Name: Odwracalny model nadciśnienia ocznego wywołanego olejem silikonowym u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-15T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj odwracalny model nadciśnienia ocznego wywołanego olejem silikonowym u myszy. Ta metoda umożliwia badanie neurodegeneracji siatkówki i testowanie terapii neuroprotekcyjnych w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez granty NIH EY024932, EY023295 i EY028106 dla YH.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanforda.
1. Indukcja nadciśnienia ocznego przez dokomorowe wstrzyknięcie SO
<ol>
	<li>Przygotować szklaną mikropipetę do dokomorowego wstrzyknięcia SO, pociągając szklaną kapilarnę za pomocą ściągacza do pipet w celu wytworzenia mikropipety. Wytnij otwór na końcówce mikropipety i dalej naostrz końcówkę za pomocą mikroszlifierki do ukosowania, aby uzyskać fazę 35°−40°.</li>
	<li>Wypoleruj krawędzie skosu i usuń wszelkie zanieczyszczenia, myjąc wodą. Autoklaw mikropipety przed użyciem.</li>
	<li>Przygotuj igłę paracentezy do wejścia do rogówki. W tym celu należy przymocować igłę 32 G do strzykawki o pojemności 5 ml na zamku Luer i dodatkowo zabezpieczyć ją taśmą. Zegnij końcówkę igły skośną do góry pod kątem 30°.</li>
	<li>Przygotować wstrzykiwacz SO, najpierw mocując i zabezpieczając końcówkę igły 18 G na strzykawce o pojemności 10 ml. Następnie przymocuj plastikową rurkę z igłą 18 G na jednym końcu i napełnij SO w razie potrzeby przez drugi koniec.</li>
	<li>Przymocuj wysterylizowaną mikropipetę do plastikowej rurki i naciśnij tłok strzykawki, aby napełnić całą mikropipetę SO.</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie SO dokomorowe na jedno oko
<ol>
	<li>Umieść 9-10-tygodniowego samca myszy C57B6/J w komorze indukcyjnej z 3% izofluranem zmieszanym z tlenem w tempie 2 l/min przez 3 minuty.</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo 2,2,2-tribromoetanol w stężeniu 0,3 mg/g masy ciała. 
	UWAGA: W przeciwieństwie do ketaminy/ksylazyny, 2,2,2-tribromoetanol nie powoduje widocznego rozszerzenia źrenicy.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i brak ruchu wąsów lub ogona, aby określić siłę znieczulającą.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji bocznej na platformie chirurgicznej. Aby zmniejszyć jej wrażliwość podczas zabiegu, przed wstrzyknięciem należy nanieść na rogówkę jedną kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie wejściowe igłą paracentezy 32 G w kwadrancie nadskroniowym, około 0,5 mm od rąbka.</li>
	<li>Tunel przez warstwy rogówki na około 0,3 mm przed przebiciem do komory przedniej. Uważaj, aby nie dotknąć obiektywu ani przysłony.</li>
	<li>Powoli wyjmować igłę, aby uwolnić trochę cieczy wodnistej (około 1-2 μl) z przedniej komory przez tunel (paracenteza).</li>
	<li>Odczekaj ~8 min, aby jeszcze bardziej zmniejszyć IOP. Można to określić, mierząc przeciwległe, kontrolne oko.</li>
	<li>Wprowadzić szklaną mikropipetę z fabrycznie załadowanym SO przez tunel rogówki do komory przedniej, skosem skierowanym w dół do powierzchni tęczówki.</li>
	<li>Powoli naciskać tłok strzykawki, aby wstrzyknąć SO do przedniej komory, aż kropla SO pokryje większość powierzchni tęczówki o średnicy ~2,3−2,4 mm.</li>
	<li>Pozostaw mikropipetę w komorze przedniej na kolejne 10 sekund, a następnie powoli ją wyjmij.</li>
	<li>Delikatnie popchnij górną powiekę, aby zamknąć nacięcie rogówki, aby zminimalizować wyciek SO.</li>
	<li>Nałóż maść z antybiotykiem (bacytracyna-neomycyna-polimyksyna) na powierzchnię oka.</li>
	<li>W trakcie zabiegu należy często zwilżać rogówkę sztucznymi łzami.</li>
	<li>Trzymaj mysz na poduszce grzewczej, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.</li>
</ol>
3. Usunięcie SO
<ol>
	<li>Przygotuj system nawadniania.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór do nawadniania zgodnie z instrukcjami producenta i umieść go w butelce do irygacji. Podnieś butelkę z roztworem do irygacji na wysokość 110−120 cm (81−88 mmHg) nad platformą chirurgiczną.</li>
		<li>Podłączyć zestaw do podawania dożylnego do butelki z roztworem do irygacji. Usuń pęcherzyki powietrza z rurki dożylnej. Podłącz igłę 33 G wygiętą pod kątem 20° do rurki dożylnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować system drenażowy, należy wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 1 ml. Podłączyć igłę 33 G do strzykawki i zgiąć igłę pod kątem 20°.</li>
	<li>Usunąć SO z komory przedniej.
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo 2,2,2-tribromoetanol (0,3 mg/g masy ciała). Sprawdź, czy nie ma reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić siłę znieczulenia i brak ruchu wąsów lub ogona.</li>
		<li>Umieść mysz na platformie chirurgicznej i zabezpiecz ją w pozycji bocznej taśmą. Nałóż jedną kroplę 0,5% chlorowodorku proparakainy na rogówkę, aby zmniejszyć jej wrażliwość.</li>
		<li>Wykonaj dwa nacięcia w kwadrancie skroniowym rogówki między godziną ~2 a 5 na krawędzi kropli SO za pomocą wstępnie przygotowanej igły do paracentezy 32 G.</li>
		<li>Wprowadzić igłę irygacyjną o sile 33 G podłączoną do roztworu irygacyjnego przez jedno nacięcie rogówki, z maksymalną prędkością.</li>
		<li>Wprowadzić kolejną igłę drenażową 33 G dołączoną do strzykawki bez tłoka przez drugie nacięcie rogówki, aby umożliwić kropli SO opuszczenie komory przedniej podczas irygacji roztworem irygacyjnym.</li>
		<li>Wyjmij igłę drenażową, a następnie igłę do irygacji.</li>
		<li>Wstrzyknij pęcherzyk powietrza do przedniej komory, aby utrzymać jego normalną głębokość i naciśnij, aby zamknąć nacięcie rogówki.</li>
		<li>Nałóż maść z antybiotykiem na oba oczy.</li>
		<li>Trzymaj mysz na podkładce regenerującej ogrzewanie, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiar IOP raz w tygodniu
<ol>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej wypełnionej 3% izofluranem zmieszanym z tlenem w ilości 2 l/min na 3 minuty.</li>
	<li>Wstrzykiwać dootrzewnowo ksylazynę i ketaminę (0,01 mg ksylazyny/g, 0,08 mg ketaminy/g).</li>
	<li>Utrzymuj rogówkę wilgotną, stosując sztuczne łzy przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Odczekaj około 15 minut, aby źrenica mogła się w pełni rozszerzyć.</li>
	<li>Zmierz ciśnienie wewnątrzgałkowe obu oczu za pomocą tonometru zgodnie z instrukcją produktu. Zbliż tonometr do oka myszy. Zachowaj odległość od końcówki sondy do rogówki myszy na poziomie około 3−4 mm. Naciśnij przycisk pomiaru 6x, aby wygenerować jeden odczyt. Z każdego oka uzyskuje się trzy odczyty generowane maszynowo w celu uzyskania średniego ciśnienia wewnątrzgałkowego.</li>
	<li>Uśmierc zwierzęta po 8 tygodniach od wstrzyknięcia SO i przeprowadź immunohistochemię całej siatkówki, liczenie RGC, półcienkie odcinki nerwu wzrokowego (ON) i kwantyfikację aksonów, które przeżyły, co zostało opisane wcześniej13.</li>
</ol>

<ol><li>Chang, E. E., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glaucoma+2.0%3A+neuroprotection%2C+neuroregeneration%2C+neuroenhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement.</a> Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).</li>
<li>Tham, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+glaucoma+and+projections+of+glaucoma+burden+through+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).</li>
<li>Pang, I. H., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+glaucoma+retinopathy+and+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy.</a> Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).</li>
<li>Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+models+for+glaucoma+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat models for glaucoma research.</a> Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).</li>
<li>McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+retinal+ganglion+cell+death+and+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma.</a> Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rodent+Model+of+Glaucoma+and+Its+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22Asia+Pacific+Journal+of+Ophthalmology+%28Philadelphia%29%22%5BJournal%5D)">The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications.</a> Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).</li>
<li>Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbead+occlusion+model%3A+a+paradigm+for+induced+ocular+hypertension+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+neuropathy+due+to+microbead-induced+elevated+intraocular+pressure+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).</li>
<li>Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+to+experimental+glaucoma+among+3+mouse+strains+using+bead+and+viscoelastic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection.</a> Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).</li>
<li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li>
<li>Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+oil+induced+glaucoma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Archieves+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Silicone oil induced glaucoma: a review.</a> Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).</li>
<li>Kornmann, H. L., Gedde, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glaucoma+management+after+vitreoretinal+surgeries%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Glaucoma management after vitreoretinal surgeries.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+oil-induced+ocular+hypertension+and+glaucomatous+neurodegeneration+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse.</a> Elife. 8, (2019).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+a+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+protein+RBPMS+is+a+selective+marker+of+ganglion+cells+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).</li>
<li>Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+RS+%22Systematic+evaluation+of+the+mouse+eye+%3A+anatomy%2C+pathology%2C+and+biomethods%22">Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods</a>. , CRC Press. (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj pokazujemy prostą, ale skuteczną procedurę indukowania trwałego wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego w oku myszy poprzez dokomorowe wstrzyknięcie SO. Tej procedury może się szybko nauczyć każdy, kto ma doświadczenie w mikrodysekcji pod mikroskopem. Podstawowym potencjalnym ryzykiem niepowodzenia jest wyciek SO z nacięcia rogówki. Jednak jedną z zalet stosowania SO jest to, że ponieważ kropla oleju jest widoczna i mierzalna, możemy łatwo zidentyfikować myszy, które otrzymały kropelki zbyt małe, aby wywołać stabilne n...

Postępująca utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC) i ich aksonów jest cechą charakterystyczną jaskry, powszechnej choroby neurodegeneracyjnej w siatkówce1. Do 2040 roku dotknie ponad 100 milionów osób w wieku 40-80 lat2. IOP pozostaje jedynym modyfikowalnym czynnikiem ryzyka w rozwoju i progresji jaskry. Aby zbadać patogenezę, progresję i potencjalne metody leczenia jaskry, konieczny jest wiarygodny, powtarzalny i indukowalny eksperymentalny model nadciśnienia ocznego/jaskry, który replikuje kluczowe cechy pacjentów.
IOP zależy od dopływu cieczy wodnistej do przedniej komory z ciała rzęskowego w komorze tylnej i odpływu przez siatkę beleczkową (TM) pod kątem przedniej komory. Po osiągnięciu stanu ustalonego ciśnienie wewnątrzgałkowe jest utrzymywane. Gdy dopływ przekracza odpływ lub jest od niego mniejszy, IOP odpowiednio wzrasta lub spada. Zmniejszając odpływ wody wodnistej poprzez zamknięcie kąta komory przedniej lub uszkodzenie TM, ustalono kilka modeli jaskry3,4,5,6,7,8,9,10. Modele te są zwykle związane z nieodwracalnym uszkodzeniem tkanki oka, a wysokie ciśnienie wewnątrzgałkowe w komorze przedniej powoduje również niepożądane powikłania, takie jak obrzęk rogówki i zapalenie wewnątrzgałkowe, co utrudnia wykonywanie i interpretację obrazowania siatkówki i oznaczania funkcji wzrokowych.
Aby opracować model, który przezwycięży te niedociągnięcia, skupiliśmy się na dobrze udokumentowanej wtórnej jaskrze spowodowanej przez olej silikonowy (SO), która występuje jako pooperacyjne powikłanie ludzkiej chirurgii witreoretinalnej11,12. SO jest stosowany jako tamponada w operacjach siatkówki ze względu na wysokie napięcie powierzchniowe. Jednak SO może fizycznie zasłaniać źrenicę, ponieważ jest lżejszy niż płyny wodne i szkliste, co zapobiega przepływowi wody wodnistej do komory przedniej. Niedrożność powoduje podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego w komorze tylnej z powodu nagromadzenia cieczy wodnistej. To zmotywowało nas do opracowania i scharakteryzowania nowego mysiego modelu nadciśnienia ocznego opartego na dokomorowym wstrzyknięciu SO i bloku źrenic13, z kluczowymi cechami jaskry wtórnej: efektywną blokadą źrenic, znacznym wzrostem ciśnienia wewnątrzgałkowego, które może powrócić do normy po usunięciu SO, oraz neurodegeneracją jaskrową.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół leczenia nadciśnienia ocznego wywołanego SO w oku myszy, w tym wstrzykiwanie i usuwanie SO oraz pomiar IOP.

<table><tbody><tr><td>0,5% chlorowodorek proparakainy</td><td>Akorn, Somerset</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>BD</td><td></td><td>Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td>18G igła</td><td>BD</td><td></td><td>ze zwykłym skosem, długość igły: 25,4 mm</td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoetanol (Avertin)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS# 75-80-9</td><td>50g</td></tr><tr><td>32G nano</td><td>BD</td><td>320122</td><td>BD Nano Ultra cienka igła do długopisu-32G 4mm</td></tr><tr><td>Igła okulistyczna 33G</td><td>TSK/ VWR</td><td>TSK3313/ 10147-200</td><td></td></tr><tr><td>5mL strzykawka</td><td>BD</td><td></td><td>Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td>AnaSed Injection (ksylazyna)</td><td>Butler Schein</td><td></td><td>100 mg/ml, 50 ml</td></tr><tr><td>sztuczne łzy</td><td>Alcon Laboratories</td><td>300651431414</td><td>Systane Ultra Lubricant Krople do oczu</td></tr><tr><td>BSS PLUS Roztwór nawadniający</td><td>Alcon Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>65080050 Dwustopniowy szklany ściągacz do mikropipet</td><td>NARISHIGE</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>EZ-7000 Klasyczny system</td><td>EZ System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>VetOne</td><td>502017</td><td>izofluran, USP, 250 ml / butelkę</td></tr><tr><td>IV Zestawy do podawania</td><td>EXELint/ Fisher</td><td>29081</td><td></td></tr><tr><td>CHLOROWODOREK KETAMINY DO WSTRZYKIWAŃ</td><td>VEDCO</td><td>50989-996-06</td><td>KETAVED 100mg/ml * 10ml</td></tr><tr><td>maszyna do fazowania microgrind</td><td>NARISHIGE</td><td>EG-401</td><td></td></tr><tr><td>Miniaturowe rurki EVA</td><td>McMaster-Carr</td><td>1883T4</td><td>0,05 "ID, 0,09" OD, 10 stóp długości</td></tr><tr><td>oleju silikonowego (SILIKON)</td><td>Alcon Laboratories</td><td>8065601185</td><td>1,000 mPa.s</td></tr><tr><td>Standardowe kapilary szklane</td><td>WPI/ Fisher</td><td>1B150-4</td><td>4 cale. (100 mm) OD 1,5 mm ID 0,84 mm</td></tr><tr><td>TonoLab TonoLab</td><td>Colonial Medical Supply, Finlandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>weterynaryjna maść antybiotykowa</td><td>Dechra Veterinary</td><td>1223RX</td><td>BNP maść okulistyczna, Vetropolycin</td></tr></tbody></table>

odwracalny model nadciśnienia ocznego wywołanego olejem silikonowym u myszy

A Reversible Silicon Oil-Induced Ocular Hypertension Model in Mice

Podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) jest dobrze udokumentowanym czynnikiem ryzyka jaskry. Tutaj opisujemy nowatorską, skuteczną metodę konsekwentnego wywoływania stabilnego wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego u myszy, która naśladuje pooperacyjne powikłanie stosowania oleju silikonowego (SO) jako środka tamponadowego w chirurgii witreoretinalnej u ludzi. W tym protokole SO jest wstrzykiwany do przedniej komory oka myszy w celu zablokowania źrenicy i zapobieżenia napływowi cieczy wodnistej. Tylna komora gromadzi ciecz wodnistą, a to z kolei zwiększa ciśnienie wewnątrzgałkowe tylnego segmentu. Pojedyncze wstrzyknięcie SO powoduje niezawodne, wystarczające i stabilne podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego, co wywołuje znaczne zwyrodnienie neurodegeneracji jaskry. Ten model jest wiernym odwzorowaniem jaskry wtórnej w klinice okulistycznej. Aby jeszcze bardziej naśladować warunki kliniczne, SO można usunąć z komory przedniej, aby ponownie otworzyć drogę drenażową i umożliwić dopływ cieczy wodnistej, która jest odprowadzana przez siatkę beleczkową (TM) pod kątem komory przedniej. Ponieważ ciśnienie wewnątrzgałkowe szybko wraca do normy, model można wykorzystać do zbadania wpływu obniżenia ciśnienia wewnątrzgałkowego na komórki zwojowe siatkówki jaskrowej. Metoda ta jest prosta, nie wymaga specjalnego sprzętu ani powtarzania procedur, ściśle symuluje sytuacje kliniczne i może mieć zastosowanie do różnych gatunków zwierząt. Mogą być jednak wymagane drobne modyfikacje.

Wkrótce po wstrzyknięciu można łatwo zidentyfikować myszy, u których nie rozwija się stabilne nadciśnienie wewnątrzgałkowe z powodu zbyt małego rozmiaru kropel SO (≤1,5 mm)13. Zwierzęta te są wykluczane z dalszych eksperymentów. Po wykonaniu procedur wstrzykiwania, u ponad 80% myszy z podaną substancją SO powstają krople o rozmiarze większym niż 1,6 mm. Mierzyliśmy IOP tych oczu raz w tygodniu przez 8 tygodni po pojedynczym wstrzyknięciu SO. IOP oka z podaną substancją SO pozostawało wysokie, zazw...

Tutaj prezentujemy protokół indukowania nadciśnienia ocznego i neurodegeneracji jaskry w oczach myszy poprzez dokomorowe wstrzyknięcie oleju silikonowego oraz procedurę usuwania oleju silikonowego z przedniej komory w celu przywrócenia podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego do normy.

Odwracalny model nadciśnienia ocznego wywołanego olejem silikonowym u myszy

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing ...

Jaskra jest główną przyczyną nieodwracalnej ślepoty, charakteryzującej się śmiercią komórek zwojowych siatkówki i neurodegeneracją opto-neurodegeneracyjną. Wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego, zwany również nadciśnieniem ocznym, jest najbardziej rozpoznawalnym czynnikiem ryzyka jaskry. Prosty, ale skuteczny model nadciśnienia ocznego u zwierząt doświadczalnych, takich jak myszy, jest ważny dla badania glaukometrów w neurodegeneracji i testowania leczenia neuroprotekcji.W związku z tym, dzięki wynikom, opracowujemy mysi model nadciśnienia ocznego, który ściśle naśladuje jaskrę wtórną obserwowaną u ludzi. Model ten wiernie odwzorowuje jaskrę wtórną spowodowaną zablokowaniem źrenic wywołanym olejem silikonowym. Procedura jest prosta, wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego jest stabilny, a jeśli neurodegeneracja związana z nadciśnieniem ocznym jest ciężka w oczach myszy, co ważniejsze, nadciśnienie oczne jest odwracalne, ponieważ olej silikonowy można łatwo usunąć z oczu myszy.Procedurę zademonstruje dr Fang Fang, lekarz po operacji z mojego laboratorium. Na początek wykonaj szklaną mikropipetę do wewnątrzkomorowego wstrzykiwania oleju silikonowego, pociągając szklaną kapilarnę za pomocą ściągacza do pipet. Wytnij otwór na końcówce mikropipety i naostrz końcówkę za pomocą ukosownika z mikroszlifierką, aby uzyskać skos od 35 do 40 stopni.Wypoleruj krawędzie skosu i umyj go wodą, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Autoklaw mikropipety przed użyciem. Aby przygotować igłę paracentezy do wprowadzenia rogówki, przymocuj igłę o rozmiarze 32 do pięciomililitrowej strzykawki na zamku przynęty i dodatkowo zabezpiecz ją taśmą.Zegnij końcówkę igły pod kątem do góry pod kątem 30 stopni. Aby przygotować wtryskiwacz oleju silikonowego, przymocuj i zabezpiecz igłę o rozmiarze 18 na 10-mililitrowej strzykawce. Następnie przymocuj plastikową rurkę z igłą o rozmiarze 18 na jednym końcu i napełnij olejem silikonowym w razie potrzeby przez drugi koniec.Po znieczuleniu dziewięcio- lub 10-tygodniowej myszy C57 black 6J sprawdź, czy nie ma reakcji na szczypanie palca u nogi brakiem ruchu wąsów lub ogona. Umieść mysz w pozycji bocznej na platformie chirurgicznej. Nałóż jedną kroplę 5% chlorowodorku proparakainy na rogówkę przed wstrzyknięciem, aby zmniejszyć jej wrażliwość podczas zabiegu.Użyj igły paracentezy o rozmiarze 32, aby wykonać nacięcie wejściowe w kwadrancie nadskroniowym około 5 milimetrów od rąbka. Tunel przez warstwy rogówki przez około 3 milimetry przed przekłuciem w przedniej komorze, uważając, aby nie dotknąć soczewki lub tęczówki. Powoli wyjmij igłę, aby uwolnić około jednego do dwóch mikrolitrów cieczy wodnistej z przedniej komory przez tunel i odczekaj około ośmiu minut, aby jeszcze bardziej obniżyć ciśnienie wewnątrzgałkowe.Zmierz przeciwległe oko kontrolne, aby określić ciśnienie. Wprowadzić szklaną mikropipetę wstępnie wypełnioną olejem silikonowym przez tunel rogówki do przedniej komory skosem skierowanym w dół do powierzchni tęczówki. Powoli naciskać tłok strzykawki, aby wstrzyknąć olej silikonowy do przedniej komory, aż kropla oleju pokryje większość powierzchni tęczówki o średnicy około 2,3 do 2,4 milimetra.Pozostaw mikropipetę w komorze przedniej na dodatkowe 10 sekund, a następnie powoli ją wyjmij. Delikatnie popchnij górną powiekę, aby zamknąć nacięcie rogówki, aby zminimalizować wyciek oleju silikonowego. A następnie nałóż maść z antybiotykiem na powierzchnię oka.Trzymaj mysz na poduszce grzewczej, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia. Aby usunąć olej silikonowy z przedniej komory, znieczul mysz, a następnie sprawdź, czy nie ma reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić siłę znieczulenia i brak ruchu wąsów lub ogona. Umieść mysz na platformie chirurgicznej i zabezpiecz ją w pozycji bocznej taśmą.Nałóż jedną kroplę 5% chlorowodorku proparakainy na rogówkę, aby zmniejszyć jej wrażliwość. Za pomocą gotowej igły do paracentezy o rozmiarze 32 wykonaj dwa nacięcia w kwadrancie skroniowym rogówki między godziną około drugiej a piątej na krawędzi kropli oleju silikonowego. Włóż igłę do irygacji o rozmiarze 33 połączonym z roztworem irygacyjnym przez jedno nacięcie rogówki z maksymalną prędkością.Wprowadzić kolejną igłę drenażową o rozmiarze 33 dołączoną do strzykawki bez tłoka przez drugie nacięcie rogówki, aby umożliwić kropli oleju silikonowego wydostanie się z przedniej komory podczas irygacji roztworem irygacyjnym. Wyjmij igłę drenażową, a następnie igłę do irygacji. Użyj szklanej mikropipety podłączonej do strzykawki Hamiltona, aby wstrzyknąć pęcherzyk powietrza do przedniej komory, aby utrzymać jej normalną głębokość i dociśnij, aby zamknąć nacięcie rogówki.Nałóż maść z antybiotykiem na oba oczy i trzymaj mysz na podkładce regenerującej ogrzewanie, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia. Umieść mysz w komorze indukcyjnej. Znieczulij go zgodnie z opisem w manuskrypcie i utrzymuj wilgotność rogówki, stosując sztuczne łzy przez cały czas trwania zabiegu.Odczekaj około 15 minut, aby źrenica mogła się w pełni rozszerzyć. Zmierz ciśnienie wewnątrzgałkowe obu oczu za pomocą tonometru zgodnie z instrukcją produktu. Zbliż tonometr do oka myszy, utrzymując odległość od końcówki sondy do rogówki myszy na poziomie około trzech do czterech milimetrów.Naciśnij przycisk pomiaru sześć razy, aby wygenerować jeden odczyt i uzyskać trzy odczyty wygenerowane maszynowo z każdego oka, aby uzyskać średnie IOP. Przeprowadzić immunohistochemię zwojów siatkówki z całą mocą, zliczając półcienkie odcinki nerwu wzrokowego i określając ilościowo aksony, które przeżyły, u zwierząt uśmierconych po ośmiu tygodniach od wstrzyknięcia oleju silikonowego. Ciśnienie wewnątrzgałkowe oczu myszy z kropelkami oleju silikonowego większymi niż 1,6 milimetra mierzono raz w tygodniu przez osiem tygodni, po pojedynczym wstrzyknięciu oleju silikonowego.Ciśnienie w oku otrzymującym olejek pozostawało wysokie, przeważnie dwukrotnie większe niż ciśnienie w przeciwległym oku kontrolnym, co wskazuje na skuteczne zablokowanie źrenicy. W innej grupie myszy olej silikonowy został wypłukany z przedniej komory dwa tygodnie po wstrzyknięciu. Po odczekaniu tygodnia, aby rogówka mogła się zregenerować, ciśnienie wewnątrzgałkowe wróciło do normy, tak samo jak w oku kontrolnym.Aby określić wpływ niedociśnienia ocznego wywołanego olejem silikonowym na komórki zwojowe siatkówki, somaty, które przeżyły w obwodowych obszarach całych wierzchowców siatkówki, określono ilościowo za pomocą barwienia RBPMS, co wykazało dramatyczną śmierć komórek zwojowych siatkówki po wstrzyknięciu oleju silikonowego. Aksony, które przeżyły w półcienkich przekrojach nerwu wzrokowego, oznaczono ilościowo za pomocą barwienia PBD osiem tygodni po wstrzyknięciu. Doszło do dużego zwyrodnienia aksonów w nadciśnieniu ocznym wywołanym olejem silikonowym.Zwierzęta można obrazować za pomocą SLOOCT w celu określenia zmian w siatkówce. Funkcję wzrokową zwierząt można również określić za pomocą wzoru ERG i OKR. Ten model nadciśnienia ocznego ułatwi badanie neurodegeneracji jaskowomierzy wywołanej wysokim ciśnieniem wewnątrzgałkowym.Może być również stosowany do testowania obiecujących terapii neuroprotekcyjnych przed kliniką.

a-reversible-silicon-oil-induced-ocular-hypertension-model-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Jaskra jest jedną z głównych przyczyn ślepoty na świecie. Podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe stanowi główny czynnik ryzyka. Hipertonia oczna indukowana laserową fotokoagulacją jest jednym z dobrze ugruntowanych modeli zwierzęcych. Niniejszy film demonstruje, jak indukować hipertonię oczną za pomocą fotokoagulacji laserem argonowym u szczura.

Model przewlekłego nadciśnienia wewnątrzgałkowego indukowanego laserem u szczurów SD

W tym filmie znieczulony szczur przechodzi zabieg okulistyczny, w którym kulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory pod wpływem pola magnetycznego w celu zablokowania kąta tęczówkowo-rogówkowego. Blokada ta blokuje siatkę beleczkową, uniemożliwiając drenaż cieczy wodnistej i prowadząc do wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego, uszkadzając komórki zwojowe siatkówki i nerw wzrokowy. W ten sposób rozwija się stan podobny do jaskry.

Eksperymentalna indukcja jaskry przez niedrożność kąta tęczówkowo-rogówkowego w modelu mysim

Źródło: Lani-Louzada, R.,  i wsp., Kauteryzacja pełnego koła rąbkowego splotu naczyniowego w przypadku chirurgicznie wywołanej jaskry u gryzoni. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje indukcję i monitorowanie podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP) w modelu szczurzym. Proces ten polega na kauteryzacji rąbkowych naczyń krwionośnych, co skutkuje niedrożnością naczyń i podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym. Szczur może następnie wyzdrowieć, a ciśnienie wewnątrzgałkowe jest regularnie...

 Indukcja podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego w modelu szczurzym

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane za pomocą laserowej fotokoagulacji siatki beleczkowej w oczach myszy. Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) utrzymuje się podwyższone przez kilka miesięcy po leczeniu laserowym. Spadek ostrości wzroku i wrażliwości na kontrast u zwierząt doświadczalnych monitoruje się za pomocą testu optomotorycznego.

Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku

Prezentujemy metodę wywoływania podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP), poprzez wstrzykiwanie mikrosfer magnetycznych do oka szczura, w celu modelowania jaskry. Prowadzi to do silnego wzrostu ciśnienia i rozległej śmierci neuronów. Protokół ten jest łatwy do wykonania, nie wymaga wielokrotnych wstrzyknięć i zapewnia stabilny, długotrwały wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego.

Jaskra doświadczalna wywołana przez wstrzyknięcie mikrosfer magnetycznych do oka

Tutaj prezentujemy protokół indukcji nadciśnienia ocznego w mysim oku, który powoduje utratę komórek zwojowych siatkówki, co obserwuje się w jaskrze. Mikrogranulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory i przyciągane do kąta tęczówkowo-rogówkowego za pomocą magnesu, aby zablokować odpływ cieczy wodnistej.

Magnetyczny model okluzji mikrokulek do wywoływania jaskry zależnej od nadciśnienia ocznego u myszy

Ten artykuł opisuje procedurę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki przez podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe u myszy. Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne siatkówki spowodowane podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym służy do modelowania ludzkich patologii charakteryzujących się upośledzonym dostarczaniem tlenu i składników odżywczych do siatkówki, umożliwiając naukowcom zbadanie potencjalnych mechanizmów komórkowych i metod leczenia chorób układu...

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki poprzez podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane przez zastosowanie szwu okołokończynowego u szczurów i myszy, co prowadzi do funkcjonalnego i strukturalnego pogorszenia komórek zwojowych siatkówki zgodnego z jaskrą.

Model jaskry indukowanej szwem okołolimbowym u szczurów i myszy

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia mysiego modelu suchego oka z niedoborem wody wodnej poprzez wycięcie gruczołów łzowych zewnątrzoczodołowych i podoczodołowych oraz ocenę zmian na powierzchni oka w suchym oku z niedoborem wodnistości.

Opracowanie mysiego modelu suchego oka z niedoborem wody wodnistej

Poznaj odwracalny model nadciśnienia ocznego wywołanego olejem silikonowym u myszy. Ta metoda umożliwia badanie neurodegeneracji siatkówki i testowanie terapii neuroprotekcyjnych w kontrolowanych warunkach.

Odwracalny model nadciśnienia ocznego wywołanego olejem silikonowym u myszy

Przeglądaj więcej filmów