Name: System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj system mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii w korze małpy. Ta metoda umożliwia precyzyjne podawanie nanolitrowych objętości z minimalnym uszkodzeniem tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z National Institutes of Health (NIH), granty EY026924 i EY014800 (dla B.N.), Unrestricted Grant od Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY dla Wydziału Okulistyki i Nauk Wizualnych, University of Utah, oraz fundusze na start dostarczone R.E. przez Henry Samueli School of Engineering i Wydział Inżynierii Elektrycznej Uniwersytetu Kalifornijskiego, Irvine. Metoda ta opiera się na poprzednim raporcie o podobnej metodzie opracowanej w laboratorium dr Tirin Moore, opublikowanym w Noudoost & Moore 2011, Journal of Neuroscience Methods. Autorzy dziękują dr Kelsey Clark za jej komentarze do manuskryptu.

Procedury eksperymentalne były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz wytycznymi i zasadami Society for Neuroscience. Protokoły procedur eksperymentalnych i behawioralnych zostały zatwierdzone przez University of Utah Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Budowa mikroiniektoru do stymulacji i rejestracji (Rysunek 1a)
<ol>
	<li>Zmierz długość kaniuli i sondy (w tym przykładzie nanoczujnika). Sonda musi być dłuższa od kaniuli o długość, na jaką ma wystawać z końcówki kaniuli (w zależności od konstrukcji sondy) plus około 2 cm.</li>
	<li>Pod lupą lub mikroskopem (powiększenie ~10x) załaduj sondę do kaniuli; jeśli to możliwe, preferowane jest ładowanie wsteczne, aby chronić końcówkę sondy. 
	nuta: Ten krok, wykonywany ręcznie, jest wyzwaniem. Zaleca się ćwiczenie z mikroelektrodą pod szkłem powiększającym przed próbą z rzeczywistą sondą eksperymentalną.</li>
	<li>Przełóż kaniulę (zawierającą sondę) przez górną tulejkę, złącze T i dolną tulejkę.
	<ol>
		<li>Jeśli sonda jest tylko pojedynczym przewodem bez żadnych namocowań, załaduj ją z powrotem do kaniuli i włóż zespół do trójnika od dolnej tulejki. Górna część kaniuli (płaska strona końcowa) powinna być umieszczona pośrodku złącza T, w dolnej, ale nie górnej skuwce. Sonda doświadczalna lub bioczujnik powinny wystawać ponad górną część górnej tulejki. 
		nuta: Tulejki wykonane na zamówienie można również wykonać, wiercąc otwór w zaślepkach tulejek za pomocą mikrowierteł, przy czym rozmiar otworu zależy od średnicy potrzebnej do dokręcenia kaniuli do złącza T.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj klucza do tulejek, aby dokręcić tuleje na górze i na dole trójnika. Nie dokręcaj zbyt mocno. Można dodać mały kawałek rurki, aby wzmocnić podparcie elektrody w górnej tulejce.</li>
	<li>złote piny do każdego z zacisków sondy (sygnał, masa itp.), zgodnie ze specyfikacją sondy.</li>
	<li>Dostosuj względne położenie sondy i kaniuli. Zmierz odległość, na jaką sonda wystaje z kaniuli pod powiększeniem i wyreguluj ręcznie od górnego końca (sonda może swobodnie przesuwać się w tulejach).</li>
	<li>Dodaj klej epoksydowy między złotymi kołkami a górną skuwką, aby przymocować sondę do tulejki.</li>
	<li>Odkręć górną tuleję, aby schować sondę wewnątrz kaniuli. Potwierdź wzrokowo, że sonda znajduje się całkowicie w kaniuli w powiększeniu.</li>
	<li>Podłącz wtryskiwacz do mikronapędu.</li>
</ol>
2. Budowa mikroiniektoru do infuzji leków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b)
<ol>
	<li>Przymocuj "nieskośny" lub płaski koniec kaniuli do dolnej części złącza T za pomocą tulejki. Użyj klucza do tulejki, aby dokręcić tuleję.</li>
	<li>Przymocuj mały kawałek rurki kapilarnej (~ 1,5 cm) do górnej części złącza T, przepuszczając go przez standardową tulejkę. Dokręć kluczem do tulejek.</li>
	<li>Załaduj mikroelektrodę z powrotem przez rurkę kapilarną, złącze T, kaniulę i odpowiednie tulejki.</li>
	<li>Upewnij się, że tylny koniec elektrody wystaje mniej niż 1 cm z tyłu rurki kapilarnej, a końcówka elektrody wystaje z kaniuli w żądanej odległości od spodu. Położenie elektrody można regulować ręcznie od góry.</li>
	<li>złoty pin do końcówki mikroelektrody.</li>
	<li>Dodaj klej epoksydowy między złotą szpilką a górną skuwką, aby przymocować mikroelektrodę do tulejki.</li>
	<li>Odkręć górną tuleję, aby schować sondę do wnętrza kaniuli. Potwierdź wzrokowo, że mikroelektroda jest całkowicie schowana w kaniuli.</li>
</ol>
3. Budowa obwodu mikroprzepływowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Umieść płytkę do krojenia chleba na stabilnej powierzchni. Umieść dwa zawory trójdrogowe równolegle do najdłuższych boków płytki stykowej, około 6 cali. osobno z jednym portem (tym, który jest zawsze otwarty) skierowanym do siebie. Użyj, aby przymocować zawory do płytki stykowej.</li>
	<li>Umieść linijkę obok zaworów (aby mierzyć i śledzić ruch płynów wewnątrz rurki kapilarnej).</li>
	<li>Załaduj mieszaninę oleju o niskiej lepkości w stosunku 1:1 i barwnika spożywczego (markera) do gazoszczelnej strzykawki i umieść w pompie Marker. Wytnij jeden kawałek rurki kapilarnej i użyj standardowych tulejek i złączy Luer-lock, aby podłączyć strzykawkę do jednego z portów na zaworze wejściowym. To jest "linia znacznika".</li>
	<li>Wytnij krótki kawałek rurki kapilarnej na "linię linijki". Użyj standardowych tulejek, aby dokręcić do portów czołowych zaworów.</li>
	<li>Wytnij dwa dłuższe kawałki rurki kapilarnej, aby połączyć zawór wyjściowy z mikrowtryskiwaczem i podłączyć pompę leku do zaworu wejściowego (użyj standardowych tulejek). 
	nuta: Długość tych dwóch przewodów zależy od konfiguracji doświadczalnej, jedna musi być wystarczająco długa, aby sięgać od aparatu infuzyjnego do zwierzęcia, a druga od pompy leku do zaworu wejściowego. Użyj kamienia do rozłupywania, aby przeciąć rurkę kapilarną.</li>
</ol>
4. Montaż mikrowtrysku do Microdrive (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Upewnij się, że mikroelektroda/sonda eksperymentalna jest schowana w kaniuli przed montażem. 
	nuta: Rura prowadząca powinna znajdować się na swoim miejscu w mikronapędzie.</li>
	<li>Podłącz specjalnie wykonany adapter do mikrowtrysku.</li>
	<li>Załaduj mikrowtryskiwacz od góry przez rurkę prowadzącą i przymocuj go do adaptera za pomocą.</li>
	<li>Zmierz położenie (głębokość) mikronapędu, na którym mikroiniekcja wystaje z rurki prowadzącej, a następnie wsuń ją o ~1 cm, aby przygotować się do włożenia.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów z mikroinfuzją należy podłączyć "linię mózgową" do nieużywanego otworu złącza T mikroiniekcji. Użyj standardowej tulejki i dokręć kluczem do tulejek.</li>
</ol>
5. Płukanie i przygotowanie układu mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Umieścić mikronapęd z mikrowtryskiwaczem nad zlewką na odpady.</li>
	<li>Załadować chlorheksydynę (np. nolvasan; rozpuszczoną w stężeniu 20 g/l) do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 1 ml i umieścić ją w pompie lekowej. Obróć kierunek przepływu zaworów tak, aby płyn przepływał z pompy leku przez zawór do przewodu zaworu i na zewnątrz "linii mózgu".</li>
	<li>Przepłukać obwód chlorheksydyną przy niskim natężeniu przepływu (50-200 μl/min) przez co najmniej 10 minut. Powtórz kroki od 5.2 do 5.3 sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie powietrzem. 
	nuta: Na tym etapie ważne jest, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. Delikatnie nałóż niestrzępiące się chusteczki na skrzyżowaniach, aby odsłonić wszelkie wycieki płynu przez tulejki.</li>
	<li>Załaduj lek do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 500 μl, spręż powietrze, a następnie umieść w pompie leku. Przepływać z prędkością 50 μl/min, aż z mikroiniekcji wypłynie kilka kropel.</li>
	<li>Namoczyć rurkę prowadzącą w chlorheksydynie (rozpuszczonej w stężeniu 20 g/l) przez 15 minut.</li>
	<li>Obróć kierunek zaworu wyjściowego w kierunku "linii płukania". Przesuwaj pompę markera, aż na linii linijki pojawi się wyraźna krawędź koloru i oleju. Upewnij się, że między lekiem a kolorem zawsze znajduje się olej, aby nie zmieszać dwóch rozpuszczalnych w wodzie materiałów i nie stracić ostrej krawędzi między nimi. Zaznacz pozycję początkową tej linii oleju/barwnika (za pomocą kawałka taśmy lub markera).</li>
	<li>Obróć kierunek zaworu wyjściowego w kierunku linii mózgu.</li>
</ol>
6. Przeprowadzanie nagrań lub eksperymentu infuzyjnego
UWAGA: Etapy postępowania ze zwierzętami będą się różnić w zależności od laboratorium i eksperymentu. Następujące kroki należy wykonać po wykonaniu niezbędnego ustawienia chirurgicznego i przygotowania do odsłonięcia opony twardej. Po eksperymencie wszystkie niezbędne kroki po zabiegu muszą zostać wykonane zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.
<ol>
	<li>Podłącz mikronapęd do komory nagrywania. Opuść rurkę prowadzącą, aby przebić oponę twardą. 
	nuta: Rurka prowadząca nie powinna wnikać dalej niż opona twarda, aby uniknąć uszkodzenia kory.</li>
	<li>Opuścić mikrowstrzyknięcie do około 2 mm powyżej miejsca zapisu/wstrzyknięcia do mózgu.</li>
	<li>Dokręć górną tulejkę (wystającą mikroelektrodę/biosensor) i podłącz złote piny do systemu nagrywania. Kontynuuj przesuwanie mikroiniekcji do miejsca docelowego. 
	nuta: Pamiętaj, aby w obliczeniach uwzględnić odległość, na jaką mikroelektroda wychodzi poza kaniulę.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów infuzyjnych użyj ręcznej pompki mikrostrzykawkowej, aby przesunąć kolumnę oleju o 1 cm co 3 minuty (~60 nL/min). Po zainfuzji żądanej objętości przełącz zawór wyjściowy w kierunku przewodu spłukującego. 
	nuta: Objętość podawanej infuzji będzie się różnić w zależności od gatunku modelu i docelowego obszaru mózgu. Szybszy przepływ może uszkodzić tkankę nerwową.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentów wsuń mikroiniekcję w rurkę prowadzącą (pozostaw sondę wysuniętą). Następnie wyjmij mikronapęd w celu przepłukania. Przepłukać układ mikroprzepływowy zgodnie z opisem w krokach 5.1-5.5. aby przygotować się do ponownego użycia. 
	nuta: Z naszego doświadczenia wynika, że mikroiniekcja wystarczy na kilka zastosowań, jeśli zachowa się odpowiednią ostrożność. Jakość zapisu elektrofizjologicznego spada szybciej niż zdolność do iniekcji.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, L. T. L., Goffart, L., Sparks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+constructing+microinjectrodes+for+reversible+inactivation+in+behaving+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for constructing microinjectrodes for reversible inactivation in behaving monkeys.</a> Journal of Neuroscience Methods. 107 (1-2), 81-85 (2001).</li>
<li>Crist, C. F., Yamasaki, D. S. G., Komatsu, H., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+grid+system+and+a+microsyringe+for+single+cell+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A grid system and a microsyringe for single cell recording.</a> Journal of Neuroscience Methods. 26 (2), 117-122 (1988).</li>
<li>Noudoost, B., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+microinjectrode+system+for+use+in+behaving+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys.</a> Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 218-223 (2011).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+simultaneous+recording+of+electrophysiological+activities+and+dopamine+overflow+in+the+deep+brain+nuclei+of+a+non-human+primate+with+Parkinson%27s+disease+using+nano-based+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">Real-time simultaneous recording of electrophysiological activities and dopamine overflow in the deep brain nuclei of a non-human primate with Parkinson's disease using nano-based microelectrode arrays.</a> Microsystems & Nanoengineering. 4, (2018).</li>
<li>Altuna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-8+based+microprobes+for+simultaneous+neural+depth+recording+and+drug+delivery+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">SU-8 based microprobes for simultaneous neural depth recording and drug delivery in the brain.</a> Lab on a Chip. 13 (7), 1422-1430 (2013).</li>
<li>Noudoost, B., Clark, K. L., Moore, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Distinct+Contribution+of+the+Frontal+Eye+Field+to+the+Visual+Representation+of+Saccadic+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Distinct Contribution of the Frontal Eye Field to the Visual Representation of Saccadic Targets.</a> Journal of Neuroscience. 34 (10), 3687-3698 (2014).</li>
<li>Rajalingham, R., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Inactivation+of+Different+Millimeter-Scale+Regions+of+Primate+IT+Results+in+Different+Patterns+of+Core+Object+Recognition+Deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reversible Inactivation of Different Millimeter-Scale Regions of Primate IT Results in Different Patterns of Core Object Recognition Deficits.</a> Neuron. 102 (2), 493(2019).</li>
<li>Katz, L. N., Ates, J. L. Y., Pillow, J. W., Huk, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+functional+significance+of+decision-related+activity+in+the+primate+dorsal+stream%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dissociated functional significance of decision-related activity in the primate dorsal stream.</a> Nature. 535 (7611), 285(2016).</li>
<li>Esfandyarpour, R., Esfandyarpour, H., Javanmard, M., Harris, J. S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+biosensor%3A+A+method+for+direct+label-free+real+time+protein+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B-Chemical%22%5BJournal%5D)">Microneedle biosensor: A method for direct label-free real time protein detection.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 177, 848-855 (2013).</li>
<li>Esfandyarpour, R., Yang, L., Koochak, Z., Harris, J. S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoelectronic+three-dimensional+%283D%29+nanotip+sensing+array+for+real-time%2C+sensitive%2C+label-free+sequence+specific+detection+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Nanoelectronic three-dimensional (3D) nanotip sensing array for real-time, sensitive, label-free sequence specific detection of nucleic acids.</a> Biomedical Microdevices. 18 (1), (2016).</li>
<li>Bahmani, Z., Daliri, M. R., Merrikhi, Y., Clark, K., Noudoost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Memory+Enhances+Cortical+Representations+via+Spatially+Specific+Coordination+of+Spike+Times%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Working Memory Enhances Cortical Representations via Spatially Specific Coordination of Spike Times.</a> Neuron. 97 (4), 967-979 (2018).</li>
<li>Veith, V. K., Quigley, C., Treue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pressure+Injection+System+for+Investigating+the+Neuropharmacology+of+Information+Processing+in+Awake+Behaving+Macaque+Monkey+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%3A+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex.</a> JoVE: Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
</ol>

Obecnie dostępnych jest kilka metod jednoczesnego dostarczania leków i elektrofizjologii. Nasz system ma być na tyle elastyczny, aby mógł być używany do nagrań niezależnie lub w połączeniu z wstrzykiwaniem leku, a także aby miał możliwość precyzyjnego umieszczenia dowolnej delikatnej sondy eksperymentalnej, takiej jak nanoczujnik lub mikroelektroda, chronionej przed uszkodzeniem, przez oponę twardą i tkankę nerwową. System umożliwia precyzyjną kontrolę objętości infuzji leku gołym okiem (precyzja 17 nL wykazana w poprzednich badaniach w naszym laboratorium3).
Istnieją bardziej specjalistyczne systemy do wtrysku ciśnieniowego o mniejszych średnicach12. Systemy te pozwalają na wiele miejsc rejestracji, ale złożona konfiguracja oprogramowania i sprzętu wymaganego do sterowania systemem wiąże się z wyższymi kosztami dla każdego z komponentów i ma mniejszą elastyczność w łączeniu się z eksperymentalnymi sondami, które nie są jeszcze skomercjalizowane na dużą skalę. Co więcej, nasz wstrzykiwacz nie wymaga przewlekłego implantu i zapewnia dużą elastyczność: jest kompatybilny z bioczujnikami do pomiaru sygnałów chemicznych i elektrofizjologicznych, a także może podawać leki, z możliwością pomiaru wpływu miejscowych wlewów leków na te reakcje.
Konstrukcja pozwala na wysunięcie sondy eksperymentalnej po penetracji opony twardej w celu uniknięcia uszkodzenia konstrukcji sondy. Ta cecha pozwala na wielofunkcyjność urządzenia, aby penetrować oponę twardą bez ryzyka uszkodzenia jakiejkolwiek sondy eksperymentalnej, takiej jak nanoczujniki w skali nanometrowej10. Istnieje jednak ograniczenie długości, która może być wysunięta, ograniczone liczbą zwojów tulejki, ograniczone do ~1 mm dla standardowych okuć. Uszkodzenia tkanek są minimalne ze względu na małą średnicę kaniuli (228 μm).
W eksperymencie, który pokazaliśmy, system został wykorzystany do kontrolowanego dostarczania muscymolu w celu odwracalnej inaktywacji FEF, jednocześnie ze stymulacją elektryczną lub zapisem zewnątrzkomórkowym (pojedynczy neuron, potencjał pola lokalnego) za pomocą mikroelektrody. Ten eksperyment w FEF wymaga mikrostymulacji FEF w celu potwierdzenia wektorów sakkad przed inaktywacją, a lek został podany w infuzji w celu zbadania pamięci roboczej podczas odwracalnej inaktywacji FEF. Jest mało prawdopodobne, aby zapis z tego samego izolowanego pojedynczego neuronu mógł być utrzymany przed i po wstrzyknięciu leku; Udało nam się jednak zarejestrować lokalne potencjały polowe przed i po infuzji. Tutaj pokazujemy eksperyment łączący wstrzykiwanie, nagrywanie i stymulację elektryczną.
Po skonfigurowaniu metoda jest bardzo niezawodna i solidna. Jednak ze względu na wytrącanie się małych cząsteczek (np. soli) w małej rurce i portach, po każdym eksperymencie wymagane jest dokładne płukanie, aby mikrofluidyki były wolne od przeszkód i wycieków. Ze względu na prostotę całego obwodu, każdy element można wymienić niezależnie, co ułatwia rozwiązywanie problemów.
Chociaż metoda została zademonstrowana w obszarze FEF u naczelnych innych niż ludzie, zasada ta może być zastosowana do każdego innego obszaru mózgu, w którym pożądana jest pewna kombinacja stymulacji elektrycznej, nagrywania i wstrzykiwania leku, u gatunków gryzoni wielkości lub większych.

Elektrofizjologia i metody wstrzykiwania leków są szeroko stosowane w neurobiologii do badania aktywności i zachowania neuronów, in vivo, u gryzoni i naczelnych. W ciągu ostatnich trzech dekad ulepszenia wczesnych modeli iniekcji pozwoliły na bardziej precyzyjną i mniej inwazyjną technikę oraz jednoczesne rejestrowanie i wstrzykiwanie leku w określone miejsca w mózgu1,2,3. W szczególności w przypadku naczelnych zdolność do precyzyjnego dostarczania małych objętości przy minimalnym uszkodzeniu tkanek ma kluczowe znaczenie, jeśli technika ta ma być wykorzystana do badania zaawansowanych funkcji poznawczych, które wymagają wysoko wyszkolonych zwierząt. Ostatnie osiągnięcia obejmują przewlekłe pomiary elektrofizjologiczne i chemiczne w połączeniu ze stymulacją za pomocą wszczepionych sond4, a niedawno pilotażowo przeprowadzono połączone rejestrowanie i mikroprzepływowe dostarczanie leków u gryzoni5. Opisany tutaj system wstrzykiwania umożliwia elektrofizjologiczną rejestrację, stymulację i precyzyjne dostarczanie leków, i został już z powodzeniem wdrożony w wielu laboratoriach naczelnych6,7,8.
Rosnąca dostępność delikatnych, wyspecjalizowanych czujników, takich jak nanosensors9,10 z aplikacjami neurologicznymi, wymaga niezawodnej metody przeprowadzania sondy przez oponę twardą bez uszkadzania delikatnych urządzeń w nanoskali lub końcówek mikroelektrod.
Zaprojektowaliśmy system mikroiniekcji, który pokonuje techniczne wyzwania związane z łączeniem tych metod za pomocą łatwo dostępnych, tanich komponentów i ułatwia dwie główne funkcje: (i) Możliwość umieszczenia delikatnej sondy eksperymentalnej, takiej jak mikroelektroda lub nanoczujnik, przez oponę twardą i tkankę nerwową, chronioną przed jakimkolwiek uszkodzeniem. Funkcjonalność ta pozwala na umieszczenie sondy eksperymentalnej w docelowych miejscach, dostarczanej za pomocą kaniuli jako przewodnika przez tkankę nerwową. (ii) Umiejętność użycia mikroelektrody do wykonywania eksperymentów łączących zapisy elektrofizjologiczne i stymulację elektryczną z wstrzykiwaniem leków.
Nasz system wykorzystuje rurkę prowadzącą do penetracji opony twardej, wraz z kaniulą, która służy zarówno do dostarczania leków (podczas korzystania z systemu do mikroinfuzji), jak i zapewnia dodatkową ochronę mikroelektrody lub nanosensora (zarówno podczas przechodzenia przez oponę twardą, jak i tkankę nerwową). System ten można łatwo zbudować z powszechnie dostępnych na rynku komponentów, które są niedrogie i łatwe do znalezienia. Minimalizujemy uszkodzenia spowodowane penetracją poprzez zastosowanie kaniuli o małej średnicy (średnica zewnętrzna OD = 235 μm, średnica wewnętrzna ID = 108 μm).
Tutaj prezentujemy instrukcje krok po kroku dotyczące budowy mikrowtrysku i konfiguracji systemu mikroprzepływowego. Wyjaśniamy, jakie kroki należy wykonać, aby można było użyć mikroiniektora, niezależnie lub w połączeniu z systemem mikroprzepływowym do wstrzykiwania leków. Podobne podejście można zastosować do każdej delikatnej sondy eksperymentalnej, takiej jak nanosensor9,10. Sonda może być ładowana do kaniuli od przodu lub do tyłu (w zależności od konstrukcji) i będzie chroniona przed uszkodzeniem podczas penetracji opony twardej i tkanki nerwowej. Podajemy przykładowe dane z eksperymentu in vivo na naczelnych innych niż ludzie, w którym użyliśmy mikroelektrody wolframowej do przeprowadzenia stymulacji elektrycznej, a następnie wstrzyknęliśmy muscymol w przednie pole oka (FEF), podczas gdy zwierzę wykonywało zadanie sakkady sterowanej pamięcią (MGS).

<table><tbody><tr><td>Zawory ręczne 3-drogowe</td><td>Ręczny</td><td>3-drogowy zawór rozdzielczy LabSmith (MV201-C360)</td><td><a href="https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#. XNYEC9NKh26">https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#. XNYEC9NKh26</a></td></tr><tr><td>Cannulae</td><td>Vita Needle Company</td><td>304 Rurka ze stali nierdzewnej, średnica zewnętrzna 228&mu; m, Średnica wewnętrzna 165&mu; m</td><td><a href="https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf">Vita Needle Master Tubing Gauge Chart</a></td></tr><tr><td>Kamień do rozłupywania</td><td>Molex</td><td>Kamień do rozłupywania 1" x 1" (nr części 1068680064)</td><td>Zdecydowanie zaleca się przestrzeganie metody cięcia rurki kapilarnej: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf</td></tr><tr><td>Dioctan klorheksydyny</td><td>Walmart</td><td>Środek dezynfekujący w roztworze Nolvasan (AAP311)</td><td>Służy do płukania obwodów mikroprzepływowych, rozpuszczony w stężeniu 20 g/l</td></tr><tr><td>Adapter niestandardowy</td><td>Niestandardowy dostawca</td> <td>-</td> <td>Niestandardowy adapter obrabiany maszynowo do podłączenia mikrowtrysku do mikronapędu hydraulicznego</td></tr><tr><td>Sterownik</td><td>LabSmith</td><td>T7 TORX do wkręcania do płytki stykowej (sterownik LS-TORX)</td><td><a href="https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#. XO8sndNKh25">https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#. XO8sndNKh25</a>Klej</td></tr> <tr><td>epoksydowy</td><td>LabSmith</td><td>Dwuskładnikowy klej epoksydowy o wysokiej wytrzymałości (LS-EPOXY) do klejenia metali i tworzyw sztucznych</td><td><a href="https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#. XO8t89NKh24">https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#. XO8t89NKh24</a>Ferrule</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Jednoczęściowa złączka LabSmith (C360-100) do łączenia kapilary, otwór przelotowy o rozmiarze 360&mu; m OD kapilarny</td><td><a href="https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#. XNYEaNNKh24">https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#. XNYEaNNKh24</a></td></tr><tr><td>Wtyczka tulejkowa</td><td>LabSmith</td><td>One-Piece Plug (C360-101) do użytku w dowolnym porcie -C360</td><td><a href="https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#. XNYFl9NKh24">https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#. XNYFl9NKh24</a></td></tr><tr><td>Klucz otuleniowy</td><td>LabSmith</td><td>1/8" klucz imbusowy do montażu jednoczęściowych złączek i kołków (LS-HEX 1/8" Klucz imbusowy)</td><td><a href="https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#. XO8sqtNKh24">https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#. XO8sqtNKh24</a></td></tr><tr><td>Strzykawka gazoszczelna</td><td>Hamilton Company</td><td>500&mu; Strzykawka gazoszczelna L model 1750 (81220) i strzykawka gazoszczelna 1 ml model 1001 (81320)</td><td><a href="https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top">https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top</a></td></tr><tr><td>Złote piny</td><td>Aim-Cambridge</td><td>Męskie pozłacane złącze zaciskane (40-9856M)</td><td><a href="https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html">https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html</a></td></tr><tr><td>Chusteczki niestrzępiące się</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimtech Science Kimwipes Delicate Task</td><td>Chusteczki niestrzępiące się, używane do identyfikacji nieszczelności w systemie</td></tr><tr><td>Płynny barwnik spożywczy</td><td>McCormick & Co. </td><td>płynny barwnik spożywczy na bazie wody (52100581873)</td><td><a href="https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color">https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color</a></td></tr><tr><td>Olej o niskiej lepkości</td><td>Clearco Products Co.</td><td>Czysty płyn silikonowy oktametylotriloksan o lepkości 1cSt przy 25&deg; C (PSF-1cSt)</td><td><a href="http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html">http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html</a></td></tr><tr><td>Złącze Luer-Lock</td><td>Adapter LabSmith</td><td>Luer-Lock (C360-300), złączka żeńska do podłączenia strzykawki Luer Lock do 360&mu; m rurka kapilarna</td><td><a href="https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#. XO81MtNKh24">https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#. XO81MtNKh24</a></td></tr><tr><td>Micro wiertła</td><td>Grainger</td><td>Micro wiertło, 0,23mm (414H85)</td><td><a href="https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits">https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits</a></td></tr><tr><td>Mikroelektroda</td><td>FHC</td><td>Metal Mikroelektroda, wolfram z izolacją epoksydową</td><td><a href="https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes">https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes</a></td></tr><tr><td>Mikromanipulator olejowo-hydrauliczny</td><td>Narishige Group</td><td>Mikromanipulator olejowo-hydrauliczny z dołączoną rurką prowadzącą (MO-96)</td><td><a href="http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html">http:// products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html</a></td></tr><tr><td>Rurka kapilarna</td><td>Polymicro Molex</td><td>Polymicro Elastyczna rurka kapilarna z topionej krzemionki (TSP150375), średnica zewnętrzna 375&micro; m, Średnica wewnętrzna 150&micro; m</td><td><a href="https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf">Rurki kapilarne z polimikrowarstwy</a></td></tr><tr><td>Programowalna pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvarda</td><td>Standardowa pompa do zaparzania/odbierania, programowalna (70-2213)</td><td><a href="https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html">https:// www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html</a></td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Empire</td><td>Stal nierdzewna 6" Sztywna linijka (27303)</td><td><a href="http://www.empirelevel.com/rulers.php">http://www.empirelevel.com/rulers.php</a></td></tr><tr><td>Zestaw</td><td>LabSmith</td><td>Zestaw mocujących zawór (LS-SCREWS .25), samogwintujące (2-28 x 1/4") do Zamontuj zawory na płytce stykowej</td><td><a href="https://products.labsmith.com/ls-screws-25#. XO8widNKh24">https://products.labsmith.com/ls-screws-25#. XO8widNKh24</a></td></tr><tr><td>Standardowa płytka stykowa</td><td>LabSmith</td><td>4" x 6" platforma (LS600), z rozstawem otworów 0,25" do montażu obwodu płynu</td><td><a href="https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#. XO8xDdNKh24">https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#. XO8xDdNKh24</a></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna (chlorek sodu) 0,9%</td><td>Baxter</td><td>0,9% Chlorek sodu sterylny</td><td>Sterylny napar dożylny</td></tr><tr><td>Sterylne filtry strzykawkowe</td><td>Millipore Sigma</td><td>MilliporeSigma&trade; Millex&trade;-GP Sterylne filtry strzykawkowe z membraną PES (SLGPM33RS)</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs">https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs</a></td></tr><tr><td>Ręczna pompa mikrostrzykawkowa</td><td>Stoelting Company</td><td>Ręczne wlewanie/pobieranie pompa (51222)</td><td><a href="https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html">https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html</a>trójnik</td></tr> <tr><td>trójnikowy</td><td>LabSmith</td><td>Interconnect (C360-203) do łączenia strumieni przepływu, do użytku z 360&mu; m Rurka kapilarna OD</td><td><a href="https://products.labsmith.com/interconnect-tee#. XO8z8dNKh24">https://products.labsmith.com/interconnect-tee#. XO8z8dNKh24</a></td></tr></tbody></table>

system mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

Microinjectrode System for Combined Drug Infusion and Electrophysiology

Ten system mikroiniekcji jest przeznaczony do infuzji leków, elektrofizjologii oraz dostarczania i pobierania eksperymentalnych sond, takich jak mikroelektrody i nanosensory, zoptymalizowane do wielokrotnego użycia u przytomnych, zachowujących się zwierząt. System mikroiniekcji może być skonfigurowany do wielu celów: (1) proste ułożenie kaniuli w celu umieszczenia sondy eksperymentalnej, która w przeciwnym razie byłaby zbyt delikatna, aby przeniknąć do opony twardej, (2) infuzja mikroprzepływowa leku, niezależnie lub sprzężona z kaniulą zawierającą sondę eksperymentalną (tj. mikroelektroda, nanoczujnik). W tym protokole wyjaśniamy krok po kroku budowę mikrowtryskiwacza, jego sprzężenie z elementami mikroprzepływowymi oraz protokół stosowania systemu in vivo. Mikroprzepływowe komponenty tego systemu pozwalają na dostarczanie objętości w skali nanolitrów, przy minimalnych uszkodzeniach penetracyjnych. Wlew leku może być wykonywany niezależnie lub jednocześnie za pomocą sond eksperymentalnych, takich jak mikroelektrody lub nanoczujniki u przytomnego, zachowującego się zwierzęcia. Zastosowania tego systemu obejmują zarówno pomiar wpływu leku na aktywność elektryczną i zachowanie kory mózgowej, jak i zrozumienie funkcji określonego regionu kory mózgowej w kontekście wydajności behawioralnej w oparciu o pomiary sondą lub nanoczujnikiem. Aby zademonstrować niektóre z możliwości tego systemu, przedstawiamy przykład infuzji muscymolu do odwracalnej inaktywacji przedniego pola gałki ocznej (FEF) u makaków rezusów podczas zadania pamięci roboczej.

Wykonaliśmy wtryskiwanie agonisty GABAa (muscymolu) w celu odwracalnej inaktywacji przedniego pola oka (FEF), podczas gdy zwierzę wykonywało zadanie sakad sterowanych pamięcią11. W tym zadaniu zwierzę skupia wzrok, a następnie prezentowany jest obwodowy cel wizualny. Zwierzę utrzymuje fiksację, zapamiętując lokalizację celu, a po zniknięciu punktu fiksacyjnego wykonuje sakadyczny ruch oka w stronę zapamiętanej lokalizacji, aby otrzymać nagrodę. Mikroelektrodę wstrzykującą wykonano zgodnie z instrukcjami przedstawionymi na Ryc. 1b. Objętość infuzji w przykładzie eksperymentalnym wynosiła 850 nL. Wyniki behawioralne w zadaniu sakad sterowanych pamięcią (MGS) w różnych lokalizacjach i czasach względem infuzji muscymolu przedstawiono na Ryc. 4. Największe deficyty w wykonaniu zadania zaobserwowano od 2 do 3 h po infuzji.
<img alt="Etapy montażu elektrody z mikroigieł, mikroiniekcja, płaski koniec, ścięty, zastosowanie mikrofluidyczne, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60365/60365fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Etapy wytwarzania mikroinjectrody. (a) Konfiguracja do użytku niezależnego od systemu mikrofluidycznego. Kanulę i sondę mierzy się w celu potwierdzenia, że końcówka sondy może zostać wysunięta na pożądaną długość (np. 150 µm). Sonda jest wprowadzana do kanuli od przodu. Kanulę przeciąga się przez złączkę T i mocuje od dołu, z płaskim końcem w środku złączki T; tylny koniec sondy przechodzi przez górną tulejkę. Mikroinjectrodę kończy się poprzez przylutowanie złotych pinów do każdego z zacisków sondy i dodanie kleju pomiędzy nimi a górną tulejką w celu zapewnienia stabilności. Połączenie z systemem akwizycji zależy od konstrukcji sondy. W tym przykładzie nasza sonda jest nanoczujnikiem z trzema przewodami. (b) Konfiguracja do użytku z systemem mikrofluidycznym. Aby połączyć mikroinjectrodę z systemem mikrofluidycznym, do górnej strony złączki T używa się fragmentu rurki kapilarnej. Sondę można wprowadzić od przodu lub od tyłu. Następnie linię mikrofluidyczną wpina się do trzeciego otworu złączki T. W tym przykładzie zastosowano mikroelektrodę. Patrz na powiększony obraz końcówki kanuli, w której mikroelektroda została wysunięta poprzez dokręcenie górnej tulejki. Listę elementów użytych do konstrukcji zawiera Tabela materiałów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60365/60365fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat zestawu do dostarczania leków w neuronauce; strzykawki szczelne gazowo, pompy, integracja mikroelektrody wstrzykującej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60365/60365fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: System mikrofluidyczny. Konfiguracja dwuzaworowa umożliwia kontrolę kierunku przepływu w stronę mikroelektrody wstrzykującej lub w stronę linii płukania w celu rozwiązywania problemów. Układ opiera się na dwóch zaworach 3-portowych połączonych za pomocą rurek kapilarnych i standardowych tulejek. Strzykawki szczelne gazowo są wykorzystywane do transportu i wstrzykiwania leku infuzyjnego oraz znacznika. Programowalna pompa strzykawkowa umożliwia automatyczne płukanie systemu i ładowanie leku. Ręczna pompa mikrostrzykawkowa pozwala na kontrolowane wstrzykiwanie i wizualizację. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60365/60365fig2alarge.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Sekwencja testów mechanicznych: mechanizm sprężynowy, urządzenie do precyzyjnego pozycjonowania, konfiguracja krok po kroku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60365/60365fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Montaż mikroelektrody wtryskowej (microinjectrode) do hydraulicznego mikronapędu z i bez możliwości wstrzykiwania. Krok 4.1: Specjalnie wykonany adapter umożliwia przytwierdzenie mikroelektrody wtryskowej do mikronapędu. Pojedyncza śruba mocuje adapter do mikronapędu; dwie śruby zabezpieczają mikroelektrodę wtryskową w adapterze. Górna tuleja powinna zostać odkręcona o co najmniej 2 obroty, aby chronić końcówkę mikroelektrody/sondy eksperymentalnej podczas umieszczania mikroelektrody wtryskowej w rurce prowadzącej mikronapędu. Krok 4.3: Wsuń mikroelektrodę wtryskową do rurki prowadzącej od góry. Krok 4.4: W przypadku przeprowadzania mikroinfuzji, podłącz linię z lekiem do trzeciego otworu w złączu T, używając plastikowej tulei. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60365/60365fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat wstrzyknięcia do mózgu, radarowy wykres wydajności, wykresy danych pokazujące efekty infuzji w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60365/60365fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Zadanie sakad sterowanych pamięcią podczas infuzji muscimolu do FEF. (a) Mikroelektrodę wstrzykującą umieszczono w prawej półkuli, w obszarze FEF. (b) Wyniki behawioralne podczas zadania MGS, w którym osiem celów umieszczono peryferyjnie. Przeprowadzono 4 bloki zadania MGS: przed wstrzyknięciem oraz w trzech punktach czasowych po wstrzyknięciu. Wykres polarny przedstawia wydajność (mimośrodowość) w każdym z tych momentów (kolor), dla różnych lokalizacji względem punktu fiksacji (kąt na wykresie polarnym). Wydajność wyraźnie spadła w lewym polu widzenia 2 h po wstrzyknięciu (niebieska linia, lewa połowa wykresu polarnego). (c) Ścieżki sakad dla 8 peryferyjnych lokalizacji pamięciowych przed (lewo) i po wstrzyknięciu muscimolu do FEF (prawo, 1 i 3 h po infuzji). Dokładność sakad w lewym polu widzenia (lewa połowa wykresów polarnych) spadła po wstrzyknięciu muscimolu. Skala podana w stopniach kąta widzenia (dva). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60365/60365fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Prezentujemy system mikroiniekcji przeznaczony do elektrofizjologii i wspomaganego dostarczania eksperymentalnych sond (tj. nanosensorów, mikroelektrod), z opcjonalnym wlewem leku. Powszechnie dostępne składniki mikroprzepływowe są sprzężone z kaniulą zawierającą sondę. Dołączony jest protokół krok po kroku dotyczący budowy mikroiniekcji, z wynikami podczas infuzji muscymolu w korze makaka.

System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes ...

Ten system mikroiniekcji jest przeznaczony do infuzji leków, elektrofizjologii oraz dostarczania i pobierania sond eksperymentalnych, takich jak mikroelektrody i nanoczujniki. Jest zoptymalizowany do wielokrotnego stosowania u obudzonych zwierząt zachowujących się z niewielkimi uszkodzeniami penetracyjnymi otaczających tkanek. System mikrowtryskiwaczy może być skonfigurowany do wielu celów.Pierwszym z nich jest proste ułożenie kaniuli w celu umieszczenia eksperymentalnej sondy, która w przeciwnym razie byłaby zbyt delikatna, aby przeniknąć do opony twardej. Drugi to mikroprzepływowy wlew leku niezależnie lub sprzężony z kaniulą zawierającą sondę eksperymentalną. Mikroprzepływowe elementy systemu pozwalają na dostarczanie objętości w skali nanolitrów.Zmierz długość kaniuli i sondy nanosensora lub mikroelektrody. Sonda musi być dłuższa od kaniuli o długość, która ma wystawać z końcówki kaniuli plus około jednego centymetra. Pod lupą załaduj sondę do kaniuli od tyłu, aby chronić końcówkę sondy.Włóż kaniulę zawierającą sondę do złącza T od dolnej tulejki. Umieść górną płaską stronę kaniuli pośrodku złącza T. Unikaj blokowania złącza za pomocą kaniuli, wsuwając je z powrotem do złącza, a następnie dokręć.Przymocuj rurkę do górnej części mikroelektrody. Załaduj mikroelektrodę z powrotem przez rurkę kapilarną, złącze T, kaniulę i odpowiednie tulejki. Przytnij mikroelektrodę na żądaną długość i zeskrob koniec.Upewnij się, że tylny koniec elektrody wystaje mniej niż jeden centymetr z tyłu rurki kapilarnej, a końcówka elektrody wystaje z kaniuli w żądanej odległości od spodu. Umieść końcówkę mikroelektrody w złotym bolcu i złotą końcówkę do końcówki mikroelektrody. Dodaj klej epoksydowy między złotą szpilką a górną skuwką, aby przymocować mikroelektrodę do tulejki.Po utwardzeniu żywicy epoksydowej, najlepiej przez ponad 24 godziny, odkręć górną skuwkę, aby upewnić się, że mikroelektroda całkowicie chowa się wewnątrz kaniuli. Aby zbudować obwód mikroprzepływowy, umieść szeroką płytkę na stabilnej powierzchni. Umieść dwa zawory trójdrogowe równolegle do najdłuższych boków szerokiej deski w odległości około 12 centymetrów od siebie, tak aby jeden port był skierowany do siebie.Użyj, aby przymocować zawory do szerokiej płyty i wytnij kolejne 10 centymetrów rurki kapilarnej na linię linijki i umieść ją pomiędzy. Użyj standardowych tulejek, aby dokręcić rurkę do portów czołowych zaworów. Wytnij od 10 do 20 centymetrów rurki kapilarnej i użyj standardowych tulejek i złączy Luer lock, aby podłączyć rurkę strzykawki do jednego z portów na zaworze wejściowym.Wytnij mały kawałek kapilary i podłącz go do zaworu wyjściowego jako linię spłukującą. Wytnij dwa dłuższe kawałki rurki kapilarnej na około 100 centymetrów, aby połączyć zawór wyjściowy z mikrowtryskiwaczem. Podłączyć pompę leku i pompę markerową do zaworu wejściowego.Najpierw upewnij się, że eksperymentalna sonda mikroelektrodowa jest schowana w kaniuli. Aby przymocować wykonany na zamówienie adapter do mikrowtryskiwacza za pomocą, załaduj mikrowtryskiwacz od góry przez rurkę prowadzącą i przymocuj go do wykonanego na zamówienie adaptera mikronapędu za pomocą pary. Zmierz głębokość położenia mikronapędu, na której mikrowtryskiwacz wystaje z rurki prowadzącej, a następnie cofnij go o jeden centymetr, aby przygotować się do włożenia.W przypadku eksperymentów z mikroinfuzją należy podłączyć linię mózgową do nieużywanego otworu złącza T mikroiniekcji. Użyj standardowej tulejki i dokręć kluczem do tulejek. Upewnij się, że górna skuwka również jest dokręcona.Następnie umieść mikronapęd nad zlewką. Załaduj chlorheksydynę w ilości 20 gramów na litr do jednomililitrowej gazoszczelnej strzykawki i umieść ją w pompie leku. Obróć kierunek przepływu zaworów i ustaw niskie natężenie przepływu od 50 do 200 mikrolitrów na minutę, tak aby płyn przepływał z pompy leku przez zawór wejściowy do zaworu wyjściowego i na zewnątrz linii mózgowej.Przepłukiwać obwód chlorheksydyną przez co najmniej 10 minut. Powtórz płukanie sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie powietrzem. Delikatnie nałóż niestrzępiące się chusteczki na skrzyżowaniach, aby odsłonić wszelkie wycieki płynu przez tulejki.Najważniejszym krokiem jest sprawdzenie, czy zespół wtryskiwacza i obwodu mikroprzepływowego jest szczelny. Załaduj lek do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 500 mikrolitrów, spręż powietrze, a następnie umieść go w pompie leku. Dostosuj przepływ do 50 mikrolitrów na minutę i pozwól płynowi przepływać, aż w mikrowtrysku pozostanie kilka kropli.Następnie namocz rurkę prowadzącą w chlorheksydynie w stężeniu 20 gramów na litr przez 15 minut. Obróć kierunek zaworu wyjściowego w kierunku linii płukania, aby przesunąć znacznik w miarę przesuwania pompy znacznika, aż do zaobserwowania wyraźnej krawędzi koloru i oleju na linii linijki. Upewnij się, że między lekiem a kolorem zawsze znajduje się olej, aby nie zmieszać dwóch rozpuszczalnych w wodzie materiałów i nie stracić ostrej krawędzi między nimi.Zaznacz pozycję początkową tej linii barwników olejowych. Po przeprowadzeniu niezbędnego zestawu doświadczalnego wsuń mikroelektrodę do kaniuli, poluzowując górną skuwkę. Podłącz mikronapęd do komory nagrywającej i opuść rurkę prowadzącą, aby przeniknąć do opony twardej.Następnie należy obniżyć mikrowstrzyknięcie do około dwóch milimetrów powyżej miejsca rejestracji znajdującego się w mózgu. Dokręć górną tuleję i podłącz złote piny do systemu nagrywania. Kontynuuj przesuwanie mikroiniekcji do miejsca docelowego.Następnie przełącz zawór wyjściowy na linię mózgową. Do eksperymentów infuzyjnych użyj ręcznej pompy mikrostrzykawkowej, aby przesunąć kolumnę oleju o 0,5 centymetra co minutę. Po podaniu żądanej objętości przestaw zawór wyjściowy w kierunku przewodu płuczącego.W tym badaniu wstrzyknięcie agonisty GABA A przez obszar FEF prawej półkuli przeprowadzono w celu odwracalnej inaktywacji przedniego pola oka, podczas gdy zwierzę zakończyło zadanie sakkady sterowanej pamięcią. Wykres biegunowy przedstawia wydajność mimośrodu dla różnych lokalizacji względem punktu fiksacji. Wydajność wyraźnie zmniejszyła się w lewej półpolu wzrokowym dwie godziny po wstrzyknięciu.Poniżej przedstawiono ślady sakkad dla ośmiu miejsc pamięci peryferyjnej przed i po wstrzyknięciu Muscimolu do FEF. Dokładność sakkad w lewej półkuli wzrokowej zmniejszyła się po wstrzyknięciu muscymolu. Po zakończeniu konfiguracji metoda jest bardzo niezawodna i solidna.Jednak ze względu na wytrącanie się małych cząsteczek w rurce i portach, przed każdym użyciem i po każdym eksperymencie wymagane jest dokładne płukanie, aby mikrofluidyk był wolny od przeszkód i wycieków. Chociaż metoda została zademonstrowana w polu przedniego oka u naczelnych innych niż ludzie, zasada ta może być zastosowana do każdego innego obszaru mózgu, w którym pożądana jest pewna kombinacja stymulacji elektrycznej, nagrywania i wstrzykiwania narkotyków u gatunków gryzoni wielkości lub większych. Nasz system jest na tyle elastyczny, że może być używany do nagrywania niezależnie lub w połączeniu z wstrzykiwaniem leku i ma możliwość precyzyjnego umieszczenia dowolnej delikatnej sondy eksperymentalnej chronionej przed uszkodzeniem przez oponę twardą i tkankę nerwową przy minimalnym uszkodzeniu tkanki ze względu na małą średnicę kaniuli.

microinjectrode-system-for-combined-drug-infusion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wraz z ewolucją i wzrostem zaawansowania badań w dziedzinie neuronauki, analiza struktur i obwodów mózgowych wymaga coraz większej dokładności i wyższej rozdzielczości. Opracowaliśmy metodę przygotowania i implantacji przewlekłego systemu infuzyjnego w mózgu, wykorzystującą borokrzemianową mikrokanulę o średnicy końcówki wynoszącej 50 mikronów.

Konstrukcja i implantacja systemu mikroinfuzyjnego do przedłużonego podawania czynników neuroaktywnych.

Dwukomorowe implantowalne kardiowertery-defibrylatory (ICD) mogą poprawić wykrywanie migotania przedsionków oraz różnicowanie tachykardii. Zaleta ta jest jednak niwelowana przez powikłania związane z drugą elektrodą, która jest wymagana w konwencjonalnych urządzeniach dwukomorowych. W związku z tym firma BIOTRONIK opracowała nową elektrodę o nazwie LinoxSMART S DX, która stosowana wraz z ICD Lumax DX zapewnia detekcję dwukomorową bez ryzyka związanego z drugą elektrodą.

Nowy jednokomorowy implantowalny kardiowerter-defibrylator z funkcją detekcji przedsionkowej: praktyczna prezentacja detekcji i łatwości implantacji

W tym filmie demonstrujemy montaż systemu infuzji mózgu za pomocą mikropompy osmotycznej, a następnie jego chirurgiczną implantację w czaszce myszy. System ten umożliwia ciągłe dostarczanie potencjalnych leków i ułatwia badanie ich wpływu na mózg i tkankę mózgową.

System ciągłego wlewu leków w modelu mysim: zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu systemu infuzyjnego pompy mikroosmotycznej w mózg myszy w celu ciągłego dostarczania leków

Ten protokół opisuje montaż i użycie iniekcji do precyzyjnego dostarczania leku do wybranych obszarów mózgu znieczulonego szczura, a następnie monitorowanie aktywności neuronalnej za pomocą zarejestrowanych sygnałów elektrycznych.

Mikroiniekcja leku z zapisem elektrofizjologicznym w mózgu szczura

Źródło: Vanegas, M. I., et al. System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia urządzenie mikroprzepływowe oparte na mikroelektrodach, które dostarcza roztwór leku przez rurkę kapilarną, wykorzystując roztwór markera na bazie oleju do precyzyjnego śledzenia objętości i umożliwiając jednoczesny zapis neuronowy i wlew leku.

System mikroiniekcji mikroprzepływowej do skojarzonego infuzji leków i elektrofizjologii

Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Supramolekularne hydrożelatory oparte na ureido-pirymidynonach pozwalają na pełną kontrolę nad makroskopowymi właściwościami żelu i zachowaniem zol – żel za pomocą pH. W tym miejscu przedstawiamy protokół formułowania i wstrzykiwania takiego supramolekularnego hydrożelatora za pomocą systemu dostarczania cewnika do miejscowego dostarczania bezpośrednio w odpowiednie obszary serca świni.

Supramolekularny hydrożel do wstrzykiwań i lek do miejscowego wstrzykiwania cewnika do serca świni

Tutaj pokazujemy wstrzyknięcie ciśnieniowe substancji neurofarmakologicznych podczas rejestracji pojedynczej komórki u przytomnego, zachowującego się makaka. Procedura ta pozwala na manipulację farmakologiczną w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca rejestracji kory mózgowej.

System iniekcji ciśnieniowych do badania neurofarmakologii przetwarzania informacji w korze mózgowej makaków zachowujących się w stanie czuwania

Nowatorskie strategie terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej serca wymagają obszernych i szczegółowych badań na dużych przedklinicznych modelach zwierzęcych, zanim będą mogły być rozważane do zastosowania u ludzi. W tym miejscu demonstrujemy technikę przezskórnego wstrzykiwania domięśniowego do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii kontrastowej u królików, która jest cenna dla hipotezy testującej skuteczność takich nowatorskich terapii.

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat zoptymalizowanego protokołu wstrzykiwań domięśniowych pod kontrolą echokardiografii w szczurzych modelach zawału mięśnia sercowego przy użyciu igły 29 G x 88 mm. Technika ta zapewnia solidne, precyzyjne i powtarzalne dostarczanie środków terapeutycznych bezpośrednio do strefy okołozawałowej.

Iniekcja pod kontrolą echokardiografii w celu ukierunkowanego i niezawodnego dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego w szczurzym modelu zawału mięśnia sercowego

Poznaj system mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii w korze małpy. Ta metoda umożliwia precyzyjne podawanie nanolitrowych objętości z minimalnym uszkodzeniem tkanek.

System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

Przeglądaj więcej filmów