Izolacja i charakterystyka modeli organoidowych gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta

Hodowle organoidowe gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzące od pacjentów są szybko ustalonym trójwymiarowym modelem, który z dużą wiernością przedstawia przedziały komórek nowotworowych nabłonka, umożliwiając badania translacyjne nad tą śmiertelną złośliwością. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody tworzenia i rozmnażania organoidów, a także wykonywania odpowiednich testów biologicznych przy użyciu tych modeli.

Metoda ta jest istotna, ponieważ modele organoidowe pochodzące od pacjentów są potężnym i szybkim narzędziem do badania raka trzustki, ponieważ odzwierciedlają genetyczną i fenotypową heterogeniczność tej choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że organoidy można wyizolować z dużą skutecznością z ograniczonej ilości nowotworów i można je szybko namnażać in vitro w celu dalszej analizy. Badanie reakcji organoidów na leki cytotoksyczne może pomóc nam zrozumieć, dlaczego nowotwory stają się oporne na terapię i określić skuteczniejsze strategie leczenia.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać przygotowaną 12-dołkową płytkę z inkubatora. Za pomocą sterylnego podnośnika komórkowego delikatnie podnieś kopułę ekstrakcyjną membrany podstawnej, tak aby unosiła się w całym podłożu, upewniając się, że nie skrobasz dna studni. Za pomocą pipety P1000 ostrożnie przenieś kopułę BME i pożywkę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Powtórz ten krok dla każdej studzienki zawierającej organoidy. Delikatnie umyj każdą studzienkę, która została zebrana, jednym mililitrem zimnego podłoża podstawowego i przenieś ten płyn do probówki zawierającej organoidy. Dokładnie wymieszaj roztwór i organoidy za pomocą pipety P1000 i wiruj 200 razy g przez pięć minut.

Na dnie probówki pojawi się warstwa BME zawierająca organoidy w zawiesinie i osad organoidowy. Ostrożnie usunąć supernatant, upewniając się, że nie dojdzie do utraty BME i warstwy organoidowej. Umieść rurkę na lodzie.

Dodaj 10 mililitrów lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek do probówki i dokładnie wymieszaj przez odwrócenie. Inkubować na lodzie przez 30 minut, mieszając co trzy minuty metodą inwersji. Następnie odwirować 200 razy g przez pięć minut.

Osad organoidowy powinien być widoczny, podczas gdy warstwa BME powinna zniknąć. Jeśli warstwa BME jest zmniejszona, ale nadal widoczna, inkubować przez dodatkowe 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i powtórzyć wirowanie. Po depolimeryzacji BME usuń roztwór do odzyskiwania komórek, pozostawiając osad organoidowy.

Umyj organoidy 10 mililitrami podłoża podstawowego, mieszając z inwersją. Wirować przy ciśnieniu 200 razy g przez pięć minut, usunąć supernatant i umieścić probówkę z osadem organoidowym na lodzie na co najmniej pięć minut. Opcjonalnie, jeśli pożądane jest przygotowanie pojedynczej komórki, dodaj do organoidów trzy mililitry trypsyny uzupełnionej 30 mikrolitrami roztworu DNAzy I.

Inkubuj tę reakcję enzymatyczną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem inwersyjnym co dwie minuty przez maksymalnie 10 minut. Użyj mikroskopu Brightfield, aby monitorować i potwierdzać, że dysocjacja pojedynczej komórki zakończyła się sukcesem. Aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodaj 10 mililitrów lodowatego podłoża podstawowego i wiruj z prędkością 200 razy g przez pięć minut.

Następnie usunąć supernatant. Umyj komórki 10 mililitrami podłoża podstawowego, mieszając z delikatną inwersją. Odwirować ponownie przy 200 razy g przez pięć minut.

Usunąć sklarowany osad i powtórzyć ten proces mycia i wirowania jeszcze raz. Umieść probówkę z osadem komórkowym na lodzie na co najmniej pięć minut. Następnie dodaj lodowaty BME do osadu komórkowego i za pomocą pipety P200 delikatnie wymieszaj roztwór, aż będzie jednorodny.

Następnie umieść końcówkę pipety blisko dna probówki i pipetuj w górę i w dół co najmniej pięć do 10 razy, aby mechanicznie rozbić organoidy. Użyj pipety P200, aby dostrzec kopułę o pojemności 100 mikrolitrów na środku dołka wstępnie podgrzanej 12-dołkowej płytki. Powtarzaj tę czynność, aż zostanie dozowany cały roztwór BME.

Następnie ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby żel BME zastygł. Po 10 minutach wyjmij płytkę i dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki organoidowej do każdej studzienki. Kultury organoidów są zwykle pasażowane przez siedem do 10 dni, w zależności od gęstości hodowli i proliferacji.

W razie potrzeby co pięć dni uzupełniaj kultury 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanych kompletnych pożywek organoidowych, aby skompensować zubożenie czynnika wzrostu i parowanie. Po wyizolowaniu pojedynczych komórek z organoidów, ponownie zawieś pojedyncze komórki w jednym mililitrze kompletnego ludzkiego organoidu. Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki, upewniając się, że rejestrujesz żywotność komórek.

Obliczyć całkowitą liczbę komórek i komórek żywotnych obecnych w zawiesinie o objętości jednego mililitra. Następnie usuń objętość odpowiadającą 400 000 komórek i przenieś ją do nowej probówki. Dodaj kompletną pożywkę organoidową do tej probówki, aby zwiększyć objętość do 7,2 mililitra.

Do testów terapeutycznych przygotuj komórki do posiewu, mieszając 800 mikrolitrów BME z 7,2 mililitrami kompletnych pożywek organoidowych zawierających komórki na lodzie. Przenieść mieszaninę do zbiornika trzymanego na lodzie i za pomocą 12-kanałowej pipety umieścić 20 mikrolitrów tej mieszaniny w każdym dołku płytki 384-dołkowej, co daje około 1 000 komórek na studzienkę. Następnie obracaj płytkę 100 razy g przez jedną minutę w wiadrze wahadłowym i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 24 godzinach użyj mikroskopu Brightfield, aby sprawdzić obecność organoidów. W tym badaniu organoidy PDAC pochodzące od pacjenta zostały wyizolowane, rozszerzone i scharakteryzowane. Aby zilustrować wyzwania związane z izolacją organoidów z PDAC, na podstawie małej próbki guza hipokomórkowego ustala się reprezentatywną kulturę organoidów pochodzącą od pacjenta.

Organoidy mogą rosnąć większe w ciągu dwóch tygodni i są pasażowane zgodnie z protokołem w celu stworzenia bardziej wytrzymałej kultury. Pojedyncze komórki z uznanego i szybko rosnącego reprezentatywnego organoidu PDAC są następnie przygotowywane w celu zademonstrowania wyniku protokołu farmakotypowania. 1 000 żywotnych komórek jest sianych w każdym dołku i pozostawia się do regeneracji w ciągu 24 godzin przed podaniem cytotoksycznych środków chemioterapeutycznych.

Test dawki 9,0 przeprowadza się w trzech egzemplarzach, zaczynając od małej dawki 100 picomolar, a kończąc na wysokiej dawce dwóch mikromolowych. Po pięciodniowym leczeniu wykonywane są reprezentatywne zdjęcia studzienek traktowanych podłożem i wysoką dawką każdego środka chemioterapeutycznego. Natychmiast po wykonaniu zdjęć żywotność komórek ocenia się za pomocą odczynnika do żywotności komórek luminescencyjnych i wykreśla za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów.

Organoidy pochodzące od pacjentów mogą mieć niejednorodną morfologię. Dlatego ważne jest, aby zoptymalizować dysocjacje enzymatyczne dla każdej pojedynczej kultury. Dalsza analiza modeli pochodzących od pacjentów zwykle obejmuje sekwencjonowanie DNA i RNA nowej generacji.

Jeśli to możliwe, należy zweryfikować charakterystykę molekularną modeli przy użyciu pierwotnych próbek tkanek. Zindywidualizowane hodowle organoidów otwierają możliwość spersonalizowanego podejścia medycznego dla pacjentów z rakiem trzustki. Należy pamiętać, że z niebezpiecznymi chemikaliami, takimi jak fenol-chloroform i chemioterapeutyki, należy obchodzić się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej i sprzętu ochronnego.