Name: Stereologiczne oszacowanie długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj stereologiczną metodę pomiaru długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta mózgu myszy. Ta technika umożliwia wczesne wykrywanie zmian neurodegeneracyjnych z wysoką dokładnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty dla W.Z.S. z Służby Badań i Rozwoju Medycznego, Departamentu Spraw Weteranów (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Stowarzyszenia Alzheimera (NPSPAD-11-202149) oraz zasobów z Midwest Biomedical Research Foundation.

Wszystkie procedury dotyczące korzystania z tych zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Kansas City Veterans Affairs Medical Center. Do eksperymentów wykorzystano osiemnastomiesięczne myszy z nadekspresją szwedzkiego zmutowanego białka prekursorowego beta-amyloidu (APPswe) i ich rodzeństwo z miotu C57/BL6 WT. Szczegóły dotyczące hodowli i genotypowania znajdują się w He et al.8.
1. Perfuzja i przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego z ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg). Ściśnij palce u stóp, aby potwierdzić brak odpowiedzi, zanim przejdziesz dalej9.</li>
	<li>Perfuzja przezskórna z ~ 50 ml lodowatego 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS), a następnie 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) 10, 
	UWAGA: PFA jest toksyczny. Podczas pracy z PFA należy stosować środki ochrony osobistej (PPE).</li>
	<li>Usuń brains10 i zanurz w 4% PFA w 0,1 M PB w temperaturze 4 °C w celu postfiksacji na 24 godziny. Umyj DPBS 3x.</li>
	<li>Zmienić na 15% roztwór sacharozy w 0,1 DPBS na noc, a następnie 30% roztwór sacharozy w 0,1 M DPBS przez kolejne 48 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć tkankę z roztworu sacharozy i zamrozić w komorze kriotomicznej nastawionej na temperaturę -20 °C. Zamrożone próbki można przechowywać w szczelnie zamkniętych probówkach w temperaturze -80 °C do czasu ich podziału.</li>
	<li>Osadź tkanki w podłożu do zatapiania w optymalnej temperaturze cięcia (patrz Tabela materiałów) i zamontuj na tarczy z próbką. Wytnij seryjne odcinki o grubości 30 μm w płaszczyźnie koronalnej za pomocą kriotomimu i zbierz wszystkie skrawki następnie na 24-dołkowych płytkach hodowlanych wypełnionych roztworem krioprotektantu (30% glicerol, 30% glikol etylenowy, 40% DPBS; <silna klasa="xfig">Rysunek 1A–C). Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Grubsze sekcje (np. 50 μm) są preferowane, jeśli jest to możliwe. Upewnij się, że sekcje są utrzymane w kolejności cięcia, a wszystkie sekcje są całkowicie w krioprotektorencie. Płytka 96-dołkowa może być używana jako alternatywa dla płytek 24-dołkowych do pobierania skrawków.</li>
	<li>Przykryj studzienki uszczelniaczem do płyt, aby zapobiec parowaniu i wysychaniu. Przechowywać płytki w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Skrawki przechowywane w temperaturze -20 °C są stabilne przez kilka miesięcy dla immunohistochemii ChAT.</li>
</ol>
2. Systematyczny wybór sekcji dla IHC
UWAGA: Należy przeprowadzić badanie pilotażowe, aby poznać całkowitą liczbę sekcji wymaganych do osiągnięcia akceptowalnego współczynnika błędu (CE). Wartość CE jest wyrazem całkowitego poziomu błędu w procedurze pobierania próbek. Najniższa wartość oznacza minimalny błąd, a wartość CE niższa niż 0,1 jest uważana za akceptowalną przez użyte tutaj oprogramowanie (patrz Tabela materiałów)11.
<ol>
	<li>Zidentyfikuj pierwszą i ostatnią sekcję dla każdego mózgu, porównując cechy morfologiczne ze standardowym atlasem mózgu myszy, takim jak Franklin i Paxinos. NBM zaczyna się od -0,0 mm i kończy na -1,6 mm. W związku z tym około 50 sekcji zawiera NBM. Całkowita liczba sekcji jest jednym z parametrów wymaganych podczas stereologii. Wybór co8-tej sekcji (SSF = 1/8) dał w sumie 6-7 sekcji do analizy i dał akceptowalne CE zarówno dla oszacowania objętości, jak i oszacowania długości włókien w naszym badaniu pilotażowym.</li>
	Losowo zacznij od jednej z pierwszych ośmiu sekcji, a następnie systematycznie próbkuj co 8 sekcję, aż do ostatniej tylnej sekcji zawierającej NBM (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1 C).<li></li>
</ol>
3. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Przenieś kriokonserwowane skrawki do temperatury pokojowej w krioprotektantze, a następnie 0,1 M buforu fosforanowego (PB) na płytkach 6-dołkowych.</li>
	<li>Umyć 3x w PB.</li>
	<li>Inkubować w 0,3% H2O2 w metanolu przez 15 min.</li>
	<li>Umyć 3x w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS).</li>
	<li>Inkubować w 0,25% Triton X-100 w TBS przez 30 min.</li>
	<li>Blok z 10% normalną surowicą bydlęcą (NBS) w 0,1% Triton X-100 w TBS przez 30 min.</li>
	<li>Inkubować z rozcieńczeniem 1:1 000 kozich przeciwciał pierwotnych przeciwko ludzkiemu ChAT (patrz tabela materiałów) w TBS z 0,1% Triton X-100 i 1% NBS przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Prać 3x w TBS w temperaturze pokojowej. Wykonaj dalszą inkubację i mycie w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować z biotynylowanym bydlęcym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko kozom (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyć 3x w TBS.</li>
	<li>Inkubować z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umyć 3x w TBS.</li>
	<li>Opracowywać przy użyciu ulepszonego roztworu substratu peroksydazy DAB (patrz tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta. 
	UWAGA: DAB jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy. Jest toksyczny przez kontakt i wdychanie. Używaj środków ochrony osobistej podczas pracy z DAB.</li>
	<li>Umyj sekcję kilka razy wodą destylowaną i utrzymuj w pH Tris = 7,6.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na żelowatych szkiełkach. Wszystkie wycinki z jednej tkanki można umieścić na tym samym szkiełku. Wysuszyć sekcje na powietrzu, odwodnić 2x po 5 minut za pomocą 70%, 90%, 95% i 100% etanolu, a następnie oczyścić sekcje dwoma 10-minutowymi płukankami ksylenu. Szkiełko nakrywkowe należy wykonać za pomocą środka montażowego (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Czas przetwarzania odwadniania i oczyszczania wpływa na grubość sekcji. Dlatego dla wszystkich sekcji należy stosować te same warunki. W niniejszym badaniu średnia wartość dla grubości końcowej wynosiła 21,11 ± 0,45 μm.</li>
	<li>Utrzymuj sekcje w dygestoriach do wyschnięcia. Suche sekcje są gotowe do badania stereologicznego.</li>
</ol>
4. Stereologia
UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z używanym mikroskopem i oprogramowaniem. Przydatny będzie obiektyw immersyjny z aperturą numeryczną (NA) > 1,2, którego należy używać w razie potrzeby. Preparaty powinny być pogrupowane według genotypu lub grupy leczonej i zakodowane. Pełna stereologia dla jednego badania powinna być wykonana przez tę samą osobę, a osoba wykonująca badanie stereologiczne powinna być ślepa na tożsamość poszczególnych preparatów lub badanej grupy1,12,13.
<ol>
	<li>Otwórz nowe badanie w oprogramowaniu. (Plik > nowego badania). Otworzy się okno dialogowe "Inicjalizacja badania". Wypełnij informacje o badaniu, korzystając z funkcji wielopoziomowej (opartej na ułamkach) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie "Głośność" w obszarze Parametry, co otworzy okno dialogowe Głośność. Nazwij interesującą Cię funkcję i wybierz sondę "Zliczanie punktów w regionie". Kliknij Dalej.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie następny parametr "Długość".
	<ol>
		<li>Podaj nazwę funkcji (np. "L") Wybierz sondę "Sphere" i kliknij Dalej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie kliknij okno dialogowe "Inicjalizacja badania", które otworzy okno "Inicjalizacja przypadku". Wypełnij informacje o sprawie. Grupy muszą zostać zakodowane przed rozpoczęciem badania. Łączna liczba sekcji to liczba sekcji, począwszy od pierwszej sekcji zawierającej obszar zainteresowania do ostatniej sekcji zawierającej obszar zainteresowania (zob. krok 2.1). Interwał próbkowania sekcji wynosi osiem, ponieważ co 8 sekcja została wybrana do barwienia IHC.</li>
	<li>Kliknięcie przycisku Dalej otwiera okno dialogowe "Inicjalizacja sondy", w którym automatycznie ustawione zostanie najmniejsze powiększenie dla wyboru obszaru i oszacowania objętości. Potwierdź ustawienia i sprawdź, czy obszar zainteresowania można zidentyfikować przy wybranym dolnym powiększeniu. Kliknij dwukrotnie "Objętość" i wypełnij 50 000 μm3 na punkt dla frakcji objętościowej regionu. Kliknij Gotowe.</li>
	<li>W obszarze Powiększenie obiektu (wysokie) ustaw Długość na 63x lub 100x. Kliknij dwukrotnie "Długość", aby otworzyć okno dialogowe Długość-Sfera i ustaw średnicę kuli na 10 μm. Kliknij Gotowe. 
	UWAGA: Strefę ochronną należy określić na podstawie rzeczywistej grubości sekcji. Operator musi sprawdzić grubość sekcji w wielu miejscach, aby uniknąć uszkodzeń. W razie potrzeby dostosuj grubość strefy ochronnej na podstawie grubości przekroju.</li>
	<li>Ustaw odpowiednie wartości dla obszaru ramki, wysokości ramki, strefy ochronnej i odstępów między ramkami. 
	UWAGA: Wartości te zależą od niejednorodności profili obiektów (włókien) w badanym obszarze. Powierzchnia ramy 400 μm2, wysokość ramy 10 μm, strefa ochronna 2 μm i odstęp między ramami 300 μm dają akceptowalne wartości CE do oszacowania długości włókien w NBM. Badanie pilotażowe musi zostać przeprowadzone z tymi wartościami przed przejściem do następnego przypadku.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez oprogramowanie po każdym kroku. Instrukcje są wyświetlane w postaci okna dialogowego i/lub u dołu ekranu.</li>
	<li>Wstawić sekcję 1.</li>
	<li>Przy małym powiększeniu (5x) zdefiniuj obszar zainteresowania, wyznaczając dowolną granicę wokół NBM. Kliknij przycisk Dalej w lewym rogu okna wideo. Postępuj zgodnie z instrukcjami i upewnij się, że wszystkie zielone punkty znajdują się w NBM. Punkty można uwzględnić lub wykluczyć, klikając na punkty. 
	UWAGA: Nie ma określonej, ustalonej granicy wokół NBM. Selekcja jest w większości definiowana przez badaczy. Neurony cholinergiczne ChAT+ NBM można zaobserwować w torebce wewnętrznej (ic) i gałki bladej (GP). W tym protokole układ scalony z neuronami cholinergicznymi ChAT+ i ich projekcjami (włóknami) oraz całym GP jest zawarty w NBM (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami i zmień na 63x dla pomiarów włókien w bieżącej frakcji. Na ekranie pojawi się okno dialogowe 'Grubość przekroju'. Ustaw górną i dolną powierzchnię przekroju, aby zmierzyć rzeczywistą grubość przekroju. Należy stosować ręczny ruch osi Z. Kliknij Gotowe. 
	UWAGA: Jeśli w okolicy nie ma światłowodu, krok można pominąć, aby przejść do następnej lokalizacji frakcji.</li>
	<li>Przesuwaj powoli oś Z od góry do dołu na wysokości ramy przekroju i zaznacz wszystkie przecinające się włókna na powierzchni wirtualnej sondy sferycznej (Rysunek 3). Po zakończeniu kliknij przycisk Dalej, aby przejść do następnej lokalizacji.</li>
	<li>Po zakończeniu wszystkich ułamków oprogramowanie poprosi o wstawienie następnej sekcji. Powtórz kroki 4.9–4.12 dla wszystkich sześciu lub siedmiu odcinków tkanki.
	<ol>
		<li>Na koniec oprogramowanie wygeneruje wynik dla przypadku pokazujący wartości CE (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Jeśli CE jest akceptowalny, przejdź do następnego przypadku. Plik > nowej sprawy. Jeśli CE nie jest akceptowalny (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A), oprogramowanie przedstawia zalecenia dotyczące zmiany niektórych parametrów. W wielu przypadkach zmniejszenie odstępów między ramkami powoduje zmniejszenie wartości CE do akceptowalnego zakresu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu wszystkich spraw wygeneruj wyniki dla każdej sprawy i grupy (Plik > Wyniki).</li>
</ol>
5. Analizy i statystyki
<ol>
	<li>Oprogramowanie dostarcza dane dla każdej próbki i każdej grupy. Samo oprogramowanie oblicza frakcje, takie jak SSF, ASF i TSF, i podaje całkowitą objętość referencyjną (VREF) i całkowitą długość (L) włókien w regionie odniesienia (w tym przypadku NBM) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4B). Eksportuj dane i zapisz lub skopiuj je do wybranego oprogramowania statystycznego w celu analizy między grupami. W tabeli 1 przedstawiono typowe dane wynikowe do celów analizy statystycznej. Analizuj gęstość włókien (Lv), dzieląc całkowitą długość włókna przez objętość referencyjną.</li>
</ol>

<ol><li>Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+length+estimation+using+spherical+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Stereological length estimation using spherical probes.</a> Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).</li>
<li>Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer+disease%3A+evidence+for+selective+loss+of+cholinergic+neurons+in+the+nucleus+basalis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).</li>
<li>Davies, P., Maloney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loss+of+central+cholinergic+neurons+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease.</a> The Lancet. 2 (8000), 1403(1976).</li>
<li>Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholinergic+hypothesis+of+geriatric+memory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction.</a> Science. 217 (4558), 408-414 (1982).</li>
<li>Savonenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episodic-like+memory+deficits+in+the+APPswe%2FPS1dE9+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%3A+relationships+to+beta-amyloid+deposition+and+neurotransmitter+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities.</a> Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).</li>
<li>Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+forebrain+degeneration+in+the+APPswe%2FPS1DeltaE9+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse.</a> Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).</li>
<li>Stokin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonopathy+and+transport+deficits+early+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).</li>
<li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GRK5+Deficiency+Leads+to+Selective+Basal+Forebrain+Cholinergic+Neuronal+Vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability.</a> Scientific Reports. 6, 26116(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMouton%2C+PR+%22Unbiased+Stereology-A+Concise+Guide%22">Unbiased Stereology-A Concise Guide</a>. , Johns Hopkins University Press. (2011).</li>
<li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started+in+stereology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Getting started in stereology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).</li>
<li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Space+Balls+Revisited%3A+Stereological+Estimates+of+Length+With+Virtual+Isotropic+Surface+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49(2018).</li>
<li>Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+capillary+network+of+aged+APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice.</a> Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).</li>
<li>Gutierrez-Jimenez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+in+the+control+of+capillary+flow+in+an+aged+APP%28swe%29%2FPS1DeltaE9+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).</li>
<li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology--reconsidered%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">The efficiency of systematic sampling in stereology--reconsidered.</a> Journal of Microscopy. 193, Pt 3 199-211 (1999).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+the+capillaries+within+the+white+matter+of+the+Tg2576+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease.</a> Brain and Behavior. 9 (4), 01268(2019).</li>
<li>McNeal, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Stereological+Analysis+of+Reactive+Astrogliosis+to+Estimate+Age-Associated+Cerebral+White+Matter+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury.</a> Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+%28amyloid-beta%29+immunotherapy+attenuates+monoaminergic+axonal+degeneration+in+the+AbetaPPswe%2FPS1dE9+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 23 (2), 271-279 (2011).</li>
<li>Gagnon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Sprouting+of+Dopamine+and+Serotonin+Axons+in+the+Pallidum+of+Parkinsonian+Monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys.</a> Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38(2018).</li>
<li>Boncristiano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+changes+in+the+APP23+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj demonstrujemy metodę szacowania gęstości włókien cholinergicznych w NBM za pomocą sondy z kosmiczną kulą (kulą). Ta sonda szacuje całkowitą długość światłowodu w obszarze zainteresowania. Całkowitą długość można podzielić przez objętość regionu, aby uzyskać gęstość włókien. Do oszacowania objętości regionu wykorzystano metodę zliczania punktów Cavalieriego. Metoda zliczania punktów Cavalieriego jest bezstronnym i wydajnym estymatorem objętości referencyjnej 3D dla dowolnego regionu. Metoda oblicza oszacowanie powie...

Ilościowe szacunki długości i/lub gęstości włókien nerwowych w mózgu są ważnymi parametrami badań neuropatologicznych. Długość aksonów cholinergicznych, dopaminergicznych i serotoninergicznych w różnych regionach mózgu jest często skorelowana z określonymi funkcjami tego regionu. Ponieważ rozmieszczenie tych aksonów jest na ogół niejednorodne, stosuje się stereologię opartą na projekcie, aby uniknąć błędu systematycznego podczas pobierania próbek. Sonda kosmiczna typu space ball została zaprojektowana, aby zapewnić wydajne i wiarygodne pomiary struktur przypominających linie, takich jak włókna neuronalne w obszarze zainteresowania1. Sonda tworzy wirtualną kulę, która jest systematycznie nakładana w tkance w celu zmierzenia przecięć linii z powierzchnią sondy. Ponieważ niemożliwe jest umieszczenie sond sferycznych w tkance w celu analizy, dostępne na rynku oprogramowanie zapewnia wirtualną trójwymiarową (3D) sferę, która jest w zasadzie serią koncentrycznych okręgów o różnych średnicach, które reprezentują powierzchnię sondy sferycznej.
Selektywna neurodegeneracja cholinergiczna jest jedną ze stałych cech choroby Alzheimera (AD)2,3,4. Dysfunkcyjna transmisja cholinergiczna jest uważana za czynnik powodujący pogorszenie funkcji poznawczych w AD. Dysfunkcja cholinergiczna jest również widoczna w wielu innych zaburzeniach psychicznych, takich jak choroba Parkinsona, uzależnienie i schizofrenia. Różne aspekty neurodegeneracji cholinergicznej są badane w modelach zwierzęcych (np. zmniejszenie acetylocholiny5, ChAT protein6, neurodegeneracja włókien cholinergicznych w pobliżu blaszek amyloidowych6, oraz spadek włókien cholinergicznych i żylaków synaptycznych7,8). Uważa się, że zwyrodnienie włókien następuje wcześniej niż utrata neuronów, ponieważ cholinergiczny ubytek neuronów nie zawsze jest obserwowany w badaniach. Większość neuronów cholinergicznych znajduje się w podstawnej przodomózgowiu i pniu mózgu, a ich aksony rzutują do różnych obszarów mózgu, takich jak kora mózgowa i hipokamp. NBM znajduje się w podstawnej przodomózgowiu i okazuje się, że jest to jeden z często dotkniętych obszarów mózgu w chorobie Alzheimera.
Metoda frakcjonowania w stereologii opiera się na systematycznym losowym pobieraniu próbek tkanek na wielu poziomach. Frakcja próbkowania skrawków (SSF) to niekomputerowe systematyczne pobieranie próbek skrawków dla metody frakcjonowania w stereologii. Frakcja próbkowania obszarowego (ASF) to frakcjonowanie obszaru obszaru zainteresowania w sekcji. Frakcja próbkowania grubości (TSF) to frakcjonowanie grubości przekroju. Sonda z kosmiczną kulą pozwala nam na ilościowe określenie interesujących profili w sferze 3D w ułamkowanych lokalizacjach. Tutaj używamy sondy z kosmiczną kulą do oszacowania całkowitej długości włókien cholinergicznych w NBM mózgu myszy, aby zilustrować procedury. Obecny protokół zawiera szczegółowe informacje na temat przetwarzania tkanek, metod pobierania próbek do stereologii, barwienia immunohistochemicznego przy użyciu przeciwciała ChAT oraz bezstronnej stereologii w celu oszacowania długości włókien cholinergicznych i gęstości włókien w NBM mózgu myszy.

<table><tbody><tr><td>Zestaw ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ChAT</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Bydlęca surowica anty-koziowa IgG-B</td><td>Santacruz Biotechnology</td><td>SC-2347</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca, dorosła</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Immpact-DAB</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4105</td><td>Ulepszony roztwór substratu peroksydazy DAB</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Westward Pharmaceuticals, NJ, USA</td><td>0143-9509-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA</td><td>AF6000</td><td>Wyposażony w zmotoryzowany stolik i kolorową kamerę cyfrową IMI-tech</td></tr><tr><td>Optymalna temperatura skrawania (O.C.T.) medium do zatapiania</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, PA, USA</td><td>62550-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Permount</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences, PA, USA</td><td>17986-01</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie stereologiczne</td><td>Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA</td><td>Stereologer2000</td><td>zainstalowany na komputerze stacjonarnym firmy Dell.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany</td><td>Zjednoczone T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td>Tris base Tris</td></tr><tr><td>, chlorowodorek Trizma</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T5941</td><td>Tris chlorowodorek</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer, Leverkusen, Niemcy</td><td>Ksyleny Rompun</td><td></td></tr>, <tr><td>stopień histologiczny</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

stereologiczne oszacowanie długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym meynerta mózgu myszy

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

Długość aksonów cholinergicznych lub innych neuronów w różnych obszarach mózgu jest często skorelowana z konkretną funkcją regionu. Stereologia jest przydatną metodą ilościowego określania profili neuronalnych różnych struktur mózgu. W tym miejscu przedstawiamy oparty na oprogramowaniu protokół stereologiczny do oszacowania całkowitej długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta (NBM) podstawy przodomózgowia. Metoda wykorzystuje sondę z kosmiczną kulą do oszacowania długości. Włókna cholinergiczne są wizualizowane za pomocą barwienia immunologicznego acetylotransferazy choliny (ChAT) za pomocą systemu wykrywania peroksydazy chrzanowej i diaminobenzydyny (HRP-DAB). Protokół barwienia jest również ważny do szacowania liczby włókien i komórek w różnych obszarach mózgu za pomocą oprogramowania stereologicznego. Protokół stereologiczny może być stosowany do szacowania dowolnych profili liniowych, takich jak włókna cholinoceptywne, włókna dopaminergiczne/katecholaminergiczne, włókna serotoninergiczne, procesy astrocytów, a nawet profile naczyniowe.

Reprezentatywne wyniki przedstawiono w Tabeli 1 oraz na Rysunku 5. Grupa C, zidentyfikowana jako grupa APPswe (APP), wykazała znacznie mniejszą długość włókien (Rysunek 5B) oraz mniejszą gęstość długości włókien (Rysunek 5C) w porównaniu do rówieśników typu dzikiego (WILD). Wyniki wykazały, że nie istniała istotna różnica w objętości NBM pomiędzy dwiema analizowanymi grupami (<stron...

Długość włókien neuronalnych w trójwymiarowej strukturze obszaru mózgu jest wiarygodnym parametrem do ilościowego określenia specyficznej integralności strukturalnej neuronów lub zwyrodnienia. W tym artykule opisano na przykład stereologiczną metodę kwantyfikacji do pomiaru długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta u myszy.

Stereologiczne oszacowanie długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta mózgu myszy

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...

Neurodenegacja w wielu zaburzeniach neurologicznych jest przewlekłym procesem, w którym utrata włókien neuronalnych często następuje przed utratą ciała komórkowego. Stereologiczna kwantyfikacja włókien neuronalnych w trzech wymiarach zapewnia czułą i dokładną metodę wykrywania wczesnych zmian neurodegeneracyjnych. Technologia ta wykorzystuje niezawodne i wydajne, oparte na komputerach, bezstronne frakcjonowanie kul kosmicznych do pomiaru długości struktur przypominających linie, takich jak włókna neuronalne w 3D.Demonstracja procedury zostanie przeprowadzona przez Prabhakara Singha, post-doca i naszego eksperta w dziedzinie stereologii, oraz Davida Penga, asystenta naukowego w moim laboratorium. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u znieczulonej myszy, przekrwić przezsercowo około 50 mililitrami lodowatego 0,1 molowego DPBS, a następnie około 25 mililitrami 4% PFA w 0,1 molowym PBS. Pod koniec perfuzji umieść mózg w pojemniku ze świeżym 4% PFA na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia umyj mózg trzema jedno- lub dwuminutowymi płukaniami w świeżym DPBS na jedno pranie i przenieś mózg do 15% sacharozy w 0,1 DPBS roztworze na noc. Następnego ranka umieść mózg w 30% roztworze sacharozy i 0,1 molowym DPBS na 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przenieś mózg do komory kriotomicznej wstępnie ustawionej na minus 20 stopni Celsjusza.Mózgi mogą być trzymane w szczelnie zamkniętych probówkach i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W celu przekrojenia należy zanurzyć próbkę tkanki w podłożu do zatapiania w optymalnej temperaturze cięcia i zamocować próbkę na krążku próbki. Następnie należy pobrać szeregowe skrawki o grubości 30 mikrometrów w płaszczyźnie koronalnej w kriotomie, przenosząc każdą sekcję do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej roztwór krioprotektantu w przygotowaniu do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Aby zidentyfikować pierwszą i ostatnią sekcję każdego mózgu, porównaj cechy morfologiczne ze standardowym atlasem mózgu myszy. NBM zaczyna się od bregma minus 0,0 milimetra, a kończy na minus 1,6 milimetra. Wybór co ósmego odcinka daje w sumie od sześciu do siedmiu odcinków i pozwala na odpowiedni współczynnik błędu zarówno dla oszacowania objętości, jak i długości włókna.W celu znakowania immunohistochemicznego skrawków tkanki, po zablokowaniu niespecyficznego wiązania z 10% normalną surowicą bydlęcą w 0,1% Triton X-100 w soli fizjologicznej buforowanej Tris, należy oznaczyć skrawki pierwszorzędowym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki trzy razy przez trzy minuty w świeżym roztworze soli fizjologicznej buforowanej Tris na każde przemycie, a następnie przeprowadzić inkubację z odpowiednim biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć skrawki trzykrotnie w świeżej soli fizjologicznej buforowanej tris, jak pokazano, a następnie zabarwić kompleksem peroksydazy biotynowej Avidin i roztworem substratu peroksydazy DAB zgodnie z protokołami producenta.Po umyciu zamontuj wszystkie skrawki z jednej próbki tkanki mózgowej na jednym żelowatym szkiełku i pozostaw próbki do wyschnięcia na powietrzu. Aby odwodnić skrawki, zanurzyć próbki dwa razy na pięć minut na rozcieńczenie w sekwencyjnych wznoszących się roztworach etanolu, jak wskazano, a następnie oczyścić je dwoma 10-minutowymi płukaniami ksylenu. Następnie za pomocą odpowiedniego medium montażowego umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach.W przypadku stereologii otwórz nowe badanie w oprogramowaniu. Otworzy się okno dialogowe inicjalizacji badania. Wypełnij informacje o badaniu i potwierdź, że wybrano wielopoziomową frakcję.Kliknij dwukrotnie głośność, aby otworzyć okno dialogowe głośności. Nazwij interesującą Cię funkcję i wybierz region sondy zliczającej punkty, a następnie kliknij przycisk Dalej. Kliknij dwukrotnie długość i podaj nazwę obiektu.Wybierz sondę sferyczną i kliknij Dalej. W polu inicjalizacji przypadku, aby zakodować grupy przed rozpoczęciem badania, należy ustawić łączną liczbę sekcji, począwszy od pierwszej sekcji zawierającej obszar zainteresowania do ostatniej sekcji zawierającej obszar zainteresowania i interwał próbkowania sekcji, na osiem. Kliknij dalej, aby otworzyć okno dialogowe inicjalizacji sondy, które automatycznie ustawi najmniejsze powiększenie dla wyboru regionu i oszacowania objętości oraz potwierdzi ustawienia.Kliknij podgląd, aby sprawdzić, czy obszar zainteresowania można zidentyfikować przy wybranym dolnym powiększeniu. Wprowadź 50 000 mikrometrów sześciennych na punkt dla ułamka objętości regionu i kliknij podgląd i gotowe. W obszarze Duże powiększenie obiektu ustaw długość na 63X i kliknij dwukrotnie długość, aby otworzyć okno dialogowe sfery długości.Ustaw średnicę tej kuli na 10 mikrometrów i kliknij gotowe. Ustaw odpowiednie wartości dla obszaru ramki, wysokości ramki, strefy ochronnej i odstępów między ramkami. Następnie kliknij Dalej i postępuj zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez oprogramowanie.Aby wstawić pierwszą sekcję, umieść szkiełko na stoliku mikroskopu pod obiektywem 5X i kliknij zieloną strzałkę, aby narysować dowolną granicę wokół NBM, aby zdefiniować obszar zainteresowania. Kliknij zieloną strzałkę i gotowe, aby zmienić obiektyw 63X, aby uzyskać pomiary włókien bieżącej frakcji. Pojawi się okno dialogowe grubości przekroju.Ustaw górną i dolną powierzchnię sekcji, aby zmierzyć rzeczywistą grubość przekroju za pomocą pokrętła ręcznego ustawiania ostrości osi z i kliknij gotowe. Przesuwaj oś z powoli od góry do dołu na wysokości ramki sekcji, aby zaznaczyć wszystkie przecinające się włókna na powierzchni wirtualnej sondy sferycznej. Gdy wszystkie włókna zostaną oznaczone, kliknij przycisk Dalej, aby przejść do następnej lokalizacji.Gdy wszystkie ułamki zostaną zakończone, kliknij zieloną strzałkę. Oprogramowanie poprosi o wstawienie następnej sekcji. Ustaw ostrość następnej próbki na szkiełku za pomocą obiektywu 5X i powtórz pomiar włókna, jak pokazano poniżej.Po zmierzeniu wszystkich przekrojów, oprogramowanie wygeneruje wynik dla danego przypadku pokazujący współczynnik wartości błędów. Jeśli współczynnik błędu jest akceptowalny, przejdź do następnego przypadku. Jeśli współczynnik błędu jest nie do zaakceptowania, oprogramowanie przedstawi zalecenia dotyczące zmiany niektórych parametrów.Gdy wszystkie obserwacje zostaną zakończone, wygeneruj wyniki dla każdej obserwacji i grupy. W tym reprezentatywnym eksperymencie szwedzka grupa zmutowanych białek prekursorowych beta-amyloidu wykazała znacznie niższą długość włókien i gęstość długości włókien w porównaniu z ich rodakami z miotu typu dzikiego. Wyniki wykazały również, że nie było znaczącej różnicy w objętości NBM między dwiema analizowanymi grupami.Technika ta wymaga odpowiedniego akwizycji we właściwej orientacji i dobrej metody barwienia w okresie inkubacji. Protokół stereologiczny może być wykorzystany do oszacowania dowolnych profili liniowych, takich jak inne włókna neuronalne, procesy astrocytów, a nawet profile naczyniowe.

stereological-estimation-cholinergic-fiber-length-nucleus-basalis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje metodę oceny synaps wstęgowych w określonych regionach ślimaka myszy. Wykorzystuje techniki barwienia immunologicznego i obrazowania konfokalnego w celu identyfikacji funkcjonalnych synaps w różnych regionach częstotliwości w każdym skręcie ślimaka.

Ocena synaps wstęgowych w określonych obszarach częstotliwości ślimaka myszy

Ten film pokazuje immunohistochemiczne barwienie włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym regionu Meynerta w sekcjach mózgu myszy. Skrawki są blokowane i leczone pierwotną przeciwko acetylotransferazie choliny, a następnie biotynylowanym przeciwciałom drugorzędowym. Dodaje się kompleksy awidyna-biotyna-peroksydaza, które wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi, a następnie z substratem chromogennym. Skrawki są następnie odwadniane i montowane przed wizualizacją pod mikroskopem.

Immunohistochemiczne barwienie włókien nerwowych w jądrze podstawnym Meynera mózgu myszy

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje dwie różne manipulacje środowiskowe oraz równoległy protokół infuzji mózgu do badania wywołanych przez środowisko zmian w mózgu, leżących u podstaw adaptacyjnego zachowania i naprawy mózgu u dorosłych myszy.

Środowiskowe modulacje liczby neuronów dopaminowych śródmózgowia u dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Ta praca przedstawia krok po kroku protokół bezstronnego stereologicznego szacowania liczby komórek neuronalnych dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego (tj. mikroskopu świetlnego, zmotoryzowanej tabeli obiektów (płaszczyzna x, y, z) oraz oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu.

Stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Wykorzystanie sztucznej inteligencji (Ai) do analizy obrazów jawi się jako potężne, mniej stronnicze i szybkie podejście w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami. Tutaj wyszkoliliśmy Ai, aby rozpoznawała organellę komórkową, pierwotne rzęski i analizowała właściwości, takie jak długość i intensywność barwienia, w rygorystyczny i powtarzalny sposób.

Podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych

Stereotaktyczna operacja celowania w miejsca mózgu u myszy zwykle obejmuje dostęp przez kości czaszki i jest prowadzona przez punkty orientacyjne czaszki. Poniżej przedstawiamy alternatywne podejście stereotaktyczne do celowania w ogonowy pień mózgu i górny odcinek szyjny rdzenia kręgowego za pomocą cisterna magna, które opiera się na bezpośredniej wizualizacji punktów orientacyjnych pnia mózgu.

Stereotaktyczne podejście chirurgiczne do mikroiniekcji ogonowego pnia mózgu i górnego odcinka szyjnego rdzenia kręgowego za pośrednictwem Cisterna magna u myszy

Prążek naczyniowy jest niezbędny do generowania potencjału wewnątrzślimakowego. Tutaj przedstawiamy sekcję rozstępów naczyniowych dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego.

Rozwarstwienie rozstępu naczyniowego dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego

Poznaj stereologiczną metodę pomiaru długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta mózgu myszy. Ta technika umożliwia wczesne wykrywanie zmian neurodegeneracyjnych z wysoką dokładnością.

Stereologiczne oszacowanie długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów