	nuta: Celem tych środków jest uniknięcie jak największego ruchu w pierwszym tygodniu.</li>
</ol>
8. USG pooperacyjne
<ol>
	<li>Przed zakończeniem znieczulenia należy użyć systemu ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości, aby uzyskać obrazy urazu, które można wykorzystać do budowy trójwymiarowych obrazów miejsca SCI.</li>
	<li>Podłącz przetwornik do mikromanipulatora, najlepiej sterowanego za pomocą zdalnego joysticka.</li>
	<li>Zanurz znieczulone zwierzę w pozycji leżącej w małym pojemniku wypełnionym roztworem znieczulającym. 
	nuta: Przymocuj zwierzę za pomocą miniaturowych worków z piaskiem lub innego sprzętu, aby uniknąć ruchu podczas sekwencji skanowania.</li>
	<li>Wyrównaj końcówkę przetwornika z osią długości zwierzęcia i zanurz go w roztworze benzokainy, aż znajdzie się zaledwie kilka milimetrów nad kilem za tylnymi kończynami zwierzęcia.</li>
	<li>Zidentyfikuj witrynę SCI. 
	nuta: Miejsce urazu jest łatwo rozpoznawalne ze względu na brak wyrostków kolczystych bezpośrednio nad SCI.</li>
	<li>Zoptymalizuj obraz, dostosowując ustawienia ultradźwięków. Upewnij się, że witryna SCI znajduje się na środku obrazu. Dostosuj pole widzenia (tj. głębię obrazu, przesunięcie głębi i szerokość obrazu), aby pokryć miejsce SCI i przylegającą zdrową tkankę. Dostosuj wzmocnienie dwuwymiarowe, aby zoptymalizować kontrast obrazu.</li>
	<li>Przesuwając przetwornik ultradźwiękowy po miejscu SCI za pomocą elektronicznie sterowanego mikromanipulatora, uzyskaj obrazy w trybie B pokrywające miejsce SCI w wielu strzałkowych miejscach przekroju poprzecznego, z kolejnymi warstwami w odstępach międzywarstwowych 50 μm. Uzyskaj obrazy filmowe zawierające 500 klatek z szybkością odświeżania ~50 klatek/s i częstotliwością przetwornika 40 MHz. 
	nuta: Ta konfiguracja wymaga elektronicznego mikromanipulatora sterowanego za pomocą zdalnego joysticka (krok 8.2).</li>
	<li>Po zakończeniu sekwencji skanowania wróć do kroku 7.</li>
</ol>

<ol><li>Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+Long-Term+Survival+After+Spinal+Cord+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Physical+Medicine+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury.</a> Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).</li>
<li>Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+management+and+quality+of+life+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Medicine+%26+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Bladder management and quality of life after spinal cord injury.</a> American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).</li>
<li>Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stockholm+spinal+cord+injury+study%3A+1.+Medical+problems+in+a+regional+SCI+population%5BTitle%5D)+AND+%22Paraplegia%22%5BJournal%5D)">The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population.</a> Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).</li>
<li>Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+traumatic+spinal+cord+injury+in+Denmark%2C+1990-2012%3A+a+hospital-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study.</a> Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).</li>
<li>Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+and+incidence+of+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury.</a> Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).</li>
<li>Aguayo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerative+and+regenerative+responses+of+injured+neurons+in+the+central+nervous+system+of+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).</li>
<li>Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+mesencephalic+neurons+survive+and+extend+long+axons+across+peripheral+nervous+system+grafts+inserted+into+the+adult+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum.</a> Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).</li>
<li>Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+long+spinal+axons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of long spinal axons in the rat.</a> Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).</li>
<li>Butler, E. G., Ward, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+spinal+cord+following+ablation+in+urodele+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).</li>
<li>Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+miR-125b+levels+is+required+to+create+a+regeneration-permissive+environment+after+spinal+cord+injury%3A+a+cross-species+comparison+between+salamander+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat.</a> Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).</li>
<li>Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+descending+axons+in+the+spinal+cord+of+the+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl.</a> Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).</li>
<li>McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+central+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration+from+the+implanted+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres.</a> Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).</li>
<li>Thygesen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+blunt+spinal+cord+injury+model+in+the+regeneration+competent+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail.</a> Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).</li>
<li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoss%2C+RJ+%22Principles+of+Regeneration%22">Principles of Regeneration</a>. , Academic Press. New York. (1969).</li>
<li>Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+limb%3A+a+model+for+bone+development%2C+regeneration+and+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing.</a> Bone. 40 (1), 45-56 (2007).</li>
<li>Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+%282%2C6-diisopropylphenol%29+is+an+applicable+immersion+anesthetic+in+the+axolotl+with+potential+uses+in+hemodynamic+and+neurophysiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments.</a> Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).</li>
<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ ryzyko urazu rdzenia kręgowego jest znaczne, krytycznymi krokami protokołu są usunięcie wyrostków kolczystych i poszerzenie dostępu kostnego do kanału kręgowego, jeśli to konieczne. Jak wspomniano w protokole, zdecydowanie zaleca się usunięcie najpierw najbardziej czaszkowego wyrostka. Oznacza to, że bardziej ogonowe wyrostki chronią rdzeń kręgowy przed uderzeniem nożyczkami. Zaleca się, aby zapewnić wystarczający dostęp chirurgiczny, co oznacza, że nie należy wykonywać zbyt małego nacięcia pierwotnego. Ponadto,...

Ogólnym celem tego badania było ustanowienie kontrolowanej i powtarzalnej metody mikrochirurgicznej do zadawania i ostrego SCI aksolotlowi (Ambystoma mexicanum), tworząc model regeneracyjnego uszkodzenia rdzenia kręgowego.
SCI to ciężki stan, który, w zależności od poziomu i zakresu, powoduje niepełnosprawność neurologiczną kończyn wraz z upośledzoną kontrolą pęcherza i jelit1,2,3. Większość SCI jest wynikiem urazów o wysokiej energii, takich jak wypadki drogowe i upadki4,5. Rany ostrymi narzędziami zdarzają się bardzo rzadko. Dlatego najczęstszym typem urazu makroskopowego są stłuczenia.
Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) ssaków jest tkanką nieregeneracyjną, dlatego nie obserwuje się odbudowy tkanki neurologicznej po SCI6,7,8. Z drugiej strony niektóre zwierzęta mają intrygującą zdolność do regeneracji tkanek, w tym tkanki OUN. Jednym z tych zwierząt jest aksolotl. Jest szeroko stosowany w badaniach biologii regeneracyjnej i jest interesujący w regeneracji rdzenia kręgowego, ponieważ jest kręgowcem9,10,11,12.
Większość badań SCI u aksolotla jest przeprowadzana jako amputacja całego ogona lub ablacja większej części rdzenia kręgowego9,10,11,12. Niedawno opublikowano nowe badanie na temat urazów13, które lepiej naśladuje sytuacje kliniczne. Podczas gdy całkowita amputacja wyrostka u aksolotla skutkuje pełną regeneracją, niektóre zjawiska regeneracyjne nieoparte na amputacji są zależne od krytycznego defektu wielkości (CSD)14,15. Oznacza to, że urazy przekraczające próg krytyczny nie są regenerowane. Aby opracować model regeneracyjny o wyższej klinicznej wartości translacyjnej, w ramach tego badania zbadano, czy uraz o średnicy 2 mm przekroczyłby limit CSD.
Ta metoda jest istotna dla badaczy pracujących nad regeneracją rdzenia kręgowego w małych modelach zwierzęcych, zwłaszcza u aksolotlów. Co więcej, może mieć bardziej ogólne zainteresowanie, ponieważ pokazuje sposób wykorzystania standardowego sprzętu laboratoryjnego do opracowania mechanizmu urazu, który jest odpowiedni do stosowania u małych zwierząt w ogóle.

<table><tbody><tr><td>25 g niestandardowy pręt opadający</td><td>na zamówienie domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rura PVC 30 mm</td><td>na zamówienie domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-64-1</td><td>Propanon</td></tr><tr><td>Aksolotl (Ambystoma mexicanum)</td><td>Exoterra GmbH</td><td>N/A</td><td>12-22 cm i 10 g - 80 g, Wszystkie szczepy (dziki, melanoidowy, biały, albinos, transgeniczny biały z GFP)</td></tr><tr><td>Benzokaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94-09-7</td><td>4-aminobenzoesan etylu</td></tr><tr><td>Electromaget</td><td>niestandardowa domowa Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2010</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Excel 2010 lub nowszy</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>ImageJ 1.5e lub nowszy. Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty mikrochirurgiczne</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kleszcze i nożyczki</td></tr><tr><td>MS550s</td><td>Fujifilm, Visualsonics</td><td>MS550s</td><td>40 MHz częstotliwość środkowa, przetwornik</td></tr><tr><td>MS700</td><td>Fujifilm, Visualsonics</td><td>MS700</td><td>50 MHz częstotliwość środkowa, przetwornik</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>dowolny producent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miękka ściereczka</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dowolna miękka tkanina o wymiarach około 70 x 55 cm2 np. ściereczka do naczyń</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>stereoskopowy</tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>Fujifilm, Visualsonics</td><td>Vevo 2100</td><td>System ultrasonograficzny wysokiej częstotliwości</td></tr></tbody></table>

stłuczenie uszkodzenie rdzenia kręgowego poprzez mikrochirurgiczną laminektomię w regeneracyjnym aksolotlu

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

Celem tego badania jest ustanowienie ustandaryzowanego i powtarzalnego modelu regeneracyjnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u aksolotla (Ambystoma mexicanum). Większość klinicznych urazów rdzenia kręgowego występuje jako urazy o wysokiej energii, wywołujące urazy stłuczenia. Jednak większość badań nad rdzeniem kręgowym aksolotla przeprowadzono z ostrymi urazami. W związku z tym badanie to ma na celu opracowanie bardziej istotnego klinicznie modelu regeneracyjnego. Ze względu na ich imponującą zdolność do regeneracji prawie każdej tkanki, aksolotle są szeroko stosowane jako modele w badaniach regeneracyjnych i są szeroko stosowane w badaniach nad uszkodzeniem rdzenia kręgowego (SCI). W tym protokole aksolotle są znieczulane przez zanurzenie w roztworze benzokainy. Pod mikroskopem wykonuje się nacięcie kątowe obustronnie na poziomie ogonowym do kończyn tylnych. Z tego nacięcia można wypreparować i odsłonić wyrostki kolczyste. Za pomocą kleszczy i nożyczek wykonuje się dwupoziomową laminektomię, odsłaniając rdzeń kręgowy. Konstruowane jest niestandardowe urządzenie urazowe składające się z opadającego pręta w cylindrze, a urządzenie to służy do wywoływania kontuzji rdzenia kręgowego. Nacięcia są następnie zszywane, a zwierzę dochodzi do siebie po znieczuleniu. Podejście chirurgiczne jest skuteczne w odsłanianiu rdzenia kręgowego. Mechanizm urazu może powodować urazy stłuczenia rdzenia kręgowego, co potwierdza histologia, rezonans magnetyczny i badanie neurologiczne. Wreszcie rdzeń kręgowy regeneruje się po urazie. Krytycznym etapem protokołu jest usunięcie wyrostków kolczystych bez powodowania uszkodzeń rdzenia kręgowego. Ten krok wymaga przeszkolenia, aby zapewnić bezpieczną procedurę. Co więcej, zamknięcie rany jest w dużym stopniu uzależnione od tego, czy nie spowoduje to niepotrzebnych uszkodzeń skóry podczas nacięcia. Protokół przeprowadzono w randomizowanym badaniu z udziałem 12 zwierząt.

Celem protokołu jest wywołanie urazu rdzenia kręgowego (SCI), który doprowadzi do paraliżu funkcji motorycznych i sensorycznych w odcinku gorszym (ogonowym) względem miejsca urazu. Ponieważ aksolotl posiada zdolność do regeneracji, przywraca on funkcje w ciągu kilku tygodni, co pozwala badaczom na analizę regeneracji ośrodkowego układu nerwowego w krótkim przedziale czasowym.
Wszystkie zwierzęta pozostawały pod narkozą przez 45 min; nie odnotowano przypadków przedwczesnego wybudzenia. Wszystki...

Ten manuskrypt przedstawia protokoły chirurgicznego zadawania kontrolowanych i ostrych uszkodzeń rdzenia kręgowego regeneracyjnemu aksolotlowi (Ambystoma mexicanum).

Stłuczenie Uszkodzenie rdzenia kręgowego poprzez mikrochirurgiczną laminektomię w regeneracyjnym aksolotlu

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

Protokół ten jest pierwszym, który wprowadza standaryzowany uraz typu stłuczenia w badaniach nad regeneracją rdzenia kręgowego aksolotl. Główną zaletą tej techniki jest to, że naśladuje traumę obserwowaną w codziennej klinice, zwiększając prawdopodobieństwo, że przyszłe odkrycie będzie można przełożyć. Urządzenie do leczenia kontuzji może być stosowane w każdym innym modelu urazu rdzenia kręgowego u małych zwierząt.Technika chirurgiczna jest trudna, zwłaszcza laminektomia. Dlatego zaleca się przeszkolenie procedury na dużej liczbie zwierząt ex vivo przed przejściem do chirurgii in vivo. Na początek ustaw stół chirurgiczny, umieszczając standardową szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym, na wierzchu tkaniny chirurgicznej.Umieść znieczulonego aksolotla w pozycji leżącej na szalce Petriego i zawiń go w ręczniki papierowe, tak aby ogon był odsłonięty. Zidentyfikuj tylne kończyny i użyj pary mikronożyczek, aby pierwsze nacięcie było do nich doogonowe. Wykonaj pionowe nacięcie od stępki, aż do wyczucia kostnej wypukłości wyrostków kolczystych.Rozciągnij cięcie na boki, tak aby nacięcie przebiegało przez całą szerokość ogona i chwytało wyrostki kolczyste kleszczami, aby zapewnić odpowiednią głębokość. Następnie przedłuż pionowe nacięcie o jeden milimetr poniżej wyrostka kolczystego po obu stronach. Umieść zwierzę na jednej stronie i zaczynając od brzusznego punktu pionowego nacięcia, wykonaj poziome nacięcie o długości około 15 milimetrów w przypadku zwierząt o wadze od 10 do 20 gramów.Użyj nożyczek, aby natychmiast wyciąć przez poziome nacięcie, aż kręgosłup zostanie wyczulony w linii środkowej. Następnie przewróć zwierzę na drugą stronę i powtórz proces. Po wypreparowaniu w głębokiej płaszczyźnie przyśrodkowej z obu stron, przeprowadź sekcję przez linię środkową, aby połączyć dwa poziome nacięcia.Następnie przesuń wolny kawałek ogona i stępki na bok, aby odsłonić wyrostki kolczyste. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej z głową skierowaną w stronę niedominującej strony chirurga i użyj kleszczy, aby chwycić wyrostki kolczyste, tylko ogonowe do kończyn tylnych. Delikatnie unieś w górę i w kierunku głowy zwierzęcia.Umieść ostrza mikronożyczek poziomo wokół procesu i delikatnie je przetnij, odsłaniając rdzeń kręgowy. Chwyć wyrostek kolczysty ogonowy do właśnie usuniętego i powtórz proces. Konieczne jest utrzymanie stałego podnoszenia wyrostka kolczystego, aby upewnić się, że nie spowoduje on uszkodzenia rdzenia kręgowego po usunięciu.Jeśli odsłonięty obszar nie jest wystarczająco szeroki, użyj dwóch par kleszczy, aby chwycić blaszki po obu stronach rdzenia kręgowego i przekręć je na boki delikatnym ruchem. Podczas usuwania wyrostka kolczystego może być konieczne zrobienie tego w kilku krokach. Dlatego odsłonięcie rdzenia kręgowego może potrwać kilka minut.Aby wprowadzić uraz typu stłuczeń, użyj szalki Petriego, aby przenieść zwierzę na oddział urazowy i poświeć latarką na rdzeń kręgowy. Następnie umieść cylinder jednostki urazowej stłuczenia nad odsłoniętym rdzeniem kręgowym za pomocą mikroregulatorów i opuść cylinder, aż znajdzie się na poziomie blaszek. Przymocuj spadający pręt do elektromagnesu i umieść żądany cylinder regulacji wysokości opadania na jednostce urazowej.Następnie umieść spadający pręt na cylindrze, wyłącz elektromagnes, aby upuścić pręt na odsłonięty rdzeń kręgowy i użyj regulacji wysokości, aby podnieść pręt z powrotem do góry. Jeśli wprowadzisz ostry ran, przetnij rdzeń kręgowy w idealnym pionowym cięciu, a następnie powtórz cięcia dwa milimetry do ogonowej strony ciała. Poczuj, jak ostrza nożyczek ocierają się o brzuszną część kanału kręgowego, aby upewnić się, że nacięcia są kompletne, i podnieś kawałek rdzenia kręgowego z kanału.Aby zamknąć ranę pooperacyjną, należy umieścić 10-punktowe szwy nylonowe O od najbardziej ogonowej części nacięcia poziomego, zamykając rany w jednej warstwie i kierując się w stronę pionowej części nacięcia. Po osiągnięciu kąta obróć szalkę Petriego i zszyj drugie poziome nacięcie, a następnie załóż szwy na pionowe nacięcia. Przed zakończeniem znieczulenia użyj ultradźwięków o wysokiej częstotliwości, aby uzyskać obrazy urazu.Dopasuj końcówkę przetwornika do osi długości zwierzęcia i zanurz go w roztworze benzokainy, aż znajdzie się zaledwie kilka milimetrów nad kilem za tylnymi kończynami zwierzęcia. Zidentyfikuj miejsce urazu i uzyskaj obrazy zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Po zakończeniu umieść aksolotla z powrotem w roztworze wolnym od znieczulenia, zanurzając szalkę Petriego w słodkiej wodzie o głębokości pięciu centymetrów i pozwalając zwierzęciu zsunąć się.Urazy rdzenia kręgowego powstałe przy użyciu tego protokołu zostały zweryfikowane przy użyciu barwienia hematoksyliną i eozyną na uszkodzonych i pozorowanych aksolotlach. Aby potwierdzić regenerację, wykonano skrawki histologiczne dziewięć tygodni po urazie. Zdjęcia pokazały przywrócone połączenie rdzenia kręgowego u rannych zwierząt.Kontuzja i regeneracja Śledzimy również badanie funkcji neurologicznych. Reakcja zwierzęcia na stymulację ogona była oceniana przy wyższych wynikach wskazujących na wyższe funkcje czuciowe dotykowe i nocyceptywne. Wśród rannych zwierząt nastąpiła utrata funkcji neurologicznych trzy tygodnie po urazie i stopniowa odbudowa w ciągu dziewięciu tygodni.Uraz rdzenia kręgowego został również uwidoczniony za pomocą ultradźwiękowego obrazowania graficznego, co pozwoliło na wizualizację tętnicy grzbietowej jako markera integralności naczynia. Rezonans magnetyczny w wysokim polu wykonano natychmiast po urazie i po trzech, sześciu i dziewięciu tygodniach. Skany te były w stanie uwidocznić obrzęk i przywrócenie integralności rdzenia kręgowego.Skany wykonane bezpośrednio po urazie były podatne na zakłócenia. Cierpliwa i skrupulatna operacja utoruje drogę do pomyślnego wyniku po laminektomii bez przedwczesnego uszkodzenia rdzenia kręgowego. Po tej procedurze można zastosować kilka metod in vivo, takich jak obrazowanie i techniki elektrofizjologiczne.

contusion-spinal-cord-injury-via-microsurgical-laminectomy

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Transplantacja prekursorów neuronalnych jest obiecującą strategią ochrony i/lub zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych szyjnych neuronów ruchowych nerwu przeponowego w przypadku urazów rdzenia kręgowego (SCI) oraz w przebiegu stwardnienia bocznego zanikowego (ALS), będącego chorobą neuronów ruchowych. Przedstawiamy protokół dostarczania komórek do przedniego rogu szyjnego rdzenia kręgowego w gryzoniach w modelach ALS i SCI.

Wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Źródło: Elzat, E. Y. Y.,  i wsp., Ustalanie modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy w oparciu o technikę minimalnie inwazyjną. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia metodę wywoływania kontuzji rdzenia kręgowego na poziomie T9 w modelu mysim przy użyciu platformy współosiowej urazu rdzenia kręgowego. Na rdzeń kręgowy na poziomie T9 upuszczany jest ciężar, który tworzy stłuczenie, które natychmiast powoduje przebarwienie i obrzęk tkanek.

Wywoływanie stłuczenia rdzenia kręgowego w modelu mysim za pomocą platformy koncentrycznej po urazie rdzenia kręgowego

Uraz rdzenia kręgowego to traumatyczny stan, który powoduje ciężką zachorowalność i wysoką śmiertelność. W niniejszej pracy szczegółowo opisano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy, po którym następuje przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych.

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Tutaj demonstrujemy działanie modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u dorosłej myszy, która oszczędza centralną niszę kanałową, w której znajdują się endogenne nerwowe komórki macierzyste (NSC). Pokazujemy, w jaki sposób test neurosfery można wykorzystać do ilościowego określenia aktywacji i migracji ostatecznych i pierwotnych NSC po urazie.

Test neurosfery do oceny endogennej aktywacji nerwowych komórek macierzystych w mysim modelu minimalnego uszkodzenia rdzenia kręgowego

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia ograniczonego czasowo i przestrzennie nokautowania genów w rdzeniu kręgowym aksolotla poprzez wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego rdzenia kręgowego, a następnie elektroporację.

Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9

Przecięcie rdzenia kręgowego kijanki Xenopus laevis jest odpowiednią metodą do badania uszkodzenia rdzenia kręgowego i regeneracji poprzez wykonanie poprzecznego cięcia, które całkowicie przecina rdzeń kręgowy na poziomie klatki piersiowej.

Przecięcie rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis

Tutaj opisujemy nową, szybką technikę modelowania uszkodzenia otwartego rdzenia kręgowego u szczurów, która eliminuje laminektomię. Hemisekcję boczną wykonuje się podczas oglądania przez mikroskop. Technika ta jest wszechstronna i może być również stosowana w odcinku szyjnym, piersiowym i lędźwiowym rdzenia kręgowego innych zwierząt.

Minimalnie inwazyjna, szybka technika hemisekcji bocznej rdzenia kręgowego do modelowania otwartych urazów rdzenia kręgowego u szczurów

Minimalnie inwazyjne techniki i proste urządzenie laboratoryjne poprawiają odtwarzalność modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego, zmniejszając uszkodzenia operacyjne u zwierząt doświadczalnych i umożliwiając utrzymanie anatomicznej morfologii. Metoda ta jest opłacalna, ponieważ wiarygodne wyniki i powtarzalna procedura ułatwiają badanie mechanizmów naprawy choroby.

Ustalenie modelu urazu rdzenia kręgowego stłuczenia u myszy w oparciu o technikę minimalnie inwazyjną

Celem niniejszej pracy było ujednolicenie bezpiecznego i powtarzalnego podejścia chirurgicznego do przeprowadzenia całkowitej poprzecznej amputacji żuchwy u Ambystoma mexicanum w celu badania regeneracji tkanki czaszkowo-twarzowej.

Projektowanie i standaryzacja modelu urazu żuchwy w celu badania regeneracji tkanek czaszkowo-twarzowych w modelu Ambystoma mexicanum

Naucz się mikrochirurgicznej laminektomii w aksolotlu Ambystoma mexicanum, aby wprowadzić kontrolowane uszkodzenie rdzenia kręgowego. Ta metoda naśladuje urazy kliniczne i wspiera badania nad regeneracją.

Stłuczenie Uszkodzenie rdzenia kręgowego poprzez mikrochirurgiczną laminektomię w regeneracyjnym aksolotlu

Przeglądaj więcej filmów