Pomiar szybkości mutacji drobnoustrojów za pomocą testu fluktuacji

Protokół umożliwia oszacowanie mutacji w drobnoustrojach. Może pokazać, w jaki sposób kontekst środowiskowy organizmu wpływa na prawdopodobieństwo spontanicznej mutacji. Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest tani i wydajny.

Równolegle można dokonać wielu szacunków tempa mutacji. Mutacje, które mierzy ten protokół, mogą wynikać z oporności na antybiotyki. Protokół ten może być wykorzystany do badania jednego z największych wyzwań na świecie, jakim jest oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób kontekst ekologiczny komórek może wpływać na ewolucję oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Protokół ten szacuje tempo mutacji w monokulturze szczepu laboratoryjnego, ale zastosowaliśmy go do szczepów klinicznych i kohodowli dwóch szczepów w celu odróżnienia cząsteczki bioneutralnej. Najbardziej niebezpiecznymi reakcjami stosowanymi w tym protokole są antybiotyk ryfampicyna i metanol.

Dlatego upewnij się, że używasz rękawic i okularów ochronnych, gdy ryfampicyna jest rozpuszczona w metanolu. Aby rozpocząć tę procedurę, zaszczepij trzy ml płynnego bulionu lizogenicznego odrobiną lodu z bulionu glicerolu E.coli K12. Potrząsaj kulturą LB przy 120 obr./min i w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około siedem godzin.

Następnie rozcieńczyć kulturę 2000-krotnie roztworem soli. Dodaj 10 ml płynnej pożywki minimalnej Davisa do każdej probówki, z których każda zawiera inne stężenie glukozy, jak pokazano tutaj. Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonej kultury do trzech 50 ml stożkowatych probówek polimerowych z denkiem sitowym.

Przygotuj 22 ml pięciu różnych roztworów płynnej pożywki minimalnej Davisa z glukozą, każdy w osobnej probówce o pojemności 50 ml, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować inokulum do środowiska, najpierw zmierz gęstość optyczną nocnych kultur na 600 nanometrach. Rozcieńczyć kultury roztworem soli i dodać od 2200 do 110000 komórek do każdego środowiska.

Zapewni to, że inokulum na jeden ml środowiska zawiera od 1000 do 5000 komórek. Następnie utwórz losowy układ równoległych kultur dla płytki głębokiej 196. Przenieść jeden ml zaszczepionej pożywki do każdego dołka płytki zgodnie z układem.

Następnie przymocuj wieczko talerza taśmą i zważ całą płytkę z pokrywką i taśmą. Potrząsaj płytką z prędkością 250 obr./min i w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie umieść dwa litry wody destylowanej w inkubatorze, aby ustabilizować ilość parowania między zestawami doświadczalnymi.

Określić wielkość inokulum, posiewając 10 mikrolitrów każdego z zaszczepionych pożywek na nieselektywnej płytce agarowej TA. Użyj sterylnego rozsiewacza w kształcie litery L, aż powierzchnia agaru wyschnie. Następnie należy przygotować selektywny agar TA zawierający ryfampicynę na płytkach sześciodołkowych.

Pobrać pipetą pięć ml selektywnego agaru TA do każdej studzienki z sześciu płytek dołkowych. Policz jednostki tworzące kolonie na nieselektywnych płytkach agarowych i określ rozmiar inokulu. Po 24 godzinach inkubacji zważ całą płytkę z głębokim dołkiem, aby określić ilość parowania, która prawdopodobnie wynosi około 10%Przenieś trzy losowo wybrane kultury na test do znakowanych probówek wirówkowych.

Umieścić na płytce pozostałe 81 równoległych kultur z płytki głębokiej studzienki na selektywnym agarze TA zawierającym ryfampicynę. Następnie zdejmij pokrywki z selektywnych płytek agarowych i pozostaw je odkryte w sterylnych warunkach, aby wysuszyć cały płyn na powierzchni agaru. Określić liczbę jednostek tworzących kolonie, rozcieńczając kultury z probówek do mikrowirówek, stosując pięć 10-krotnych etapów rozcieńczania, mieszając i wirując 900 mikrolitrów roztworu soli ze 100 mikrolitrami kultury na etap rozcieńczania.

Umieścić 40 mikrolitrów końcowego rozcieńczenia na nieselektywnym agarze TA i przykryć płytki pokrywką. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy wszystkie studzienki na płytce sześciodołkowej są wolne od płynu hodowlanego, ponownie załóż pokrywkę.

Następnie inkubuj płytki pod przykryciem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 44-48 godzin. Czwartego dnia policz jednostki tworzące kolonie na nieselektywnych płytkach agarowych. W piątym dniu policz liczbę kolonii, które są odporne na antybiotyk na selektywnych płytkach agarowych TA.

Zapisz rozkład wśród równoległych kultur obserwowanej liczby mutantów dla danego testu. Otwórz odpowiednie oprogramowanie na komputerze. W zakładce testowania hipotez pozostaw wartości domyślne.

Kliknij przycisk przeglądania i wybierz plik tekstowy z rozkładem obserwowanych mutantów. Po wgraniu pliku kliknij na przeprowadzony test. Po prawej stronie, pod wynikiem testu, pod testem ML dla jednej próby, znajdź numer mutacji.

To jest m, oczekiwana liczba zdarzeń mutacyjnych. Następnie oszacuj tempo mutacji danego genotypu w określonym środowisku, zgodnie z zarysem w protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj częstość mutacji MG1655 trzech różnych markerów fenotypowych, cykloseryny, ryfampicyny i kwasu nalidyksowego.

Częstość mutacji ocenia się w minimalnym pożywce Davisa o stężeniu glukozy 80 mg/L, 125 mg/L i 250 mg/L. W jednym przypadku stosuje się stężenie glukozy 1000 mg/L. Zgodnie z oczekiwaniami, wskaźniki mutacji są wyższe w przypadku oporności na cykloserynę, najniższe w przypadku oporności na kwas nalidyksowy, a wskaźnik oporności na ryfampicynę znajduje się pośrodku.

Test fluktuacji wyraźnie pokazuje, który szczep jest konstytutywnym mutatorem, a który ma normalne tempo mutacji. Ponieważ szczep deletantu mutT miał wskaźnik mutacji w kierunku oporności na kwas nalidyksowy, który jest około 50 razy wyższy niż w kontrolnym szczepie MG1655. Podczas tworzenia tego protokołu upewnij się, że twoje komórki dobrze rosną.

Powinny rosnąć do jednolitej gęstości w równoległych kulturach w tym samym środowisku. Jednym z działań następczych po tej procedurze jest określenie sekwencji DNA genu rpoB w opornych koloniach. Określenie, w jaki sposób spektrum mutacji oporności na ryfampicynę różni się w zależności od środowiskowego genotypu drobnoustrojów.

Testy fluktuacji w XX wieku pokazały, że mutacja jest spontaniczna i losowa w odniesieniu do środowiska. Teraz rzucają nowe światło na to, w jaki sposób tempo mutacji różni się w zależności od środowiska pod względem genetycznym, ekologicznym, a nawet społecznym.