Hodowle organoidów prostaty jako narzędzia do translacji genotypów i profili mutacji na odpowiedzi farmakologiczne

Prezentowany tutaj jest protokół do badania reakcji farmakologicznych w organoidach nabłonka prostaty. Organoidy bardzo przypominają biologię in vivo i podsumowują genetykę pacjenta, co czyni je atrakcyjnymi systemami modelowymi. Organoidy prostaty można ustalić z prostaty typu dzikiego, genetycznie modyfikowanych modeli myszy, łagodnych tkanek ludzkich i zaawansowanego raka prostaty.

Protokół ten zapewnia standardowe i powtarzalne metody oceny odpowiedzi farmakologicznych w hodowlach organoidów prostaty. Hodowle organoidów gruczołu krokowego zapewniają system in vitro, który zachowuje wiele aspektów biologii in vivo i odpowiedzi farmakologicznej, umożliwiając komórkom przyjęcie trójwymiarowej struktury w macierzy błony podstawnej. Jesteśmy szczególnie podekscytowani wykorzystaniem tych metod do oceny, w jaki sposób genotyp dyktuje odpowiedź farmakologiczną w prostacie i do modelowania oporności na leki.

Metody te można zastosować do systemów hodowli organoidów, które wykorzystują metodę posiewu kopułowego. Jednak składniki w pożywce, takie jak czynniki wzrostu, mogą się różnić w zależności od rodzaju tkanki. Demonstracja wizualna pozwoli na bardziej szczegółowe i szczegółowe omówienie etapów protokołu i tego, czym różnią się one od wielu innych opublikowanych systemów hodowli organoidów dostępnych dla badaczy.

Hodowla organoidów jest zazwyczaj bardziej czasochłonna niż dwuwymiarowa hodowla komórkowa. Pamiętaj, aby przeznaczyć dodatkowy czas na te metody. Zacznij od wyizolowania organoidów prostaty z tkanki myszy lub człowieka.

Zmielić i enzymatycznie trawić tkankę, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, a następnie zebrać komórki przez odwirowanie w ilości 300 razy g przez pięć minut. Policz komórki i ponownie zawieś je w macierzy błony podstawnej. Następnie połóż je w odpowiedniej gęstości w kopułach matrycy na wstępnie ogrzanych płytkach z kultur organoidowych.

Kopuły powinny być oddalone od siebie o dwa milimetry i od strony studni. Po zestaleniu delikatnie dodaj pożywkę z boku studzienki, aby uniknąć uszkodzenia matrycy. Po zastygnięciu kopuł dodaj media na wierzchu kopuły, tak aby były całkowicie zakryte.

Hoduj organoidy do pożądanej ilości do dalszych zastosowań, określając liczbę komórek za pomocą standardowych metod liczenia. Gdy organoidy są gotowe do użycia, pobrać pożywkę za pomocą pipety Pten00 i pipetować ją w górę iw dół, aby rozbić matrycę błony podstawnej. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwirować 300 razy g przez pięć minut.

Odessać supernatant i przemyć osad komórkowy pięcioma mililitrami PBS. Powtórz wirowanie, a następnie ponownie zawieś osad w czterech mililitrach trypsyny zastępującej i pozostaw do strawienia przez pięć do 10 minut, wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj równą objętość pożywki organoidowej z 10% FBS, aby zahamować wymianę trypsyny i odwiruj probówkę z prędkością 300 razy g przez pięć minut.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze PBS. Następnie odcedź komórki za pomocą filtra o średnicy 40 mikrometrów, aby zapewnić zawieszenie pojedynczych komórek i policz je za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 100 komórek na 10 mikrolitrów za pomocą pożywki organoidowej z 10-mikromolowym inhibitorem kinazy rho Y27632.

Przenieś 1 100 komórek do nowej stożkowej rurki i dodaj 285 mikrolitrów matrycy błony podstawnej, co da 70% stężenie matrycy. Następnie umieść komórki w 35 mikrolitrach kopuł matrycy na wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytce, upewniając się, że na próbce znajduje się od trzech do pięciu powtórzeń. Odwróć płytkę i umieść ją w inkubatorze komórkowym, aby zestalić matrycę podstawową.

Po 10 minutach wyjąć płytkę z inkubatora i dodać pożywkę zawierającą inhibitor kinazy rho. Odświeżaj pożywkę co dwa dni, a po siedmiu dniach policz liczbę organoidów utworzonych na kopułę i oblicz procent organoidów utworzonych z całkowitej liczby komórek. Po wyizolowaniu organoidów, jak opisano wcześniej, zasiewaj od 1 000 do 10 000 komórek w kopule matrycy, wykorzystując wydajność tworzenia organoidów i szybkość wzrostu jako wskaźnik zastępczy do określenia ostatecznej liczby komórek.

Następnie wysiewaj 35 mikrolitrów kopuł matrycowych na 24-dołkowej płytce i pozwól kopule zestalić się. Dodać pożywkę zawierającą inhibitor kinazy rho i wybrany lek. Wykonać przyrost log 10 w celu określenia połowy maksymalnego stężenia hamującego, używając jako kontroli nośnika, w którym lek został rozpuszczony.

Odświeżaj pożywkę co dwa do trzech dni i analizuj organoidy w siódmym dniu, aby określić odpowiedź farmakologiczną na lek, wykonując test żywotności komórek, jak opisano w manuskrypcie. Aby pokryć fragmenty organoidów bez trypsynizacji, użyj pipety Pten00 do zasysania pożywki i pipety w górę iw dół, aby rozbić macierz błony podstawnej. Gdy matryca jest całkowicie rozerwana, przenieś zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj przy 300 razy g przez pięć minut.

Odessać supernatant i dodać pięć mililitrów PBS. Po umyciu ponownie zawiesić organoidy w jednym mililitrze PBS i rozbić organoidy przez rozcieranie szklaną pipetą Pasteura. Określić ilościowo liczbę fragmentów organoidów i zasiać pięć powtórzeń ze 100 fragmentami, jak opisano wcześniej.

Siedem dni później wykonaj test żywotności komórek zgodnie ze wskazówkami z manuskryptu. Komórki podstawne prostaty typu dzikiego wykazywały lepsze tworzenie organoidów w porównaniu z komórkami luminalnymi. Niewielki wzrost tworzenia organoidów osiągnięto dzięki utracie Pten lub P53 za pośrednictwem CRISPR-Cas9 i utracie obu tych elementów w celu dalszego zwiększenia zdolności do tworzenia.

Wpływ cząsteczek antyandrogennych na wzrost badano w mysich organoidach o różnych genotypach. Utrata P53 nie powodowała oporności na cząsteczki antyandrogenne, ale utrata Pten zwiększała oporność. Podwójna utrata P53 i Pten spowodowała jednak całkowitą oporność.

Hamowanie receptora androgenowego również zmieniło fenotypy. Organoidy z delecją Pten i delecją P53 typu dzikiego wykazały zmniejszenie wielkości światła organoidu, podczas gdy organoidy z utratą zarówno Pten, jak i P53 były fenotypowo nienaruszone. Zgodnie z oczekiwaniami, gdy komórki te zostały przeszczepione podskórnie w bok, rosły tylko podwójnie deleczowane organoidy Pten i P53.

Dwa odrębne organoidy ludzkiego raka prostaty MSKPCA2 i MSKPCA3 zostały przetestowane pod kątem ich odpowiedzi na cząsteczki antyandrogenne. Namnażanie MSKPCA2 organoidów było silnie zahamowane, podczas gdy MSKPCA3 organoidy pozostały nienaruszone. MSKPCA2 wykazywał ekspresję wysokiego poziomu receptorów androgenowych i FKBP5, a także charakterystycznych białek luminalnych.

MSKPCA3 również wykazywały ekspresję markerów bazalnych i mezenchymalnych i nie wykazywały ekspresji FKBP5, co sugeruje, że te organoidy modelują fenotyp niezależny od androgenów światła. Aby zachować żywotność, organoidy muszą być okresowo rozbijane przez trypsynizację lub rozcieranie szklaną pipetą. Częstość zależy od pochodzenia gatunkowego i genotypu.

Każdy rodzaj sekwencjonowania nowej generacji lub eksperymentu proteomicznego można przeprowadzić zgodnie z opisanymi procedurami. Eksperymenty te miały na celu zbadanie molekularnych podstaw fenotypów i reakcji farmakologicznych. Ta trójwymiarowa technika hodowli organoidów pozwala naukowcom badać reakcje farmakologiczne w ściśle kontrolowanym kontekście genetycznym in vitro.

Może to być wiarygodna alternatywa dla długotrwałych badań in vivo.