Stereologiczne oszacowanie długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta mózgu myszy
5 lutego 2020
Długość włókien neuronalnych w trójwymiarowej strukturze obszaru mózgu jest wiarygodnym parametrem do ilościowego określenia specyficznej integralności strukturalnej neuronów lub zwyrodnienia. W tym artykule opisano na przykład stereologiczną metodę kwantyfikacji do pomiaru długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta u myszy.
Neurodenegacja w wielu zaburzeniach neurologicznych jest przewlekłym procesem, w którym utrata włókien neuronalnych często następuje przed utratą ciała komórkowego. Stereologiczna kwantyfikacja włókien neuronalnych w trzech wymiarach zapewnia czułą i dokładną metodę wykrywania wczesnych zmian neurodegeneracyjnych. Technologia ta wykorzystuje niezawodne i wydajne, oparte na komputerach, bezstronne frakcjonowanie kul kosmicznych do pomiaru długości struktur przypominających linie, takich jak włókna neuronalne w 3D.
Demonstracja procedury zostanie przeprowadzona przez Prabhakara Singha, post-doca i naszego eksperta w dziedzinie stereologii, oraz Davida Penga, asystenta naukowego w moim laboratorium. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u znieczulonej myszy, przekrwić przezsercowo około 50 mililitrami lodowatego 0,1 molowego DPBS, a następnie około 25 mililitrami 4% PFA w 0,1 molowym PBS. Pod koniec perfuzji umieść mózg w pojemniku ze świeżym 4% PFA na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego dnia umyj mózg trzema jedno- lub dwuminutowymi płukaniami w świeżym DPBS na jedno pranie i przenieś mózg do 15% sacharozy w 0,1 DPBS roztworze na noc. Następnego ranka umieść mózg w 30% roztworze sacharozy i 0,1 molowym DPBS na 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przenieś mózg do komory kriotomicznej wstępnie ustawionej na minus 20 stopni Celsjusza.
Mózgi mogą być trzymane w szczelnie zamkniętych probówkach i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W celu przekrojenia należy zanurzyć próbkę tkanki w podłożu do zatapiania w optymalnej temperaturze cięcia i zamocować próbkę na krążku próbki. Następnie należy pobrać szeregowe skrawki o grubości 30 mikrometrów w płaszczyźnie koronalnej w kriotomie, przenosząc każdą sekcję do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej roztwór krioprotektantu w przygotowaniu do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Aby zidentyfikować pierwszą i ostatnią sekcję każdego mózgu, porównaj cechy morfologiczne ze standardowym atlasem mózgu myszy. NBM zaczyna się od bregma minus 0,0 milimetra, a kończy na minus 1,6 milimetra. Wybór co ósmego odcinka daje w sumie od sześciu do siedmiu odcinków i pozwala na odpowiedni współczynnik błędu zarówno dla oszacowania objętości, jak i długości włókna.
W celu znakowania immunohistochemicznego skrawków tkanki, po zablokowaniu niespecyficznego wiązania z 10% normalną surowicą bydlęcą w 0,1% Triton X-100 w soli fizjologicznej buforowanej Tris, należy oznaczyć skrawki pierwszorzędowym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki trzy razy przez trzy minuty w świeżym roztworze soli fizjologicznej buforowanej Tris na każde przemycie, a następnie przeprowadzić inkubację z odpowiednim biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki trzykrotnie w świeżej soli fizjologicznej buforowanej tris, jak pokazano, a następnie zabarwić kompleksem peroksydazy biotynowej Avidin i roztworem substratu peroksydazy DAB zgodnie z protokołami producenta.
Po umyciu zamontuj wszystkie skrawki z jednej próbki tkanki mózgowej na jednym żelowatym szkiełku i pozostaw próbki do wyschnięcia na powietrzu. Aby odwodnić skrawki, zanurzyć próbki dwa razy na pięć minut na rozcieńczenie w sekwencyjnych wznoszących się roztworach etanolu, jak wskazano, a następnie oczyścić je dwoma 10-minutowymi płukaniami ksylenu. Następnie za pomocą odpowiedniego medium montażowego umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach.
W przypadku stereologii otwórz nowe badanie w oprogramowaniu. Otworzy się okno dialogowe inicjalizacji badania. Wypełnij informacje o badaniu i potwierdź, że wybrano wielopoziomową frakcję.
Kliknij dwukrotnie głośność, aby otworzyć okno dialogowe głośności. Nazwij interesującą Cię funkcję i wybierz region sondy zliczającej punkty, a następnie kliknij przycisk Dalej. Kliknij dwukrotnie długość i podaj nazwę obiektu.
Wybierz sondę sferyczną i kliknij Dalej. W polu inicjalizacji przypadku, aby zakodować grupy przed rozpoczęciem badania, należy ustawić łączną liczbę sekcji, począwszy od pierwszej sekcji zawierającej obszar zainteresowania do ostatniej sekcji zawierającej obszar zainteresowania i interwał próbkowania sekcji, na osiem. Kliknij dalej, aby otworzyć okno dialogowe inicjalizacji sondy, które automatycznie ustawi najmniejsze powiększenie dla wyboru regionu i oszacowania objętości oraz potwierdzi ustawienia.
Kliknij podgląd, aby sprawdzić, czy obszar zainteresowania można zidentyfikować przy wybranym dolnym powiększeniu. Wprowadź 50 000 mikrometrów sześciennych na punkt dla ułamka objętości regionu i kliknij podgląd i gotowe. W obszarze Duże powiększenie obiektu ustaw długość na 63X i kliknij dwukrotnie długość, aby otworzyć okno dialogowe sfery długości.
Ustaw średnicę tej kuli na 10 mikrometrów i kliknij gotowe. Ustaw odpowiednie wartości dla obszaru ramki, wysokości ramki, strefy ochronnej i odstępów między ramkami. Następnie kliknij Dalej i postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez oprogramowanie.
Aby wstawić pierwszą sekcję, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu pod obiektywem 5X i kliknij zieloną strzałkę, aby narysować dowolną granicę wokół NBM, aby zdefiniować obszar zainteresowania. Kliknij zieloną strzałkę i gotowe, aby zmienić obiektyw 63X, aby uzyskać pomiary włókien bieżącej frakcji. Pojawi się okno dialogowe grubości przekroju.
Ustaw górną i dolną powierzchnię sekcji, aby zmierzyć rzeczywistą grubość przekroju za pomocą pokrętła ręcznego ustawiania ostrości osi z i kliknij gotowe. Przesuwaj oś z powoli od góry do dołu na wysokości ramki sekcji, aby zaznaczyć wszystkie przecinające się włókna na powierzchni wirtualnej sondy sferycznej. Gdy wszystkie włókna zostaną oznaczone, kliknij przycisk Dalej, aby przejść do następnej lokalizacji.
Gdy wszystkie ułamki zostaną zakończone, kliknij zieloną strzałkę. Oprogramowanie poprosi o wstawienie następnej sekcji. Ustaw ostrość następnej próbki na szkiełku za pomocą obiektywu 5X i powtórz pomiar włókna, jak pokazano poniżej.
Po zmierzeniu wszystkich przekrojów, oprogramowanie wygeneruje wynik dla danego przypadku pokazujący współczynnik wartości błędów. Jeśli współczynnik błędu jest akceptowalny, przejdź do następnego przypadku. Jeśli współczynnik błędu jest nie do zaakceptowania, oprogramowanie przedstawi zalecenia dotyczące zmiany niektórych parametrów.
Gdy wszystkie obserwacje zostaną zakończone, wygeneruj wyniki dla każdej obserwacji i grupy. W tym reprezentatywnym eksperymencie szwedzka grupa zmutowanych białek prekursorowych beta-amyloidu wykazała znacznie niższą długość włókien i gęstość długości włókien w porównaniu z ich rodakami z miotu typu dzikiego. Wyniki wykazały również, że nie było znaczącej różnicy w objętości NBM między dwiema analizowanymi grupami.
Technika ta wymaga odpowiedniego akwizycji we właściwej orientacji i dobrej metody barwienia w okresie inkubacji. Protokół stereologiczny może być wykorzystany do oszacowania dowolnych profili liniowych, takich jak inne włókna neuronalne, procesy astrocytów, a nawet profile naczyniowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę stereologiczną służącą do ilościowego określania długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta u myszy, co stanowi kluczowy parametr w ocenie integralności neuronów w procesach neurodegeneracyjnych. Dzięki zastosowaniu analizy trójwymiarowej technika ta oferuje zwiększoną czułość w wczesnym wykrywaniu utraty włókien neuronalnych przed wystąpieniem degeneracji ciał komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neurodegeneracja
- Stereologia
Wstęp
- Neurodegeneracji poprzedza utratę ciał komórek neuronalnych, co często objawia się utratą włókien.
- Metody stereologiczne umożliwiają precyzyjny pomiar struktur neuronalnych w trzech wymiarach.
- Włókna cholinergiczne odgrywają istotną rolę w funkcjach poznawczych oraz chorobach neurodegeneracyjnych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody stereologicznej kwantyfikacji długości włókien cholinergicznych.
- Zademonstrowanie zastosowania tej metody w konkretnym regionie mózgu.
- Ułatwienie wczesnego wykrywania zmian neurodegeneracyjnych.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano techniki stereologiczne do ilościowego określania włókien neuronalnych w trzech wymiarach.
- Myszy służą jako model biologiczny do oceny włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta.
- Metodyka obejmuje szczegółowe przygotowanie tkanek, sekcjonowanie oraz znakowanie immunohistochemiczne.
- Analiza komputerowa jest wykorzystywana do obiektywnej kwantyfikacji i szacowania parametrów.
Główne wyniki
- Metoda stereologiczna skutecznie mierzy długość włókien cholinergicznych, wykazując zdolność do wykrywania wczesnych oznak degeneracji.
- Wyniki ilościowe demonstrują potencjał w zakresie oceny integralności strukturalnej w stanach neurodegeneracyjnych.
- Wyniki wskazują na protokół, który zapewnia dokładność i powtarzalność pomiaru długości włókien.
Wnioski
- Niniejsze badanie podkreśla znaczenie metod stereologicznych w badaniu neurodegeneracji.
- Zastosowana metodologia umożliwia wdrożenie strategii wczesnej interwencji poprzez identyfikację degeneracji przed wystąpieniem utraty komórek.
- Uzyskane informacje ułatwiają lepsze zrozumienie integralności układu cholinergicznego oraz potencjalnych celów terapeutycznych w chorobach neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określenie długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta dostarcza czułego biomarkera wczesnych zmian neurodegeneracyjnych, umożliwiając walidację celu w przedklinicznych modelach zaburzeń poznawczych. To podejście stereologiczne wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wykrywanie utraty aksonów przed degeneracją ciał komórkowych, co zwiększa pewność predykcyjną w badaniach przesiewowych terapii. Metoda ta zwiększa ciągłość translacyjną, łącząc integralność strukturalną z wynikami funkcjonalnymi w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie integralności układu cholergicznego jako hipotezy terapeutycznej w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe i obiektywne pomiary długości włókien w celu wyjaśnienia stopnia zaangażowania celu w konkretnych szlakach.
- Wartość naukowa: Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka poprzez wykrywanie wczesnej utraty aksonów, co zwiększa pewność co do wybranego celu podczas identyfikacji wiodących kandydatów.
Przesiewanie i rozwój testów
- Wartość naukowa: Generuje ustandaryzowane, powtarzalne wyniki ilościowe dotyczące długości włókien cholinergicznych, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie testu poprzez zdefiniowanie parametrów sekcjonowania, barwienia oraz oprogramowania do stereologii w celu skalowalnego przesiewu.
- Wartość naukowa: Dostarcza wskaźniki gęstości długości oraz współczynnika błędu, aby zapewnić jakość danych i porównywalność między badaniami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje istotność w kontekście choroby, wiążąc zmniejszoną długość włókien cholinergicznych w modelach transgenicznych z fenotypami neurodegeneracyjnymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez spójną kwantyfikację długości włókien w różnych genotypach.
- Wartość naukowa: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację znaczącej utraty włókien bez wpływu zakłócających zmian objętości.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta jest integrowana z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków w celu oceny zaangażowania celu w szlakach cholinergicznych, wspierając identyfikację związków wiodących poprzez ilościowe odczyty integralności aksonalnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących degeneracji cholinergicznej poprzez obiektywną estymację długości włókien 3D w regionach mózgu istotnych dla danej choroby.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu przetwarzaniu tkanek, immunobarwieniu oraz ustawieniom sond stereologicznych dla powtarzalnych pomiarów włókien.
- Analityka: Dostarcza wyniki w postaci długości włókien, gęstości długości oraz współczynnika błędu, umożliwiając ilościowe porównanie między warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację utraty włókien jako biomarkera zgodnego z progresją neurodegeneracyjną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do kwantyfikacji dowolnego liniowego profilu neuronalnego lub naczyniowego, rozszerzając użyteczność poza układy cholinergiczne.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną dzięki wykrywaniu wczesnej degeneracji aksonalnej, redukując niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym protokołom stereologicznym oraz bezstronnej frakcjonacji opartej na oprogramowaniu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go poprzez dostarczenie wczesnych danych o biomarkerach, co zwiększa efektywność kapitałową i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o zmiany długości włókien, wspierając decyzje o dalszym rozwoju w projektach dotyczących chorób neurodegeneracyjnych.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu stereologii, immunohistochemii oraz mikroskopii konfokalnej lub światła przechodzącego w celu dokładnego znakowania włókien.
- Metoda opiera się na wykorzystaniu oprogramowania stereologicznego z funkcją analizy sondy typu space ball oraz mikrotomu do uzyskania jednolitych przekrojów o grubości 30 µm.
- W celu zapewnienia powtarzalności niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie fiksacji, interwału cięcia (co ósmy przekrój) oraz ustawień sondy (średnica sfery 10 µm).
- W przypadku zastosowania metody do innych profili liniowych, takich jak włókna dopaminergiczne lub profile naczyniowe, wymagana jest walidacja adaptacyjna ze względu na różnice w gęstości znakowania.
- Ograniczeniem jest jakość tkanki oraz spójność barwienia, które bezpośrednio wpływają na wykrywalność włókien i dopuszczalny współczynnik błędu.
