Przeszczep inżynierii tkankowej do obwodowej rekonstrukcji przełyku u szczurów
10 lutego 2020
Rekonstrukcja przełyku jest wymagającą procedurą, a opracowanie inżynierii tkankowej przełyku, która umożliwia regenerację błony śluzowej i mięśni przełyku i która może być wszczepiona jako sztuczny przeszczep, jest konieczna. Tutaj przedstawiamy nasz protokół generowania sztucznego przełyku, w tym produkcję rusztowań, hodowlę bioreaktorów i różne techniki chirurgiczne.
Naprawa obwodowa przełyku jest technicznie trudna w modelu szczurzym, co wymaga opracowania przełyku według inżynierii tkankowej, która umożliwia regenerację błony śluzowej i mięśni przełyku bez wycieku zespolenia przełyku. Jako model pilotażowy wdrożyliśmy dwuwarstwowe rusztowanie rurowe, składające się z wewnętrznego nanowłókna i zewnętrznej nici druku 3D w połączeniu z zespoleniem mikronaczyniowym w celu zminimalizowania wycieku śliny po przeszczepie. Konwencjonalna standardowa rekonstrukcja przełyku wiąże się z szerokim zakresem powikłań i zachorowalności.
W związku z tym inżynieria tkankowa przełyku może być obiecującą alternatywą dla rozwoju modeli przełyku natywnego pacjenta. Połączenie rusztowania hybrydowego, uprawy w bioreaktorze i doustnego systemu żywienia można zastosować do każdego systemu, który ma podobnie zanieczyszczone środowisko z ciągłym ciśnieniem mechanicznym. Zacznij od wysterylizowania rusztowania przełyku wydrukowanego w 3D z godzinną ekspozycją na światło ultrafioletowe, 10-minutowym moczeniem w etanolu i trzema praniami PBS.
Po ostatnim płukaniu umieścić dwuwarstwowe rusztowanie rurowe na nieprzylegającej 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej i delikatnie, ale równomiernie dodać jeden razy 10 do sześciu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej na mililitr macierzy błony podstawnej uzupełnionej pożywką wzrostową do wewnętrznej powierzchni rusztowania. Użyj systemu bioreaktora z przepływem pulsacyjnym, aby mocno przymocować rusztowanie rurowe z nasionami komórek do akrylowego uchwytu w komorze hodowlanej bioreaktora i dodaj 500 mililitrów pożywki wzrostowej do komory. Następnie nałóż 1 dyn na centymetr kwadratowy naprężenia ścinającego wywołanego przepływem w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla.
Po pięciu dniach użyj zestawu do oznaczania żywotności LIVE/DEAD, aby określić odpowiedzi komórek na wewnętrznej powierzchni rusztowania zgodnie ze standardowymi protokołami i zobrazować komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego należy potwierdzić brak reakcji na odruch pedałowania u znieczulonego szczura i umieścić zwierzę w pozycji leżącej na sterylnym serwecie. Użyj maszynki do strzyżenia, aby usunąć włosy z miejsca operowanego i zdezynfekuj odsłoniętą skórę sekwencyjnymi peelingami BETADINE i 70% etanolem.
W celu umieszczenia rurki T wykonaj nacięcie skóry i mięśni w linii środkowej brzucha szczura i użyj ostrza skalpela, aby utworzyć trzymilimetrowy otwór w przedniej ścianie żołądka. Włóż końcówkę silikonowej rurki T do miejsca ubytku, aby przymocować ją do ściany żołądka i ostrożnie przymocuj rurkę do tkanki mięśniowej żołądka. Zszyj ścianę brzucha szwem VICRYL 4-0.
Ostrożnie włóż dystalny koniec wszczepionej rurki T przez tunel podskórny do tylnej części szyi i użyj angiocewnika, aby połączyć nasadkę heparyny z końcem rurki T, aby zapobiec cofaniu się treści żołądka. Gdy czepek jest na miejscu, użyj szwów poliglaktynowych 4-0, aby zamknąć wszystkie warstwy skóry brzucha i umieść szczura w klatce metabolicznej z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. Tydzień po założeniu rurki T przygotuj szczura do operacji, jak pokazano.
Umieść szczura pod mikroskopem i wykonaj przednie środkowe nacięcie szyi w odsłoniętej zdezynfekowanej skórze. Oddziel mięśnie paska, aby odsłonić strukturę tchawiczo-przełykową. Odizoluj lewą stronę przełyku od tchawicy.
Ostrożnie oddziel górną część przełyku od tarczycy i za pomocą nożyczek chirurgicznych stwórz pięciomilimetrowy ubytek o pełnym obwodzie zawierający wszystkie warstwy przełyku. Następnie włóż szew 9-0 między prawy dolno-tylny brzeg pozostałości górnego przełyku i rusztowania i kontynuuj szycie od prawej do lewej między pozostałością górnego przełyku a rusztowaniem, aby utworzyć mikrozespolenie na górnym końcu dystalnego ubytku przełyku. Następnie zespolej rusztowanie w taki sam sposób, jak górny brzeg pozostałości dolnego przełyku.
Po zakończeniu zespolenia należy położyć otaczający płat tarczycy na miejscu przeszczepu, aby zapewnić zaopatrzenie naczyniowe i stabilne utrzymanie przeszczepu. Następnie zszyj podskórną tkankę mięśniową i skórną szwem 4-0 VICRYL i umieść szczura w klatce metabolicznej na urządzeniu grzewczym na podczerwień z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. Po równomiernym nałożeniu na wewnętrzną ścianę rusztowania za pomocą wstrzyknięcia, macierz błony podstawnej osadzonej w ludzkich mezenchymalnych komórkach macierzystych wykazuje oczekiwaną morfologię mezenchymalnych komórek macierzystych, ocenianą za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
Po przeszczepieniu przełyku szczurom z pełnoobwodowymi wadami przełyku, jak pokazano, przeszczep jest pokryty płatem tarczycy w celu stabilnego mocowania i zaopatrzenia naczyniowego w miejsce implantacji. Szczury, którym przeszczepiono przełyk, pozostają na poziomie 340 gramów do około dziewięciu dni po zabiegu, w którym to momencie zwierzęta gwałtownie tracą na wadze z różnych przyczyn, co prowadzi do śmierci do 15 dnia. Chociaż u większości szczurów rozwija się niedrożność przełyku spowodowana przez kule włosowe, ogólnie rzecz biorąc, nie ma poważnych dowodów na perforację, nieszczelność zespolenia z przetoką, nagromadzenie surowiczaka, tworzenie ropnia lub martwicę otaczających tkanek miękkich u żadnego zwierzęcia doświadczalnego.
Ponowny nabłonek miejsca przeszczepu można potwierdzić barwieniem immunofluorescencyjnym na keratynę, a zregenerowaną warstwę kolagenu i włókna elastyny można wyraźnie zaobserwować za pomocą barwienia trichromowego Massona. O regeneracji warstwy mięśniowej przełyku świadczy również obfita neowaskularyzacja, oceniana za pomocą analizy immunohistochemicznej desminy. Powodzenie tej procedury opiera się na stabilnym utrzymaniu rurki T poprzez zamocowanie za szyją w celu zapewnienia odżywiania podczas rekonstrukcji przełyku.
Aby przezwyciężyć wczesną śmiertelność typową dla tej procedury, po implantacji przełyku można zastosować technologię organoidów lub wczesnego unaczynienia, aby wspomóc funkcjonalną rekonstrukcję przełyku.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Rekonstrukcja przełyku jest złożoną procedurą, a opracowanie inżynieryjnie tkankowego przełyku ma kluczowe znaczenie dla skutecznej regeneracji. Niniejszy artykuł przedstawia protokół tworzenia sztucznego przełyku, koncentrując się na produkcji rusztowania i technikach chirurgicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Medycyna regeneracyjna
- Techniki chirurgiczne
Wstęp
- Okoliczna naprawa przełyku jest trudna pod względem technicznym.
- Standardowa rekonstrukcja przełyku wiąże się z wysokim odsetkiem powikłań.
- Rozwiązania z zakresu inżynierii tkankowej mogą zapewnić lepsze wyniki.
- Hybrydowe rusztowania mogą wspierać regenerację przełyku.
Cel badania
- Opracowanie inżynieryjnie tkankowego przełyku, który minimalizuje powikłania.
- Wdrożenie dwuwarstwowego modelu rusztowania do naprawy przełyku.
- Zbadanie metod zwiększających regenerację tkanek przełyku.
Zastosowane metody
- Tworzenie dwuwarstwowego rusztowania rurkowatego z wykorzystaniem nanowłókien i druku 3D.
- Anastomoza mikro naczyniowa w celu zmniejszenia wycieku śliny po przeszczepie.
- Kultywacja w bioreaktorze w celu wspierania wzrostu tkanki.
- Sterylizacja rusztowań za pomocą światła UV i etanolu.
Główne wyniki
- Rusztowanie hybrydowe skutecznie wspomaga regenerację tkanki przełyku.
- Zastosowanie techniki anastomozy mikro naczyniowej pozwoliło na zminimalizowanie przecieków.
- Pomyślne wdrożenie systemu żywienia doustnego w modelu.
- Wykazany potencjał do zastosowania w środowiskach zanieczyszczonych.
Wnioski
- Przełyk wytworzony metodami inżynierii tkankowej wykazuje potencjał w zastosowaniach klinicznych.
- Rusztowania hybrydowe mogą znacząco poprawić wyniki chirurgiczne.
- Dalsze badania są niezbędne w celu optymalizacji technik i materiałów.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Inżynierowane tkankowo przeszczepy przełyku odpowiadają na krytyczną, niezaspokojoną potrzebę w medycynie regeneracyjnej w zakresie naprawy defektów okrężnych, gdzie konwencjonalne podejścia charakteryzują się wysokim odsetkiem niepowodzeń ze względu na przecieki anastomotyczne i słabą epitelializację. Ten model szczurzy demonstruje strategię hybrydowego rusztowania łączącą nanowłókna poliuretanowe, wydrukowaną w technologii 3D polikaprolakton, prekondycjonowanie w bioreaktorze z użyciem mezenchymalnych komórek macierzystych oraz pokrycie płatem unaczynionym w celu wsparcia regeneracji śluzówki i mięśni. Podejście to stanowi przedkliniczną platformę do ograniczania ryzyka strategii inżynierii tkankowej przełyku przed skalowaniem do większych modeli lub badań umożliwiających złożenie wniosku o badanie nowego leku (IND).
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie efektów parakrynnych mezenchymalnych komórek macierzystych w procesie regeneracji nabłonka i mięśni gładkich w mechanicznie aktywnym środowisku światła naczyniowego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje architekturę rusztowania oraz gęstość zasiewu komórek w celu zapewnienia powtarzalnej oceny integracji przeszczepu i stratyfikacji tkanki.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych punktów końcowych badania histologicznego (nabłonek keratin+, mięśnie desmin+, odkładanie elastyny, neowaskularyzacja CD31+) w celu oceny skuteczności przeszczepu w oparciu o biomarkery.
- Wartość operacyjna: Ustanawia standaryzowany protokół bioreaktora perfuzyjnego do prekondycjonowania rusztowań zasianych komórkami macierzystymi w warunkach fizjologicznie istotnego naprężenia ścinającego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Badanie augmentacji płatem unaczynionym jako strategii poprawiającej przeżywalność przeszczepu w zanieczyszczonym, dynamicznym środowisku poddanym siłom perystaltycznym.
- Wartość operacyjna: Walidacja tymczasowego żywienia wspomaganego przez gastrostomię jako elementu opieki okołoperacyjnej w celu zmniejszenia wczesnej zachorowalności w modelach rekonstrukcji przełyku.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsza praca wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, w którym projektowanie rusztowań oraz kondycjonowanie komórkowe wpływają na wybór wiodącego kandydata, natomiast wyniki implantacji warunkują decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac nad strategiami unaczynionych przeszczepów w regeneracji pustych organów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w regeneracji tkanek za pośrednictwem komórek macierzystych w dynamicznych środowiskach luminalnych poprzez kontrolowanie zmiennych, takich jak skład rusztowania i kondycjonowanie w bioreaktorze.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, multipleksowych odczytów histologicznych, umożliwiając bezpośrednie porównanie projektów rusztowań lub schematów dawkowania komórek.
- Analityka: Zapewnia wskaźniki regeneracji zrębu i nabłonka (gęstość włókien elastyny, pokrycie keratyną, grubość warstwy mięśniowej), które korelują z funkcjonalną drożnością przeszczepu.
- Badania translacyjne: Modeluje ciągłość od etapu laboratoryjnego do badań na dużych zwierzętach poprzez włączenie anastomozy chirurgicznej, pokrycia płatem i wsparcia żywieniowego — kluczowych zmiennych translacyjnych w rekonstrukcji przełyku.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy modularną platformę, w której materiały rusztowań, typy komórek i parametry bioreaktora mogą zostać dostosowane do rekonstrukcji innych organów rurkowatych (np. tchawicy, moczowodu).
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w interakcjach między nabłonkiem a mięśniami podczas regeneracji organów cewkowatych, umożliwiając spatiotemporalne śledzenie markerów specyficznych dla linii komórkowych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowany, gotowy do sterylizacji format rusztowania kompatybilny z procesami przetwarzania komórek zgodnymi ze standardami GMP.
- Wartość strategiczna: Uzasadnia dostosowane do ryzyka inwestycje w strategie augmentacji płatów unaczynionych lub organoidów poprzez kwantyfikację ich wpływu na przeżywalność przeszczepu powyżej dwóch tygodni.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia wczesną selekcję podejść do regeneracji przełyku w oparciu o dojrzałość histologiczną i neowaskularyzację w określonych odstępach czasu po operacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie wytwarzania rusztowań, pracy z komórkami macierzystymi oraz obsługi bioreaktora z przepływem pulsującym.
- Metoda zależy od dostępu do druku 3D, elektroprzędzenia oraz mikroskopii konfokalnej w celu walidacji strukturalnej i komórkowej.
- Konieczne jest zastosowanie ustandaryzowanych protokołów anastomozy chirurgicznej, pobrania płata i umieszczenia rurki gastrostomijnej przez wszystkich operatorów.
- Należy uwzględnić różnice międzygatunkowe w kinetyce gojenia i odpowiedzi immunologicznej podczas przenoszenia badań z modelu szczura na modele większych zwierząt.
- Badania są ograniczone przez wczesną śmiertelność pooperacyjną wynikającą z powikłań pozajadłowych (np. deficytów żywieniowych, niedrożności z powodu kulek z sierści), co podkreśla potrzebę udoskonalenia modeli opieki okołooperacyjnej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:27
Cell Seeding and Bioreactor Cultivation
2:51
Surgical Preparation
3:20
Gastrostomy Surgery
4:30
Esophageal Transplantation
6:18
Results: Representative Esophageal Transplantation and Reconstructed Esophagus Histological Analyses
8:02
Conclusion
