System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

Ten system mikroiniekcji jest przeznaczony do infuzji leków, elektrofizjologii oraz dostarczania i pobierania sond eksperymentalnych, takich jak mikroelektrody i nanoczujniki. Jest zoptymalizowany do wielokrotnego stosowania u obudzonych zwierząt zachowujących się z niewielkimi uszkodzeniami penetracyjnymi otaczających tkanek. System mikrowtryskiwaczy może być skonfigurowany do wielu celów.

Pierwszym z nich jest proste ułożenie kaniuli w celu umieszczenia eksperymentalnej sondy, która w przeciwnym razie byłaby zbyt delikatna, aby przeniknąć do opony twardej. Drugi to mikroprzepływowy wlew leku niezależnie lub sprzężony z kaniulą zawierającą sondę eksperymentalną. Mikroprzepływowe elementy systemu pozwalają na dostarczanie objętości w skali nanolitrów.

Zmierz długość kaniuli i sondy nanosensora lub mikroelektrody. Sonda musi być dłuższa od kaniuli o długość, która ma wystawać z końcówki kaniuli plus około jednego centymetra. Pod lupą załaduj sondę do kaniuli od tyłu, aby chronić końcówkę sondy.

Włóż kaniulę zawierającą sondę do złącza T od dolnej tulejki. Umieść górną płaską stronę kaniuli pośrodku złącza T. Unikaj blokowania złącza za pomocą kaniuli, wsuwając je z powrotem do złącza, a następnie dokręć.

Przymocuj rurkę do górnej części mikroelektrody. Załaduj mikroelektrodę z powrotem przez rurkę kapilarną, złącze T, kaniulę i odpowiednie tulejki. Przytnij mikroelektrodę na żądaną długość i zeskrob koniec.

Upewnij się, że tylny koniec elektrody wystaje mniej niż jeden centymetr z tyłu rurki kapilarnej, a końcówka elektrody wystaje z kaniuli w żądanej odległości od spodu. Umieść końcówkę mikroelektrody w złotym bolcu i złotą końcówkę do końcówki mikroelektrody. Dodaj klej epoksydowy między złotą szpilką a górną skuwką, aby przymocować mikroelektrodę do tulejki.

Po utwardzeniu żywicy epoksydowej, najlepiej przez ponad 24 godziny, odkręć górną skuwkę, aby upewnić się, że mikroelektroda całkowicie chowa się wewnątrz kaniuli. Aby zbudować obwód mikroprzepływowy, umieść szeroką płytkę na stabilnej powierzchni. Umieść dwa zawory trójdrogowe równolegle do najdłuższych boków szerokiej deski w odległości około 12 centymetrów od siebie, tak aby jeden port był skierowany do siebie.

Użyj, aby przymocować zawory do szerokiej płyty i wytnij kolejne 10 centymetrów rurki kapilarnej na linię linijki i umieść ją pomiędzy. Użyj standardowych tulejek, aby dokręcić rurkę do portów czołowych zaworów. Wytnij od 10 do 20 centymetrów rurki kapilarnej i użyj standardowych tulejek i złączy Luer lock, aby podłączyć rurkę strzykawki do jednego z portów na zaworze wejściowym.

Wytnij mały kawałek kapilary i podłącz go do zaworu wyjściowego jako linię spłukującą. Wytnij dwa dłuższe kawałki rurki kapilarnej na około 100 centymetrów, aby połączyć zawór wyjściowy z mikrowtryskiwaczem. Podłączyć pompę leku i pompę markerową do zaworu wejściowego.

Najpierw upewnij się, że eksperymentalna sonda mikroelektrodowa jest schowana w kaniuli. Aby przymocować wykonany na zamówienie adapter do mikrowtryskiwacza za pomocą, załaduj mikrowtryskiwacz od góry przez rurkę prowadzącą i przymocuj go do wykonanego na zamówienie adaptera mikronapędu za pomocą pary. Zmierz głębokość położenia mikronapędu, na której mikrowtryskiwacz wystaje z rurki prowadzącej, a następnie cofnij go o jeden centymetr, aby przygotować się do włożenia.

W przypadku eksperymentów z mikroinfuzją należy podłączyć linię mózgową do nieużywanego otworu złącza T mikroiniekcji. Użyj standardowej tulejki i dokręć kluczem do tulejek. Upewnij się, że górna skuwka również jest dokręcona.

Następnie umieść mikronapęd nad zlewką. Załaduj chlorheksydynę w ilości 20 gramów na litr do jednomililitrowej gazoszczelnej strzykawki i umieść ją w pompie leku. Obróć kierunek przepływu zaworów i ustaw niskie natężenie przepływu od 50 do 200 mikrolitrów na minutę, tak aby płyn przepływał z pompy leku przez zawór wejściowy do zaworu wyjściowego i na zewnątrz linii mózgowej.

Przepłukiwać obwód chlorheksydyną przez co najmniej 10 minut. Powtórz płukanie sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie powietrzem. Delikatnie nałóż niestrzępiące się chusteczki na skrzyżowaniach, aby odsłonić wszelkie wycieki płynu przez tulejki.

Najważniejszym krokiem jest sprawdzenie, czy zespół wtryskiwacza i obwodu mikroprzepływowego jest szczelny. Załaduj lek do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 500 mikrolitrów, spręż powietrze, a następnie umieść go w pompie leku. Dostosuj przepływ do 50 mikrolitrów na minutę i pozwól płynowi przepływać, aż w mikrowtrysku pozostanie kilka kropli.

Następnie namocz rurkę prowadzącą w chlorheksydynie w stężeniu 20 gramów na litr przez 15 minut. Obróć kierunek zaworu wyjściowego w kierunku linii płukania, aby przesunąć znacznik w miarę przesuwania pompy znacznika, aż do zaobserwowania wyraźnej krawędzi koloru i oleju na linii linijki. Upewnij się, że między lekiem a kolorem zawsze znajduje się olej, aby nie zmieszać dwóch rozpuszczalnych w wodzie materiałów i nie stracić ostrej krawędzi między nimi.

Zaznacz pozycję początkową tej linii barwników olejowych. Po przeprowadzeniu niezbędnego zestawu doświadczalnego wsuń mikroelektrodę do kaniuli, poluzowując górną skuwkę. Podłącz mikronapęd do komory nagrywającej i opuść rurkę prowadzącą, aby przeniknąć do opony twardej.

Następnie należy obniżyć mikrowstrzyknięcie do około dwóch milimetrów powyżej miejsca rejestracji znajdującego się w mózgu. Dokręć górną tuleję i podłącz złote piny do systemu nagrywania. Kontynuuj przesuwanie mikroiniekcji do miejsca docelowego.

Następnie przełącz zawór wyjściowy na linię mózgową. Do eksperymentów infuzyjnych użyj ręcznej pompy mikrostrzykawkowej, aby przesunąć kolumnę oleju o 0,5 centymetra co minutę. Po podaniu żądanej objętości przestaw zawór wyjściowy w kierunku przewodu płuczącego.

W tym badaniu wstrzyknięcie agonisty GABA A przez obszar FEF prawej półkuli przeprowadzono w celu odwracalnej inaktywacji przedniego pola oka, podczas gdy zwierzę zakończyło zadanie sakkady sterowanej pamięcią. Wykres biegunowy przedstawia wydajność mimośrodu dla różnych lokalizacji względem punktu fiksacji. Wydajność wyraźnie zmniejszyła się w lewej półpolu wzrokowym dwie godziny po wstrzyknięciu.

Poniżej przedstawiono ślady sakkad dla ośmiu miejsc pamięci peryferyjnej przed i po wstrzyknięciu Muscimolu do FEF. Dokładność sakkad w lewej półkuli wzrokowej zmniejszyła się po wstrzyknięciu muscymolu. Po zakończeniu konfiguracji metoda jest bardzo niezawodna i solidna.

Jednak ze względu na wytrącanie się małych cząsteczek w rurce i portach, przed każdym użyciem i po każdym eksperymencie wymagane jest dokładne płukanie, aby mikrofluidyk był wolny od przeszkód i wycieków. Chociaż metoda została zademonstrowana w polu przedniego oka u naczelnych innych niż ludzie, zasada ta może być zastosowana do każdego innego obszaru mózgu, w którym pożądana jest pewna kombinacja stymulacji elektrycznej, nagrywania i wstrzykiwania narkotyków u gatunków gryzoni wielkości lub większych. Nasz system jest na tyle elastyczny, że może być używany do nagrywania niezależnie lub w połączeniu z wstrzykiwaniem leku i ma możliwość precyzyjnego umieszczenia dowolnej delikatnej sondy eksperymentalnej chronionej przed uszkodzeniem przez oponę twardą i tkankę nerwową przy minimalnym uszkodzeniu tkanki ze względu na małą średnicę kaniuli.