Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

Grupowanie receptorów jest wszechobecne i często niezbędne do sygnalizacji aktywacji kaskady. Dostępnych jest jednak niewiele metod pomiaru stopnia grupowania. Używamy fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia, mikroskopii TIRF, aby śledzić dyfuzję cząsteczek FGFR1-mEGFP w błonie plazmatycznej żywych komórek.

Następnie stosujemy jasność liczbową, analizę N&B, aby opisać dynamikę stymulowanego grupowania receptorów. TIRF jest idealny do szybkiego obrazowania czasowego zdarzeń molekularnych, które zachodzą w pobliżu powierzchni komórki, podczas gdy N&B określa średni stan oligomeryczny cząsteczek fluorescencyjnych na podstawie dyfuzji do i na zewnątrz objętości oświetlenia mikroskopu. Rzeczywiście, jest to narzędzie do łączenia przestrzennej organizacji czasowej receptorów na powierzchni komórki, gdzie sygnalizują.

N&B potrzebuje jedynie dostępu do mikroskopu z modułem szybkiej akwizycji. Możesz analizować duży obszar żywych komórek, posiadając tylko podstawową wiedzę na temat metod fluktuacji fluorescencji. Metodę tę można zastosować do białek, które tworzą dimery lub klastry i mogą być znakowane stechiometrycznie barwnikiem fluorescencyjnym.

Jeśli białka znajdują się w przedziałach wewnątrzkomórkowych, do pozyskiwania obrazów używa się innych typów mikroskopów. Ważne jest, aby przygotować konstrukt wyrażający monomeryczną formę fluoroforu do pomiaru w warunkach eksperymentalnych czystej jasności monomerycznej jako kontroli. Pierwszego dnia wysiewaj komórki HeLa w 1,5 mililitra kompletnego podłoża o stężeniu od 100 000 do 200 000 komórek na mililitr w naczyniach ze szklanym dnem.

Wysiewaj od sześciu do ośmiu powtórzeń szalek i inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Drugiego lub trzeciego dnia komórki osiągnęły subkonfluencję. Dodaj bezsurowicową pożywkę z plazmidem białkowym do połowy szalek i dodaj plazmidy referencyjne z monomerem i dimerem do drugiej połowy szalek, aby transfekować komórki.

Po jednym dniu sprawdź, czy transfekowane komórki przylegają do dna naczyń, a błona komórkowa jest fluorescencyjna. Wyrzuć naczynia z przerośniętymi komórkami lub o bardzo niskiej fluorescencji. Cztery godziny przed eksperymentem aktywuj inkubator temperatury mikroskopu na 37 stopni Celsjusza.

Włącz mikroskop, komputery i kamery i poczekaj, aż kamery osiągną odpowiednią temperaturę roboczą minus 75 stopni Celsjusza. Umieść małą kroplę oleju na soczewce obiektywu. Umieść naczynie na próbkę w inkubatorze mikroskopu i zamknij drzwiczki inkubatora, aby temperatura naczynia wyrównała się przez 10 minut.

Włącz lampę epifluorescencyjną i laser 488 nm. Wybierz tryb kontrastu epifluorescencji, aby zbadać próbkę, przeszukując komórkę, na której ma być ustawiona ostrość z soczewki oka. Wybierz odpowiedni filtr do zbierania zielonej emisji przez kamerę mikroskopową o pasmie przepustowym Ex 490/20 500 i pasmowym Em 525/50 lub podobnym.

Przełącz się z raportu okularowego na krzywkowy w trybie epifluorescencji. Popraw ostrość i zmień tryb na TIRF. Następnie aktywuj automatyczne wyrównywanie zgodnie z instrukcjami mikroskopu TIRF.

Wybierz odpowiednią głębokość oświetlenia i zoptymalizuj kierunek zanikającego pola. Przełącz się na drugą kamerę. Zdefiniuj obszar zainteresowania o wymiarach co najmniej 256 na 256 pikseli.

Ustaw ekspozycję na jedną milisekundę, a wzmocnienie EM na 1 000. Dostosuj moc lasera do 0,5 miliwata. Konieczne jest posiadanie pewnych informacji na temat współczynnika dyfuzji białka, ponieważ czas ekspozycji musi być krótszy niż średni czas spędzony przez cząsteczki fluorescencyjne w oświetlonej objętości.

Uruchom pierwszą sekwencję próbną w warunkach początkowych i z grubsza oszacuj wartość sygnału do szumu. Warunki są dopuszczalne przy stosunku sygnału do szumu równym dwóm do trzech lub wyższym, mierzonym w pierwszym szeregu czasowym. Następnie użyj suwaka systemu rozdzielania emisji łączącego kamerę numer dwa z mikroskopem, aby zamaskować stronę obrazu.

Wybierz opcję automatycznego zapisywania plików z aparatu. Rozpocznij akwizycję serii obrazów dla co najmniej 700 klatek przy minimalnym stosunku sygnału do szumu wynoszącym dwa. Nie wyjmując naczynia z mikroskopu, dodaj ligand.

Wybierz komórkę z jasną membraną fluorescencyjną i szybko rozpocznij pierwszą serię czasową przebiegu kinetycznego. Przeszukaj drugą komórkę i uzyskaj drugi punkt czasowy kinetyki. Przechwyć nową komórkę dla każdego punktu czasowego biegu kinetycznego.

Dla każdej nowej czaszy powtórz wyrównanie linii lasera i optymalizację oświetlenia TIRF. Teraz przekonwertuj i zapisz pliki obrazów uzyskane za pomocą oprogramowania aparatu jako pliki tif. Importuj pliki tif w procedurze oprogramowania analitycznego, aktywując graficzną interakcję użytkownika N&B MATLAB.

Odrzuć serie, dla których średni profil intensywności wykazuje więcej niż 10% fotowybielania oraz serie, w których podczas pozyskiwania wystąpiło wyraźne zniekształcenie błony komórkowej lub translacja. Przycinaj klatki, które są ewidentnie nieostre. Do analizy należy przechowywać tylko serie z co najmniej 500 ramami czasowymi.

Najpierw określ parametry kamery. Aktywuj rutynową kalibrację kamery. Wybierz obszar o wymiarach co najmniej 20 na 50 pikseli w obszarze zakłóceń detektora.

Na wykresie logarytmicznym częstotliwości w funkcji poziomu cyfrowego przesuń liniowy czerwony kursor, aby wyznaczyć wartość gaussa w liniowej części krzywej. Aktywuj B. Zastosuj minimalną kategoryzację 2,2, aby zmniejszyć rozproszenie danych i wygenerować histogram B-I.

Użyj iteracyjnego kursora kwadratowego, aby sprawdzić histogram B-I. Wybierz kwadratowy zwrot z inwestycji do analizy i wygeneruj mapę B wybranego zwrotu z inwestycji. Następnie zapisz plik ASCII z wartościami B skojarzonymi z zaznaczeniem.

Zaimportuj ASCII do programu graficznego, aby obliczyć rozkład częstotliwości danych i uzyskać średnią wartość B plus lub minus S.E. Zastosuj równanie epsilon, aby wyprowadzić średnią jasność dla każdej komórki w każdym punkcie czasowym przebiegu kinetycznego. Znormalizuj dane zgodnie z równaniem normalizacji, gdzie B't jest średnią wartością B zmierzoną w czasie t po dodaniu liganda, a B'0 jest średnią wartością B zmierzoną w czasie, gdy t jest równe zero, czyli od 10 do 20 sekund po dodaniu liganda. Wykreśl znormalizowaną średnią jasność w funkcji czasu akwizycji, aby zbudować przebieg kinetyczny.

W tym badaniu przedstawiono reprezentatywne wyniki z dwóch komórek HeLa w tym samym naczyniu wyrażających mEGFP-FGR1 wychwycony w czasie zero i siódmym, po dodaniu 20 nanogramów na mililitr FGF2. W porównaniu z konstruktami referencyjnymi, dimerami GPI-mEGFP i GPI-mEGFP-mEGFP, cała sekwencja analizy pokazuje średnią intensywność szeregów czasowych. Wykres wszystkich wartości B.

Histogram B-I. B-mapa wybranego zwrotu z inwestycji. I związany z tym histogram rozkładu B.

Po stymulacji 20 nanogramami na mililitr FGF2, reprezentatywne przebiegi kinetyczne pokazujące średnią jasność w funkcji czasu opisują powolny proces dimeryzacji, który utrzymuje się przez kilka minut na powierzchni komórki. Po stymulacji 50 mikrogramami na mililitr NCAM-Fc, profil kinetyczny ujawnia szybkie i cykliczne przejścia receptora w mieszaninach oligomerycznych, który osiąga również wartości jasności powyżej dimera. Wielokrotnie obserwuje się znormalizowaną średnią wartość trzy.

Ważne jest, aby zminimalizować dodatkowe warianty ze względu na brak wahań molekularnych i bielenia. A komórki muszą być dobrze przylegające do naczynia ze szklanym dnem, nie zarośnięte i nie ułożone w stosy. Jeśli interesuje nas białko, które szybciej dyfunduje wewnątrz przedziałów wewnątrzkomórkowych, możemy zastosować szybsze czasy zerowe i użyć skanowania na mikroskopach ogniskowych lub wielofotonowych do zobrazowania wnętrza komórki.

Dzięki naszemu podejściu minimalizujemy szkodliwe skutki fotowybielania, gdy chcemy zbadać dynamikę zdarzeń takich jak dimeryzacja. Zdarzenia te kontrolują różne reakcje komórkowe i są bardzo trudne do udowodnienia w żywych komórkach za pomocą innych technik.