Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Metoda ta pozwala na hodowlę Mycobacterium tuberculosis w ściśle niskich warunkach żelaza i oczyszczanie pęcherzyków błonowych z filtratu o niskiej zawartości żelaza. Ponieważ wiadomo, że ograniczenie żelaza stymuluje produkcję pęcherzyków błonowych, protokół ten daje dużą obfitość czystych pęcherzyków błonowych, które można wykorzystać do dalszych testów biochemicznych lub funkcjonalnych. Kiedy zademonstrujemy protokół przy użyciu Mycobacterium smegmatis, szczepu niezjadliwego, protokół ten można zastosować w placówkach BSL-2 wykorzystujących Mycobacterium tuberculosis, zjadliwy szczep.

Na początek przygotuj jeden litr minimalnej pożywki, rozpuszczając pięć gramów fosforanu monopotasowego, pięć gramów L-asparaginy, 20 mililitrów glicerolu i dwa gramy dekstrozy w 900 mililitrach wody dejonizowanej w plastikowym pojemniku. Dostosuj pH do 6,8 za pomocą pięciu normalnych wodorotlenków sodu i dostosuj objętość do jednego litra wodą dejonizowaną. Następnie dodaj 50 gramów żywicy chelatującej metale i delikatnie mieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia przerwij mieszanie i pozwól żywicy osiąść przez około 30 minut. Wysterylizuj i usuń pozostałą żywicę z roztworu przez filtrację przez filtr o średnicy 22 mikronów z plastikowym odbiornikiem. Teraz uzupełnij minimalną pożywkę 0,5 miligrama na litr chlorku, 40 miligramów na litr siarczanu magnezu i 0,1 miligrama na litr siarczanu manganu.

Zaszczepić pojedynczą kolonię MTB w dwóch mililitrach pożywki bulionowej prątków uzupełnionej wzbogaceniem ADN. Inkubować z mieszaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy widoczny jest wzrost, ekstrahować dwa mililitry kultury i zmierzyć OD 540 na spektrofotometrze.

Przerwij inkubację, gdy OD 540 osiągnie 0,8, co wskazuje na późną fazę logarytmiczną. Rozprowadź 200 mikrolitrów późnej kultury logarytmicznej na płytkach agarowych prątków uzupełnionych 0,2 glicerolu, 0,5% Tween 80 i ADN. Zaszczepić co najmniej pięć płytek.

Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. A po tygodniu wzrost bakterii jest widoczny jako zlewająca się warstwa. Następnie zwilż sterylny bawełniany wacik w minimalnym podłożu o niskim poziomie żelazka.

Użyj tego wacika, aby zebrać bakterie z płytek agarowych. Zaszczepij bakterie w 100 mililitrach pożywki o minimalnej zawartości żelaza w probówce. Zebrać wystarczającą ilość bakterii, aby przygotować zawiesinę o średnicy zewnętrznej 540 jednego.

Rozcieńczyć zawiesinę 10 razy do jednego litra minimalnym podłożem o niskiej zawartości żelaza i podzielić ją na dwie sterylne plastikowe butelki. Następnie przenieś dwa mililitry kultury do pięciomililitrowej probówki hodowlanej. Dodaj 10 mikrolitrów 10% objętości tyloksapolu.

Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 14 dni. Przenieś kulturę do pięciu stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 225 mililitrów i wiruj w temperaturze 2 850 g przez siedem minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Zebrać supernatant kultury za pomocą pipety o pojemności 50 mililitrów i przefiltrować, wysterylizować przez filtr 0,22 mikrona.

Aby wyizolować MEV, należy przenieść filtrat hodowlany do systemu ultrafiltracji z mieszanymi komórkami umieszczonego w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przefiltrować koncentrat pod ciśnieniem mniejszym niż 50 PSI przez membranę odcinającą o mocy 100 kilodaltonów. Następnie odwirować skoncentrowany filtrat kulturowy w temperaturze 15 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant w probówkach do ultrawirowania poliwęglanu. Odwirować supernatant z ciśnieniem 100 000 g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić błoniaste granulki w sumie w jednym mililitrze sterylnego PBS przez delikatne pipetowanie. Wymieszaj 0,5 mililitra zawiesiny granulek z 1,5 mililitra 60% roztworu jodu, na dnie cienkościennej probówki ultrawirówki z polipropylenu. Nałóż tę zawiesinę jodiksanolu MVE 45% na jeden mililitr roztworów 40%35%30%25% i 20%jodiksanolu oraz jeden mililitr PBS na górze.

Wirować przy 100 000 g przez 18 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj jednomililitrowej strzykawki Hamiltona, aby zebrać jednomililitrowe frakcje gradientu gęstości, zaczynając od góry. Rozcieńczyć każdą zebraną frakcję do 20 mililitrów PBS i odwirować przy 100 000 razy g przez dwie godziny w czterech stopniach Celsjusza.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 0,5 mililitra PBS. Przechowuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić analizę lipidów błonowych, połącz 10 mikrolitrów każdej frakcji gradientowej za pomocą fluorescencyjnej sondy membranowej TMA-DPH o końcowym stężeniu jednego mikrograma na mililitr w 50 mikrolitrach PBS w każdym dołku 96-dołkowej czarnej płytki.

Inkubuj płytki w temperaturze 33 stopni Celsjusza przez 20 minut. Zmierz fluorescencję przy 360 nanometrach dla wzbudzenia i 430 nanometrach dla emisji. W tym protokole MEV oczyszczono przez sedymentację różnicową w gradiencie gęstości.

W opisanych warunkach MEV rozdzielono głównie w trzeciej frakcji gradientu, która odpowiada 25% jodiksanolu. Białka związane z pęcherzykami były skoncentrowane we frakcji trzeciej pokazanej za pomocą analizy dot blot. Barwienie ujemne potwierdziło również obecność MEV we frakcji trzeciej, a analiza nanocząstek wykazała, że rozmiar MEV wynosił około 100 nanometrów.

Stężenie białek i lipidów znormalizowane do jednostek tworzących kolonie wykazało około ośmiokrotny wzrost wydajności MEV w warunkach niskiego poziomu żelaza w porównaniu z warunkami wysokiego poziomu żelaza. Analiza dot blot wykazała bardziej intensywny sygnał od markerów związanych z MEV we frakcjach gradientu gęstości z hodowli MTB o ograniczonej zawartości żelaza niż z kultur MTB o wystarczającej ilości żelaza. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi przygotowania minimalnej pożywki, aby zapewnić warunki ograniczonego żelaza i zapobiec zanieczyszczeniu pęcherzyków błonowych agregatami lipoprotein.

Oczyszczone w ten sposób pęcherzyki błonowe prątków można wykorzystać do charakterystyki biochemicznej i analizy funkcjonalnej.