Name: Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Naucz się izolować komórki macierzyste z trójwymiarowych kultur sferoidalnych metodą retencji znaczników bez użycia biomarkerów. Ta technika umożliwia separację żywych komórek macierzystych od komórek potomnych w badaniach nad rakiem prostaty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Dziękujemy Instytutowi Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Illinois w Chicago za pomoc w sortowaniu komórek.

Wszystkie czynności związane z komórkami i przygotowaniem pożywek powinny być wykonywane z zachowaniem aseptyki w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC).
1. Hodowla i utrzymanie komórek HPrEC w 2D
<ol>
	<li>Pokryj szalki hodowlane o średnicy 100 mm 2 ml roztworu fibronektyny o stężeniu 2,5 μg/cm2 przez noc w temperaturze pokojowej (RT). Odessać roztwór i pozostawić szalki hodowlane do wyschnięcia na powietrzu w BSC przez 45 minut. Szalki hodowlane pokryte fibronektyną można przechowywać przez 2–4 tygodnie w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 9 ml pożywki do wzrostu komórek nabłonka gruczołu krokowego (np. PrEGM) do naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm pokrytego fibronektyną i utrzymywać naczynie w cieple w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę z zamrożonymi komórkami HPrEC (2 x 105/ml) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i ponownie zawiesić komórki w 10 ml ciepłego podłoża.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dokładnie zawiesić komórki w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej. Komórki nasienne przez pipetowanie 1 ml zawiesiny komórkowej bezpośrednio do pokrytego fibronektyną 100 mm naczynia hodowlanego zawierającego 9 ml wstępnie podgrzanej pożywki (całkowita objętość pożywki i komórek wynosi 10 ml). Umieścić szalki hodowlane z powrotem w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Uzupełniaj podłoże co 2 dni. W tym celu należy ostrożnie odessać wszystkie podłoża i dodać 10 ml świeżego, ciepłego podłoża.</li>
	<li>Po około 5 dniach upewnij się, że kultury są zlewające się w ~70–80%. Trawienie enzymatyczne przeprowadzić przez inkubację komórek z 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Zatrzymaj trawienie, dodając 3 ml ciepłego PBS zawierającego 10% FBS.</li>
	<li>Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze suchej masy. Odessać i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 30 ml ciepłej pożywki i równomiernie rozmieścić go w trzech nowych naczyniach hodowlanych o średnicy 100 mm pokrytych fibronektyną do następnego przejścia. 
	UWAGA: Pierwotne komórki HPrEC mogą być pasażowane ~3-5x bez zmiany ich charakterystyki komórek nabłonkowych. Fenotyp nabłonka bada się za pomocą ekspresji markerów komórek podstawnych nabłonka, cytokeratyny 5 i p63, za pomocą testów immunocytochemicznych/immunofluorescencyjnych (ICC/IF).</li>
</ol>
2. Etykietowanie HPrEC za pomocą barwników BrdU, CFSE lub Far Red
UWAGA: Komórki mogą przejść do kroku 2.1 lub kroku 2.2, po którym następuje transfer do hodowli prostasfery 3D, jak opisano w kroku 3.1.
<ol>
	<li>Pojedyncze znakowanie ogniw za pomocą BrdU
	<ol>
		<li>Hodowla 2 x 105 komórek HPrEC na pokrytych fibronektyną 100 mm szalkach hodowlanych z 10 ml ciepłej pożywki zawierającej 1 μM BrdU. Hoduj komórki przez 10 dni (przez dwa pasaże), aby zapewnić znakowanie wszystkich komórek, w tym komórek macierzystych prostaty i komórek progenitorowych.</li>
		<li>Po 10 dniach ostrożnie odessać pożywkę PrEGM zawierającą BrdU i przemyć komórki 5 ml ciepłego PBS. Powtórz 1x.</li>
		<li>Przeprowadź trawienie enzymatyczne przy użyciu 0,05% trypsyny/EDTA, jak opisano w krokach 1.7–1.8. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulowane komórki znakowane BrdU (5 x 104) w 500 μl lodowatej (1:1) matrycy/pożywki błony podstawnej i przenieść do hodowli prostasfery 3D (opisanej w kroku 3.1) na 5 dni, aby umożliwić wymywanie BrdU podczas tworzenia sferoidy (~6 cykli komórkowych).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwójne znakowanie komórek barwnikami BrdU i CFSE lub Far Red
	<ol>
		<li>Jeśli pożądane jest wspólne znakowanie żywych komórek, należy pobrać wstępnie znakowane komórki inkubowane z BrdU przez 10 dni od kroku 2.1 i wspólnie znakować 5 μM CFSE lub fluorescencyjnymi barwnikami fluorescencyjnymi z żywych komórek Far Red przez 30 minut. Wykonaj wspólne znakowanie w dniu 10.</li>
		<li>Ostrożnie odessać pożywkę zawierającą barwniki BrdU i CFSE lub Far Red. Umyj komórki 5 ml ciepłego PBS. Powtórz pranie 1x.</li>
		<li>Przeprowadź trawienie enzymatyczne przy użyciu 0,05% trypsyny/EDTA, jak opisano w krokach 1.7–1.8. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić współznakowane komórki (5 x 104) w 500 μl lodowatej (1:1) macierzy/pożywki błony podstawnej i przenieść do hodowli prostasfery 3D (opisanej w sekcji 3.1) na 5 dni, aby umożliwić wymywanie BrdU i CFSE lub Far Red podczas tworzenia sferoidy (~6 cykli komórkowych).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj wykrywanie komórek zatrzymujących etykiety w kulach (prostasfery dnia 5) zgodnie z opisem w krokach 4.1, 4.2, 4.3 lub 5. 
	UWAGA: Karboksyfluoresceina dioctan sukcynimidylu ester (CFSE) i Far Red są długotrwałymi fluorescencyjnymi barwnikami pro-owymi i są dobrze zatrzymywane w znakowanych komórkach. Wewnątrzkomórkowa esterazy w żywych komórkach rozszczepiają grupy octanowe, które aktywują zielone lub czerwone cząsteczki fluorescencyjne, które są teraz nieprzepuszczalne dla błony.</li>
</ol>
3. Tworzenie prostasfery w systemie hodowli błony podstawnej 3D
<ol>
	<li>Hodowla prostasfery w systemie matrycy błony podstawnej 3D
	<ol>
		<li>Matrycę błony podstawnej rozmrozić w temperaturze 4 °C przez noc i przechowywać na lodzie przed użyciem.</li>
		<li>Delikatnie dodaj 1 ml lodowatej matrycy błony podstawnej do równej objętości lodowatej pożywki hodowlanej. Powoli mieszać, pipetując w górę i w dół, unikając pęcherzyków. 
		UWAGA: Dno 12-dołkowych płytek hodowlanych należy wstępnie pokryć 100 μl tego roztworu. Zminimalizuje to liczbę komórek, które wpadają przez matrycę i rosną jako monowarstwa.</li>
		<li>Zawiesić 5 x 104 komórek HPrEC w lodowatej (1:1) mieszance matrycy błony podstawnej i pożywki hodowlanej w całkowitej objętości 500 μl.</li>
		<li>Odpipetować 500 μl tego roztworu komórkowego wokół dolnej krawędzi każdego dołka.</li>
		<li>Zakręć płytą, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę wokół krawędzi studni. Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na 30 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy.</li>
		<li>Gdy matryca zastygnie, przykryj 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej na dołek. Nie naruszaj pierścienia matrycy błony podstawnej. Ostrożnie wyceluj końcówką pipety i dozuj pożywkę hodowlaną do środka studzienki. 
		UWAGA: Pożywkę hodowlaną należy ogrzać do 37 °C po dodaniu do zestalonej matrycy błony podstawnej. Matryca membrany podstawnej straci swoją integralność i rozpuści się pod wpływem zimnych/chłodnych mediów.</li>
		<li>Uzupełniaj podłoże co 2 dni. Ostrożnie odessać ~500 μL zużytej pożywki i dodać 500 μL świeżej, ciepłej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Monitoruj tworzenie i wzrost prostasfery przez 5–7 dni za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasażowanie prostasfer
	<ol>
		<li>Zbierz prostasfery z matrycy, ostrożnie odsysając jak najwięcej pożywki. Unikaj przeszkadzania lub podnoszenia pływających kawałków zestalonej matrycy.</li>
		<li>Dodać 1 ml roztworu dypazy (matryca błony podstawnej: dyspaza w stosunku 1:2). Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Inkubować płytki hodowlane w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Zrób zdjęcia prostasfer, które znajdują się na dnie naczynia hodowlanego, aby zliczyć liczbę kul i zmierzyć rozmiar.</li>
		<li>Zebrać mieszaninę kulek do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia kulek. Odessać i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Rozproszyć kulki na pojedyncze komórki, trawiąc 500 μl ciepłej 0,05% trypsyny/EDTA i przenosząc zawiesinę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Inkubować probówkę do mikrowirówek w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Zatrzymaj działanie trypsyny za pomocą 500 μl ciepłego PBS zawierającego 10% FBS. Przepuścić strawioną zawiesinę kulek przez strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 26 G 5x, aby zdysocjować kulki na pojedyncze komórki.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę o sile 500 x g przez 5 minut, aby komórki zostały osadzone w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i wyrzucić.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej i przefiltrować przez nylonowe sitko komórkowe o wielkości porów 40 μm.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut, aby komórki zostały osadzone w temperaturze pokojowej. Odessać i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowatej (1:1) macierzy błony podstawnej/pożywki hodowlanej i subkulturę w matrycy błony podstawnej 3D do drugiego przejścia prostasfery.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Identyfikacja komórek macierzystych gruczołu krokowego zachowujących BrdU za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego
<ol>
	<li>Wyrastają z przyczepionych prostasfer, a następnie następuje barwienie immunofluorescencyjne (IF) w celu obrazowania 2D komórek macierzystych prostaty.
	<ol>
		<li>Zebrać prostasfery przez trawienie dypazowe, jak opisano w krokach 3.2.1–3.2.3. Odwirować kulki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić kulki w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Inkubować ~ 50 prostasfer na studzienkę w 8 szkiełkach dołetkowych w 200 μl pożywki hodowlanej w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić przyłączenie i wyrastanie kulek.</li>
		<li>W dniu 2 odessać i wyrzucić pożywkę hodowlaną. Przerastające kulki myć 200 μl PBS przez 5 minut.</li>
		<li>Umieścić kulki w 200 μl/studzienkę lodowatego metanolu w temperaturze -20 °C na 20 minut.</li>
		<li>Myć kulki 200 μl/dołek PBS przez 5 minut. Powtórzyć 2x.</li>
		<li>Kulki do przemywania kwasem z 200 μL/studzienkę 2N HCl przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Myć kulki 200 μl/dołek PBS przez 5 minut. Powtórzyć 3x.</li>
		<li>Dodać 100 μl roztworu blokującego zawierającego 5% normalnej surowicy koziej w PBST (PBS z 0,25% Triton X-100) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać roztwór blokujący i dodać 100 μl PBST zawierającego 2% normalnej surowicy koziej i pierwotnego mysiego przeciwciała anty-ludzkiego BrdU (1:200) do każdej studzienki i inkubować w wilgotnym pudełku w temperaturze 4 °C przez noc. 
		UWAGA: Mysie przeciwciało IgG jest używane jako kontrola ujemna.</li>
		<li>Odessać i usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Myj kulki 200 μl PBS przez 5 min. Powtórz 2x.</li>
		<li>Dodać 100 μl PBST zawierającego 2% normalnej koziej surowicy i wtórne kozie przeciwciało anty-mysie Alexa Fluor 488 (1: 500) do każdej studzienki i inkubować w RT w ciemności przez 2 godziny.</li>
		<li>Odessać i usunąć wtórny roztwór przeciwciała. Myj kulki 200 μl PBS przez 5 min. Powtórz 3x.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka z ~25-40 μL wodnego medium montażowego zawierającego DAPI.</li>
		<li>Uzyskaj obrazy zabarwionych kulek/komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i kolorowej kamery cyfrowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie IF prostasfer w całości do obrazowania 3D komórek macierzystych prostaty 
	UWAGA: W przypadku barwienia IF całego mocowania, prostasfery są obsługiwane za pomocą probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
	<ol>
		<li>Zbierz prostasfery przez trawienie dypazowe, jak opisano w krokach 3.2.1–3.2.3. Odwirować kulki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przy 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić.</li>
		<li>Ponownie zawiesić i utrwalić kulki za pomocą 1 ml 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Odwirować kulki przy 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić.</li>
		<li>Umyć kulki, ponownie zawieszając osad w 1 ml PBS. Odwirować kulki o masie 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić. Powtórz 1x.</li>
		<li>Przemyć kulki kwasem, ponownie zawieszając osad w 1 ml 2N HCl na 30 minut.</li>
		<li>Przemywać kulki 1 ml PBS przez 5 minut i wirować przy 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić. Powtórz 3 razy.</li>
		<li>Zawiesić ~15–30 kulek w 100 μl roztworu blokującego zawierającego 5% normalnej surowicy koziej w PBST (PBS z 0,25% Triton X-100) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Aby usunąć roztwór blokujący, odwirować kulki o stężeniu 500 x g przez 5 minut. Odessać i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić kulki w 100 μl PBST zawierającego 2% normalnej surowicy koziej i pierwotne mysie przeciwciało anty-ludzkie BrdU (1:200) i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Umyć kulki, ponownie zawieszając osad w 1 ml PBS. Odwirować kulki o masie 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić. Powtórz 1x.</li>
		<li>Ponownie zawiesić kulki w 100 μl PBST zawierającym 2% normalnej surowicy koziej i wtórne przeciwciało anty-mysie Alexa Fluor 488 (1:1,000) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Umyć kulki, ponownie zawieszając osad w 1 ml PBS. Odwirować kulki o masie 500 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i wyrzucić. Powtórz 1x.</li>
		<li>Zawiesić kulki w 30–50 μl wodnego podłoża montażowego zawierającego DAPI. Aby zapobiec spłaszczeniu kulek, należy je wlać do studzienki utworzonej z niepowlekanego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem nakrywkowym. Następnie dodaj szkiełko nakrywkowe do naczynia hodowlanego, przykrywając studzienkę.</li>
		<li>Rejestruj obrazy całego stosu sfery Z za pomocą odwróconego fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego w świetle przechodzącym. Konwertuj te obrazy Z-stack na obrazy 3D za pomocą oprogramowania do obrazowania z możliwością rysowania w dowolnym kształcie. 
		UWAGA: Mysie przeciwciało IgG jest używane jako kontrola ujemna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza sparowanych komórek (protokół 4-dniowy)
	<ol>
		<li>Kultura sfer oznaczonych BrdU do dnia 5.</li>
		<li>Dzień 1: Zbierz kulki z macierzy błony podstawnej z 1 ml trawienia dyspazy. Rozproszyć w pojedynczych komórkach w 500 μl ciepłej 0,05% trypsyny/EDTA w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, jak opisano w krokach 3.2.1–3.2.11.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Umieść rozproszone pojedyncze komórki (~ 300-500 na studzienkę) w szkiełkach 8-dołkowych i hoduj w 200 μl / dołku pożywce hodowlanej przez noc, aby umożliwić przyłączenie.</li>
		<li>Dzień 2: Zmienić pożywkę hodowlaną z 200 μl 2 μM cytochalazyny D w pożywce hodowlanej i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, aby umożliwić podział jednej komórki, który zatrzymuje się w późnej metafazie do anafazy.</li>
		<li>Dzień 3–4: Odessać i wyrzucić pożywkę. Utrwalić komórki w 200 μl/studzienkę lodowatego metanolu w temperaturze -20 °C przez 20 minut. Postępuj zgodnie z protokołem barwienia immunologicznego dla BrdU, jak opisano w krokach 4.1.5–4.1.14.</li>
		<li>Rób zdjęcia sparowanych komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Upewnij się, że odległość między dwoma jądrami jest mniejsza niż 30 μm. Na podstawie retencji BrdU zidentyfikuj sparowane komórki macierzyste jako podlegające symetrycznemu lub asymetrycznemu podziałowi komórkowemu. 
		UWAGA: Komórki macierzyste gruczołu krokowego zachowujące etykietę BrdU przechodzą symetryczny podział, aby dać początek dwóm potomnym komórkom macierzystym zachowującym równą ilość BrdU, podczas gdy komórki macierzyste poddawane asymetrycznemu podziałowi powodują powstanie jednej potomnej komórki macierzystej, która zachowuje całą BrdU, a druga potomna komórka progenitorowa, która utraciła etykietę BrdU.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Izolacja komórek macierzystych prostaty zachowujących etykietę CFSE za pomocą sortowania FACS
<ol>
	<li>Dzień 5: Zbierz prostasfery dnia 5 oznaczone CFSE rosnące na 6-dołkowych płytkach hodowlanych w kulturze 3D, zastępując pożywkę 2 ml dyspazy (matryca błony podstawnej: dyspaza w stosunku 1:2). Kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Inkubować płytki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu roztrawienia matrycy.</li>
	<li>Zebrać mieszaninę kulek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować kulki o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i wyrzucić.</li>
	<li>Zawiesić granulkę kuli w 500 μl ciepłej 0,05% trypsyny/EDTA i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Inkubować kulki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 500 μl ciepłego PBS zawierającego 10% FBS.</li>
	<li>Przełóż kulki przez strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 26 G 5x, aby całkowicie rozdzielić kulki na pojedyncze komórki.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej zawierającej 1 μg/ml jodku propydyny (PI) w celu wybarwienia martwych komórek. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl ciepłej pożywki hodowlanej i zebrać komórki w probówkach z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu, filtrując je przez zatrzaski z sitkiem o wielkości porów 35 μm.</li>
	<li>Wykonaj analizę komórek prostasfery znakowanych trypsyną znakowanych CFSE za pomocą jednokanałowego analizatora FACS.</li>
	<li>Bramka subpopulacji frakcjonowanych komórek CFSEHi, CFSEMed i CFSELo. Użyj kontroli ujemnej i dodatniej do bramkowania. 
	UWAGA: Obecność komórek macierzystych prostaty z posortowanymi przez FACS zachowującymi znaczniki CFSE (patrz Hu et al.13) można potwierdzić za pomocą mikroskopii zielonej fluorescencji i ich większego rozmiaru komórek w porównaniu z komórkami niezatrzymującymi. Ten większy rozmiar komórek jest właściwością komórek macierzystych prostaty w stosunku do populacji komórek progenitorowych. Może to być inne w przypadku innych typów tkanek.</li>
</ol>

<ol><li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li>
<li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li>
<li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li>
<li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem%2Fprogenitor+cells+and+prostate+cancer+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li>
<li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li>
<li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758(2014).</li>
<li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dividing+cellular+asymmetry%3A+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li>
<li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li>
<li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li>
<li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li>
<li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li>
<li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li>
<li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration%3A+Wnt+signaling+and+stem+cell+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012(2014).</li>
<li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li>
<li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają powiązań finansowych do ujawnienia.

Cytometria przepływowa z wykorzystaniem wielu markerów powierzchniowych komórek macierzystych jest powszechnie stosowanym podejściem do badań nad komórkami macierzystymi, pomimo braku zarówno swoistości, jak i selektywności 1,5,6. Podczas gdy tworzenie sferoidów w systemie hodowli 3D jest kolejną użyteczną metodą wzbogacania rzadkiej populacji komórek macierzystych z pierwotnych komórek nabłonkowych, w tym HPrEC, powstałe sferoi...

Ludzki gruczoł krokowy zawiera nabłonek świetlny z funkcją wydzielniczą i komórki podstawne leżące pod nim wraz z niezwykłym składnikiem komórek neuroendokrynnych. Komórki nabłonkowe, w tym przypadku, są generowane z rzadkiej populacji komórek macierzystych prostaty, które są stosunkowo spokojne in vivo i działają jako system naprawczy w celu utrzymania homeostazy gruczołów przez całe życie1. Pomimo wielu postępów, identyfikacja i funkcjonalna izolacja komórek macierzystych gruczołu krokowego pozostaje głównym wyzwaniem w tej dziedzinie. Biomarkery komórek macierzystych, w tym metodologie oparte na markerach powierzchniowych komórek w połączeniu z cytometrią przepływową, są powszechnie stosowane w badaniach nad komórkami macierzystymi2,3,4. Jednak wyniki wzbogacania i izolacji różnią się znacznie w zależności od kombinacji markerów i swoistości przeciwciał5,6, co rodzi pytania o tożsamość izolowanych komórek. Innym szeroko stosowanym podejściem do wzbogacania komórek macierzystych jest trójwymiarowa (3D) hodowla sferoidalna2,3,4. Podczas gdy rezydentne komórki macierzyste są stosunkowo spokojne in vivo z ograniczeniami niszowymi, przechodzą podział komórek w hodowli matrycowej 3D (zarówno symetrycznej, jak i asymetrycznej), generując zarówno komórki macierzyste, jak i progenitorowe, które szybko rozmnażają się w kierunku zobowiązania linii7,8. Utworzone sferoidy są niejednorodną mieszaniną zawierającą zarówno komórki macierzyste, jak i komórki progenitorowe na różnych etapach zaangażowania w linię, w tym komórki progenitorowe we wczesnym i późnym stadium. W związku z tym testy z wykorzystaniem całych sferoid nie są przeznaczone wyłącznie dla komórek macierzystych, co sprawia, że identyfikacja unikalnych właściwości komórek macierzystych jest niejednoznaczna. Dlatego tak ważne jest stworzenie testów w celu identyfikacji i oddzielenia komórek macierzystych prostaty od ich potomnych przodków. W tym celu celem obecnego protokołu jest ustanowienie systemu testów, który pozwoli na skuteczną identyfikację i izolację komórek macierzystych z tkanek ludzkiej prostaty, a następnie dogłębną analizę ich funkcji biologicznych.
Długoterminowe przechowywanie znaczników 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) jest szeroko stosowane do śledzenia linii komórkowych in vivo i in vitro na podstawie ich przedłużonego czasu podwojenia9,10. Obecne podejście do identyfikacji i izolacji komórek macierzystych gruczołu krokowego opisane w niniejszym dokumencie opiera się na ich względnej charakterystyce spoczynkowej i właściwościach zatrzymywania etykiet w mieszanej populacji nabłonkowej. Ponadto, w oparciu o hipotezę nieśmiertelnej nici DNA, tylko komórki macierzyste mogą ulegać asymetrycznemu podziałowi komórkowemu. Komórka macierzysta reprezentuje komórkę potomną, która zawiera starsze rodzicielskie DNA, podczas gdy komórka progenitorowa, która jest zaangażowaną komórką potomną, otrzymuje nowo zsyntetyzowane DNA. Opisana powyżej unikalna właściwość komórek macierzystych jest wykorzystywana do znakowania BrdU w rodzicielskich komórkach macierzystych w hodowlach pierwotnych, a następnie śledzenia ich etykiety po wypłukaniu BrdU po przeniesieniu do hodowli sferoidalnej 3D bez kotwicy. Podczas gdy większość pierwotnych komórek nabłonka prostaty zachowuje fenotyp podstawowy i amplifikujący tranzyt w hodowli 2D, istnieje również rzadka populacja multipotencjalnych komórek macierzystych, które uzupełniają i utrzymują homeostazę nabłonka, o czym świadczy tworzenie sferoidów lub w pełni zróżnicowanych organoidów z odpowiednimi pożywkami hodowlanymi po przeniesieniu do systemów 3D3,12. W naszym obecnym protokole, używając sferoidów prostaty HPrEC lub testów retencji BrdU, CFSE lub Far Red opartych na prostasferze, a następnie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), identyfikujemy komórki macierzyste zachowujące znaczniki w sferoidach na poziomie pojedynczej komórki13.
Co ważne, dodatkowo potwierdziliśmy cechy komórek macierzystych komórek zachowujących etykietę we wczesnych stadiach sferoid w porównaniu z komórkami progenitorowymi z zaangażowaniem w linię. Należą do nich asymetryczny podział komórek macierzystych, zdolność do tworzenia sferoidów in vitro i zdolność do regeneracji tkanek in vivo, podwyższona aktywność autofagii, zwiększona biogeneza rybosomów i zmniejszona aktywność metaboliczna. Następnie przeprowadzono analizę RNAseq. Zaobserwowano geny o zróżnicowanej ekspresji w komórkach sferoidalnych zachowujących etykiety, które mogą służyć jako nowe biomarkery dla ludzkich komórek macierzystych prostaty. To oparte na sferoidach podejście do zachowywania etykiet może mieć zastosowanie do próbek nowotworów w celu podobnej identyfikacji niewielkiej liczby nowotworowych komórek macierzystych, zapewniając w ten sposób możliwości translacyjne do zarządzania populacjami opornymi na leczenie13. Poniżej przedstawiono test retencji znaczników oparty na prostasferze na przykładzie ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty (HPrEC).

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1 ml strzykawki tuberkulinowe</td><td>Bectin Dickinson</td><td>BD 309625</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mikrowirówki, sterylne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki hodowlane 100 mm</td><td>Corning/Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Corning/Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 ml </td><td>rurki Corning/Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm, sq</td><td>Corning</td><td>284522</td><td>Do naczynia hodowlanego MatTek 35 mm</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 x 50 mm</td><td>Corning</td><td>2975245</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna 26G x 1,5 cala</td><td>Monoject</td><td>1188826112</td><td></td></tr><tr><td>2N HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm z dnem ze szklaną pokrywą</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-10-C</td><td>Dno szklane nr 0, niepowlekane, <img src="/files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"> napromieniowane</td></tr><tr><td>40 &amp;mikro; Sitko z nylonu o dużych porach</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli CO2 5%, 37 &amp;; Probówki</td> wirówkowe C <td>Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Corning/Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z zatrzaskiem sitkowym</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>35 µ </td></tr><tr><td>m Nylon Mesh 6-dołkowe płytki hodowlane</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowe szkiełka komorowe</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Wodne medium montażowe zawierające DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>A Barwnik fluorescencyjny jądrowy</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego, certyfikat</td><td></td><td></td><td></td>poziomu 2</tr><tr><td>BrdU (5-bromo-2'-deoksyurydyna)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002</td><td>1 mM roztwór podstawowy w DMSO</td></tr><tr><td>Wirówka do probówek mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do probówek 15 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Allegra 6</td></tr><tr><td>CFSE (ester karboksyfluoresceiny sukcynimidylowej)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td> 5 <td>mM roztwór podstawowy w</td></tr><tr><td>cytochalazynie</td> DMSO <td>D Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>PHZ1063</tr><tr><td>Dispase 1U/mL</td><td>StemCell Technologies</td><td>07923</td><td></td></tr><tr><td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td>s</td><td></td></tr><tr><td>Far-Red pro-dye</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34564</td><td>5 mM roztwór podstawowy w DMSO</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>Do powlekania naczyń hodowlanych 100 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny z kolorowym aparatem cyfrowym</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Axioskop 20 mikroskop fluorescencyjny; kolorowa cyfrowa Axiocamera</td></tr><tr><td>Goat anty-mysie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>HPrEC (Pierwotne normalne ludzkie komórki nabłonka prostaty)</td> <td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0038</td><td>Pobrano od 3 młodych (19-21 lat) dawców narządów wolnych od choroby; 1 x 105 komórek/ml; przechowywany w wiadrze z lodem ciekłego azotu</td></tr><tr><td>i lodzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikrosopa z aparatem</td><td></td><td></td><td></td>cyfrowym</tr><tr><td>Matrigel, niski czynnik wzrostu, wolny od czerwieni fenolowej</td><td>Corning</td><td>356239</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Corning</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-BrdU</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>5292S</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało IgG ( kontrola negatywna)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Pipettory i końcówki, różne rozmiary</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0041</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>R &amp; D Systems</td><td>5135/10</td><td>10 μ g/ml PI w PBS przechowywanym w temperaturze 4 &amp; deg; C w ciemności</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne, różne rozmiary</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do liczenia kul i pomiaru</td><td></td><td></td><td></td>wielkości</tr><tr><td>Oprogramowanie: obrazy 3D za pomocą Imaris oprogramowanie do obrazowania z możliwością</td><td></td><td></td><td></td>rysowania o dowolnym kształcie</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna, 37 &amp; deg; Obrazy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C z-stack przy użyciu odwróconego fluorescencyjnego mikroskopu</td><td></td><td></td><td></td> konfokalnego w świetle przechodzącym</tr></tbody></table>

izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Pomimo postępów w badaniach nad dorosłymi komórkami macierzystymi, identyfikacja i izolacja komórek macierzystych z próbek tkanek pozostaje głównym wyzwaniem. Podczas gdy rezydentne komórki macierzyste są stosunkowo spokojne z niszowymi ograniczeniami w dorosłych tkankach, wchodzą do cyklu komórkowego w trójwymiarowej hodowli bez kotwicy (3D) i przechodzą zarówno symetryczny, jak i asymetryczny podział komórkowy, dając początek zarówno komórkom macierzystym, jak i progenitorowym. Te ostatnie szybko się namnażają i są główną populacją komórek na różnych etapach zaangażowania w linię, tworząc heterogeniczne sferoidy. Wykorzystując pierwotne normalne ludzkie komórki nabłonka gruczołu krokowego (HPrEC), opracowano test oparty na sferoidach i zatrzymywaniu znaczników, który umożliwia identyfikację i funkcjonalną izolację komórek macierzystych inicjujących sferoidę w rozdzielczości pojedynczej komórki.
HPrEC lub linie komórkowe są dwuwymiarowo (2D) hodowane za pomocą BrdU przez 10 dni, aby umożliwić jego włączenie do DNA wszystkich dzielących się komórek, w tym samoodnawiających się komórek macierzystych. Wymywanie rozpoczyna się po przeniesieniu do hodowli 3D na 5 dni, podczas których komórki macierzyste samoodnawiają się poprzez asymetryczny podział i inicjują tworzenie sferoidów. Podczas gdy stosunkowo spokojne potomne komórki macierzyste zachowują DNA rodzicielskie znakowane BrdU, przodkowie potomni szybko się namnażają, tracąc etykietę BrdU. BrdU można zastąpić barwnikami CFSE lub Far Red, które umożliwiają izolację żywych komórek macierzystych za pomocą FACS. Charakterystyka komórek macierzystych jest potwierdzana przez tworzenie sferoidów in vitro, testy regeneracji tkanek in vivo oraz poprzez dokumentowanie ich symetrycznych/asymetrycznych podziałów komórkowych. Wyizolowane komórki macierzyste zachowujące znaczniki mogą być rygorystycznie badane przez dalsze badania molekularne i biologiczne, w tym sekwencję RNA, sekwencję ChIP, wychwytywanie pojedynczych komórek, aktywność metaboliczną, profilowanie proteomu, immunocytochemię, tworzenie organoidów i regenerację tkanek in vivo. Co ważne, to wolne od markerów podejście do funkcjonalnej izolacji komórek macierzystych identyfikuje komórki macierzyste ze świeżych próbek nowotworowych i linie komórek rakowych z wielu narządów, co sugeruje szerokie zastosowanie. Może być stosowany do identyfikacji biomarkerów nowotworowych komórek macierzystych, badań przesiewowych leków ukierunkowanych na nowotworowe komórki macierzyste oraz odkrywania nowych celów terapeutycznych w nowotworach.

Pierwotne normalne ludzkie komórki nabłonkowe prostaty są umieszczane w szalkach hodowlanych pokrytych fibronectyną, a wzrost komórek jest utrzymywany w hodowli dwuwymiarowej (Rycina 1a). Po przeniesieniu do hodowli trójwymiarowej z matrycą błony podstawnej, komórki nabłonkowe ulegają stopniowemu obumieraniu. Tylko komórki macierzyste prostaty są w stanie przeżyć w hodowli bez zakotwiczenia i tworzyć sferydy w ciągu 5 dni (Rycina 1b</str...

Korzystając z ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty, przedstawiamy nową, wolną od biomarkerów metodę funkcjonalnej charakterystyki komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach. Opisano protokół krok po kroku dla znakowania komórek BrdU, CFSE lub Far Red 2D; trójwymiarowe tworzenie sferoid; identyfikacja komórek macierzystych zachowujących znacznik za pomocą immunocytochemii; i izolacja przez FACS.

Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Izolacja komórek macierzystych pozostaje poważnym wyzwaniem ze względu na koizolację komórek progenitorowych przy użyciu obecnych metod. Opracowaliśmy nowatorski, niezawierający biomarkerów test do izolowania komórek macierzystych w stanie spoczynku od mieszanych komórek progenitorowych. Główną zaletą tego sferoidalnego testu retencji znaczników jest to, że może on namnażać i izolować żywe komórki macierzyste od ich potomnych przodków za pomocą FACS przy użyciu znakowania CFSE lub Far Red.Podczas gdy konwencjonalne terapie eliminują większość komórek raka prostaty, rakowe komórki macierzyste pozostają z powodu oporności terapeutycznej, napędzając w ten sposób postęp choroby. Izolacja komórek macierzystych pozwoli na identyfikację nowych genów, które mogą być terapeutycznie współukierunkowane w celu skutecznej remisji choroby. Nasz test retencji znaczników ma zastosowanie do normalnej izolacji komórek macierzystych z różnych tkanek i komórek oraz do badań nad rakowymi komórkami macierzystymi.Co ważne, test ten ma zastosowanie do innych nowotworów nabłonkowokomórkowych, takich jak rak piersi i rak jelita grubego. Zacznij od pokrycia 100-milimetrowych szalek hodowlanych dwoma mililitrami 2,5 mikrograma roztworu fibronektyny i inkubuj je przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie odessać roztwór i pozostawić szalki hodowlane do wyschnięcia na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 45 minut.Dodaj dziewięć mililitrów pożywki do wzrostu komórek nabłonka prostaty do naczynia pokrytego fibronektyną i trzymaj w cieple w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozmrozić jedną fiolkę z zamrożonymi ludzkimi komórkami nabłonka prostaty w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach ciepłego podłoża. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 500 g przez pięć minut.Następnie odessać i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze ciepłej pożywki hodowlanej i przenieść jeden mililitr zawiesiny bezpośrednio do naczynia pokrytego fibronektyną ze wstępnie podgrzaną pożywką. Następnie inkubuj naczynie w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.W przypadku wspólnego znakowania komórek, należy przygotować komórki znakowane BrdU w 10-dniowej hodowli 2D, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Następnie dodaj pięć mikromolowych CFSE lub Far Red i inkubuj komórki przez 30 minut. Po inkubacji ostrożnie zassać pożywkę barwnikiem i dwukrotnie umyć komórki pięcioma mililitrami ciepłego PBS.Następnie przeprowadź trawienie enzymatyczne z 05%trypsyną EDTA zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Odwirować komórki w ilości 500 razy g przez pięć minut i odrzucić supernatant. Komórki zawieszono w lodowatej matrycy błony podstawnej jeden do jednego i mieszance pożywki hodowlanej w celu utworzenia prostasfery 3D.Aby przygotować kulturę prostasfery w systemie matrycy podstawowej 3D, należy rozmrozić matrycę błony podstawnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc i przechowywać ją na lodzie przed użyciem. Następnie delikatnie dodaj jeden mililitr lodowatej matrycy błony podstawnej do równej objętości lodowatej pożywki hodowlanej. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.Ponownie zawiesić pięć razy od 10 do 1/4 ludzkich komórek nabłonka prostaty w lodowatej matrycy błony podstawnej jeden do jednego i mieszance pożywek hodowlanych, aby uzyskać łączną objętość 500 mikrolitrów. Odpipetować roztwór do dolnej krawędzi każdej studzienki i zakręcić płytką, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę. Umieść płytkę w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby matryca zestaliła się.Następnie przykryj go jednym mililitrem ciepłej pożywki hodowlanej na studzienkę, uważając, aby nie naruszyć pierścienia. Aby zebrać prostasfery z oznaczeniem CFSE, zastąp podłoże dwoma mililitrami, odpal i pipetuj w górę iw dół, aby kilkakrotnie wymieszać. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby strawić matrycę, a następnie zebrać mieszaninę kulek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Odwirować kulki w temperaturze 500 razy g przez pięć minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach ciepłej 05% trypsyny EDTA i przenieść je do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Inkubuj kulki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie dodaj 500 mikrolitrów ciepłego PBS z 10% FBS.Przełóż je przez jednomililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 26, aby całkowicie oddzielić kulki. Odwirować komórki w temperaturze 500 razy g przez pięć minut. Następnie odessać i wyrzucić supernatant.Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze ciepłej pożywki hodowlanej z jednym mikrogramem na mililitr jodku propidyny, aby wybarwić martwe komórki i inkubować je przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Powtórzyć wirowanie i odrzucić supernatant. Następnie umyj komórki jednym mililitrem ciepłego podłoża.Powtórzyć wirowanie i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze ciepłej pożywki hodowlanej i zebrać komórki w pięciomililitrowych probówkach z okrągłym dnem z polistyrenu, filtrując je przez zatrzaski z sitkiem o wielkości porów 35 mikronów. Wykonaj analizę FACS rozproszonych trypsyną komórek prostasfery znakowanych CFSE.Używając nieznakowanych komórek jako kontroli ujemnej i komórek znakowanych CFSE jako kontroli pozytywnej w celu ustawienia bramek, uruchom próbkę, aby posortować i zebrać subpopulacje frakcjonowanych komórek o wysokiej i niskiej CFSE. Pierwotne normalne ludzkie komórki nabłonka prostaty umieszczono w szalkach hodowlanych pokrytych fibronektyną, a wzrost komórek utrzymano w hodowli 2D. Po przeniesieniu do hodowli 3D z macierzą błony podstawnej, zróżnicowane komórki nabłonkowe powoli obumierały i pozostały tylko komórki macierzyste prostaty.Podwójne znakowanie komórek nabłonka prostaty w hodowli 2D, a następnie tworzenie sferoidów w hodowli 3D wykazało kolokalizację BrdU, CFSE i Far Red w tych samych komórkach zachowujących znacznik. Podwójne barwienie immunologiczne wykazało, że komórki zatrzymujące znaczniki wykazują niższy poziom białka cytokeratyny 14, zmniejszone białko połączenia komórkowego E-kadherynę, zwiększone białka markerowe wczesnych komórek macierzystych Wnt10b i ALDH1A1, zwiększone białko autofagii LC3 i zwiększone miozyny IIB. Co więcej, oparty na sferoidach test retencji znaczników z powodzeniem wykrywa rakowe komórki macierzyste w próbkach raka prostaty.Znakowane CFSE zatrzymujące się komórki rakowe i sferoidy pochodzące z próbek ludzkiego raka prostaty wykazywały zmniejszone białko E-kadheryny w stosunku do nieznakowanych komórek progenitorowych. Podczas próbowania tego protokołu ważne jest, aby utrzymać matrycę w postaci płynnej do przygotowania pożywki hodowlanej. Przechowuj go przez noc w temperaturze czterech stopni i schładzaj końcówki pipet w lodowatym PBS przed dozowaniem matrycy.Po wyizolowaniu komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach, można przeprowadzić sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i analizę proteomiczną w celu zidentyfikowania określonych genów i nowych biomarkerów w komórkach macierzystych. Izolacja żywych nowotworowych komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach umożliwia naukowcom hodowanie guzów pochodzących z rakowych komórek macierzystych in vitro oraz badania przesiewowe nowych leków przeciwnowotworowych.

isolation-of-stem-like-cells-from-3-dimensional-spheroid-cultures

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Potencjał terapeutyczny mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) jest dobrze udokumentowany, jednak najlepsza metoda przygotowania komórek dla pacjentów pozostaje kontrowersyjna. W tym artykule przekazujemy protokoły umożliwiające efektywne generowanie i podawanie terapeutycznych agregatów sferycznych lub "sferoid" MSCs przygotowanych w warunkach wolnych od ksenotypów do zastosowań eksperymentalnych i klinicznych.

Produkcja i podawanie terapeutycznych sferoid mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) przygotowanych w hodowlach 3D w warunkach wolnych od ksenotypów

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Naucz się izolować komórki macierzyste z trójwymiarowych kultur sferoidalnych metodą retencji znaczników bez użycia biomarkerów. Ta technika umożliwia separację żywych komórek macierzystych od komórek potomnych w badaniach nad rakiem prostaty.

Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

Przeglądaj więcej filmów