Name: Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Mycobacterium tuberculosis hodowanych w warunkach niedoboru żelaza. Protokół umożliwia uzyskanie czystych pęcherzyków do badań biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Rafaelowi Prados-Rosalesowi za udostępnienie surowicy anty-MEV oraz Navneet Dogra za przeprowadzenie analizy śledzenia nanocząstek.

1. Przygotowanie zdefiniowanego podłoża zubożonego w żelazo
<ol>
	<li>Przygotować 1 l minimalnej pożywki (MM), rozpuszczając 5 g KH2PO4, 5 g L-asparaginy, 20 ml glicerolu i 2 g dekstrozy w 900 ml wody dejonizowanej w plastikowym pojemniku. Unikaj szkła, aby zapobiec zanieczyszczeniu żelazem. Doprowadzić pH do 6,8 za pomocą 5 N NaOH, a objętość do 1 l za pomocą wody.</li>
	<li>Dodać 50 g żywicy chelatującej metale (MCR) i delikatnie mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego przez 24 godziny w temperaturze 4 °C. Wysterylizować i usunąć MCR przez filtrację przez jednostkę filtrującą 0,22 μm z plastikowym zbiornikiem. Aby przyspieszyć filtrację i zapobiec zatykaniu się filtra, pozostaw żywicę na około 30 minut przed filtracją. 
	nuta: Pożywka ta zawiera mniej niż 2 μM resztkowego żelaza, co określono za pomocą atomowej spektroskopii absorpcyjnej.</li>
	<li>Uzupełnij MM 0,5 mg/l ZnCl2, 40 mg/lMgSO4 i 0,1 mg/LMnSO4. Oddzielnie przygotuj skoncentrowane zapasy (1,000x) każdego z metalowych suplementów w wodzie dejonizowanej i sterylizuj przez filtrację przed suplementacją MM. MM zubożony w żelazo, uzupełniony metalem będzie tutaj określany jako MM o niskiej zawartości żelaza (LIMM).</li>
	<li>Z 50 mM zapasu FeCl3 rozpuszczonego w 10 mM HCl, dodaj 1 ml do 1 l LIMM (50 μM stężenie końcowe), aby otrzymać MM o wysokiej zawartości żelaza (HIMM).</li>
</ol>
2. Hodowla prątków w warunkach ograniczonych żelazem
<ol>
	<li>Rozmrozić 50 μl zamrożonego 15% glicerolu Mtb i ułożyć na płytce agarowej uzupełnionej 10% wzbogaceniem ADN (5 g/L albuminy, 2 g/L dekstrozy i 0,85 g/L chlorku sodu, 0,2% glicerolu i 0,05% Tween-80)10. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C aż do momentu, gdy pojawią się kolonie.</li>
	<li>Zaszczepij pojedynczą kolonię Mtb10 w 2 ml pożywki bulionowej mykobakteryjnej (tabela materiałów) uzupełnionej wzbogaceniem ADN. Inkubować z mieszaniem w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Niech kultura Mtb urośnie do późnej fazy logarytmicznej (OD540 wynosi ~0,8). Aby to sprawdzić, zmierz OD540 za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Rozprowadzić 200 μl późnej kultury logarytmicznej na płytkach agarowych prątków (tabela materiałów) uzupełnionych 0,2% glicerolu, 0,05% Tween-80 i ADN. Zaszczepić co najmniej 5 płytek. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C do momentu, gdy rozwój bakterii będzie widoczny w postaci zlewającej się warstwy. Zajmuje to ~1 tydzień dla Mtb.</li>
	<li>Zwilż sterylny bawełniany wacik w LIMM. Użyj tego wacika, aby zebrać bakterie z płytek agarowych i zaszczepić 100 ml LIMM, aby przygotować skoncentrowaną zawiesinę bakteryjną o OD540 ~1,0.</li>
	<li>Rozcieńczyć tę zawiesinę 10 razy do objętości 1 litra za pomocą LIMM i podzielić ją na dwie sterylne plastikowe butelki o pojemności 2 litrów, z których każda zawiera 500 ml kultury.</li>
	<li>Wyjmij 2 ml kultury i przenieś ją do probówki hodowlanej o pojemności 5 ml. Dodać 10 μl tyloksapolu 10% obj.</li>
	<li>Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w temperaturze 14 dni.</li>
</ol>
3. Kolekcja MEV
<ol>
	<li>Zmierzyć OD540 w 2 ml kultury w momencie pobierania. Wykonać seryjne rozcieńczenia kultury w stosunku 1:10 i podać 100 μl każdego rozcieńczenia na płytkach agarowych z ADN i 0,05% Tween-80.</li>
	<li>Przenieść kulturę do pięciu stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 225 ml i wirować przy 2,850 x g przez 7 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant hodowli za pomocą pipety o pojemności 50 ml i przefiltrować, wysterylizować przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.</li>
</ol>
4. Izolacja MEV
<ol>
	<li>Przenieść filtrat hodowlany do systemu ultrafiltracji z mieszanymi komórkami umieszczonego w temperaturze 4 °C i przefiltrować koncentrat przy <50 psi przez membranę odcinającą 100 kDa do ~50 ml.</li>
	<li>Odwirować zagęszczony filtrat kulturowy o sile 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.</li>
	<li>Odwirować filtrat kulturowy w probówkach ultrawirówek z poliwęglanu o sile 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić błoniaste granulki w objętości łącznie 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Zmieszać 0,5 ml zawiesiny osadów otrzymanej w kroku 4.4 z 1,5 ml 60% roztworu jodiksanolu, uzyskując końcowe stężenie jodiksanolu wynoszące 45% wag./obj. Dozować tę mieszaninę na dno cienkościennej probówki ultrawirówki z polipropylenu o wymiarach 13 mm x 51 mm.</li>
	<li>Na zawiesinę MEV-jodixanol 45% nałożyć 1 ml roztworów jodiksanolu o stężeniu 1 ml roztworów 40%, 35%, 30%, 25% i 20% (obj. w PBS) oraz 1 ml PBS na górze.</li>
	<li>Wirować przy 100 000 x g przez 18 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbierz 1 ml frakcje gradientu gęstości, zaczynając od góry, za pomocą strzykawki Hamilton o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć każdą zebraną frakcję do 20 ml za pomocą PBS i odwirować przy 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić osad w 0,5 ml PBS. Przechowywać ten granulat w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja MEV
<ol>
	<li>Zmierz stężenie białka w każdej frakcji za pomocą testu Bradforda (tabela materiałów), postępując zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
	<li>Wykonaj analizę lipidów błonowych.
	<ol>
		<li>Inkubować 10 μl każdej frakcji gradientowej za pomocą fluorescencyjnej sondy membranowej 1-(4-trimetyloamoniomfenylo)-6-fenylo-1,3,5-heksatrien-p-toluenosulfonianu (TMA-DPH) przy końcowym stężeniu 1 μg/ml w końcowej objętości 50 μl PBS w 96 dołkach czarnych.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 33 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Zmierzyć fluorescencję przy wzbudzeniu 360 nm i emisji 430 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza jakościowa MEV
<ol>
	<li>Wykonaj elektroforezę białek.
	<ol>
		<li>Zmieszać około 1 μg próbek MEV w 16 μl z 4 μl 5 razy więcej buforu do ładowania próbki (10% w/v SDS, 10% mM ditiotreitol, 20% v/v glicerolu 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05% w/v błękitu bromofenolowego) i podgrzewać próbki w buforze próbki w temperaturze 85 °C przez 5 min.</li>
		<li>Załaduj 10% Tris/Glycine SDS-poliakryloamid żel11 i uruchom z napięciem 10 V/cm w buforze do pracy (25 mM zasada Tris, 190 mM glicyna, 0,1% SDS), aż niebieski przód barwnika dotrze do dna żelu.</li>
		<li>Zabarwić żel ultrawrażliwym roztworem do barwienia białek (tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj plamę punktową.
	<ol>
		<li>Załadować 2 μl zawiesiny MEV o stężeniu około 0,5 μg/μl i dwukrotnie seryjnie rozcieńczyć na membranie nitrocelulozowej i poddać procesowi do uzyskania kropli punktowej zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Użyj surowicy odpornościowej wyhodowanej u myszy przeciwko preparatowi MEV w rozcieńczeniu 1:5 000 jako przeciwciało pierwszorzędowe i koziego anty-mysiego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:10 000 jako przeciwciała drugorzędowego. Wykrywanie kompleksów antygen-przeciwciało za pomocą odpowiedniego substratu HRP, odczynnika do wykrywania blottingu i systemu obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj barwienie ujemne i mikroskopię elektronową.
	<ol>
		<li>Związać 250 μl MEV z 2% aldehydem glutarowym w 0,1 M kakodylanu w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i inkubować przez noc w 4% formaldehydzie, 1% aldehydzie glutarowym i 0,1% PBS.</li>
		<li>Utrwalone próbki należy barwić 2% tetratlenkiem osmu przez 90 minut.</li>
		<li>Seryjnie odwodnić próbkę w etanolu i zatopić w żywicy epoksydowej Spurr.</li>
		<li>Obserwuj MEV pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li>
<li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li>
<li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li>
<li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Pst%2FSenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778(2018).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731(2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li>
<li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).</li>
<li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies.+A+laboratory+manual%22">Antibodies. A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Opracowano wiele metod oczyszczania egzosomów pochodzących z komórek eukariotycznych12. Z drugiej strony istnieją ograniczone informacje na temat skutecznych metod oczyszczania EV pochodzących z bakterii7. Skuteczna izolacja EV pochodzących z Mtb musi uwzględniać nieodłączne trudności w hodowli tego chorobotwórczego prątka. Mtb ma długi czas podziału (~24 h) i powinien być traktowany w warunkach trzeciego poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3). Dlatego ważne jest, aby...

Mykobakteryjne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (MEV) to nanocząstki związane z błoną, o rozmiarach 60−300 nm, naturalnie uwalniane przez szybko i wolno rosnące prątki1. MEV uwalniane przez chorobotwórcze prątki stanowią mechanizm interakcji z gospodarzem za pośrednictwem immunologicznie aktywnych białek, lipidów i glikolipidów wydzielanych w skoncentrowany i chroniony sposób2,3,4. Aby scharakteryzować MEV i zrozumieć ich biogenezę i funkcje, kluczowe znaczenie mają ścisłe i skuteczne metody oczyszczania i walidacji pęcherzyków. Do tej pory MEV zostały wyizolowane z filtratów hodowlanych prątków hodowanych w pożywce bogatej w żelazo1,5,6,7,8.
Jednak poprzednie prace wykazały, że ograniczenie żelaza znacznie stymuluje uwalnianie pęcherzyków w Mtb, prawdopodobnie do wychwytywania żelaza przez mykobaktynę, siderofor wydzielany w MEVs9. Chociaż opisano procedury izolacji MEV od Mtb hodowanego w pożywce o wysokiej zawartości żelaza, nie zgłoszono skutecznej metodologii otrzymywania MEV z kultur o niskiej zawartości żelaza. Dlatego celem tej metody jest wyizolowanie, oczyszczenie i ilościowe określenie MEV uzyskanych z kultur o niskiej zawartości żelaza, tak aby można je było wykorzystać do testów biochemicznych i funkcjonalnych oraz do analizy genetycznych uwarunkowań produkcji pęcherzyków u prątków.

<table><tbody><tr><td>Komórka mieszająca Amicon Model 108</td><td>EMD Milipore</td><td>UFSC40001</td><td>Cell System ultrafiltracji</td></tr><tr><td>BD Polipropylen 225 mL probówki stożkowe</td><td>Fisher</td><td>05-538-61</td><td>Stożkowe probówki wirówkowe</td></tr><tr><td>Membrana ultrafiltracyjna odcinająca Biomax 100 kDa</td><td>EMD Milipore</td><td>PBHK07610</td><td>Membrana ultrafiltracyjna</td></tr><tr><td>Żywica Chelex-100</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2842</td><td>Metal żywica chelatująca</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD Difco</td><td>262710</td><td>Mykobakteryjne płytki agarowe</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Bulion</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Pożywka bulionowa mykobakteryjna</td></tr><tr><td>Membrana do bibułowania nitrocelulozowego</td><td>GE Healthcare</td><td>10600001</td><td>Membrana do bibułowania</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td> Ultra wirowanie <td>jodixanolu</td></tr> z <tr><td>poliwęglanu Rurki 25 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td>Probówki do ultra wirówek z poliwęglanu 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>Cienkościenna rurka wirówkowa z polipropylenu 13 mm x 15 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>Polipropylenowa cienkościenna rurka wirówkowa 13 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Barwnik do oznaczania białek</td><td>BioRad</td><td>5000006</td><td>Bradford Barwienie białek</td></tr><tr><td>SYPRO Rubinowe</td><td>sondy molekularne</td><td>S12000</td><td>Ultraczułe barwienie białkowe</td></tr><tr><td>TMA-DPH</td><td>Sondy molekularne</td><td>T204</td><td>1-(4-trimetyloamoniomfenylo)-6-fenylo-1,3,5-heksatrien p-toluenosulfonian</td></tr><tr><td>Termosy</td><td>CellPro</td><td>V50022</td><td>Jednostka filtrująca</td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Prątki, w tym Mycobacterium tuberculosis (Mtb), czynnik wywołujący gruźlicę u ludzi, naturalnie uwalniają pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) zawierające immunologicznie aktywne cząsteczki. Wiedza na temat molekularnych mechanizmów biogenezy pęcherzyków, zawartości pęcherzyków i ich funkcji na granicy faz patogen-gospodarz jest bardzo ograniczona. Odpowiedź na te pytania wymaga rygorystycznych procedur izolacji, oczyszczania i walidacji pojazdów elektrycznych. Wcześniej stwierdzono, że produkcja pęcherzyków jest zwiększona, gdy M. tuberculosis był narażony na ograniczenie żelaza, stan napotkany przez Mtb w środowisku gospodarza. Przedstawiono tutaj kompletny i szczegółowy protokół izolacji i oczyszczania EV z prątków z niedoborem żelaza. Do walidacji oczyszczonych EV stosuje się metody ilościowe i jakościowe.

MEV oczyszczano metodą sedymentacji różnicowej w gradiencie gęstości (Rycina 1, Rycina 2). W opisanych warunkach MEV oddzielały się głównie w frakcji gradientu 3 (F3), która odpowiada 25% jodiksanolu. Wniosek ten oparto na detekcji białka, lipidów błonowych, wizualizacji mikroskopowej nienaruszonych MEV, rozkładzie wielkości nanocząstek oraz pozytywnej reaktywności z antysurowicą przeciwciałami przeciwko pęcherzykom (<strong clas...

Mycobacterium tuberculosis wykazuje zwiększoną produkcję i uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w odpowiedzi na warunki niskiego poziomu żelaza. Praca ta szczegółowo opisuje protokół generowania warunków o niskiej zawartości żelaza oraz metody oczyszczania i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków uwalnianych w odpowiedzi na niedobór żelaza.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Metoda ta pozwala na hodowlę Mycobacterium tuberculosis w ściśle niskich warunkach żelaza i oczyszczanie pęcherzyków błonowych z filtratu o niskiej zawartości żelaza. Ponieważ wiadomo, że ograniczenie żelaza stymuluje produkcję pęcherzyków błonowych, protokół ten daje dużą obfitość czystych pęcherzyków błonowych, które można wykorzystać do dalszych testów biochemicznych lub funkcjonalnych. Kiedy zademonstrujemy protokół przy użyciu Mycobacterium smegmatis, szczepu niezjadliwego, protokół ten można zastosować w placówkach BSL-2 wykorzystujących Mycobacterium tuberculosis, zjadliwy szczep.Na początek przygotuj jeden litr minimalnej pożywki, rozpuszczając pięć gramów fosforanu monopotasowego, pięć gramów L-asparaginy, 20 mililitrów glicerolu i dwa gramy dekstrozy w 900 mililitrach wody dejonizowanej w plastikowym pojemniku. Dostosuj pH do 6,8 za pomocą pięciu normalnych wodorotlenków sodu i dostosuj objętość do jednego litra wodą dejonizowaną. Następnie dodaj 50 gramów żywicy chelatującej metale i delikatnie mieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia przerwij mieszanie i pozwól żywicy osiąść przez około 30 minut. Wysterylizuj i usuń pozostałą żywicę z roztworu przez filtrację przez filtr o średnicy 22 mikronów z plastikowym odbiornikiem. Teraz uzupełnij minimalną pożywkę 0,5 miligrama na litr chlorku, 40 miligramów na litr siarczanu magnezu i 0,1 miligrama na litr siarczanu manganu.Zaszczepić pojedynczą kolonię MTB w dwóch mililitrach pożywki bulionowej prątków uzupełnionej wzbogaceniem ADN. Inkubować z mieszaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy widoczny jest wzrost, ekstrahować dwa mililitry kultury i zmierzyć OD 540 na spektrofotometrze.Przerwij inkubację, gdy OD 540 osiągnie 0,8, co wskazuje na późną fazę logarytmiczną. Rozprowadź 200 mikrolitrów późnej kultury logarytmicznej na płytkach agarowych prątków uzupełnionych 0,2 glicerolu, 0,5% Tween 80 i ADN. Zaszczepić co najmniej pięć płytek.Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. A po tygodniu wzrost bakterii jest widoczny jako zlewająca się warstwa. Następnie zwilż sterylny bawełniany wacik w minimalnym podłożu o niskim poziomie żelazka.Użyj tego wacika, aby zebrać bakterie z płytek agarowych. Zaszczepij bakterie w 100 mililitrach pożywki o minimalnej zawartości żelaza w probówce. Zebrać wystarczającą ilość bakterii, aby przygotować zawiesinę o średnicy zewnętrznej 540 jednego.Rozcieńczyć zawiesinę 10 razy do jednego litra minimalnym podłożem o niskiej zawartości żelaza i podzielić ją na dwie sterylne plastikowe butelki. Następnie przenieś dwa mililitry kultury do pięciomililitrowej probówki hodowlanej. Dodaj 10 mikrolitrów 10% objętości tyloksapolu.Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 14 dni. Przenieś kulturę do pięciu stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 225 mililitrów i wiruj w temperaturze 2 850 g przez siedem minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Zebrać supernatant kultury za pomocą pipety o pojemności 50 mililitrów i przefiltrować, wysterylizować przez filtr 0,22 mikrona.Aby wyizolować MEV, należy przenieść filtrat hodowlany do systemu ultrafiltracji z mieszanymi komórkami umieszczonego w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przefiltrować koncentrat pod ciśnieniem mniejszym niż 50 PSI przez membranę odcinającą o mocy 100 kilodaltonów. Następnie odwirować skoncentrowany filtrat kulturowy w temperaturze 15 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant w probówkach do ultrawirowania poliwęglanu. Odwirować supernatant z ciśnieniem 100 000 g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić błoniaste granulki w sumie w jednym mililitrze sterylnego PBS przez delikatne pipetowanie. Wymieszaj 0,5 mililitra zawiesiny granulek z 1,5 mililitra 60% roztworu jodu, na dnie cienkościennej probówki ultrawirówki z polipropylenu. Nałóż tę zawiesinę jodiksanolu MVE 45% na jeden mililitr roztworów 40%35%30%25% i 20%jodiksanolu oraz jeden mililitr PBS na górze.Wirować przy 100 000 g przez 18 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie użyj jednomililitrowej strzykawki Hamiltona, aby zebrać jednomililitrowe frakcje gradientu gęstości, zaczynając od góry. Rozcieńczyć każdą zebraną frakcję do 20 mililitrów PBS i odwirować przy 100 000 razy g przez dwie godziny w czterech stopniach Celsjusza.Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 0,5 mililitra PBS. Przechowuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić analizę lipidów błonowych, połącz 10 mikrolitrów każdej frakcji gradientowej za pomocą fluorescencyjnej sondy membranowej TMA-DPH o końcowym stężeniu jednego mikrograma na mililitr w 50 mikrolitrach PBS w każdym dołku 96-dołkowej czarnej płytki.Inkubuj płytki w temperaturze 33 stopni Celsjusza przez 20 minut. Zmierz fluorescencję przy 360 nanometrach dla wzbudzenia i 430 nanometrach dla emisji. W tym protokole MEV oczyszczono przez sedymentację różnicową w gradiencie gęstości.W opisanych warunkach MEV rozdzielono głównie w trzeciej frakcji gradientu, która odpowiada 25% jodiksanolu. Białka związane z pęcherzykami były skoncentrowane we frakcji trzeciej pokazanej za pomocą analizy dot blot. Barwienie ujemne potwierdziło również obecność MEV we frakcji trzeciej, a analiza nanocząstek wykazała, że rozmiar MEV wynosił około 100 nanometrów.Stężenie białek i lipidów znormalizowane do jednostek tworzących kolonie wykazało około ośmiokrotny wzrost wydajności MEV w warunkach niskiego poziomu żelaza w porównaniu z warunkami wysokiego poziomu żelaza. Analiza dot blot wykazała bardziej intensywny sygnał od markerów związanych z MEV we frakcjach gradientu gęstości z hodowli MTB o ograniczonej zawartości żelaza niż z kultur MTB o wystarczającej ilości żelaza. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi przygotowania minimalnej pożywki, aby zapewnić warunki ograniczonego żelaza i zapobiec zanieczyszczeniu pęcherzyków błonowych agregatami lipoprotein.Oczyszczone w ten sposób pęcherzyki błonowe prątków można wykorzystać do charakterystyki biochemicznej i analizy funkcjonalnej.

isolation-characterization-extracellular-vesicles-produced-iron

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Gupta, S., et al. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje procedurę hodowli Mycobacterium tuberculosis w warunkach ograniczonych żelazem w celu wywołania stresu żelazowego i promowania wydzielania sideroforów, które wspierają przeżycie bakterii.

Hodowla prątków gruźlicy w warunkach ograniczonych żelazem

Źródło: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki z ograniczoną ilością żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje stopniową izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Mycobacterium tuberculosis hodowanych w warunkach ograniczających żelazo, które naśladują środowisko gospodarza. Przedstawiono w nim zastosowanie ultrafiltracji, wirowania różnicowego i separacji gradientu gęstości w celu wzbogacenia i...

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających syderofory z Mycobacterium tuberculosis

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Ten film opisuje metodę opartą na chromatografii wykluczania wielkości (SEC) do izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV pochodzących z komórek odpornościowych mózgu - mikrogleju. EV działają jak ładunek molekularny, dostarczając mediatory, które regulują odpowiedź immunologiczną. W związku z tym wyizolowane EV mogą być wykorzystane jako model in vitro do badania wzajemnych oddziaływań mikrogleju i neuronów podczas neuronalnej odpowiedzi immunologicznej.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z mikrogleju oparta na SEC: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek hodowlanych kondycjonowanych mikroglejem

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Ten protokół opisuje chromatografię wykluczania rozmiaru, łatwą i powtarzalną technikę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis z supernatantów hodowli.

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

Proponowany protokół zawiera wytyczne dotyczące unikania zanieczyszczenia endotoksyną podczas izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z supernatantów hodowli komórkowych oraz jak prawidłowo je ocenić.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o niskiej zawartości endotoksyn pochodzących z linii komórek rakowych

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Mycobacterium tuberculosis hodowanych w warunkach niedoboru żelaza. Protokół umożliwia uzyskanie czystych pęcherzyków do badań biochemicznych.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Przeglądaj więcej filmów