Name: Izolacja i charakterystyka modeli organoidowych gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj izolację i charakterystykę organoidów gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta. Ta metoda umożliwia szybkie hodowanie modeli 3D do badania heterogeniczności nowotworu i odpowiedzi na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, członków laboratorium Lowy oraz UC San Diego Department of Surgery, Division of Surgical Oncology. AML jest hojnie wspierany przez NIH CA155620, nagrodę SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16) oraz darczyńców Funduszu na rzecz Leczenia Raka Trzustki.

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2018%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li>
<li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer%3A+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology+Practice%22%5BJournal%5D)">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li>
<li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer%3A+A+single-institution+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+Surgery%22%5BJournal%5D)">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li>
<li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li>
<li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li>
<li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li>
<li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li>
<li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li>
<li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li>
<li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Reporter+Activity+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183(2014).</li>
<li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li>
<li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy aktualne protokoły izolacji, rozszerzania i charakteryzowania organoidów PDAC pochodzących od pacjenta. Nasz obecny wskaźnik sukcesu w tworzeniu hodowli organoidów wynosi ponad 70%; W związku z tym metody te nie zostały jeszcze udoskonalone i oczekuje się, że z czasem ulegną poprawie i ewolucji. Należy zwrócić uwagę na wielkość próby, ponieważ PDAC ma niską komórkowość nowotworową. W związku z tym małe próbki będą zawierały niewiele komórek nowotworowych i będą generować tylko garstkę organoid...

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest śmiertelną chorobą charakteryzującą się późnym rozpoznaniem u większości pacjentów, brakiem skutecznych terapii i wynikającym z tego niskim 5-letnim wskaźnikiem całkowitego przeżycia, który utrzymuje się na poziomie niższym niż 10%1. Tylko u 20% pacjentów diagnozuje się zlokalizowaną chorobę nadającą się do leczniczej interwencji chirurgicznej2,3. Pozostali pacjenci są zazwyczaj leczeni kombinacją chemioterapeutyków, które są skuteczne u mniejszości pacjentów4,5. Aby sprostać tym pilnym potrzebom klinicznym, naukowcy aktywnie pracują nad strategiami wczesnego wykrywania i opracowywaniem skuteczniejszych terapii. Aby przyspieszyć kliniczne przełożenie ważnych odkryć, naukowcy wykorzystują genetycznie modyfikowane modele myszy, ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów, jednowarstwowe linie komórkowe, a ostatnio modele organoidowe6.
Trójwymiarowa kultura organoidów nabłonkowych wykorzystująca czynnik wzrostu i warunki bogate w ligand Wnt w celu stymulacji proliferacji nieprzekształconych komórek progenitorowych została po raz pierwszy opisana dla jelita myszy7 i szybko została przystosowana do normalnej tkanki trzustki ludzkiej8. Oprócz normalnej tkanki przewodowej, metodologia organoidów pozwala na izolację, ekspansję i badanie ludzkiego PDAC8. Co ważne, metoda ta wspiera tworzenie organoidów z próbek chirurgicznych, a także biopsje cienkoigłowe i gruboigłowe, co pozwala naukowcom badać wszystkie etapy choroby9,10. Co ciekawe, organoidy pochodzące od pacjentów podsumowują dobrze opisane podtypy transkryptomiczne nowotworów i mogą umożliwić rozwój platform medycyny precyzyjnej9,11.
Obecne protokoły organoidowe dla PDAC umożliwiają pomyślne rozszerzenie ponad 70% próbek pobranych od pacjentów wcześniej nieleczonych chemioterapią9. Poniżej przedstawiamy standardowe metody stosowane przez nasze laboratorium do izolowania, rozszerzania i charakteryzowania organoidów PDAC pochodzących od pacjentów. Inne metodologie organoidów PDAC zostały opisane12,13, ale nie przeprowadzono dokładnie porównania tych metod. Ponieważ technologia ta jest stosunkowo nowa i szybko się rozwija, spodziewamy się, że protokoły te będą nadal ewoluować i ulepszać; Jednak zasady postępowania z tkankami i hodowli organoidów będą nadal przydatne.

<table><tbody><tr><td>Pipeta 12-kanałowa (P20, P100 lub P200) z końcówkami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>Olympus</td><td>25-106</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030122208</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Rotator i/lub nutator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Inkubator CO2</td> 37 &deg;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> C Łaźnia</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr><td>384 dołki</td><td>Corning</td><td>4588</td><td>Ultra niska nasadka, i optycznie przezroczysta</td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>TOCRIS</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADV DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Bezzwierzęcy Rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik</td><td></td><td></td><td></td> komórek</tr><tr><td>Suplement B27</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cell Recovery Solution</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Odczynnik, który depolimeryzuje ekstrakt z błony podstawnej w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>CellTiterGlow</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>Odczynnik żywotności komórek luminescencyjnych</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Komputerowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kriostor CS10</td><td>StemCELL Tech</td><td>07930</td><td>Roztwór do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Komórki</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-K</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Drukarka leków</td><td>Tecan</td><td>D300e</td><td>Jest to drukarka leków, której używamy w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>Excel</td><td></td><td></td><td>Do analizy danych</td></tr><tr><td>Ekstra drobne kleszcze Graefe</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin I (człowiek)</td><td>TOCRIS</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>Delikatna kolagenaza/hialuronidaza</td><td>STEMCELL Tech</td><td>7919</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>roztwór glutaminy</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td><td>Do analizy danych</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr>Kaptur do <td></td><td></td><td></td><td>hodowli tkanek z przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Luminometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Wnt-3A wyrażający komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>MACS Roztwór do przechowywania tkanek</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Ekstrakt z błony podstawnej (BME), zredukowany czynnik wzrostu</td></tr><tr><td>Mr. Mr. Frosty Zamrażanie Pojemnik</td><td>ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta p1000 z końcówkami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P200 z końcówkami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>Jednostki filtrujące o szybkim przepływie (0,2 i mikro; m)</td> <td>ThermoFisher</td><td>121-0020</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe skalpele, #10 Ostrze</td><td>VWR</td><td>89176-380</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td>do kultur</tr><tr><td>tkankowych Naczynia do hodowli tkankowych 10 cm</td><td>Olympus</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>TRIZol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>Kwaśny roztwór fenolu</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>ThermoFisher</td><td>R25001</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka modeli organoidowych gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z najbardziej śmiertelnych nowotworów złośliwych. Ostatnio opisano metody hodowli organoidów nowej generacji, umożliwiające trójwymiarowe (3D) modelowanie tej choroby. Modele organoidów pochodzących od pacjenta (PDO) można wyizolować zarówno z próbek chirurgicznych, jak i z małych biopsji i szybko tworzyć się w hodowli. Co ważne, modele organoidowe zachowują patogenne zmiany genetyczne wykryte w guzie pacjenta i pozwalają przewidzieć odpowiedź pacjenta na leczenie, umożliwiając w ten sposób badania translacyjne. W tym miejscu zapewniamy kompleksowe protokoły adaptacji przepływu pracy hodowli tkankowej do badania 3D, modeli organoidowych z wbudowanymi matrycami. Szczegółowo opisujemy metody i zagadnienia dotyczące izolowania i rozmnażania pierwotnych organoidów PDAC. Ponadto opisujemy, w jaki sposób przygotowywane i kontrolowane w laboratorium podłoża organoidowe na zamówienie. Na koniec opisujemy testy do dalszej charakterystyki modeli organoidowych, takich jak izolacja kwasów nukleinowych (DNA i RNA) oraz testowanie leków. Co ważne, przedstawiamy kluczowe kwestie dotyczące wdrożenia metodologii organoidów w laboratorium badawczym.

Aby zilustrować trudności związane z izolacją organoidów z PDAC, przedstawiamy proces tworzenia hodowli organoidów pochodzących od pacjenta z małej, hipokomórkowej próbki guza. Po wstępnym wysiewie w każdej studzience widocznych było tylko kilka organoidów, co przedstawiono na Rysunku 1. Pozwolono organoidom na wzrost w ciągu 2 tygodni, a następnie przeprowadzono ich pasażowanie zgodnie z naszym protokołem w celu ustanowienia bardziej stabilnej hodowli, co pokazują reprezentatywne zdjęcia z ...

Hodowle organoidowe gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzące od pacjentów są szybko ustalonym trójwymiarowym modelem, który z dużą wiernością przedstawia przedziały komórek nowotworowych nabłonka, umożliwiając badania translacyjne nad tą śmiertelną złośliwością. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody tworzenia i rozmnażania organoidów, a także wykonywania odpowiednich testów biologicznych przy użyciu tych modeli.

Izolacja i charakterystyka modeli organoidowych gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Metoda ta jest istotna, ponieważ modele organoidowe pochodzące od pacjentów są potężnym i szybkim narzędziem do badania raka trzustki, ponieważ odzwierciedlają genetyczną i fenotypową heterogeniczność tej choroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że organoidy można wyizolować z dużą skutecznością z ograniczonej ilości nowotworów i można je szybko namnażać in vitro w celu dalszej analizy. Badanie reakcji organoidów na leki cytotoksyczne może pomóc nam zrozumieć, dlaczego nowotwory stają się oporne na terapię i określić skuteczniejsze strategie leczenia.Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać przygotowaną 12-dołkową płytkę z inkubatora. Za pomocą sterylnego podnośnika komórkowego delikatnie podnieś kopułę ekstrakcyjną membrany podstawnej, tak aby unosiła się w całym podłożu, upewniając się, że nie skrobasz dna studni. Za pomocą pipety P1000 ostrożnie przenieś kopułę BME i pożywkę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.Powtórz ten krok dla każdej studzienki zawierającej organoidy. Delikatnie umyj każdą studzienkę, która została zebrana, jednym mililitrem zimnego podłoża podstawowego i przenieś ten płyn do probówki zawierającej organoidy. Dokładnie wymieszaj roztwór i organoidy za pomocą pipety P1000 i wiruj 200 razy g przez pięć minut.Na dnie probówki pojawi się warstwa BME zawierająca organoidy w zawiesinie i osad organoidowy. Ostrożnie usunąć supernatant, upewniając się, że nie dojdzie do utraty BME i warstwy organoidowej. Umieść rurkę na lodzie.Dodaj 10 mililitrów lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek do probówki i dokładnie wymieszaj przez odwrócenie. Inkubować na lodzie przez 30 minut, mieszając co trzy minuty metodą inwersji. Następnie odwirować 200 razy g przez pięć minut.Osad organoidowy powinien być widoczny, podczas gdy warstwa BME powinna zniknąć. Jeśli warstwa BME jest zmniejszona, ale nadal widoczna, inkubować przez dodatkowe 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i powtórzyć wirowanie. Po depolimeryzacji BME usuń roztwór do odzyskiwania komórek, pozostawiając osad organoidowy.Umyj organoidy 10 mililitrami podłoża podstawowego, mieszając z inwersją. Wirować przy ciśnieniu 200 razy g przez pięć minut, usunąć supernatant i umieścić probówkę z osadem organoidowym na lodzie na co najmniej pięć minut. Opcjonalnie, jeśli pożądane jest przygotowanie pojedynczej komórki, dodaj do organoidów trzy mililitry trypsyny uzupełnionej 30 mikrolitrami roztworu DNAzy I.Inkubuj tę reakcję enzymatyczną w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem inwersyjnym co dwie minuty przez maksymalnie 10 minut. Użyj mikroskopu Brightfield, aby monitorować i potwierdzać, że dysocjacja pojedynczej komórki zakończyła się sukcesem. Aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodaj 10 mililitrów lodowatego podłoża podstawowego i wiruj z prędkością 200 razy g przez pięć minut.Następnie usunąć supernatant. Umyj komórki 10 mililitrami podłoża podstawowego, mieszając z delikatną inwersją. Odwirować ponownie przy 200 razy g przez pięć minut.Usunąć sklarowany osad i powtórzyć ten proces mycia i wirowania jeszcze raz. Umieść probówkę z osadem komórkowym na lodzie na co najmniej pięć minut. Następnie dodaj lodowaty BME do osadu komórkowego i za pomocą pipety P200 delikatnie wymieszaj roztwór, aż będzie jednorodny.Następnie umieść końcówkę pipety blisko dna probówki i pipetuj w górę i w dół co najmniej pięć do 10 razy, aby mechanicznie rozbić organoidy. Użyj pipety P200, aby dostrzec kopułę o pojemności 100 mikrolitrów na środku dołka wstępnie podgrzanej 12-dołkowej płytki. Powtarzaj tę czynność, aż zostanie dozowany cały roztwór BME.Następnie ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby żel BME zastygł. Po 10 minutach wyjmij płytkę i dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki organoidowej do każdej studzienki. Kultury organoidów są zwykle pasażowane przez siedem do 10 dni, w zależności od gęstości hodowli i proliferacji.W razie potrzeby co pięć dni uzupełniaj kultury 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanych kompletnych pożywek organoidowych, aby skompensować zubożenie czynnika wzrostu i parowanie. Po wyizolowaniu pojedynczych komórek z organoidów, ponownie zawieś pojedyncze komórki w jednym mililitrze kompletnego ludzkiego organoidu. Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki, upewniając się, że rejestrujesz żywotność komórek.Obliczyć całkowitą liczbę komórek i komórek żywotnych obecnych w zawiesinie o objętości jednego mililitra. Następnie usuń objętość odpowiadającą 400 000 komórek i przenieś ją do nowej probówki. Dodaj kompletną pożywkę organoidową do tej probówki, aby zwiększyć objętość do 7,2 mililitra.Do testów terapeutycznych przygotuj komórki do posiewu, mieszając 800 mikrolitrów BME z 7,2 mililitrami kompletnych pożywek organoidowych zawierających komórki na lodzie. Przenieść mieszaninę do zbiornika trzymanego na lodzie i za pomocą 12-kanałowej pipety umieścić 20 mikrolitrów tej mieszaniny w każdym dołku płytki 384-dołkowej, co daje około 1 000 komórek na studzienkę. Następnie obracaj płytkę 100 razy g przez jedną minutę w wiadrze wahadłowym i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po 24 godzinach użyj mikroskopu Brightfield, aby sprawdzić obecność organoidów. W tym badaniu organoidy PDAC pochodzące od pacjenta zostały wyizolowane, rozszerzone i scharakteryzowane. Aby zilustrować wyzwania związane z izolacją organoidów z PDAC, na podstawie małej próbki guza hipokomórkowego ustala się reprezentatywną kulturę organoidów pochodzącą od pacjenta.Organoidy mogą rosnąć większe w ciągu dwóch tygodni i są pasażowane zgodnie z protokołem w celu stworzenia bardziej wytrzymałej kultury. Pojedyncze komórki z uznanego i szybko rosnącego reprezentatywnego organoidu PDAC są następnie przygotowywane w celu zademonstrowania wyniku protokołu farmakotypowania. 1 000 żywotnych komórek jest sianych w każdym dołku i pozostawia się do regeneracji w ciągu 24 godzin przed podaniem cytotoksycznych środków chemioterapeutycznych.Test dawki 9,0 przeprowadza się w trzech egzemplarzach, zaczynając od małej dawki 100 picomolar, a kończąc na wysokiej dawce dwóch mikromolowych. Po pięciodniowym leczeniu wykonywane są reprezentatywne zdjęcia studzienek traktowanych podłożem i wysoką dawką każdego środka chemioterapeutycznego. Natychmiast po wykonaniu zdjęć żywotność komórek ocenia się za pomocą odczynnika do żywotności komórek luminescencyjnych i wykreśla za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów.Organoidy pochodzące od pacjentów mogą mieć niejednorodną morfologię. Dlatego ważne jest, aby zoptymalizować dysocjacje enzymatyczne dla każdej pojedynczej kultury. Dalsza analiza modeli pochodzących od pacjentów zwykle obejmuje sekwencjonowanie DNA i RNA nowej generacji.Jeśli to możliwe, należy zweryfikować charakterystykę molekularną modeli przy użyciu pierwotnych próbek tkanek. Zindywidualizowane hodowle organoidów otwierają możliwość spersonalizowanego podejścia medycznego dla pacjentów z rakiem trzustki. Należy pamiętać, że z niebezpiecznymi chemikaliami, takimi jak fenol-chloroform i chemioterapeutyki, należy obchodzić się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej i sprzętu ochronnego.

isolation-characterization-patient-derived-pancreatic-ductal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisujemy protokół implantacji pod kontrolą ultrasonograficzną linii komórkowych rdzeniakoraka przewodowego trzustki pochodzących od myszy bezpośrednio do natywnego miejsca guza. Takie podejście spowodowało guzy trzustki wykrywalne za pomocą skanowania ultrasonograficznego w ciągu 2-4 tygodni od wstrzyknięcia i znacznie zmniejszyło odsetek wysiewu komórek nowotworowych na ścianie otrzewnej w porównaniu z chirurgiczną implantacją ortotopową.

Ortotopowa implantacja mysiego gruczolakoraka przewodowego trzustki pod kontrolą USG

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Opisano metodę tworzenia organoidów przy użyciu ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) do badań przesiewowych in vitro, co daje dopasowane pary modeli in vivo/in vitro. Guzy PDX zostały zebrane/przetworzone na małe kawałki mechanicznie lub enzymatycznie, a następnie metodą Cleversa do wyhodowania organoidów nowotworowych, które zostały pasażowane, kriokonserwowane i scharakteryzowane w stosunku do oryginalnego PDX.

Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami

Ten protokół opisuje przygotowanie organotypowych kultur plastrowych (OTSC). Technika ta ułatwia hodowlę ex vivo nienaruszonej tkanki wielokomórkowej. OTSC mogą być natychmiast użyte do zbadania ich odpowiedniej odpowiedzi na leki w środowisku wielokomórkowym.

Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Obecny protokół opisuje przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) i normalnych komórek nabłonka przewodowego trzustki na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Zapewniamy zoptymalizowaną i szczegółową procedurę krok po kroku, od przygotowania lentiwirusa do ustanowienia stabilnych linii iPSC.

Przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki na pluripotencję

Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Heterogeniczność raka prostaty i oporność na leczenie pozostają wyzwaniami. Opisujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów (PDO), które zachowują kluczowe cechy guza rodzicielskiego. Ten standaryzowany model wspiera badania przesiewowe leków i postępy w medycynie precyzyjnej.

Ustanowienie i utrzymanie organoidów raka prostaty pochodzących od pacjentów: szczegółowy protokół eksperymentalny

Poznaj izolację i charakterystykę organoidów gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta. Ta metoda umożliwia szybkie hodowanie modeli 3D do badania heterogeniczności nowotworu i odpowiedzi na leczenie.

Izolacja i charakterystyka modeli organoidowych gruczolakoraka przewodowego trzustki pochodzących od pacjenta

Przeglądaj więcej filmów